Infeksiøs pankreas nekrose IPN FISKEHELSE

APRIL 2011 Temanummer Infeksiøs pankreas nekrose IPN FISKEHELSE

Fagtidsskriftet Fiskehelse INNHOLD ISBN 978-82-8208-024-8 Utgiver: Tekna Fiskehelseforeningen Faglig gruppe i Tekna www.fiskehelseforeningen.org Adresse: Tekna Fiskehelseforeningen Postboks 2312 Solli 0212 Oslo Redaksjonen Redaktør: Kjetil Korsnes kjetil.korsnes@hibo.no Redaksjonsmedarbeider: Jostein Grip jostein.grip@gmail.com Layout: Anne Edholm anne.edholm@tekna.no Infeksiøs pankreas nekrose IPN, Kjetil Korsnes, Valeria Orudzheva... 4 IPN-status per 2010, Torunn Taksdal... 5 IPN-viruset og virulensfaktorer, Ane Sandstø... 7 Patogen med nytt verktøy mot IPN-tap, Vidar Aspehaug, Magnus Devold... 18 Resistent laks endelig en løsning på IPNproblemet? Nina Santi, Thomas Moen, Eivind Isdal... 21 Vaksinering mot IPN muligheter og begrensninger, Eirik Wilkinson, Maja Bævre-Jensen...... 25 Sammenlignende studie av deteksjonsmetoder for IPNV, Tove Hansen, Inderjit Singh Marjara, Øystein Evensen... 27 Tekna Havbruk, Olav Fjeld Kraugerud...30 Skriveveiledning til fagtidsskriftet Fiskehelse... 31 Forside illustrasjon: Settefisk PatoGen 2

Annonsering i tidsskriftet Fiskehelse Fiskehelse utgis av Fiskehelseforeningen, en faglig gruppe i Tekna. Målgruppen for tidsskriftet er fiskehelsebiologer, veterinærer, konsulenter, forskere, forvaltning, oppdrettere og andre interesserte i fagfeltet. Bladet finansieres av annonser og abonnement. Pris på annonser: Helside kr 3 000 Halvside kr 1 500 Prisene er ekskl. MVA Fiskehelse inneholder faglige artikler der forskere og andre fagfolk skriver om aktuelle problemstillinger innenfor fiskehelse og akvakultur. I tillegg er det presentasjoner av mastergrader i fiskehelse og informasjon fra Fiskehelseforeningen. Henvendelser angående annonser i tidsskriftet Fiskehelse sendes til: Kjetil Korsnes kjetil.korsnes@hibo.no Abonnere på tidsskriftet Fiskehelse Ved å abonnere på tidsskriftet Fiskehelse får du aktuell informasjon om hva som foregår innenfor fagfeltet akvakultur og fiskehelse. Bladet koster kr 100 pr. utgave. Abonnement opprettholdes inntil eventuell oppsigelse. Studer fiskehelse! Profesjonsstudium i fiskehelse/akvamedisin Norge trenger flere fiskehelsebiologer Kan fisk få influensa og feber? Blir de like slappe som oss mennesker? Hvordan er det å være syk når man er fisk, og hvordan blir man frisk? Kan man vaksinere en fisk? Disse og mange andre spørsmål jobber fiskehelsebiologer med å besvare. Noen har vi funnet svar på, men det er mange gåter. Hvis du har interesse for dyrehelse, biologi og bioteknologi, og har en realfaglig bakgrunn fra videregående skole, har du gode forutsetninger for å studere fiskehelse/akvamedisin. Fiskehelsebiologer utdannes til å arbeide med biologiske problemstillinger i skjæringspunktet mellom fiskehelse, miljø, produksjon og teknologi, dermed har de en nøkkelrolle i Norges viktigste fremtidsnæring, fiskeoppdrett. Henvendelser angående abonnement sendes: Tekna Fiskehelseforeningen fiskehelse@tekna.no Skrive i tidsskriftet Fiskehelse? Er du interessert i å skrive en artikkel i tids skriftet Fiskehelse, kan du ta kontakt med redaktør. For skriveveiledning til fagtidsskriftet Fiskehelse, se s. 27. Se mer om fiskehelse på youtube.com/studerfiskehelse fiskehelse@tekna.no www.fiskehelseforeningen.org 3

Infeksiøs pankreas nekrose IPN Kjetil Korsnes* 1, Valeria Orudzheva 2 1 Universitetet i Nordland, 8049 Bodø 2 NCE Aquaculture, Kunnskapsparken i Bodø, Postboks 815, 8001 Bodø * kjetil.korsnes@uin.no Denne utgaven av Fiskehelse fokuserer på IPN som problem i lakseoppdrett, med utgangspunkt i et fagseminar arrangert av NCE Aquaculture og Senter for etter- og videreutdanning ved Universitetet i Nordland. Arrangementet foregikk i Bodø 30. november 2010. I alt var 48 deltagere fra industri, forskningsmiljøer og forvalting samlet. IPN på laks er et velkjent problem som ikke trenger noen videre presentasjon, og målsettingen med seminaret var å gjøre opp kunnskapsstatus. IPN-problematikken er fortsatt veldig aktuell for mange lakseoppdrettere i Norge. Antall IPN-utbrudd var i 2009 rekordhøyt, der diagnosen ble gitt på 223 lokaliteter. Det har ikke vært bedre i 2010, med 198 utbrudd. Det er også rapportert fra fiskehelsetjenester at IPN nå er et større problem enn tidligere. IPN fagseminaret hadde som intensjon å vise hele spektret rundt IPN fra historikk til bekjempelse. Det skulle gi faglig påfyll til dem som har problemet til daglig. På denne bakgrunn ble tema og foredragsholdere satt sammen, med en oppsummerende paneldebatt som avslutning. Torunn Taksdal fra Veterinærinstituttet gikk gjennom status på IPN-utbrudd i 2010, patologi og diagnostikk. Kristin Hjelde fra Nova Sea gikk gjennom erfaringer med IPN-utbrudd, og brukte et eksempel fra et utbrudd i 2009 som illustrasjon på hvordan sykdommen rammer selskapet. Ane Sandtrø fra Helgeland Havbruksstasjon som har arbeidet med IPN-viruset gjennom sitt doktorgradsarbeid, gikk gjennom virulens og forskjeller mellom ulike IPNV-isolat. Magnus Devold fra Patogen Analyse presenterte resultater fra et forskningsprosjekt rundt betydning av IPNV-smitte i ferskvann. Nina Santi fra Aqua Gen presenterte resultater fra avlsarbeid for økt IPNresistens. Til slutt gikk Eirik Wilkinson fra Pharmaq gjennom muligheter og begrensinger ved vaksinering mot IPN. Foredragsholderne har bidradd med artikler basert på egne foredrag til dette temanummer av Fiskehelse. Paneldiskusjonen konkluderte med at det fremdeles er for lite kunnskap om IPN-viruset, noe som har gjort det vanskelig å forutsi om eller når utbrudd kommer. Det ble også diskutert om fisken i utgangspunktet smittes i ferskvann, og at dette er årsaken til at sykdomsutbrudd kommer enten i settefiskfasen eller i sjøfasen og ikke begge steder samtidig for en fiskegruppe. Det ble dermed poengtert at i tiden rundt smoltutsett bør håndtering være så skånsom som mulig for å redusere faren for utbrudd. Kirsti Hjelde mente at det er delvis oppdrettere som er årsaken til at utbruddet oppstår. Fisken blir presset for mye, utsettes for stress og settes ut for tidlig. Ifølge Nina Santi er erfaringer med QTL-rogen veldig god, og et godt alternativ for oppdrettere som erfaringsmessig har mye IPN-problemer. Magnus Devold kommenterte at ved å undersøke biofilm vil en sannsynligvis få fram et bedre bilde av mulige smittekilder. Vedrørende vaksinering, så foreligger det ikke gode data om hvilke effekter IPN-vaksinen har på allerede infisert fisk. Det er heller ikke mulig å vaksinere seg vekk fra IPN-problemet. Det er dermed viktig å forsikre seg at fisken er virusfri før IPN-vaksinering. Det var også enighet om at det er viktig å kombinere flere tiltak, redusere stress, bruke avl, opprettholde gode hygienerutiner og ha kontroll over alle paramenter som kan ha innvirkning. Dette vil i sum hjelpe for å begrense IPN-problemet. Presentasjonene fra seminaret kan lastes ned på www.nceaquaculture.com. 4

