AdnaTest BreastCancerDetect RT-PCR-sett for påvisning av brystkreft-assosiert genekspresjon i anrikede tumorceller Til bruk i in vitro-diagnostikk Brukerhåndbok T-1-509
Innhold Bestillingsinformasjon... 3 Bruksområde... 3 Forkortelser og symboler... 4 Patenter og registrerte varemerker... 5 Produktbeskrivelse... 5 Settkomponenter... 6 Nødvendige tilleggsmaterialer... 7 Oppbevaring... 8 Informasjon om bruk... 9 Advarsler og forsiktighetsregler knyttet til in vitro-diagnostisk bruk... 10 Protokoll... 11 A. Klargjøring av Dynabeads Oligo(dT) 25... 11 B. mrna-isolering... 12 C. Revers transkriptase... 14 D. Multiplex-PCR... 16 E. Fragmentanalyse... 18 Ytelseskarakteristikker... 21 Feilsøking... 21 Hurtigveiledning... 22 2
Bestillingsinformasjon Du finner bestillingsinformasjon på www.qiagen.com og www.adnagen.com. I tillegg vil supportteamet fra QIAGEN Hannover svare på spørsmål angående AdnaTest (support@adnagen.com). Bruksområde brukes til analyse av brystkreftassosiert genekspresjon i immunmagnetisk anrikede tumorceller ved revers transkripsjon og PCR og skal brukes til in vitrodiagnostikk. AdnaTest BreastCancerSelect blir brukt til anriking av sirkulerende tumorceller fra perifert blod. 3
Forkortelser og symboler AdnaMag-S Konsentrator for magnetiske partikler (Small) bp Basepar cdna Komplementær deoksyribonukleinsyre C+ Positiv kontroll C- Negativ kontroll DNA Deoksyribonukleinsyre dntp-er Deoksynukleotidtrifosfater GA733-2 Gastrointestinal tumorassosiert antigen 733-2 Her-2 Human epidermal vekstfaktorreseptor 2 mrna Budbringer-ribonukleinsyre Muc-1 Muc-1-gen PCR Polymerasekjedereaksjon RNase Ribonuklease o/min Omdreininger per minutt RT Revers transkriptase Skal brukes innen Temperaturbegrensning Katalognummer Se informasjonen i håndboken Produsent Medisinsk utstyr for in vitro-diagnostikk 4
Patenter og registrerte varemerker Denne testen krever lisenser fra Hoffmann-La Roche AG, Basel. Kjøp av AdnaTests tillater ikke brukeren å utføre PCR uten lisens. Dynabeads er et registrert varemerke som tilhører Invitrogen og Life Technologies Corporation. Varemerkene Sensiscript og HotStarTaq er registrert av QIAGEN, Hilden. LabChip er et amerikansk-registrert varemerke som tilhører Caliper Technology Corp. Produktbeskrivelse inneholder Oligo (dt) 25 -belagte kuler for isolering av mrna fra lysatet av forhåndsanrikede tumorceller. Revers transkripsjon gir cdna som deretter brukes som templat for påvisning av tumorceller og karakterisering av Multiplex-PCR. PrimerMix BreastDetect gjør det mulig med amplifikasjon av tre tumorassosierte antigener og ett kontrollgen. Primerne genererer fragmenter med følgende størrelser: GA733-2: 395 bp Muc-1: 299 bp Her-2: 265 bp Aktin: 120 bp (intern PCR-kontroll) Merk: Fragmentstørrelser kan variere noe. Bruk positiv kontroll (C+) 9 for tildeling av de påviste signalene. 5
Settkomponenter inneholder følgende komponenter: Tabell 1. Settkomponenter Komponent Lysis/Binding Buffer (lyserings-/bindingsbuffer) Symbol T-1-509 (12 tester) 3 1 Dynabeads Oligo(dT) 25 4 1 Buffer A 5 1 Buffer B 6 1 10 mm Tris-HCl 7 1 PrimerMix BreastDetect 8 1 Positive Control (C+) (positiv kontroll (C+)) 9 1 Det er tilstrekkelig med reagenser til å analysere 6 PCR-kontroller og 12 blodprøver. 6
Nødvendige tilleggsmaterialer Utstyr: Vorteksmikser for 1,5 ml rør Konsentrator for magnetiske partikler AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, katalognr. T-1-800) Termoblokk eller et vannbad (50 C) Termosykler med oppvarmet lokk og en oppvarmingshastighet på 2 C/s. Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) Materiale: Sterile, RNase-frie 0,2 ml PCR-rør med tynn vegg Sterile, RNase-frie 1,5 ml reagensrør (f.eks. Sarstedt, katalognr. 72.690) Pipetter og RNase-frie pipettespisser med aerosolbarriere, egnet for pipetteringsvolumer fra 1 µl til 200 µl Vernehansker 7
