Sluttsrapport for prosjektet: Forekomst av SAV2 hos vill laksefisk i Midt- Norge. ( referanse: 2013/7835-25062013).

1 Til: Direktoratet for Naturforvaltning Sluttsrapport for prosjektet: Forekomst av SAV2 hos vill laksefisk i Midt- Norge. ( referanse: 2013/7835-25062013). Heidrun Plarre & Are Nylund Fiskesykdomsgruppen Institutt for biologi Universitetet i Bergen 5020 Bergen. Kontakt: are.nylund@bio.uib.no

2 Forord Prosjektet er finansiert av flere bidragsytere. Direktoratet for Naturforvaltning (DN), nå Miljødirektoratet, (referanse: 2013/7835-25062013), SalmonCamera, Redd Villaksen, Elvene rundt Trondheimsfjorden (ERT), Hardanger Villfisklag og privatpersoner, har alle bidratt til finansieringen. DN har bevilget 150.000,- (NOK) til analyser gjort ved UiB, mens SalmonCamera (Appendix A) og øvrige har finansiert logistikk rundt tilrettelegging, oppsett, opplæring og innsamling av materiale fra laks i fire elver i Trøndelag. Analysene av materialet er utført hos Fiskesykdomsgruppen ved UiB. Are Nylund Prosjektansvarlig Bergen 1. April 2014.

3 Bakgrunn Økt kunnskap om utbredelsen til smittestoffer kjent fra både ville laksefisk populasjoner og oppdrettlaks vil øke forståelsen av hvordan havbruksindustrien kan påvirke vill laksefisk. Smitte kan forekomme direkte mellom villfisk og oppdrettsfisk. I tillegg kan rømt oppdrettsfisk også være bærere av ulike patogener og dermed bidra til spredning av smitte. Både mengde og diversitet av potensielle laksefisk patogener kan endre seg over tid. Havbruksnæringen kan påvirke slike endringer med variasjoner i produksjonsvolum, samt avstander og plassering av oppdrettslokaliteter i fjordsystemer. I dette prosjektet vil hovedfokuset være rettet mot en nylig introdusert variant av SAV, dvs SAV2 (cf. Hjortaas et al 2013 Karlsen et al 2014), et virus som er vist å være årsak til pankreas sykdom (PD) hos laksefisker. SAV er, i Norge, hovedsakelig påvist hos oppdrettslaks på vestlandet og i Trøndelag, men viruset har også gitt sykdom hos oppdrettslaks i Nordland, Troms og Finnmark. Viruset har vært påvist hos ørret i enkelte elver på det sørlige vestlandet (pers. obs.). Den opprinnelige SAV varianten i Norge er SAV3 (Hodneland et al 2005) og har i hovedsak hatt en utbredelse på vestlandet med enkelte introduksjoner til Nord Norge (Karlsen et al 2006). SAV2 er nylig introdusert til Trøndelag/Nordvestlandet, og mest sannsynlig via transport av smolt/embryos fra Skottland til Norge. Dette gir en unik mulighet til å klarlegge smittepotensialet til SAV, dvs fra oppdrettslaks til vill-laks. I tillegg til at viruset kan spres over lengre distanser via transport av smolt (Karlsen et al 2006, 2014) så har det vært foreslått at spredning også kan skje fra oppdrettsanlegg til oppdrettsanlegg via havstrømmer (passiv horisontal spredning via sjø) (Kristoffersen et al 2009, Viljugrein et al 2009). Det kan derfor ikke utelukkes at utvandrende laksesmolt (og ørret) og tilbakevandrende laksefisk på vei til vassdrag i Trøndelag, i områdene med SAV2 i oppdrettspopulasjoner, vil kunne bli smittet med dette viruset. Hvis SAV-smittet rømt oppdrettslaks skulle gå opp i elvene vil dette øke nærheten mellom smittet oppdrettslaks og vill-laks og dermed også sjansene for spredning av SAV til vill-laks. Det er alt dokumentert at lakselus (Lepeophtheirus salmonis) produsert i lakseoppdrett spres til vill laksefisk (Krkosek et al 2012) og studier av Piscine reovirus, PRV (assosiert med hjerte -skjelettmuskel betennelse), tyder på at det er en betydelig spredning av dette viruset fra oppdrett til vill-laks langs norskekysten (Nylund 2013, Garseth et al 2013). Hovedmålet med dette studiet er derfor å undersøke om det introduserte viruset, SAV2, har smittet fra oppdrettslaks i Trøndelag til vill-laks i elvene Gaula, Orkla, Namsen og Stjørdalselva.