IPN-status per 2010 Torunn Taksdal Veterinærinstituttet, Postboks 750 Sentrum, 0106 Oslo torunn.taksdal@vetinst.no IPN (infeksiøs pankreasnekrose) er en smittsom virussykdom som kan angripe flere fiskearter, men oftest laksefisk. Sykdommen ble opprinnelig beskrevet som en yngelsykdom hos ørret i Nord-Amerika tidlig på 1940-tallet. I Norge ble viruset påvist første gang i 1975, mens det første sykdomsutbruddet ble påvist i 1985. IPN-virus er et nakent, lite og robust virus. I grove trekk består IPN-virus av et mangekantet proteinskall ( kube ) som inneholder to biter av dobbelttrådet RNA. Til forskjell fra de tidlige beskrivelsene av IPN som en yngelsykdom hos ørret, opplevde man under norske oppdrettsbetingelser at sykdommen rammet atlantisk laks. Spesielt var det at også eldre fisk ble syke, oftest fra 3-6 uker etter sjøsetting og gjennom de første månedene etter sjøsetting. Utbruddene kommer nå gjennom hele ferskvannsfasen og de første månedene etter sjøsetting. Unntaksvis påvises utbrudd også seinere i sjøvannsfasen, inkludert svært få påvisninger andre året i sjø. I de aller fleste IPN-utbruddene i Norge er det laks som rammes, men også regnbueørret og sjeldnere kveite i norsk fiskeoppdrett rammes av sykdommen. Diagnostikk Sykdommen oppdages på grunnlag av økt dødelighet og at fisk svømmer unormalt ( svimere ). Noen individer kan også snurre rundt sin egen akse ( spiralsvømming ). Utvendig blir syke individer gjerne mørkere enn de friske. Ved obduksjon ses oftest gult, slimete innhold i tarm, slik som hos annen fisk som ikke spiser. Oftest ses også litt eller mye væske i bukhulen. Ved mye væske i bukhulen kan buken ble synlig utspilt, særlig hos liten fisk og særlig hos regnbueørret. For å stille diagnosen, må vevsprøver fikseres på formalin og sendes til laboratorium for histologisk og immunhistokjemisk undersøkelse. Diagnosen IPN stilles på grunnlag av både påvisning av nekrose i eksokrint pankreasvev og positiv merking for IPN-virus i nekrotisk pankreas vha immunhistokjemisk undersøkelse. Friske bærere av IPN-virus er utbredt, og det er avgjørende at IPN-diagnosen ikke stilles på bakgrunn av viruspåvisning alene. Påvisning av store mengder IPN-virus, kan indikere utbrudd av IPN, slik som f eks ved hjelp av en agglutinasjonstest med lav følsomhet eller mengdebestemmelse vha titrering i cellekultur. Mengdebestemmelser av virus vil uansett bare gi indikasjon og ikke en sikker sykdomsdiagnose. Skjult infeksjon med IPN-virus Fiskens immunrespons klarer åpenbart ikke å fjerne infeksjonen hos fiskgrupper som overlever smitte eller et sykdomsutbrudd. Dette ble kjent allerede i 1963. Siden har man påvist at stress kan reaktivere denne skjulte infeksjonen. Antall IPN-utbrudd per år I 2010 ble det ved Veterinærinstituttets laboratorier registrert IPN-utbrudd i 198 forskjellige anlegg i Norge. Av disse var fire utbrudd på regnbueørret, resten på laks. Femtifire av utbruddene var i ferskvannsanlegg og 144 i matfiskanlegg i sjø. Dette er omtrent samme fordeling som tidligere år. Antall utbrudd per år har nå i mange år vært stabilt høyt, og de siste årene (2002-2009) har det vært registrert mellom 165 og 223 sykdomsutbrudd per år. Gjennom mange år har tapene knyttet til IPN-utbruddene vært varierende, men i noen tilfeller svært høye, noe som også har vært rapportert fra flere fiskehelsetjenester i 2010. Bekjempelse IPN er anerkjent vanskelig å bekjempe, kanskje spesielt fordi IPN-viruset er så robust; det tåler blant annet både høy og lav ph, varme og tørke, og fordi viruset overlever i klinisk frisk fisk. I prinsippet er det tre hovedfaktorer som vil virke 5

sammen for å skape et sykdomsutbrudd: vert, smittestoff og miljøfaktorer. I bekjempelsesarbeidet er det viktig å tenke bredt og vurdere alle mulige tiltak innenfor disse tre generelle hovedkategoriene for sykdomsbekjempelse. Klarer man å minske betydningen av en eller flere faktorer i illustrasjonen ovenfor, blir den enkelte ringen mindre/av mindre betydning, det blir mindre overlapp mellom ringene i sentrum av illustrasjonen og derfor redusert risiko for IPN-utbrudd. Tekna - en fagforening for deg som ønsker et faglig engasjement Tekna vil fremme rekruttering, utdanning, forskning og utvikling innen teknisk-naturvitenskapelige fagområder. Tekna legger til rette for faglige og sosiale fellesskap som engasjerer våre medlemmer. Teknas medlemmer med biologisk bakgrunn har i år startet opp to nye foreninger, Tekna Biotek og Tekna Havbruk. 6 Les mer på www.tekna.no/biotek og www.tekna.no/havbruk Les mer om faglige arrangementer på www.teknakurs.no

