Preanalyse Kurs i Molekylærpatologi Oslo, 07.-08. juni 2017 Heidemarie Svendsen Bioingeniør Enhet for molekylærpatologi Avdeling for Patologi Oslo Universitetssykehus Innhold Prøvemateriale Preparering og forbehandling av prøvemateriale Ekstraheringsmetoden Prøvekvalitet Feilkilder Framtiden 1
Prøvemateriale FFPE Ferskt /frosset vev Blod/ benmarg Cellesuspensjon Kroppsvæsker Buccal swab Urin Plasma Preparering og forbehandling FFPE Begrenset tumorvev i blokk eller analysen krever en viss andel tumorceller Patolog merker HE snitt Merket område skrapes fra blokk eller ufarget parafinsnitt 2
Preparering og forbehandling FFPE Hele snitteflaten kan brukes 2-3 snitt à 10-20µm med sledemikrotom Unngå å snitte på vann pga fare for kontaminering! Hele ufargede snitt skrapes fra objektglass Preparering og forbehandling FFPE Materialet overføres til mikrorør Parafinen fjernes Deparafineringsløsning Smelting av parafin Materialet lyseres i buffer og fordøyes med proteinase-k ved 56 C Kryssbindinger med formalin brytes opp ved inkubasjon med høy temperatur over en viss tid DNA 90 o C, 1h RNA 80 o C, 15 min 3
Preparering og forbehandling ferskt frosset vev Snittes med frysemikrotom (2-3 snitt à 40µm) eller med skalpell (ca 5mg vev) Materialet overføres til mikrorør Tissue-tek fjernes med PBS DNA: Materialet lyseres i buffer og fordøyes med proteinase-k ved 56 C RNA: Materialet homogeniseres med tissue Rupter Preparering og forbehandling Blod/ benmarg RNA-analyser krever at erytrocyttene fjernes Materiale skal være på laboratorium innen 24h Leukocyttpellet (helst innen 24-48 h) Lysering av røde blodceller med lysisbuffer pellet 1x10 7 celler MonoNukleæreCeller (ikke eldre en 24h og romtemarert) Fjerning av røde blodceller og granulocytter med lymfoprep plasma MNC Lysering av hvite blodceller for å frigjøre DNA og RNA erytrocytter, granulocytter 4
DNA/ RNA-ekstrahering Magnetkuler (automatisert) Kolonner (automatisert og manuell) EZ1 DNA Blood Handbook 04/2010 QIAsymphony DSP DNA Instructions for Use (Handbook) 08/2015 QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook 05/2016 Ekstrahering av både DNA og RNA fra samme utgangsmateriale Kolonne (automatisert og manuell ) AllPrep DNA/RNA Mini Handbook 11/20053 5
Kvalitet DNA / RNA Måling av DNA /RNA konsentrasjon Spectrophotometer Fluorometer NanoDrop Kvalitetsanalyser Referanse gen som er sjeldent påvirket av tumor Qubit RIN ( RNA Integrity Number) RNA kvalitet RNA Integrity Number Intakt RNA Delvis degradert RNA Degradert RNA 6
DNA eller RNA? Analysene avgjør om DNA, RNA eller både DNA og RNA isoleres Enklere å isolere DNA DNA er mest stabil (degraderes lite) RNA degraderes fort og krever strengere krav i henhold til RNase RNase et uønsket enzym Enzym som degraderer og spalter RNA i mindre fragmenter Alle organismer danner RNase Arbeidsplassen og alt utstyr vaskes med RNase-away Større krav med hensyn til RNA Blod/ benmarg skal prepareres så fort som mulig Ferskt vev må fryses ned 7
Hvorfor RNA? Genuttrykk Gener som blir/ er transkribert er tilgjenglig når RNA isoleres. Translokasjoner / fusjonstranskripter DNA har store intron områder mens RNA kun har exon RNA kontaminert med DNA gdna ikke fjernet Referanse gen DNA Referanse gen RNA Kopier Kopier mean 5889 6173 6457 6173 7769 7769 gdna fjernet Referanse gen DNA Referanse gen RNA Kopier Kopier mean 0,51 0,52 0,53 0,52 13942 13942 8
Kvantitet = Kvalitet? FFPE vs ferskt vev RNA referanse gen DNA Size Ladder Kvantitet = Kvalitet? FFPE vs ferskt vev Kontroll DNA DNA kons. 100ng/µl Renhet[260:280]: 1,9 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp 600 bp FFPE DNA kons. ng/µl: 173 Renhet[260:280]: 1,9 Kontroll DNA DNA kons. 100ng/µl Renhet[260:280]: 1,9 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp 600 bp Ferskt vev DNA kons. ng/µl: 40 Renhet[260:280]: 1,9 9
Feilkilder / prøvekvalitet FFPE DNA Fragmentering kan påvirke PCR- reaksjoner Deaminering (Cytosin Uracil) falsk lesing av sekvens (C=T) konsekvenser for mutasjonsanalyser kryssbinding med formalin DNA er bundet RNA Fragmentering kan påvirke PCR- reaksjoner Dekalsinering RNA ødelegges av syre Lagring ved romtemperatur over lang tid RNA degraderes kryssbinding med formalin RNA er bundet FFPE eller ferskt vev Formalin fiksert Ferskt Fragmentert Degradering pga. fiksering Deaminering (Cytosin Uracil) Bedre DNA og RNA kvalitet Degradering pga. RNase 10
Gammelt Lang reisevei Koagulert Feilkilder / prøvekvalitet blod/ benmarg Materiale ikke tilstrekkelig blandet med antikoagulant Lysert Frostskader Feil prøverør Heparin som antikoagulant Hemmer PCR reaksjoner Framtiden? Optimalt prøvemateriale for enhver analyse Alternativ for formalin: PAXgene Tissue System Alternativ for ferskt vev: RNA- Later Alternativ for blod: PAXgene- rør 11