1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 6.A Generelt om elektroforese 6.B Klassisk elektroforese 1
2 6.C. 1. Innledning: Kapillær-elektroforese (CE) er en kombinasjon av elektroforese: "differensiell migrering av ioner i løsning i et elektrisk felt " med "kromatografisk praksis" : "instrumentering, automatisering og 'on-line'-deteksjonsmetodikk" Veldig fritt oversatt & adaptert etter : James W. Jorgensen (en av grunnleggerne til den moderne CE en) 2
3 6.C. 1. Innledning: Karakteristikk av CE: Elektroforese som utføres i trange kapillærer (fused silica, 25-75 μm i.d., 20-80 cm lange) Høy spenning, 10-30 kv : gir sterke elektriske felt, 100-500 V/cm) Høy elektrisk motstand i kapillæret (p.g.a. lite tverrsnittareal A) begrenser strømstyrken og varmeutvikling (Joule heating). Høy effektivitet (opp til N = 100.000-1.000.000, H 1 μm, p.g.a. EOF's strømningsprofil), og korte analysetider (vanlig ca. 5-30 min). Deteksjon i kapillæret ("in-column"), vanligvis (med unntak)). Basert på transport til/gjennom detektoren ved elektroosmotisk strøm (få unntak). Meget små prøvevolum ( 1-50 nl = 0,001-0,05 μl ), Forskjellige varianter av CE, kan gi tilpasset selektivitet, noe som utvider anvendelses-området. Vandige media ("miljøvennlig", "nært fysiologisk"), "Simple method development" automatiserbar 3
4 6.C. 1. Innledning: Noen av de viktigste metodene innen kapillær-elektroforese: (Jfr. f.eks. LRG- Chro '14: s. 130ff.) Sone-elektroforese (Capillary (Free) Zone Electrophoresis, CZE)* Jfr. også Lab-eksperimentet. Isoelektrisk fokusering (IEF) Gel-elektroforese (Capillary gel electrophoresis) Gelfri-sikting ( Gel-free sieving ) * Micelle elektrokinetisk kapillærkromatografi ("Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography", MEKC, MECC) * Isotachoforese ( Isotachophoresis, ITP) Elektrokromatografi (Electrochromatography EC, CEC (= capillary EC) - i krysningssonen mellom (kapillær-)elektroforese og kromatografi : Separasjon ved kromatografiske prinsipper (mest RP), med MF-transport v.h.a. elektroosmose istedenfor ved (høy-)trykk ved pumping. De stjernemerkede metodene * : finnes kun "i kapillær-format". 4
5 6.C. 2. Kapillær-elektroforese-instrumentering oversikt : Kan være relativt enkelt; pr. i dag mest PC-kontrollerte og automatiserbare systemer. 1. Kapillærrør 2. Detektor (her "in-column") 3., 4. Elektrolyttreservoarer 5. Prøve, plasseres til injeksjon på plassen til elektrolyttreservoar 3 6., 7. Elektrodene (platina-tråder), hhv. anode (6) og katode (7) (polaritet byttbar), m. spenningskilde (HV) 8. Termostatering av kapillær (via luft, eller væske) 9. Nivåregulering for prøven (for hydrodynamisk injeksjon) og/eller 10. Overtrykk-/undertrykk-kontroll (for hydrodynamisk injeksjon) 11 Systemkontroll (PC) 5
6 6.C. 3. Sonespredning i CE : Sonespredning omfatter noe mer enn bare diffusjonsbidrag i kapillæret : Bidragene kan (som i kromatografi) oppføres som additive i form av variansen (tilsv. platehøyder) : Cationic Dye Capillary Electrophoresis: Method Electropherogram of Pen A (λ observed = 214 nm) (Fra: Google Pix's (CE): www.fbi.gov, 2014-03-20) Totalvariansen for sonen blir da: 2 T = 2 Dif + 2 Inj + 2 Temp + 2 Ads + 2 Det + 2 Electrodisp. +... Subskriptene står for: diffusjon injeksjon temperaturgradienter adsorpsjonsprosesser deteksjon elektrodispersjon ("mobility mismatch") (evt. muligens litt Eddy-diffusjon når gel-matrise i bruk?) 6