IPN-viruset og virulensfaktorer Ane Sandtrø Helgeland Havbruksstasjon, Næringshagen i Sandnessjøen, Torolv Kveldulvsonsgt. 39, 8800 Sandnessjøen ane@havforsk.com Infeksiøs pankreas nekrose virus (IPNV) er sannsynligvis det best studerte viruset som infiserer og dreper fisk. IPNV er et fiskepatogen i familien Birnaviridae (Dobos 1995a), genus Aquaviridae. Sykdommen Infeksiøs Pankreas Nekrose (IPN) ble beskrevet allerede i 1941 og IPNV ble isolert i USA i 1957 fra brunørret (Salvelius fontinalis). IPNV ble først isolert i Norge fra atlantisk laks i 1975 (Håstein & Krogsrud 1976). I dag er det kjent at IPNV og liknende virus er spredt over hele verden og er grunnlag for sykdom i mange akvatiske arter. Tidligere var IPN kjent som en akutt, virulent og svært smittsom sykdom hvor yngel og parr var mest mottakelige. Den kliniske manifestasjonen av sykdommen har endret seg, og i dag er IPN-utbrudd vanlig i løpet av de første ukene etter startfôring av yngel, men kan også oppstå senere i ferskvannsfasen. I tillegg har antall utbrudd hos post-smolt etter overføring til sjøvann økt siden midten av 80-tallet, og dukket opp som en betydelig trussel mot økonomien til oppdrettsnæringen. Epidemiologi Dødeligheten ved et IPN-utbrudd varierer mye, fra ubetydelig til nesten 100 %. Denne variasjonen har vært knyttet både til verten (art, alder, genetikk, miljømessige stressfaktorer) og til viruset (serotype, stamme, titre, optimal temperatur for replikasjon) (Frantsi & Savan, 1971; Silim et al, 1982;. Okamoto, 1993; McAllister & Owens, 1995; Bruslind & Reno, 2000). Det er ikke kjent om utbrudd i sjøvann er et resultat av stress-mediert tilbakefall av IPN (Taksdal et al., 1998), eller om viruset stammer fra en marin kilde, siden IPNV kan infisere flere marine fisk og virvelløse arter (Hill & Way, 1995). Utspiling av buken og mørkere pigmentering er kliniske tegn på akutt IPN. Gjellene er bleke og moderat utstående øyne er vanlig. Ofte finner man ventrale blødninger, gjerne på bukfinnene, og hematokrittverdiene er lave. Det mest karakteristiske tegnet på at fisk er hardt angrepet av IPNV er korketrekkersvømming, dette forekommer mest i de siste stadiene av sykdommen. IPNV angriper hovedsakelig den Figur 1. Viser oppbyggingen av IPNV og plasseringen til de ulike virusproteinene. 7

Figur 2. Illustrasjonen viser fordelingen av genene til virusproteinene i segment A og B. eksokrine delen av pankreas, og histologiske undersøkelser viser store nekroser i dette området. Histopatologiske forandringer kan forekomme i peripankrealt fettvev, samt i ekskretoristiske og hematopoetiske deler av nyre. Nyre er det organet hvor en med størst sikkerhet kan isolere IPNV fra syk fisk (Biering,1992). Persistente infeksjoner En høy andel av fisken som overlever et IPN-utbrudd blir persistent infisert, men bærertilstanden har ingen direkte negativ innvirkning på de persistent infiserte individene. Fisk som er persistent infiserte sprer virus, men titer svinger over tid og øker i perioder med stress (Hedrick & Fryer, 1982; Mangunwiryo & Aguis, 1988; Bootland et al, 1991). I persistent infisert fisk, er virus funnet assosiert med leukocytter i blodet, hodenyre og milt, trolig i makrofager. IPNV kan replikere i adherente leukocytter isolert fra bærere, men det gir ingen lytiske infeksjoner (Johansen og Sommer, 1995). IPNV er også i stand til å indusere persistente infeksjon i cellekulturer (Hedrick et al., 1978). Mesteparten av cellene inneholder da virus, men produserer lave mengder virusantigen. De persistent infiserte cellene er motstandsdyktige mot infeksjon av homologe virus og kan kureres ved å tilsette virusnøytraliserende antiserum (Kennedy & Macdonald, 1982). Overraskende nok er det ingen sammenheng mellom tilstedeværelsen av viruset og nivået av antistoffer mot IPNV i persistent infisert fisk (Smail & Munro, 1985), og en immunisering hindrer ikke nødvendigvis etablering av en bærertilstand. Mange av mekanismene bak etablering og vedlikehold av persistente IPNV-infeksjoner fortsatt ukjente. IPNV - oppbygning og genetikk Klassifiseringen av IPNV ble gjort av Hill og Way (Hill og Way, 1995), og IPNV ble delt inn i to serogrupper. Serogruppe A inneholder 9 serotyper, mens serogruppe B inneholder en serotype av IPNV. De rekombinante virusisolatene som er brukt i dette arbeidet tilhører serogruppe A, serotype Sp. IPNV er et relativt lite virus, 60 nm i diameter. Det er et nakent virus som er omgitt av et icosahedrisk kapsid (Malsberger & Ceremi, 1963; Kelly & Loh, 1972; Dobos et al., 1977). Det at viruset mangler en ytre fettløselig kappe, gjør viruset motstandsdyktig når det gjelder fysiske og kjemiske påvirkninger. Virusgenomet består av to segmenter dobbelttrådet RNA (dsrna) (Dobos et al., 1977). Segment A er 3097 basepar (bp), mens segment B er 2784 bp (Figur 2). Segment B Segment B koder for et 90 kda stort protein, VP1 (VPvirusprotein), en RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp) (Duncan et al., 1991). Alle RNA-virus, uavhengig av replikasjon og hvilke proteiner de koder for, må kode for en RdRp som er viktig for en rekke funksjoner i replikasjonsprosessen. En slik enzymatisk funksjon finnes ikke i eukaryote celler. VP1 er funnet i renset IPNV, det vil si at RdRp finnes i infeksiøse vibrioner. Forskning har vist at VP1 finnes i vibrioner i to former; (1) som et fritt polypeptid (2) som et genom-bundet protein (det heter da VPg) (Dobos, 1995b; Clavert et al., 1991). Vanligvis er polymerasen avhengig av en primer, for eksempel en kort polynukleotide, for å starte polymeringen, men flere virus benytter RdRp som primer. På den måten er de ikke lenger avhengig av en ekstern primer. I akvatiske birnavirus fungerer VPg som primer under RNAtranskripsjonen. Segment A Kapsidet til IPN-viruset er oppbygd av strukturelle proteiner, disse proteinene betegnes som VP2 og VP3. VP2 danner det ytre kapsidet og utgjør rundt 60 % av alle virale proteiner, mens VP3 er et internt strukturelt protein assosiert med det virale genomet (Dobos, 1995a; Hjalmar- 8