Reagenser: Sensiscript-sett for revers transkripsjon (QIAGEN, katalognr. 205211, 50 reaksjoner) Merk: Sensiscript-sett for revers transkripsjon (katalognr. 205211) rekker kun til 25 prøver fordi det kreves dobbelt volum for hver reaksjon. Rekombinant RNAsin, RNase-hemmer, 2500 E (Promega, katalognr. N2511) HotStarTaq Master Mix-sett (QIAGEN, katalognr. 203443, 250 E) Oppbevaring skal oppbevares ved 4 8 C. Esken med PrimerMix BreastDetect 8 og positiv kontroll (C+) 9 skal imidlertid oppbevares ved maks. 20 C. Primerblandingen bør alikvoteres for å unngå mulig kontaminering og gjentatte temperaturendringer. Ingen komponenter skal brukes etter utløpt holdbarhetsdato. 8
Informasjon om bruk Hvis det er ytre skader på settets eske eller enkeltkomponenter, kan du kontakte QIAGEN Technical Services (se www.qiagen.com for kontaktinformasjon). Testen må utføres av personell med kompetanse innen molekylær-biologiske teknikker. Alle komponenter og ekstra reagenser som leveres fra andre leverandører, må oppbevares i henhold til instruksjonene. Følg sikkerhetsrådene fra de aktuelle produsentene. Bruk vernehansker for å unngå kontaminering med DNA, RNA og RNaser. Testen må utføres i angitt rekkefølge og må overholde alle spesifikasjoner angitt i forbindelse med inkubasjonstider og -temperaturer. Utfør prøvebehandling inkl. revers transkripsjon og påfølgende analyse av amplifiserte PCR-produkter i ulike rom om det er mulig, for å unngå krysskontaminering. Bruk av produkter fra andre leverandører enn de som er foreslått, kan føre til resultater av dårligere kvalitet. 9
Advarsler og forsiktighetsregler knyttet til in vitrodiagnostisk bruk Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Se gjeldende sikkerhetsdatablader (SDS) hvis du ønsker mer informasjon. Disse er tilgjengelige i praktisk og kompakt PDF-format på www.qiagen.com/safety, der du kan søke etter, vise og skrive ut sikkerhetsdatabladet for hvert QIAGEN-sett og hver settkomponent. Kast prøve- og analyseavfall i henhold til lokale sikkerhetsprosedyrer. 10
Protokoll Del A til C beskriver isolering av mrna og revers transkripsjon, og del D til F omhandler Multiplex-PCR og fragmentanalyse. A. Klargjøring av Dynabeads Oligo(dT) 25 1. Stabiliser lyserings-/bindingsbuffer 3 til romtemperatur. Merk: Sjekk at lyserings-/bindingsbuffer ikke inneholder bunnfall. Hvis det blir observert bunnfall, må bufferen stabiliseres til romtemperatur og blandes til den er fullstendig oppløst. 2. Resuspender Dynabeads Oligo(dT) 25 4 grundig ved pipettering før bruk. Skal ikke blandes i vorteksmikser! 3. Beregn volumet av kulene som trengs for alle prøver som skal behandles (20 µl per prøve pluss 10 %), og overfør det beregnede volumet til et RNase-fritt 1,5 ml reagensrør. 4. Sett røret inn i AdnaMag-S. Merk: Magnetskyveenheten til AdnaMag-S kan settes inn i to posisjoner. Skyveenheten må alltid settes inn med den hvite plastfilmen vendt fremover, slik at magnetene kommer nær reagensrørene. 5. Fjern supernatanten med en pipette etter 1 min. 11