4 Material og metode Material Gjeller, og i noen tilfeller andre vev (hjerte), er innsamlet fra laks i elvene Gaula, Orkla, Namsen og Stjørdalselva. Innsamlingen har vært organisert av SalmonCamera, som også har samlet finansiering til prosjektet. Alt materialet ble tatt fra nylig avlivet laks og lagret på etanol ved temperaturer mellom 4 og 20 ºC frem til levering ved laboratoriet til Fiskesykdomsgruppen ved Universitetet i Bergen. Etter ankomst til UiB er materialet lagret ved 20 ºC. I utgangspunktet er hjertevev best egnet for påvisning av SAV hos laks, men forekomst (prevalens) av SAV i gjellevev er tilnærmet den samme som i hjertemuskulatur. Analysene er derfor i første omgang basert på gjellevev (som er tilgjengelig fra alle fiskene) og ved en eventuell positiv påvisning vil hjertevev bli benyttet til kontrollanalyse. RNA rensing og real time RT PCR RNA ble renset som beskrevet av Devold et al (2000) og lagret ved -20 ºC. RNAet ble benyttet til real time RT PCR påvisning av et utvalg av virus og parasitter; Salmonid alfavirus, SAV (Andersen et al 2007), Piscine reovirus, PRV (Tabell 1), Infeksiøs lakseanemi virus, ISAV (Plarre et al 2005), Infeksiøs pankreasnekrose virus, IPNV (Watanabe et al 2006), Ichthyobodo salmonis (Isaksen et al 2012), Parvicapsula pseudobranchicola (Nylund et al 2011), og Paranucleospora theridion (Nylund et al 2011). Elongeringsfaktor 1 alpha (EF1A) ble benyttet som intern kontroll (Olsvik et al. 2005). Hver kjøring bestod av 45 sykluser og prøvene ble ansett som positive når fluorescenssignalet oversteg en gitt terskel for det enkelte assayet. I tillegg er enkelte laks undersøkt for tilstedeværelse av Renibacterium salmoninarum (BKD), Candidatus Piscichlamydia salmonis (epitheliocystis), Candidatus Branchiomonas cysticola (Epitheliocystis), og Piscine myocarditis virus (PMCV). PMCV er assosiert med hjertesprekk (Cardiac myopathy syndrome, CMS) hos laks i oppdrett.

5 Tabell 1. Real time RT PCR assay for påvisning av Piscine reovirus, PRV. Assayet er rettet mot segmentet M2. Primer / Probe Sekvens PRV-M2-F 5`- CAA TCG CAA GGT CTG ATG CA -3` PRV-M2-probe FAM 5`- CTG GCT CAA CTC TC -3`MGB PRV-M2-R 5`- GGG TTC TGT GCT GGA GAT GAG 3`