7 6.C. 3. Sonespredning i CE : Cationic Dye Capillary Electrophoresis: Method Electropherogram of Pen A (λ observed = 214 nm) (Fra: Google Pix's (CE): www.fbi.gov, 2014-03-20) Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 7
8 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : Nesten alltid av silika! Elektrisk isolerende, fleksible, godt UV-gjennomsiktige (for on-column optisk deteksjon) når beskyttelseslaget (polyimid) på utsiden fjernes, kjemisk ganske inerte og med god tilgang til EOF-skapende ioniserbare silanolgrupper,... som kan derivatiseres ved behov. Google-Pix : mrsarge.deviantart.com Typiske lengder (for CZE) ca. 20 cm - 80 cm (i.d. 20-100 μm) : totalt kolonnevolum 0,1-10 μl! Totalt kolonnevolum i lab.-forsøket: L=310 mm, i.d.= 0,05 mm): 0.6 μl Silika er også egnet til: IEF, Gel-E (CGE), MECC, CEC, og ITP. Google-Pix : chemwiki.ucdavies.edu 8
9 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : a) Kolonne(-vegg)ens egenskaper er viktige : Veggmodifikasjoner kan tilpasse kapillæret til spesielle CE-metodikk, bl.a. hindring av uønsket vegg-adsorption og kontroll av elektroosmose. Kolonneveggens bufrings-egenskaper er viktige : skaper/styrer EOF, som er avhengig av ph : EOF som funksjon av ph De fleste overflater i kontakt med elektrolytt lager anioniske grupper (f.eks. silanol-grupper eller karboksyl-grupper): gir EOF mot katoden (negativ. pol). Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 9
10 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : a) Kolonne(-vegg)ens egenskaper viktige : Alternative faktorer som kontrollerer EOF : økende elektrolytt-konsentrasjon (ionestyrke) reduserer EOF (gjennom avtagende zeta-potensial), økende konsentrasjoner av evt. tilsatt organisk modifikator reduserer EOF, ph styrer, i tillegg til kapillærveggens ioniseringsgrad, også ioniseringen til syrer og baser, og bestemmer dermed deres elektroforetiske mobilitet. surfaktanter (ioniske), overflateaktive stoffer: litt mer komplisert: endrer EOF sterkt, kan t.o.m. reversere retningen, s.n. EOF Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 EOF Google-Pix : chemwiki.ucdavies.edu, 2015 10
11 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : Beregnings-eksempel: For EOF : kapillær totallengde, L : 58,5 cm (katode anode) migrasjonslengde, l : 50 cm (inngang detektor) Potensial V : 25 kv.. OBS.! : feil i tabellen: μ e (cm 2 /Vs) for "Neutral" skal være null (= 0) (men μ a er korrekt) Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 μ ef = μ obs - μ EOF, μ obs = μ a : apparent mobility For anionet μ ef = 1,26 10-3 - 2,31 10-3 = - 1,05 10-3 cm 2 /sv (negativ!) For kationet (vist i fig.): μ ef = 3,05 10-3 - 2,31 10-3 = 0,74 10-3 cm 2 /sv 11
12 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : b) Joule-varme i kapillærer: Generelt: J = R i 2 t = V i t Q = V i / A L J = Varme totalt produsert Q = effekt-tetthet [W/mL] R = motstand, i = stømstyrke t = tid, V = spenningen L, A = lengde-, tverrsnitt av kapillæret Joule-varmen som dannes må fjernes gjennom kapillærveggen. Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 Temperaturen blir høyest i midten av kapillæret. viskositeten minst der (minker ca. 2 % pr ºK). mobilitetene større i midten enn ved veggen: forstyrrer den flate EOF-strø-/ og elektroforese-profilen gir økt båndspredning. Temperatur-gradienten øker i kvadrat med kapillærradiusen r ( ΔT = W r 2 /4k ) k = varmeledningsevne Tynne kapillærer kan brukes med høyere spenning enn tykke, fordi de gir mer "reserve" før T-gradienten i kapillæret blir ødeleggende stor (Men tynne kapillærer har lavere deteksjonsgrenser ved in-column deteksjon.) 12