Gode grunner til å være medlem i Tekna Juridisk hjelp Teknas juridiske kontor hjelper deg med alle dine spørsmål om an set telses- og arbeidsvilkår, som for eksempel oppsigelser og omorganiseringer, patenter og opphavsrett. Ring til Teknas sentral bord på 22 94 75 00 mellom kl 9 og 15 og be om å få snakke med vakthavende jurist. Lønns- og arbeidsvilkår Teknas 2000 lokale tillitsvalgte representerer medlemmene i alle saker som har med arbeidsforholdet å gjøre, og deltar i de lokale lønns forhandlingene. Tekna har avtaler om lønn og arbeidsvilkår med private, statlige og kommunale arbeidsgivere. Du som ikke er repre sentert av en lokal tillitsvalgt, kan få råd og hjelp direkte fra Teknas sekretariat. R: motstand I: strøm U= R x I P= U x I R= U=P=U 2 2 I I P Lønnsstatistikk Teknas lønnsstatistikk er det beste grunnlaget for vurdering av egen lønn. Den publiseres i november/ desember hvert år, og kun medlemmer får tilgang til hele statistikken. Jobbsøking og ansettelse Uansett om du er nyutdannet eller har jobbet noen år, så hjelper Tekna deg med å lese gjennom jobbsøknader og CV-er. Vi vurderer også din arbeidskontrakt. Bare husk å kontakte oss før du underskriver! Teknas jobbsøkerhåndbok er nyttig for alle som skal søke jobb. Siste årsstudenter får den automatisk i posten. Andre kan få den ved å kontakte oss. Bank og forsikring Gjennom Teknas samarbeidsavtale med Gjensidige får du gunstig pris på forsikringer og rentefordel på alle vanlige banktjenester. Mange sparer inn mer enn Tekna-kontingenten på å benytte medlemsrabatten. Sjekk særlig prisen på Uføreforsikring Pluss og Dødsfallforsikring. Les om tilbudet på gjensidige.no/tekna eller ring telefon 03140. Kurs og nettverk innen fagområdet ditt Tekna tilbyr kurs, konferanser og seminarer utviklet av noen av landets fremste fagfolk. Du som er medlem får selvsagt rabatt på arrangementene. Fyll ut dine faglige interesser på «Din s ide» på tekna.no for å motta kur s invitasjoner innen de fag områdene som er interessante for deg. Se kurs- og konferanseprogram på teknakurs. no. Delta i Teknas faglige grupper og foreninger, så får du et omfattende kontaktnett innen eget fagfelt, og får mulighet til å påvirke politikken innen det feltet du er opptatt av. Se oversikt på tekna.no/fag. Tidsskrifter Som medlem får du Teknisk Ukeblad og Magasinet Tekna. Studenter får også Tekna Studenten. Kontakt oss! Har du spørsmål, kontakt Tekna på 22 94 75 00 eller post@tekna.no. Husk å gi oss beskjed om endring av adresse, arbeidsgiver og andre medlemsopplysninger, slik at vi kan gi deg best mulig service. Bruk «Din side» på tekna.no, eller kontakt Teknas medlemskontor på medlem@tekna.no eller 2294 7500. Tekna Teknisk-naturvitenskapelig forening Tekna har nå over 56 000 medlemmer, og av dem er over 9 000 studenter. Teknas medlemmer har utdanning på masternivå innen teknisknaturvitenskapelige fag. 9

Figur 3. Smitteforsøk viste stor variasjon i de norske IPNV-stemmenes virulensegenskaper. son et al., 1999). Selv om det er indikasjoner på at noen VP3-epitoper blir uttrykt til overflaten av virioner er serotype spesifikke og nøytraliserende antistoffer nesten utelukkende rettet mot epitoper på VP2 (Frost et al., 1995;. Heppel et al., 1995b;. Liao & Dobos, 1995; Park & Jeong, 1996; Tarrab et al., 1995). VP2-epitoper er trolig viktig for induksjon av beskyttende immunitet in vivo, og VP2 er involvert i binding til andre celler og er assosiert med virulens (Håvardstein et al, 1990;. Frost & Ness, 1997; Labus et al, 2001; Santi et al., 2004). De to strukturelle proteinene (VP2 og VP3) er kodet for av segment A som også koder for to andre strukturelle proteiner, VP4 og VP5. Det store RNA-segmentet (A) inneholder to delvis overlappende leserammer (ORF) (Heppel et al. 1995a), og den største (106 kda) koder for et polyprotein (NH2-VP2-protease (VP4)-VP3-COOH) som deretter blir kløyvd for å gi pvp2 (forløperen til VP2), VP3 og VP4 (Duncan et al., 1987) ved en kotranslasjonell autokatalytisk prosess (Sadasiv 1995, Heppel et al. 1995). Denne prosessen er kontollert av VP4, den virale proteasen. pvp2 bearbeides videre til VP2. Funksjonen til VP4 kan ikke hindres av høye temperaturer, aminosyreanaloger eller kjente protease inhibitorer (Dobos et al.1977). Den minste leserammen (444 baser) starter 52 nukleotider oppstrøms for den andre leserammen og koder for et 17 kda arginin-rikt protein, VP5 (Heppel et al. 1995, Weber et al. 2001). VP5 er bare funnet i infiserte celler og dets funksjon er ikke kjent. VP5 er antakeligvis et medlem i Bcl-2 familien og involvert i virusets strategi for å regulere vertscellens apoptose-off system, og derved å lette virusets produksjon av nye viruspartikler (Hong et al. 2002). Santi og kollegaer viste i 2005 at IPNV induserer apoptose in vitro og in vivo uavhengig av VP5 ekspresjon (Santi et al. 2005a) og at VP5 ikke er involvert i virusets persistens og virulensegenskaper (Santi et al. 2005b). Virusprotein 2 - VP2 VP2 er det viktigste strukturelle polypeptidet hos IPNV, særlig når det gjelder immunogene funksjoner. Serotypespesifikke epitoper er knyttet til dette proteinet (Liao et al., 1995). Den høyvariable delen av VP2, aminosyre 183 335, ble opprinnelig beskrevet av Heppel (Heppel et al.,1995) og er senere bekreftet av andre (Blake et al., 2001). Dette området omfatter to hydrofile hypervariable segmenter. Hydrofile områder vil være en naturlig del av yttersiden av virionet og antageligvis viktige antigene seter. Virulens- og persistensegenskaper Det er kjent at dødeligheten etter utbrudd av IPN i yngel varierer fra under 10 % til over 90 %, og er avhengig av flere faktorer som virusstamme, mengde virus fisken ble infisert med, miljø og vert. Det impliserer at noen IPNVstammer er mer virulent enn andre. IPNV-stammer av ulike serotyper, og er svært heterogen både innen patogenisitet og på genetisk og antigen nivå (Hsu et al, 1995;. Heppell et al, 1995b; McAllister og Owens, 1995; Silim et al, 1982.). Sp serotype anses å være mer hissig enn Ab serotype (Vestergård Jørgensen & Kehlet, 1971). Undersøkelser av norske feltstammer har vist at de er nært knyttet til, eller identisk med, den norske N1-stammen, og tilhø- 10

Figur 4. Dødelighet i smitteforsøk med to ulike rekombinante isolat rniv15 (TA) og rnvi15vp2 (PA) (Santi et al, 2005). Figur 5. Dødelighet i smitteforsøk med to ulike rekombinante isolat (Santi et al, 2005). rer Sp serotype (Melby og Christie,1994). Sano og kolleger viste i 1992 at segment A er ansvarlig for virulensforskjeller mellom IPNV-serotypene (Sano et al., 1992). Det er også vist at det er virulensvariasjon hos stammer av samme serotype, forbundet med visse motiver i VP2 genet (Bruslind og Reno, 2000, Shivappa et al., 2004, Santi et al., 2004). I tillegg er virulente IPNV-stammer kjent for å miste sin virulens etter flere passeringer i cellekultur (Dorson et al, 1978;. McAllister og Owens, 1986; Santi et al, 2005c). Santi og kollegaer gjennomførte i 2004 en studie for å undersøke om det er variasjon i de norske IPNV-stammenes virulensegenskaper. Yngel av atlantisk laks ble smittet 11