6 Resultater Resultatene i denne rapporten inkluderer patogen analysedata (real time RT PCR påvisning av patogener) for laks (Salmo salar) samlet inn fra elvene Gaula, Orkla, Namsen og Stjørdal i 2013. Alle Ct-verdier er kvalitetssikret gjennom inkludering av negative kontroller og ved repetisjoner av kjøringer med verdier nært deteksjonsgrensene for de enkelte assays. Falske negative kan ikke utelukkes, men vil kun forekomme med lav frekvens siden real time RT PCR har høy sensitivitet. Vekt, lengde og kjønn er oppgitt for et utvalg av fiskene (Tabell 2). Tabell 2. Gjennomsnittlig vekt og lengde på et utvalg av laks fra de enkelte elvene. Elv Vekt gram Lengde mm Hann Hunn N Stjørdalselva 4031 733 18 12 30 / 74 Orkla 5204 753 30 20 52 1 /78 Gaula 8033 926 15 41 61 2 /77 Namsen 3686 586 55 21 115 3 /122 1 Kjønn ble ikke oppgitt for to av laksene fra Orkla. 2 Kjønn ble ikke oppgitt for 5 av laksene fra Gaula. 3 Kjønn ble ikke oppgitt for 39 av laksene fra Namsen. Stjørdalselva (Nord Trøndelag) Laksen (N = 74) i Stjørdalselva ble fisket på følgende steder: Hesthølen, Holmhølen, Heimhølen, Kleivhølen, Einang, Torehølen, Båtstø, Kongerike, Nord Kringen, og Nedre Berg. Kjønn, vekt og lengde ble oppgitt for 40,5 % av laksene i denne elven (Tabell 2). Gjelle fra alle individene ble undersøkt for følgende patogener; Virus (Piscine reovirus - PRV, Salmonid Alphaivrus - SAV, Infeksiøs lakseanemivirus - ILAV og Infeksiøs pankreasnekrose virus - IPNV) og parasitter (Paranucleospora theridion Pt, Ichthyobodo spp costia, og Parvicapsula pseudobranchicola - Pp). I tillegg ble enkelte fisk undersøkt for tilstedeværelse av utvalgte bakterier: Candidatus Branchiomonas cysticola, Candidatus Piscichlamydia salmonis og Renibacterium salmoninarum BKD. Det ble kjørt totalt 642 real time RT PCR analyser på fisken fra Stjørdalselva. I tillegg kommer negative og positive kontroller.

7 Ingen av fiskene var positive for virusene SAV (som er det viruset som er årsak til pankreas nekrose hos laks i oppdrett langs Norskekysten) og PMCV (Piscine myocarditis virus, -årsak til hjertesprekk hos laks) (Tabell ST3). Det ble heller ikke påvist BKD hos undersøkte fisk (N = 10). Tabell ST3. Resultater fra Stjørdalselven. Gjennomsnittlig Ct verdi for elongeringsfaktor 1 alfa (kontroll genet) er for fiskene fra denne elven = 15,3, hvilket indikerer god kvalitet på det innsendte materialet. Patogen N Pos Prevalens Ct-range Gj.sn. ct Virus SAV 74 0 0 - - ILAV 74 2 2,7 30,4-34,6 32,5 IPNV 74 3 4,6 22,4 30,0 25,8 PRV 74 4 5,4 24,1 32,2 28,7 PMCV 10 0 - - - Parasitter P. theridion 74 8 10,8 22,0 36,5 29,0 P. pseudobranchicola 74 35 47,3 20,5 37,0 31,2 Ichthyobodo spp. 74 50 67,6 17,3 32,6 23,7 Bakterier Ca. B. cysticola 10 6 (60,0) 19,5 27,7 24,0 Ca. P. salmonis 10 2 (20,0) 27,2 29,2 28,2 BKD 10 0 - - - PMCV = piscine reovirus (assosiert med hjertesprekk hos laks). Ca. Branchiomonas cysticola og Ca. Piscichlamydia salmonis er assosiert med epitheliocystis hos laks. BKD = bakteriell nyresyke (Renibacterium salmoninarum). Det ble påvist en lav prevalens av virusene ILAV, IPNV og PRV, hvor to av fiskene hadde henholdsvis ct = 22,4 og 24,9 for IPNV på gjellene. Prevalens og densitet for parasitten P. theridion var lav, mens prevalensen var noe høyere for parasittene P. pseudobranchicola (45,9) og Ichthyobodo spp. (78,4) (Tabell ST3).