6. Vasking a. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. b. Tilsett originalvolumet (trinn 3) med lyserings-/bindingsbuffer 3, og resuspender kulene ved gjentatt pipettering. Resuspender forsiktig for å unngå skumming. c. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S. d. Fjern supernatanten helt etter 1 min. Gjenta én gang (to vaskinger totalt). 7. Fjern røret fra AdnaMag-S, og resuspender kulene i lyserings-/ bindingsbuffer 3 til originalvolumet (se trinn 3). B. mrna-isolering Klargjøring: 1. Stabiliser vaskebuffer A 5 og vaskebuffer B 6 til romtemperatur. 2. Legg 10 mm Tris-HCl 7 på is. 3. Tin RNase-fritt vann (del av Sensiscript-sett for revers transkriptase, QIAGEN). 4. Reguler en termoblokk eller et vannbad til 50 C. 12
Behandling: 1. Tilsett 20 µl Dynabeads Oligo(dT) 25 (trinn A7) til hvert rør som inneholder cellelysat (brukerhåndbok for AdnaTest Breast- CancerSelect, trinn B16). 2. Roter rørene langsomt (ca. 5 o/min) i 10 minutter ved romtemperatur på en enhet med både vippe- og dreiefunksjon. 3. Sett rørene inn i AdnaMag-S uten magnetskyveenhet. Snu AdnaMag-S nedover for å frigjøre kuler og væske som er fanget i overdelen. 4. Sett inn magnetskyveenheten, og fjern supernatantene etter 1 min. 5. Vask A a. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. b. Tilsett 100 µl vaskebuffer A 5 til hvert rør, og resuspender kulene ved gjentatt pipettering. Skyll korken og rørveggen grundig for å unngå tap av kuler. c. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S. d. Fjern supernatanten helt etter 1 min. Gjenta én gang (to vaskinger totalt). 6. Vask B a. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. b. Tilsett 100 µl vaskebuffer B 6 til hvert rør, resuspender kulene ved pipettering, og overfør dem i nye 1,5 ml reagensrør. c. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S. d. Fjern supernatanten helt etter 1 min. Dette trinnet må utføres nøye (følg med på pelleten) siden kulene kan gli og bli fjernet ved en feiltakelse. 13
Gjenta en gang i de samme reagensrørene (to vasker totalt). 7. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. 8. Tilsett 100 µl iskald 10 mm Tris-HCl 7 til hvert rør, og resuspender kulene ved gjentatt pipettering. 9. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S. 10. Fjern supernatantene helt etter 1 min. 11. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. 12. Resuspender mrna/kule-kompleks i 29,5 µl RNase-fritt vann. 13. Overfør rørene til en termoblokk eller et vannbad, og inkuber i 5 minutter ved 50 C. 14. Legg rørene på is umiddelbart i minst 2 min. 15. Fortsett umiddelbart (innen 5 minutter) med revers transkripsjon (del C). mrna/kule-komplekset skal ikke oppbevares! C. Revers transkriptase (Sensiscript-sett for revers transkriptase, QIAGEN) 1. Tin 10 buffer RT og dntp-er ved romtemperatur, bland i vorteksmikser, sentrifuger kort, og oppbevar på is. Klargjør RT Master Mix på is. 2. RT Master Mix klargjøres som vist i tabell 2 i henhold til antall prøver. 14
Volumet av Master Mix skal beregnes 10 % større enn nødvendig for det totale antallet reaksjoner med revers transkripsjon. En negativ kontrollreaksjon uten tilsetning av mrna må alltid være klargjort (RT-kontroll). 3. Vorteks RT Master Mix, sentrifuger kort, og pipetter 10,5 µl for hver reaksjon i 0,2 ml PCR-rør. 4. Resuspender mrna/kule-komplekser (trinn B14) forsiktig med en pipette. Overfør det totale volumet til 0,2 ml PCR-reagensrør som inneholder RT Master Mix. Bland grundig ved gjentatt pipettering. Tabell 2. Revers transkriptase Komponent RT Master Mix Prøver Sensiscript-sett for revers transkriptase (QIAGEN) Volum 10 buffer RT 4,0 µl dntp-er 4,0 µl Sensiscript revers transkriptase (SRT) 2,0 µl RNase-hemmer, 40 U/µl (Promega) 0,5 µl mrna/kule-kompleks eller RT-kontroll (RNase-fritt vann) hver (1) : 29,5 µl Totalt volum 40,0 µl 1) Merk: Som RT-kontroll skal det legges til 29,5 µl RNase-fritt vann i stedet for mrna/kule-kompleks. Volumet av mrna/kulekomplekset kan variere noe. Bruk uansett hele volumet til revers transkripsjon! 15