Figur 6. Dødelighet i smitteforsøk med to ulike rekombinante isolat etter passering i cellekultur rnvi15p10r (TA) og rnvi15p10c (TT) (Santi et al, 2005). med ni ulike feltisolat. Noen av isolatene forårsaket høy dødelighet med uttalte skader i lever og bukspyttkjertel hos smittet fisk, mens andre gav lav dødelighet uten påvisbare skader i indre organer (figur 3). Gensekvensen for segment A av virusarvestoffet ble bestemt for alle ni virusisolatene. Sammenligning av sekvensene viste at alle virusisolatene var unike, men nært beslektet med hverandre og med andre IPNV serotype Sp stammer. Virusene var svært like i de områdene som koder for VP3 og -4, samt i de delene av genomet som ikke koder for virusproteiner. Det ble funnet store variasjoner mellom stammene på fire av aminosyrene i VP2. De høyvirulente IPNV-stammene hadde følgende motiv: aminosyrene Thr217, Ala221, Thr/Ala247 og Tyr/ His500 i VP2. Videre ble betydningen av VP2-aminosyrene 217 og 221 for IPN-virusets virulensegenskaper studert ved hjelp av rekombinante virusvarianter laget med revers genetikk teknikk. Revers genetikk innbefatter at en DNA-kopi av det virale genomet blir laget, og at virus-rna og senere komplette viruspartikler dannes fra DNA etter transfeksjon av celler med DNA-kopien. DNA, men ikke RNA, kan enzymatisk manipuleres på et laboratorium ved bruk av ulike teknikker, for eksempel kan en enkelt aminosyre i proteinet det kodes for endres. VP2-aminosyre 217 og 247 hos to høyvirulente stammer ble byttet ut med tilsvarende aminosyrer fra et lavvirulent IPNV. Vekstegenskapene til de nye variantene i cellekultur var som hos et lavvirulent virus, og de forårsaket også betydelig lavere dødelighet hos smittet fisk enn høyvirulente stammer (figur 4 og 5) (Santi et al., 2005). Etter ti passasjer av en høyvirulent virusstamme i CHSE-214 celler (Chinook Salmon Embryo Cells), ble det påvist en enkelt aminosyresubstitusjon fra Ala til Thr på posisjon 221 i VP2. Denne substitusjonen førte til sterkt redusert sykdomsfremkallende evne hos viruset, som gav 6 % dødelighet hos smittet fisk, sammenlignet med 68 % hos det upasserte viruset (figur 6) (Santi et al., 2005). Dette viser at aminosyrene 217 og 221 på VP2 bestemmer virulensen til IPNV Sp-stammer. Høyvirulente stammer koder for Thr217 og Ala221, moderat- til lavvirulente stammer har Pro217 og Ala221, mens stammer med Thr på aminosyre 221 er nesten avirulente, uavhengig av posisjon 217. Tabell 1 viser en oversikt over ulike rekombinante IPNVisolater og deres virulensmotiv. TA PA TT PT Høyvirulent Moderat virulent Lavvirulent Avirulent Tabell 1. Oversikt over ulike rekombinante IPNV-isolater og deres virulensmotiv (aminosyreposisjon 217 og 221 i VP2). Dynamikken i en IPNV-infeksjon RNA-virus er vist å ha et stort genetisk mangfold og høye mutasjonsrater (Steinhauer & Holland 1987, Domingo et al., 1998). RNA virus eksisterer ofte som quasispecies el- 12

ler svermer av virus av samme art, men med litt variasjoner i genomsekvenser. Flere biologiske aspekter kan settes i sammenheng med disse genetiske variasjonene, blant annet virulens, persistens og adaptasjon in vitro og in vivo. Persistente infeksjoner skaper en langvarig bærertilstand av viruset, uten at fisken nødvendigvis viser tegn til sykdom. At viruset adapteres vil si at det best mulig tilpasser seg omgivelsene for å overleve dette gjelder både i cellekultur og i fisk. IPN-viruset er et RNA-virus og er derfor antatt å ha høye mutasjonsrater. For å se på mutasjonsfrekvensen til IPNV i persistent infisert laks over tid ble det gjennomførte en studie hvor vi så også på sammenhengen mellom mutasjoner i flere nukleotider i aminosyreposisjoner som er vist å være viktig for virusets virulensegenskaper. Vi benyttet to ulike lavvirulente rekombinante IPNV-isolater, med henholdsvis prolin/alanin og prolin/treonin i posisjon 217/221. Dette gir isolater med moderat virulens (PA) og en avirulent profil (PT). Isolatene er genomisk identiske med unntak av posisjon 221. Yngel (0,2g) av atlantisk laks ble smittet og fulgt i syv måneder etter smitte (persistensfasen). Prøver ble tatt ut hver måned for å undersøke utviklingen i bærertilstanden hos fisken, blandingsforholdet mellom virusisolatene over tid og eventuelle mutasjoner i VP2-genet. Det ble foretatt reisolering av virus i cellekultur hver måned, samt deteksjon av IPNV ved bruk av RT-PCR, og frem til 7 måneder etter smitte var mer enn 90 % av fisken perisistent infisert. RNA fra IPNV ble isolert og sekvensert for å se hvordan IPN-viruset endret seg over tid i en persistent mutasjon. Viruset med motivet P217T221 ga en stabil persistent infeksjon, mens viruset med motivet P217A221 hadde mutert allerede ved infisering av fisken. Ved celleoppdyrkning på RTG-2 (Regnbueørret gonade celler) har isolatet mutert i posisjon 221 fra A til V. P217V221 er også et isolat som er funnet i felt, og dette funnet viser hvor lett IPNV tilpasser seg omgivelsene, adapteres og muterer. Det ble senere kjørt smitteforsøk med P217V221, og det viste Figur 7. Kormatogrammet til en fisk infisert med PA-isolat 1 måned etter smitte. Figur 8. Kormatogrammet til en fisk infisert med PT-isolat 6 måneder etter smitte. 13