8 Bakterier (Ca. B. cysticola og Ca. P. salmonis)) assosiert med epitheliocystis hos laks ble påvist i moderate mengder hos laksen fra Stjørdalselva. Orkla (Sør Trøndelag) Gjeller fra totalt 78 laks ble samlet inn i Orkla og 70 av disse ble undersøkt ved hjelp av real time RT PCR med henblikk på påvisning av et utvalg av patogener, inkludert SAV. Vekt og lengde ble oppgitt for 66,7 % av laksene i denne elven, mens kjønn ble oppgitt for 64,1 % (Tabell 2). Resultatene av real time RT PCR analysene er presentert i Tabell O3. Det ble kjørt totalt 560 real time RT PCR analyser på fisken fra Orkla. I tillegg kommer negative og positive kontroller. Tabell O3. Resultater fra Orkla. Gjennomsnittlig Ct verdi for elongeringsfaktor 1 alfa (kontroll genet) er for fiskene fra denne elven = 15,2, hvilket indikerer god kvalitet på det innsendte materialet. Patogen N Pos Prevalens Ct-range Gj.sn. ct Virus SAV 70 0 - - - ISAV 70 4 5,7 29,8-35,9 33,6 IPNV 70 0 - - - PRV 70 5 7,1 25,6-35,6 30,6 Parasitter P. theridion 70 15 21,4 24,8-34,8 30,8 P. pseudobranchicola 70 28 40,0 23,2-37,9 33,2 Ichthyobodo spp. 70 49 70,0 14,0-32,2 24,2 Det ble ikke påvist SAV eller IPNV hos noen av laksene fra Orkla. Det ble påvist en lav prevalens av virusene ILAV og PRV. Prevalens og densitet for parasitten P. theridion var lav, mens prevalensen var noe høyere for parasittene P. pseudobranchicola og Ichthyobodo spp. (Tabell O3).

9 Gaula (Sør Trøndelag) Gjeller fra totalt 77 laks ble samlet inn i Gaula og 75 av disse ble undersøkt ved hjelp av real time RT PCR med henblikk på påvisning av et utvalg av patogener, inkludert SAV. Vekt og lengde ble oppgitt for 80,5 % av laksene i denne elven, mens kjønn ble oppgitt for 72,7 % (Tabell 2). Resultatene av real time RT PCR analysene er presentert i Tabell G3. Det ble kjørt totalt 600 real time RT PCR analyser på fisken fra Gaula. I tillegg kommer negative og positive kontroller. Tabell G3. Resultater fra Gaula. Gjennomsnittlig Ct verdi for elongeringsfaktor 1 alfa (kontroll genet) er for fiskene fra denne elven = 15,9, hvilket indikerer god kvalitet på det innsendte materialet. Patogen N Pos Prevalens Ct-range Gj.sn. ct Virus SAV 75 - - - - ISAV 75 3 4,0 30,4-35,7 33,7 IPNV 75 - - - - PRV 75 6 8,0 23,2-35,7 28,3 Parasitter P. theridion 75 3 4,0 23,7-29,1 26,4 P. pseudobranchicola 75 37 49,3 19,2-37,4 31,0 Ichthyobodo spp. 75 43 57,3 15,5 38,1 28,0 Det ble ikke påvist SAV eller IPNV hos noen av laksene fra Gaula. Det ble påvist en lav prevalens av virusene ILAV og PRV. Prevalens og densitet for parasitten P. theridion var lav, mens prevalensen var moderat for parasittene P. pseudobranchicola og Ichthyobodo spp. (Tabell G3).