5. cdna blir syntetisert i en termosykler under følgende betingelser (tabell 3). Tabell 3. RT-program 37 C 60 min 93 C 5 min 4 C 6. Legg reagensrør med cdna på is, eller oppbevar dem ved maks. 20 C i maks. 4 uker. D. Multiplex-PCR 1. Tin HotStarTaq Master Mix (QIAGEN), positiv kontroll (C+) 9, PrimerMix BreastDetect 8 og RNase-fritt vann, vorteks, sentrifuger raskt, og oppbevar på is. 2. PCR Master Mix klargjøres som vist i tabell 4 i henhold til antall prøver. Volumet av Master Mix bør være minst 10 % større enn det kravet som er beregnet fra antall prøver. Vær oppmerksom på at en positiv kontroll (C+) 9, RNase-fritt vann som negativ kontroll (C-) og RT-kontrollen alltid må være inkludert. 3. For hvert preparat skal 42,0 µl av Master Mix pipetteres til 0,2 ml PCR-reagensrør. Resuspender cdna/kule-blanding ved pipettering, og tilsett 8,0 µl av den til hvert reagensrør. Merk: Som negativ kontroll skal det legges til 8,0 µl RNase-fritt vann i stedet for cdna. 16
Tabell 4. Klargjøring av Multiplex-PCR Komponent PCR Master Mix Prøver Volum HotStarTaq Master Mix 25,0 µl RNase-fritt vann 13,0 µl PrimerMix BreastDetect 8 4,0 µl cdna eller RT-kontroll eller Negativ kontroll (RNase-fritt vann) eller Positiv kontroll (C+) 9 hver: 8,0 µl Totalt volum 50,0 µl En termosykler blir brukt til PCR i henhold til programmet som er beskrevet i tabell 5. Kjør termosykleren med en rampe på 2 C per sekund. PCR blir utført med totalt 35 sykluser. Tabell 5. PCR-program 95 C 15 min 94 C 30 sek 60 C 30 sek 72 C 60 sek 72 C 10 min 4 C 35 sykluser 17
E. Fragmentanalyse Agilent 2100 Bioanalyzer Det anbefales å utføre analyse med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) på en DNA 1000 LabChip. Følg instruksjonene i brukerhåndboken til DNA 1000 LabChip, og sørg for at ingen kuler overføres til LabChip. Magnetiske kuler i gelen kan føre til falske resultater. Start Bioanalyzer-programvaren 2100 expert. Under Contexts (Kontekster) velger du Instrument og klikker på knappen Assay (Analyse) ved siden av Assay selection (Valg av analyse). Velg electrophoresis > DNA 1000 Series II.xsy (elektroferese > DNA 1000 Series II.xsy). Klargjør brikken, og start analyseringen. Angi en terskel for påvisning, slik det er beskrevet nedenfor, for å evaluere resultatene: Under Contexts (Kontekster) velger du først Data, deretter fanen Assay Properties (Analyseegenskaper). På høyre side velger du Global og Normal fra rullegardinmenyen. Velg Sample Setpoints > Integrator > height threshold (FU) (Innstillingspunkter for prøver > Integrator > høydeterskel (FU)), og angi denne verdien til 0 (standardverdi er 20 ) for å registrere alle signaler. 18
Evaluering Testen anses som positiv dersom et PCR-fragment av minst ett tumorassosiert transkript tydelig påvises. Topper med en konsentrasjon på 0,15 ng/µl er positive (fig. 1). Fragmentet av kontrollgenet aktin må påvises i alle pasientprøver (intern PCR-kontroll). Et aktinsignal gir en positiv kontroll for en vellykket celleseparasjon, revers transkripsjon og Multiplex-PCR. Negativ kontroll og RT-kontrollprøver må ikke vise noen større bånd enn 80 basepar (primerdimere). Et fragment som er større enn 1 kb, indikerer kontaminering med genomisk DNA. Separasjonsprosessen var ikke vellykket, og resultatene må kasseres hvis et slikt fragment blir påvist. Eventuelle avvik fra protokollen kan føre til falskt negative eller falskt positive resultater. 19