13 6.C. 4. Kapillærer / kolonner : b) Joule-varme i kapillærer: I praksis brukes (for CZE) typisk 50-75 μm i.d. (300-400 μm y.d.). Alternativt kan lengre kapillærer brukes (evt. elektrolytt med lavere ledningsevne). Må velge effektivitet mot følsomhet. I praksis økes spenningen inntil effektiviteten/oppløsningen i begynner å bli målbart dårligere, eller ved bruk av "Ohm's plot" (når strømstyrken i kapillæret, målt som funksjon av økende potensial, øker mer enn proporsjonalt med økt pålagt spenning). Temperaturkontroll er viktig (termostatering brukes) p.g.a. betydningen av viskositeten. Eks. på "Ohm's plot" 13
14 6.C. 5. Prøveapplisering : Applisering av nl eller mindre, reproduserbar, (gjerne også nøyaktig) 2 hovedmetoder: a) Elektrokinetisk injeksjon : Injiserer prøve fra prøveglasset ved elektroforese en kort periode (kapillær-inngang og elektrode innføres i prøveglass, og potensialet settes på en kort periode), før selve den vanlige elektroforesen utføres, fra (etter flytting til) "run buffer"-glasset. Mengde analytt injisert (overført inn i kapillæret) blir (med-)bestemt av hver analytts elektroforetiske mobilitet, elektroforetisk mobilitet skaper noe selektivitet / diskriminering mellom ioner med ulik mobilitet. Q = (μ ef + μ EOF ) V π r 2 C t / L (Q = Mengde injisert analytt, C = analytt-konsentrasjon, V = el. potensial). Mengdekontroll skjer gjennom kontroll av t og V 14
15 6.C. 5. Prøveapplisering : Applisering av nl eller mindre, reproduserbar (gjerne også nøyaktig) 2 hovedmetoder : b) Hydrodynamisk injeksjon : Injiserer prøve fra prøveglasset ved å legge trykk-diffreranse mellom kolonneinngang og utgang (uten el. spenning) (kapillær-inngang med overtrykk, el. -utgang med vakuum, el. "hevert" med høyre inngangs-/ lavere utgangs-væskenivå), før den vanlige elektroforese, fra "run buffer"-glasset, utføres (d.v.s. el. felt slås på). Analytt-overføring til kapillæret trolig 'representativ', uselektiv. inj.vol. = Δp d 4 π t / 128 η L (el. formel 6.4 i LRG, "Chro." 2014) Volumkontroll gjennom kontroll av t og Δp 15
16 6.C. 5. Prøveapplisering : Anbefaling (tommelfingerregel) for injeksjon: start-plugg kortere enn ca. 2% av kolonnelengden (få mm lang, tilsv. 1 50 nl). Alt for lange plugger kan gi : Volum-overbelastning (brede topper med flat maksimum) ved mobilitetsforskjell ( mobility mismatch ) - forsterkes felt-inhomogenitet ekstra sterk fronting el tailing. (asymmetriske topper) Det finnes oppkonsentreringsmetoder for applisering av større prøvevolum Stacking -metoder (jfr. lignende innen GC og HPLC, og klassisk el.forese). I enkle tilfeller: injeksjon av prøven i løsning med meget lav ionestyrke : analytt-ionene samles ved grensen til høy(ere) konsentrert elektrolytt i smale bånd. 16
17 6.C. 6. Deteksjon : Typisk : on-column / in-column for optisk deteksjon : UV/synlig lys LOD: μm og (litt) lavere. (Med Diode Array fås spektral-info.) fluorescens, høyere følsomhet (10-100 x), men krever ofte derivatisering) RI-deteksjon: (lav følsomhet, lite brukt). Ok med silika-kolonner: etter å ha fjernet polyimid-belegg fås kvarts-celler. Fra : Google pic 1503 Ulemper: meget kort lysvei -- begrenset følsomhet (Beer- Lamberts lov), ikke-optimal lysvei, problemer med strølys o.l. (særlig i fluorescens). Fiberoptiske konstruksjoner er ikke uvanlige. Tilpassede detektor-spesial-løsninger blir mer vanlig (bl.a. "bubble cell" for UV) ideal : real : Fig.'s fra : Fra D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 17