Figur. 9. Relativ frekvens av aminosyrekombinasjoner i posisjon 217 og 221 - PA-infisert fisk. seg å være et avirulent virus. Resultatene fra forsøket viste at de opprinnelige, lavvirulente variantene (PA/PV/PT) dominerte i de tidlige faser etter infeksjon (mest prevalente). Kromatogrammene til de sekvenserte isolatene ble studert, og kort tid etter infeksjon var de rene, uten blandinger eller mutasjoner i noen av aminosyreposisjonene (figur 7). Senere i persistensfasen er ikke lenger kromatogrammene like rene, det har oppstått mutasjoner i virusets genom og i flere av aminosyreposisjonene ser en doble topper i kromatogrammene (figur 8). Disse doble toppene viser mutasjoner i virusets genom, og en ser flere ulike virulensmotiver komme til uttrykk samtidig. Flere av prøvene ble senere klonet og sekvensert, resultatet av dette viste samme blandingsforhold som en så i kromatogrammene. Dette viser at variasjonene en ser etter sekvensering av PCR-produktene er reelle. I forløpet av persistensfasen påvises også nye og høyvirulente virusvarianter (T217A221) som følge av mutasjoner i VP2. Dette kan skyldes en reversjon i retning av opprinnelige varianter. Særlig stor er mutasjonsraten i VP2-posisjon 217 og 221 som er viktige virulensmarkører og flere varianter kan påvises fra samme individ. Figur 9 viser den relative frekvensen av aminosyrerkombinasjoner i posisjon 217 og 221 hos fisk infisert med P217A221-isolatet. Dette viser at nye IPN virusvarianter oppstår kontinuerlig i en populasjon av persistent infiserte laks og opptrer som quasispecies, Figur 10. VP1-ekspresjon (virusreplikasjon) i TT-infisert fisk etter stressbehandling. 14

og at reversjonsmutasjoner oppstår som følge av interaksjoner i virusets genom. Samme forsøk ble også gjennomført med to rekombinante høyvirulente IPNV isolater T217A221 og T217T221. Isolatene er genomisk identiske med de lavvirulente isolatene som ble benyttet i forsøket med unntak av posisjon 217 og 221. Yngel (0,2g) av atlantisk laks ble smittet og først fulgt i seks måneder etter smitte (persistensfasen), før den ble delt i to grupper. Den ene gruppen ble utsatt for stresspåvirkning over en uke for å øke replikasjonsraten av virus in vivo. Prøver ble tatt ut hver måned i persistensfasen og ukentlig etter stresspåvirkningen for å undersøke utviklingen i bærertilstanden hos fisken, blandingsforholdet mellom virusisolatene over tid og eventuelle mutasjoner i VP2 genet. Her ble ingen mutasjoner detektert i noen av gruppene selv ikke 6 måneder etter smitte. Mest sannsynlig har disse stammene utviklet persistens uten seleksjonspress fra miljøet rundt, samt at fisken er immuntolerant mot viruset. Derimot oppstod det 28 dager etter stress en reversjon mot det høyvirulente villtype isolatet, fra T217T221 til T217A221. Det ble ikke detektert i persistent infisert fisk, men det er noen varianter som dominerer. Årsaken til dette er ikke kjent, men kan være knyttet til replikasjonseffektivitet og/eller immunitet hos fisken. Oppsummering IPNV er et robust virus med gode persistensegenskaper. Ulike IPNV-varianter oppstår kontinuerlig i en populasjon med persistent infisert laks. Det er stor variasjon i virulens mellom de ulike IPNV-isolatene, og de fleste mutasjonene skjer i virusets virulens og persistensmarkører, aminosyre 217 og 221 på VP2. En punktmutasjon i aminosyreposisjon 217 kan øke dødeligheten med opptil 70 %. I tillegg er det vist at virusets replikasjonsrate øker ved stress dette gir rom for flere mutasjoner i virusets genom. Dette betyr at en laksepopulasjon som er bærer av et lavvirulent IPNVisolat kan få sykdomsutbrudd og høy dødelighet som følge av stresspåkjenninger. Det er derfor ønskelig å minimere antall IPNV-bærere samt redusere stresspåkjenningen i laksenæringen. Dette kan gjøres ved avl, hygieniske tiltak og minimering av stress både i settefisk og matfiskproduksjon. Dette arbeidet ble utført ved Norges Veterinærhøgskole i samarbeid med Koestan Gadan, Nina Santi og Øystein Evensen. Figur 11. VP1-ekspresjon (virusreplikasjon) i TA- og TT-infisert fisk. mutasjoner i noen andre områder på genomet. Ved å se på replikasjonen til viruset ble det også vist at den øker kort tid etter en stresspåkjenning (Figur 10) og at den er nesten 1700 ganger høyere i de reverserte isolatene (T217A221) sammenlignet med det isolatet fisken opprinnelig ble infisert med (T217T221) (figur 11). Dette viser at virusreplikasjonen øker under stress og er større i høyvirulente isolater enn i mindre virulente isolater. Kromatogrammene viste også endringer i aminosyrer utenfor de kodende områder for virulensmarkørene. Det er en klar sammenheng mellom mutasjoner i nukleotideposisjon 3 i aminosyre 220 og nukleotideposisjon 1 i aminosyre 217 på VP2. Mutasjoner i nukleotide 3 i 220 vil ikke føre til noen endringer i aminosyre (synonym mutasjon), mens endring av nukleotide 1 i 217 fører til endring av aminosyre (ikke-synonym mutasjon). Dette viser at synonyme mutasjoner som ligger utenfor de kjente virulensmarkørene (217 og 221) påvirker endringsraten i disse posisjonene. Aminosyre 217 er vist å være viktig for virusets virulensegenskaper, så en endring av aminosyre i denne posisjonene vil har stor betydning for virusets virulens. Det er mange ulike muterte varianter av IPNV som forekommer samtidig Referanser Biering, E. (1992). Infeksiøs pankreaanekrose virus, et stadium av replikasjon I CHSE-214 celler og leukocytter isolert fra atlantisk laks (Salmo salar), Hovedoppgave Cand Scient UiB Blake, S., Ma, J. Y., Caporale, D. A., Jairath, S., Nicholson, B. L. (2001). Phylogenetic relationships of aquatic birnaviruses based on deduced amino acid sequences of genome segment A cdna. Dis. Aquat. Org. 45:89-102. Bootland, L. M., Dobos, P., Stevenson, R. M. W. (1991). The IPNV carrier state and demonstration of vertical transmission in experimentally infected brook trout. Dis. Aquat. Org. 10:13-21. Bruslind, L. D., Reno, P. W. (2000). Virulence comparison of three Buhl-subtype isolates of infectious pancreatic necrosis virus in brook trout fry. J. Aquat. Anim. Health 12:301-315. Calvert, J. G., Nagy, E., Soler, M., Dobos, P. (1991). Characterization of the VPg-dsRNA linkage of infectious pancreatic necrosis virus. J. Gen. Virol. 72:2563-2567. Dobos, P., Hallett, R., Kells, D. T. C., Sorensen, O., Rowe, D. (1977). Biophysical studies of infectious pancreatic necrosis virus. J. Virol. 22:150-159. 15