10 Namsen (Nord Trøndelag) Gjeller fra totalt 122 laks ble samlet inn i Namsen og 121 av disse ble undersøkt ved hjelp av real time RT PCR med henblikk på påvisning av et utvalg av patogener, inkludert SAV. Vekt og lengde ble oppgitt for 94,3 % av laksene i denne elven, mens kjønn ble oppgitt for 61,5 % (Tabell 1). Resultatene av real time RT PCR analysene er presentert i Tabell N3. Det ble kjørt totalt 984 real time RT PCR analyser på fisken fra Namsen. I tillegg kommer negative og positive kontroller. Tabell N3. Resultater fra Namsen. Gjennomsnittlig Ct verdi for elongeringsfaktor 1 alfa (kontroll genet) er for fiskene fra denne elven = 14,1, hvilket indikerer god kvalitet på det innsendte materialet. Patogen N Pos Prevalens Ct-range Gj.sn. ct Virus SAV 121 0 - - - ILAV 121 0 - - - IPNV 121 0 - - - PRV 121 6 5,0 22,2-31,8 26,3 PMCV 4* 0 - - - Parasitter P. theridion 121 31 25,6 19,9-36,3 29,4 P. pseudobranchicola 121 82 67,8 20,0 37,0 29,5 I. salmonis 121 108 89,3 12,6 31,7 23,8 Bakterier Ca. B. cysticola 4* 4 (100) 11,9 29,3 21,7 Ca. P. salmonis 4* 4 (100) 20,0 36,7 27,8 BKD 4* 0 - - - PMCV = piscine reovirus (assosiert med hjertesprekk hos laks). Ca. Branchiomonas cysticola og Ca. Piscichlamydia salmonis er assosiert med epitheliocystis hos laks. BKD = bakteriell nyresyke (Renibacterium salmoninarum). *Disse fire fiskene var svært avmagret (Figur 1).

11 Ingen av virusene SAV, ILAV eller IPNV ble påvist hos laks fra Namsen. Prevalens av PRV var lav, mens prevalens av P. theridion var betydelig høyere in Namsen sammenlignet med tilsvarende prevalenser fra de andre tre elvene. Det var også en relativt høy prevalens av Ichthyobodo spp. og P. pseudobranchicola. Fire hele lakser fra Namsen ble sendt til vårt laboratorium for videre undersøkelser. Alle fire var svært magre (Figur 1). Det ble ikke påvist noen sykdomsdagens som kunne forklare den lave kondisjonsfaktoren. Analyser av øresteinene (Figur 2a,b,c) fra disse fire individene ble foretatt av Professor Arild Folkvord, Institutt for Biologi, Universitetet i Bergen. Disse analysene indikerer at det dreier seg om vill-laks (Appendix B). Figur 1. Avmagret laks fra Namsen. En av disse hadde store mengder Anisakis i bukhulen. Den gjennomsnittlige vekt og lengde for disse fire laksene var henholdsvis 498 gram og 42 cm.

Figure 2a. Øresteiner fra laks i Namsen. Foto: Prof. Arild Folkvord. 12

13 Figure 2b. Øresteiner fra laks i Namsen. Foto: Prof. Arild Folkvord. Figure 2c. Øresteiner fra laks i Namsen. Foto: Prof. Arild Folkvord.

14 Diskusjon Salmonid alphavirus 2 (SAV2) Det primære målet med dette studiet var å kartlegge om SAV2 var blitt etablert i noen av villlaks populasjonene i Trøndelag etter introduksjon av viruset fra Skottland til lakseoppdrett i dette området. Fiskehelserapporten for 2013 gir en oversikt over PD utbrudd i Trøndelag de siste fire årene (Figur 3). Figur 3. Denne firugren viser den offisielle forekomst av SAV i Trøndelag i perioden 2010 til 2013 (Fiskehelserapporten 2013). I 2013 ble det påvist 31 tilfeller med PD i Sør Trøndelag. Som det fremgår av oversikten over de offisielle PD utbrudd i Sør Trøndelag er det rimelig å anta at laks som skal til elvene; Orkla, Gaula og Stjørdal, vil passere i rimelig nærhet til anlegg med PD utbrudd. Det kan heller ikke utelukkes at laks som skal til Namsen vil passere anlegg med PD. Det må imidlertid påpekes at av de 31 påvisningene i dette fylket så var 19 av disse i perioden Oktober Desember, men fire utbrudd var i Januar-Mars. Kun åtte utbrudd forekom i perioden Mai September, dvs i perioden hvor det er rimelig å anta at villaksen