18 6.C. 6. Deteksjon : F.eks. Filter UV-detektor : (her med fiberoptisk lysoverføring) (Beckman-Coulter) 18
19 6.C. 6. Deteksjon : F.eks. Diode Array -UV-detektor : (her med fiberoptisk lysoverføring) UV-lampe Optisk fiber Gitter.. Kvikksølvlampe-til λ-kalibrering Diode Array (Beckman-Coulter) (Oppsett som brukt i Lab.-oppgaven) 19
20 6.C. 6. Deteksjon : Ved fluorescens-deteksjon (on column): Bruk av laser-lys gunstig: høy intensitet og koherens : øker følsomheten med mer enn x 10 6 i forhold til vanlig lampelys) 1, dl-2016 2 3 Laser 1 10 9 8 4 5 Laser 2 (Beckman-Coulter) 6 7 20
21 6.C. 6. Deteksjon : For ikke-absorberende ioniske analytter: mulighet for indirekte deteksjon ved bruk av lys-absorberende buffersalter. Ikke-lysabsorberende analytt-ioner fortrenger /fortynner lysabsorberende elektrolyttioner (ofte aromatiske syrer eller baser) og reduserer lysabsorpsjonen når en ikke-absorberende analytt passerer detektoren. Ion-deteksjon ved måling av økt lysintensitet (Nøytrale stoffer gir ikke tilsvarende utslag ved indirekte deteksjon.) "On column"-måling av ledningsevne er mulig (v.h.a. "Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detector" ("C4D")). For elektrokjemisk, -amperometrisk eller massespektrometrisk deteksjon blir målepunktet utenfor - etter - kolonnen, ikke on-/in-column. Kan evt. bli brukt i serie, etter en in-column-deteksjon (f.eks. optisk). 21
22 6.C. 6. Deteksjon : Viktig faktor ved kvantifisering: Topparealer øker proporsjonalt med migrasjons-tiden for soner med omtrent lik konsentrasjon og sonespredning (bredde i mm) fordi seine topper migrerer (forflytter seg gjennom detektor-sonen) saktere enn tidlige topper, og blir derfor bredere på tidsaksen. Bruk av topphøyde frarådes fordi innflytelsen av stacking og mobility mismatch (topp-asymmetri) på topp-høyde er større enn på topp-arealet. Alternativt forslag : bruk areal delt med migrasjonstid. 22
23 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: a ) Kapillær-sone-elektroforese (=CZE) - separasjon etter mobilitet. Typisk 'ren' elektroforese : Mobilitet til analytt-ionene kan være bestemt av Fast ladning og hydrodynamisk størrelse. I tillegg: likevektsavhengig ladning, protonerings-/ deprotonerings-likevekt, komplekserings-likevekt (inkl. metaller, ligander (også kirale)). Beckman-Coulter; indirect. UV-det. 23
24 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: a ) Kapillær-sone-elektroforese (=CZE) - separasjon etter mobilitet. Typisk elektroforese : Mobilitet kan være bestemt av I tillegg: likevekt-avhengig ladning, protonerings-/ deprotonerings-likevekt, komplekserings-likevekt (inkl. metaller, ligander, kirale). Fast ladning og hydrodynamisk størrelse. For syrer 1 og 2 (Figure 3) er ------------------------ maksimal forskjell i mobilitet mellom syrene 1 og 2 omkring midt mellom pk a -verdiene. Jo lenger unna dette, desto mer like blir mobilitetene (enten mest ladet, eller mest nøytral form), desto dårligere separasjonsmulighetene. D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 24