Dobos, P. (1995a). The molecular biology of infectious pancreatic necrosis virus. Ann. Rev. Fish Dis. 5:25-54. Dobos, P. (1995b). Protein-primed RNA synthesis in vitro by the virion-associated RNA polymerase of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 208:19-25. Domingo, E., Baranowski, E., Ruiz-Jarabo, C. M., Martín- Hernández, A. M., Sáiz, J. C., Escarmís, C. (1998). Quasispecies structure and persistence of RNA viruses. Emerg. Infect. Dis. 4:521-527. Dorson, M., Castric, J., Torchy, C. (1978). Infectious pancreatic necrosis virus of salmonids: biological and antigenic features of a pathogenic strain and of a non-pathogenic variant selected in RTG-2 cells. J. Fish Dis. 1:309-320. Duncan, R., Mason, C. L., Nagy, E., Leong, J-A., Dobos, P. (1991). Sequence analysis of infectious pancreatic necrosis virus genome segment B and its encoded VP1 protein: A putative RNA-dependent RNA polymerase lacking the Gly-Asp-Asp motif. Virology 181:541-552. Duncan, R., Nagy, E., Krell, P. J., Dobos, P. (1987). Synthesis of the infectious pancreatic necrosis virus polyprotein, detection of a virus encoded protease, and fine structure mapping of genome segment A coding regions. J. Virol. 61:3655-3664. Frantsi, C, Savan, M. (1971). Infectious pancreatic necrosis virus temperature and age factor in mortality. J. Wildlife Dis. 7:249-255. Frost, P., Håvardstein, L. S., Lygren, B., Ståhl, S., Endresen, C., Christie, K. E. (1995). Mapping of neutralization epitopes on infectious pancreatic necrosis viruses. J. Gen. Virol. 76:1165-1172. Frost, P., Ness, A. (1997). Vaccination of Atlantic salmon with recombinant VP2 of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), added to a multivalent vaccine, suppress viral replication following IPNV challenge. Fish Shellfish Immunol. 7:609-619. Hedrick, R. P., Fryer, J. L. (1982). Persistent infections of salmonid cell lines with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV): A model for the carrier state in trout. Fish Pathol. 16:163-172. Heppell, J., Tarrab, E., Berthiaume, L., Lecomte, J., Arella, M. (1995a). Characterization of the small open reading frame on genome segment A of infectious pancreatic necrosis virus. J. Gen. Virol. 76:2091-2096. Heppell, J., Tarrab, E., Lecomte, J., Berthiaume, L., Arella, M. (1995b). Strain variability and localization of important epitopes on the major structural protein (VP2) of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 214:40-49. Hill, B. J., Way, K. (1995). Serological classification of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and other aquatic birnaviruses. Ann. Rev. Fish Dis. 5:55-77. Hjalmarson, A., Carlemalm, E., Everitt, E. Infectious pancreatic necrosis virus: Identification of a VP3-containing ribonucleoprotein core structure and evidence for O-linked glycosylation of the capsid protein VP2. J. Virol. 73:3484-3490. Hong, J. R., Wu, J. L. (2002). Induction of apoptotic cell death in cells via Bad gene expression by infectious pancreatic necrosis virus infection. Cell Death Differ. 9:113-124. Hsu, Y. L., Chen, C. C., Wu, J. L. (1995). Molecular relationships in infectious pancreatic necrosis virus. Virus Res. 37:239-252. Håstein, T. Krogsrud, J.( 1976), Infectious pancreatic necrosis virus first isolation of virus from fish in Norway, Acta Vet Scan, 17, 109 111 Håvardstein, L. S., Kalland, K. H., Christie, K. E., Endresen, C. (1990). Sequence of the large double-stranded RNA segment of the N1 strain of infectious pancreatic necrosis virus: a comparison with other Birnaviridae. J. Gen. Virol. 71:299-308. Kelly, R. K., Loh, P. C. (1972). Electron microscopical and biochemical characterization of infectious pancreatic necrosis virus. J. Virol. 10:824-834. Kennedy, J. C., Macdonald, R. D. (1982). Persistent infection with infectious pancreatic necrosis virus mediated by defective-interfering (DI) virus particles in a cell line showing strong interference but little DI replication. J. Gen. Virol. 58:361-371. Labus, M. B., Breeman, S., Ellis, A. E., Smail, D. A., Kervick M., Melvin, W. T. (2001). Antigenic comparison of a truncated form of VP2 of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus expressed in four different cell types. Fish Shellfish Immunol. 11:203-216. Lai, M. Liao, L., Dobos, P. (1995). Mapping of a serotype specific epitope of the major capsid protein VP2 of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 209:684-687. Mangunwiryo, H, Aguis, C (1988). Studies of the carrier state of infectious pancreatic ecrosis virus infections in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. J. Fish Dis. 11:125-132. Okamoto, N, Tayama, T, Kawanobe, M, Fujiki, N, Yasuda, Y, Sano, T. (1993). Resistance of a rainbow trout strain to infectious pancreatic necrosis. Aquaculture 117:71-76. 16

Malsberger, R. G., Cereni, C. P. (1963). Characteristics of infectious pancreatic necrosis virus. J. Bacteriol. 86:1283-1287. McAllister, P. E., Owens, W. J. (1986). Infectious pancreatic necrosis virus: Protocol for a standard challenge to brook trout. Trans. Amer. Fish. Soc. 115, 466-470. McAllister, P. E., Owens, W. J. (1995). Assessment of the virulence of fish and molluscan isolates of infectious pancreatic necrosis virus for salmonid fish by challenge of brook trout, Salvelinus fontinalis (Mitchill). J. Fish Dis. 18:97-103. Melby, H. P., Christie, K. E. (1994). Antigenetic analysis of reference strains and Norwegian field strains of aquatic birnaviruses by the use of six monoclonal antibodies produced against the infectious pancreatic necrosis virus N1 strain. J. Fish Dis. 17:409-415. Park, J. W., Jeong, G. (1996). Identification of VP3 as an important neutralising epitope from DRT strain, a Korean isolate of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Fish Shellfish Immunol. 6:207-219. Sadasiv E.C. (1995) Immunological and pathological responses of salmoids to infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Ann Rev Fish Dis, 5, 209-225 Sano, M., Okamoto, N., Fukuda, H., Saneyoshi, M., Sano, T. (1992). Virulence of infectious pancreatic necrosis virus is associated with the larger RNA segment (RNA segment A). J. Fish Dis. 15, 283-293. Santi N, Vakharia VN, Evensen Ø (2004) Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322(1):31-40. Silim, A, Elazhary, M. A. S. Y., Lagacé, A. (1982). Susceptibility of trouts of different species and origins to various isolates of infectious pancreatic necrosis virus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 39:1580-1584. Smail, D. A., Munro, A. L. S. (1985). Infectious pancreatic necrosis virus persistence in farmed Atlantic salmon (Salmo salar). In: Fish and Shellfish Pathology (ed.by A. E. Ellis), pp 277-288. Academic Press. Steinhauer D.A., Holland J.J. (1987.) Rapid evolution of RNA viruses. Annu Rev Microbiol. 41:409-33. Taksdal, T., Ramstad, A, Stangeland, K, Dannevig, B. H. (1998). Induction of infectious pancreatic necrosis (IPN) in covertly infected Atlantic salmon, Salmo salar L., postsmolts by stress exposure, by injection of IPN virus (IPNV) and by cohabitation. J. Fish Dis. 21:193-204. Tarrab, E., Berthiaume, L., Grothé, S., O Connor-McCourt, M., Heppell, J., Lecomte, J. (1995). Evidence of major neutralizable conformational epitope region on VP2 of infectious pancreatic necrosis virus. J. Gen. Virol. 76:551-558. Vestergård Jørgensen, P. E., Kehlet, N. P. (1971). Infectious pancreatic necrosis (IPN) viruses in Danish rainbow trout. Their serological and pathogenic properties. Nord. Vet. Med. 23:568-575. Weber, S., Fichtner, D., Mettenleiter, T. C., Mundt, E. (2001). Expression of VP5 of infectious pancreatic necrosis virus strain VR-299 is initiated at the second in-frame start codon. J. Gen. Virol. 82:805-812. Santi N, Sandtrø A, Sindre H, Song H, Hong JR, Thu B, Wu JL, Vakharia VN, Evensen Ø (2005a). Infectious pancreatic necrosis virus induces apoptosis in vitro and in vivo independent of VP5 expression. Virology. 10;342(1):13-25 Santi N, Song H, Vakharia VN, Evensen Ø. (2005b) Infectious pancreatic necrosis virus VP5 is dispensable for virulence and persistence. J Virol. 79(14):9206-16. Song H, Santi N, Evensen O, Vakharia VN. (2005c) Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. J Virol. 79(16):10289-99 Shivappa, R. B., Song, H., Yao, K., Aas-Eng, A., Evensen, Ø., Vakharia, V. N. (2004). Molecular characterization of Sp serotype strains of infectious pancreatic necrosis virus exhibiting differences in virulence. Dis. Aquat. Org. 61:23-32. 17