15 kommer inn til elvene. Det er også klart at ingen PD utbrudd forekom i nærheten av elvemunningen til de fire omtalte elver. Ingen av de 340 laks som ble analysert, 74 fra Stjørdalselva, 121 fra Namsen, 75 fra Gaula, og 70 fra Orkla, var positive for SAV. En generell regel er at analyse av 30 fisk vil fange opp en prevalens av SAV på 10 % med 95 % sikkerhet, og analyse av 60 fisk en prevalens på 5 %. I denne sammenheng ble det analysert mer enn 70 fisk fra hver av de fire elvene. Det totale antallet laks undersøkt i Trøndelag var over 300 individer hvilket skulle tilsi at det skulle være mulig å fange opp en prevalens på > 1,0 % i dette området. Tidligere analyser av vill-laks fra Vestlandet tilsier at prevalens av SAV hos laks, som er gått opp i elver, sannsynligvis er lavere en 2,0 % (pers. obs.). Prevalens kan selvfølgelig variere betydelig fra elv til elv. Erfaringene fra Vestlandet tilsier også at det vil være betydelig lettere å påvise SAV hos ørret, Salmo trutta, enn hos laks. Ved en eventuell oppfølging av denne undersøkelsen i 2014 bør en derfor, om mulig, også inkludere sjø-ørret i analysene. Konklusjonen er at det ikke foreligger indikasjoner på at SAV2 har smittet fra oppdrett til villaks i Trøndelag. Infeksiøs lakseanemi virus (ILAV) Enkeltindivider av laks fra tre av elvene, Stjørdal, Gaula og Orkla (alle med utløp i Trondheimsfjorden), var positive for ILA virus, lav-virulent variant (HPR0). Dette viruset er vanlig forekommende (med lav prevalens) i elver på Vestlandet (Tabell 3, Plarre et al 2005, Plarre 2012, se Tabell 5) og i lakseoppdrett (Nylund et al 2006). Det er vist at ILA virus kan smitte vertikalt, dvs fra stamfisk i oppdrett og til avkom via egg (Multiple Authors 2005, Nylund et al 2006, Vike et al 2009, Plarre 2012). I oppdrett er det vanlig å påvise ILA virus av lavvirulent type både i ferskvann og sjø. Analyser av både virulente og lav-virulente ILA virus viser at det er de lav-virulente ILA virus som muterer (rekombinasjon) og gir opphav til de virulente variantene (cf: Plarre 2012, Plarre et al 2012). Det er likevel rimelig å anta at de lav-virulente ILA virus ikke representerer noen fare for villlaks og ørret, men er tilpasset biologien til disse to artene som lever i små fragmenterte populasjoner.

16 Tabell 3. (fra Plarre 2012, dr. grad 2012). Infeksiøs pankreas nekrose virus (IPNV) IPNV kan forårsake sykdom hos oppdrettsyngel av laksefisk i ferskvann og hos postsmolt i oppdrett. Viruset er vanlig å påvise hos oppdrettslaks, men det er langt mindre vanlig å finne det hos vill-laks (i dette tilfellet hos tre laks i Stjørdalselva). Det er usikkert om dette viruset kan være av betydning for vill-laks.