25 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: a ) Kapillær-sone-elektroforese (=CZE) - separasjon etter mobilitet. Viktig her at bufferen: Har god bufrings-kapasitet i ønsket ph-område (innenfor ±1 enhet fra pk) er gunstig for deteksjon av analytter f.eks. har egnet UV-absorpsjon (lite for direkte, mye for indirekte deteksjon). har lav mobilitet for å begrense strømstyrken (store lavtladede ioner) men likevel har mobilitet tilpasset analyttene for å minske toppasymmetri (elektrodispersjon) har evt. evne til (nyttig) kompleksering ph-kontroll viktig for EOF-kontroll, analytt-protoneringsgrad ( jfr. Lab.-eksperiment ) Buffere forbrukes - elektrolysen v. elektrodene (og "surgjøring ved luft- CO 2 ") : de må skiftes ofte. Obs.: Lab.-oppgaven illustrerer! D.N. Heiger, "HPCE An Introd.", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 25
26 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: a ) Kapillær-sone-elektroforese (=CZE) - separasjon etter mobilitet. Effekt av feltstyrke (spenning) : på migrasjonstid; på effektivitet 26
27 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: a ) Kapillær-sone-elektroforese (=CZE) separasjon etter mobilitet. b) Isoelektrisk fokusering, IEF (analog vanlig el.-forese) Sone-elektroforetisk analyse av amfotere ioner i en ph-gradient i kapillæret c) Gel Sone-elektroforetisk analyse av makromolekyler i en ekskluderende (størrelsesdiskriminerende) gelmatriks (kryssbundet gel el. "entangled polymers") d) MEKC Analyse av nøytrale analytter, v.h.a. ladede miceller som fungerer som en upolar fase )med sin egen elektroforetiske mobilitet i forhold til bufferen, og bufferen som den polare fasen, med sin EOF-bestemte mobilitet). En slags fordelings-kromatografi (RP-lignende) i et Kapillær-elektroforetisk system. e) ITaF Elektroforetisk analog til fortrengingskromatografi. f) Elektro-kromatografi = potensial-drevet kromatografi Kromatografi der elektroosmose brukes som MF-"pumpe". SF må ha ioniske grupper, og MF må være elektrolytt. 27
28 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: b) Isoelektrisk fokusering, IEF (analog i vanlig el.-forese) Sone-elektroforetisk analyse av zwitter-ioniske stoffer (amfotere ioner) i en ph-gradient. kapillæret skal ikke ha (minimisere) EOF og analytt-adsorpsjon Prøven introduseres i kapillæret sammen med spesialbufferen ("Ampholyte buffer", skaper ph gradienten). Med anode- og katode-buffer (hhv. sur og basisk), og spenningen slått på, "ordner bufferen seg slikt" at en ph-gradient oppstår langs kapillæret. I ph-gradienten forflytter zwitterioniske analytter seg til ph lik deres pi "fokuseres" til punktet ph = pi: - protonerte, kationer, beveger seg mot katoden i økende ph-gradient inntil de er nøytralisert til ladning 0 ved pi. - deprotonerte, anioner, beveger seg i retning anode i ph gradienten som synker inntil anionene er protonerte/ nøytraliserte til ladning 0 ved pi. Når fokuseringen er gjennomført forflyttes "hele gradienten", med de separerte analyttene i kapillæret mot detektoren (elektroforetisk eller hydrodynamisk forflytting) der elektroferogrammet fra fokuseringen registreres. Analyttene detekteres i rekkefølgen til deres pi (oppløsning ned til 0,02 pi-enhet). N.B.: Det isoelektriske punkt, pi (el. ph(i)), er ph-verdien der et molekyl (f.eks. zwitter-ion) har netto-ladning null (+ og kompenserer hverandre eksakt). 28