DNA-stige Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Negativ kontroll (C-) Positiv kontroll (C+) Basepar 1500 1000 850 700 500 400 GA733-2 300 Muc-1 Her-2 200 150 100 Aktin 50 15 Figur 1. -resultater fra prøver analysert med en Agilent 2100 Bioanalyzer Det første feltet viser DNA-størrelsesstandarden (DNA-stigen). Prøve 1 er positiv for GA733-2, Muc-1 og Her-2, prøve 3, 4 og 5 er positive for GA733-2 og Muc-1, og prøve 2 er negativ. Signaler påvist i prøve 6 er kun positiv for GA733-2. Aktin er påvist i prøve 1 til 6. PCR-negativ (C-) og positiv kontroll (C+) vises i de siste to feltene. 20
Ytelseskarakteristikker Se www.qiagen.com/hb-2109-d01 for ytelseskarakteristikker for. Feilsøking En feil i genekspresjonsanalyser kan ha ulike årsaker. Det er viktig at alle analysetrinn alltid utføres nøyaktig i henhold til bruksanvisningen. Hvis det fortsatt oppstår problemer, kan du se: www.adnagen.com og laste ned feilsøkingsveiledningen i produktdelen. Ta kontakt med supportteamet hvis problemene vedvarer. 21
Hurtigveiledning Komponenter Du trenger Lysis/Binding Buffer 3 (lyserings-/bindingsbuffer) Oligo(dT) 25 Beads 4 (Oligo(dT) 25 -kuler) Buffer A 5 Buffer B 6 10 mm Tris-HCl 7 PrimerMix BreastDetect 8 Positive Control (C+) 9 (positiv kontroll (C+)) 0,2 ml PCR-rør 1 1,5 ml reagensrør per prøve pipetter og spisser (RNase-frie) for 1 200 µl Sensiscript RT-sett (QIAGEN) HotStarTaq Master Mix-sett (QIAGEN) Protokoll Stabiliser 3, 5 og 6 til romtemperatur, og legg 7 på is. Vask 20 µl Oligo(dT) 25 -kuler 4 per prøve 2 med 20 µl lyserings-/ bindingsbuffer 3 per prøve. Tilsett 20 µl vaskede Oligo(dT) 25 -kuler 4 til hver prøve. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur med vipping og rotasjon ved ca. 5 o/min. Plasser reagensrøret i AdnaMag-S, og fjern supernatanten. 22
Vask kuler med 2 100 µl buffer A 5. Viktig: Skyll korken og rørveggen grundig for å unngå tap av kuler. Resuspender kuler i 100 µl buffer B 6, og overfør dem til et nytt 1,5 ml rør. Vask kuler med 1 100 µl buffer B 6. Vask kuler med 1 100 µl Tris-HCl 7. Resuspender kuler i 29,5 µl RNase-fritt vann. Inkuber i 5 min ved 50 C, og legg på is i minst 2 min. Fortsett med revers transkripsjon; se tabell 7 og tabell 8. Tabell 6. Revers transkriptase Komponent RT Master Mix Prøver Sensiscript-sett for revers transkriptase (QIAGEN) Volum 10 buffer RT 4,0 µl dntp-er 4,0 µl Sensiscript revers transkriptase (SRT) 2,0 µl RNase-hemmer, 40 U/µl (Promega) 0,5 µl mrna/kule-kompleks eller RT-kontroll (RNase-fritt vann) hver (1) : 29,5 µl Totalt volum 40,0 µl 1) Merk: Som RT-kontroll skal det legges til 29,5 µl RNase-fritt vann i stedet for mrna/kule-kompleks. Volumet av mrna/kulekomplekset kan variere noe. Bruk uansett hele volumet til revers transkripsjon! 23
Tabell 7. RT-program 37 C 60 min 93 C 5 min 4 C Fortsett med Multiplex-PCR (tabell 9), eller oppbevar cdna ved maks. 20 C i maks. 4 uker. Tabell 8. Klargjøring av Multiplex-PCR Komponent PCR Master Mix Prøver Volum HotStarTaq Master Mix 25,0 µl RNase-fritt vann 13,0 µl PrimerMix BreastDetect 8 4,0 µl cdna eller RT-kontroll eller Negativ kontroll (RNase-fritt vann) eller Positiv kontroll (C+) 9 hver: 8,0 µl Totalt volum 50,0 µl PCR blir utført med totalt 35 sykluser. Tabell 9. PCR-program 95 C 15 min 94 C 30 sek 60 C 30 sek 72 C 60 sek 72 C 10 min 4 C 35 sykluser Til fragmentanalyse kan du bruke Agilent 2100 Bioanalyzer. 24
HB-2109-NO QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D-40724 Hilden TYSKLAND Hvis du trenger hjelp, ring Telefonnr.: +49 (0) 511 72 59 50-50 Faksnr.: +49 (0) 511 72 59 50-40 E-post: support@adnagen.com Internet: www.adnagen.com og www.qiagen.com