PATOGEN MED NYTT VERKTØY MOT IPN-TAP Vidar Aspehaug* 1, Magnus Devold 1 1 PatoGen analyse AS, Serviceboks 9, 6025 Ålesund *vidar.aspehaug@patogen.no Mer enn 50 settefiskanlegg med tilhørende matfisklokaliteter overvåkes i dag etter PatoGens overvåkingsmodell for å identifisere og evaulere tiltak i kampen mot IPN. I et nylig avsluttet forskningsprosjekt ble det påvist at IPN-smitte innebærer risiko for sykdom uavhengig av virusvariant, og at husstammer er en betydelig utfordring i norske settefiskanlegg. Videre er introduksjon av virus fra stamfisk en sannsynlig risiko som det bør tas høyde for. Grunnlaget for overvåkningsmodellen som benyttes ble lagt i prosjektet: Detection, characterization and differentiation of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) strains in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.), hvor betydningen av ulike varianter av IPN-viruset ble studert, samt at smitteveiene for viruset gjennom produksjonssyklusen av laks ble kartlagt med nye metoder. En sentral konklusjon i prosjektet er at selv om det er sannsynlig at IPN-viruset kan overføres fra stamfisk, så at det er husstammer av viruset som utgjør det største problemet i norske settefiskanlegg. Innlegg av IPN-fri rogn vil kun gi gode resultater dersom anlegget også får kontroll med sin husstamme. Som et viktig verktøy i prosessen med å få kontroll med smittekilden i settefiskanlegg brukes genetiske sporingsverktøy som PatoGen utviklet i prosjektet. Med dette verktøyet kan PatoGen identifisere smittekilder og smutthull for introduksjon av viruset, slik at anleggene får langt bedre kontroll med prosessen og sin smittestatus, og kan sette inn målrettede tiltak for å kvitte seg med IPN-viruset. Anlegg som klarer å bli kvitt husstammen anbefales å legge inn IPNV-testet rogn for å redusere risikoen for ny introduksjon av viruset. Settefisk PatoGen Skotske IPN-erfaringer Utgangspunktet for arbeidet med å kartlegge smitteveiene til IPN-viruset i mer detalj var veterinær Trude Bakke Jøssund sine tanker om forekomst av såkalte husstammer i settefiskanlegg. Erfaringer fra Skottland med bruk av stamfiskscreening for å luke vekk infiserte foreldre ble tatt til inntekt for at Skottland hadde en bedre IPN-situasjon enn Norge. Resultatene av innstsen var likevel ikke så bra som metoden skulle tilsi. PatoGen gikk derfor videre med teorien om at det finnes husstammer i settefiskanleggene. Og resultatene fra prosjektet støttet teorien om husstammer. En rekke settefiskanlegg i Norge har husstammer, og det vil ha lite for seg å bruke ressurser på smittefri rogn til slike anlegg dersom en ikke gjennomfører en grundig desinfeksjon av anlegget først. Erfaringer fra flere anlegg det siste året har vist at slik desinfeksjon er fullt mulig, og at det er en effektiv måte å kvitte seg med problemet på. Som et virkemiddel for å unngå ny introduksjon vil stamfisk screening kunne være et viktig verktøy. Ferskvannsvirus Resultatene så langt tyder nemlig på at IPN-viruset utelukkende kommer fra ferskvann, og smitten skjer i settefiskanlegget. Smittet fisk får utbrudd før eller siden. De genetiske slektskapsanalysene har vært et sentralt verktøy for å lære mer om viruset, og gjør at det er mulig å hente mye informasjon fra virusets arvestoff som kan indikere både smittevei og smittekilde. Verktøyet brukes blant annet til å evaluere effekten av igangsatte tiltak, og vi kan med stor sikkerhet slå fast om det er en husstamme som turnerer fra et år til det neste i et settefiskanlegg, eller om anlegget plages med gjentatte introduksjoner. Det genetiske sporingsverktøyet brukes i dag av alle Pato Gens kunder som foretar systematisk oppfølging av IPN-smitte og evaluering av tiltak i sine anlegg. 18

kraftige nyheter Les mer på www.ewos.no 19

Forskningsprosjektet som nå er avsluttet var delfinansiert gjennom Norges forskningsråds FUGE-program, og var et samarbeid mellom Norges veterinærhøgskole, Høgskolen i Ålesund, Sisomar AS, Flatanger Settefisk AS, Marine Harvest Norway AS, Aqua Gen AS og PatoGen Analyse AS. IPN-fakta: IPNV hører til akvatiske birnavirus i familien Birnaviridae. Viruset er svært motstandsdyktig mot fysiske og kjemiske påvirkninger. Overlever ensilasje, UV-lys, tørrlegging og temperaturer fra -80 til +20 grader. Viruset rammer laks, ørret og kveite, men også torsk kan bli syk. Viruset ble isolert i cellekultur i 1958 som det første fiskesykdomsframkallende virus. Første norske utbrudd i 1985. Dødeligheten under et utbrudd varierer fra svært lav til over 90 %. Hos regnbueørret og bekkerøye smitter IPN fra stamfisk til yngel. Dette gjelder trolig også for atlantisk laks. Stort problem i settefiskanlegg og i den første tiden etter sjøutsett. Slik kan du forebygge mot IPN: Hindre at smittede og usmittede smoltgrupper settes sammen på ny brakklagt lokalitet. Bruk smittefri rogn og unngå å introdusere infisert materiale til settefiskanlegget. Infiserte anlegg må gjennom grundig rengjøring og desinfeksjon for å unngå nye utbrudd. Det vil hindre smitte mellom ulike innsett i settefiskanlegg. Ha god hygiene under klekkingen og fjern død rogn og rognskall. Ha gode desinfeksjonsrutiner ved deling av utstyr, gjen bruk av utstyr og før flytting av fisk internt i anlegg. Godt smittehygienisk skille mellom ulike enheter og kar for å unngå spredning ved eventuell påvisning av IPN i enkeltenheter. Kilde: www.patogen.no Mer smolt Bedre smolt ATPase-analyse Legemidler Økt kontroll Treff smoltvinduet Ubrutt kjølekjede Full sporbarhet 20 Europharma as salg@europharma.no www.europharma.no Telefon: 76 06 09 30 Telefaks: 76 06 09 40