29 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: c) Gel-elektroforese Sone-elektroforetisk analyse av makromolekyler i en ekskluderende /størrelsesdiskriminerende gelmatriks (kryssbundet gel, el. ikke kryssbundet gel "entangled polymers") Direkte sammenlignbar med "tradisjonell" gel-elektroforese (sjikt/stav) Kapillæret skal ikke gi EOF (!!) og ikke analytt-adsorpsjon. Weston & Brown, 'HPLC & CE', (1997), editert (Kapillær-)Gel-E utviklet spesielt for makromolekyler av ulik størrelse med omtrent konstant størrelse/ladning-forhold. Der er elektroforetisk mobilitet ca. lik for alle: ingen separasjon p.g.a. elektroforetisk mobilitet alene. (nukleinsyre-polymerer, evt.sds-denaturerte proteiner/peptider). Gelen skal øke diskriminering etter størrelse slik at separasjon etter størrelse blir mulig: Små molekyler migrerer raskere/lenger enn store. Geler: f.eks. polyakrylamid, Agarose som kryssbundet gel og lineær ("entangled") polymer, (PEG'er, Me-cellulose, dextraner, m.m.) Fra D.N. Heiger, "HPCE ", Hewlett-Packard, 2nd ed., 1992 (Rel. lav følsomhet for kap.-sds-ge smlg. med klassisk G-EF. Konkurranse fra slabs, p.g.a. parallellanalyse-mulighet) 29
30 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: c) Gel-elektroforese Gene-Analyser / DNA-analyzer - dedikerte CE-systemer : (eksempler fra 1 leverandør) 1-kapillær, Fluorsc.-det: Ex.:Ar-laser 488nm & 514nm Em.: CCD-kamera 525-650nm; opt. det. for "dye Sets" El.-for 0,1-15kV 1 Kapill. 47cm x 50μm; opptil 600bp ALS, 48 el. 96 sample tubes (fra ca. 2005, ikke lenger i salg) 8-24- kapillær, Fluorsc.-det: Ex.:Sol.State-laser 505nm Em.: CCD-kamera 525-650nm; opt. det. for "dye Sets" El.-for opptil 20kV 8 el. 24 kapill., 36 cm el. 50cm; opptil 850bp ALS, 48 el. 96 sample tubes 48-96-kapillærer-"Array", Fluorsc.-det: Ex.:Sol.State-laser 505nm Em.: CCD-kamera 525-650nm; opt. det. for "dye Sets" El.-for opptil 20kV 8 el. 24 kapill. - 36 cm el. 50cm opptil 900bp ALS, 16 96- el. 384-well -plates 30
31 Zones Θ 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: MEKC- Kromatogram. d) MEKC = Micellar ElectroKinetic Chromatography Kromatografi-liknende analyse av nøytrale analytter: med en upolar fase = hydrofob "kjerne" av miceller av ladede detergensmolekyler, i nærkontakt med en polar fase, elektrolytten/bufferen. Fasene har ulik mobilitet : Micellen har EOF + micellens elektroforetiske mobilitet ; bufferen har EOF'en.' Analyttmolekyler fordeles mellom fasene etter deres polaritet, med migrasjonshastighet etter deres mengdemessige fordeling i de to "fasene" (analog kromatografi) Beckman-Coulter; 1993 En slags fordelings-kromatografi (omvendt fase-lignende) i et kapillær-elektroforetisk system. Injeksjons-side detektor-side S. Terabe, MEKC-brochure Beckman-Coulter; 1993 31
32 6.C. 7. Separasjonsprinsipper: e) ITaF (kapillær-) Isotakoforese Elektroforetisk analog til fortrengingskromatografi Enten anioner eller kationer analyseres; uten EOF; et stort prøvevolum. Prøve appliseres mellom en lede-elektrolytt (leading electrolyte) med høyeste mobilitet i systemet og en avsluttende elektrolytt (terminating electrolyte) med laveste mobilitet i systemet. analyttionene separeres mellom de to "system-bufferene" i separate soner for hvert ion, etter hverandre, ordnet etter mobilitet (høyest først, lavest sist). Når sonene med ionene har oppstått forflytter alle seg med samme hastighet ("iso-tacho") i eksperimentet. Beckman-Coulter; Intro CE 1994 Øvre kurve: differensiell ledningsevne (den deriverte av nedre kurve) Alle soner har lignende konsentrasjon av analytt, men ulike lengde (volum) avh. av analytt-mengde i prøven). Nedre kurve: ledningsevne-deteksjon Merk: tidsaksen her, mot normal : høyre venstre Beckman-Coulter; Intro CE 1994 32