17 Piscine reovirus (PRV) PRV er assosiert med hjerte skjelettmuskel betennelse (HSMB) og et av kjerneområdene for denne sykdommen er midt Norge i følge landsoversikten gitt i Fiskehelserapporten 2011 (Johannessen 2012). I en undersøkelse av prevalens av dette viruset i Namsen og Stjørdalselva i perioden 2007 til 2009 ble det påvist prevalenser på henholdsvis 6,3 og 16,2 % i disse to elvene (Garseth et al 2012). Videre synes det å fremgå klart av molekylærepizootiologiske studier at oppdrettslaks er en viktig spreder av dette viruset (Nylund 2013, Garseth et al 2013). Se figur 2 som viser slektskap mellom PRV fra forskjellige Norske elver. Rømt oppdrettslaks Rømt oppdrettslaks Figur 2. Slektskap mellom PRV fra Norsk vill-laks, og oppdrettslaks fra Norge, Canada og Chile. Analysen er baset på 1089 nukleotider i segmentet S2 hos PRV. Bokstavene AA, VA R, H, SF, MR, ST, NT, N, T og F refererer til fylkene langs Norskekysten (Aust Agder til Finnmark). Alle sekvensene ligger i GenBanken.

18 På denne bakgrunn er det noe underlig at det påvises relativt lave prevalenser (< 8,0 %) av PRV hos vill-laks i de fire undersøkte elvene i 2013. En mulig forklaring kan være at vill-laks som har utviklet HSMB ikke evner å gå opp i elvene, men vil oppholde seg i fjorden eller estuariene (eller er død på grunn av HSMB eller svekket predatorrespons på grunn av HSMB). Den lave prevalensen av PRV i 2013 kan også være en indikasjon på naturlige svingninger i prevalens av dette viruset. Forekomst av HSMB i oppdrettspopulasjoner i midt- Norge i 2013 er imidlertid ikke kjent og det er derfor usikkert om det foreligger støtte til en slik hypotese. Det bør også legges til at det ikke er fullt ut vist at PRV er årsak til HSMB. Paranucleospora theridion (mikrosporidie) Parasitten P. theridion forekommer i mindre mengder i alle fire elvene med høyest prevalens i Namsen (Ct = 25,6 %). P. theridion er assosiert med gjellebetennelse hos laks på Vestlandet ved temperaturer over 10 ºC (Nylund et al 2009abcdef, 2010, 2011, Sveen et al 2012). I smitteforsøk har parasitten gitt opp til 50 % dødelighet. Lakselus, Lepeophtheirus salmonis, er sluttverten for P. theridion og sporene som smitter laksen produseres i lakselusen (Nylund et al 2010). Spredningspotensialet til denne parasitten er betydelig, men sykdom som følge av smitte synes å være avhengig av temperaturer høyere enn 10 ºC over lengre tid og slike høye temperaturer over tid vil ikke laks ute i Norskehavet eksponeres for. Selv om parasitten ikke nødvendigvis er direkte årsak til dødelighet så vil den imidlertid kunne svekke verten (laks) da målcellene er leukocytter og blodkarendotel, dvs celler som utgjør en viktig del av fiskens immunforsvar. Parvicapsula pseudobranchicola Parasitten P. pseudobranchicola forekommer i moderate mengder i alle fire elvene (prevalenser varierer fra 40, 0 % i Orkla til 67,8 % i Namsen). P. pseudobranchicola er hovedsakelig et stort problem for oppdrettslaks i Troms og Finnmark selv om parasitten synes å være vanlig langs hele Norskekysten (Karlsbakk et al 2002). I oppdrett er det særlig hos høst-smolt en kan få betydelig dødelighet. Det kan se ut som om denne parasitten kun utgjør et problem for laks ved relativt lave temperaturer. Det er ukjent om denne parasitten er av betydning for vill-laks, men det er vanlig å påvise den hos vill-laks langs hele Norskekysten (pers.obs.).

19 Ichthyobodo spp. To arter Ichthyobodo er kjent fra laks i Norge, I. necator i ferskvann og I. salmonis som forekommer i både ferskvann og fullt sjøvann (Isaksen et al 2010, 2011, 2012). Store mengder av parasitten har vært assosiert med to tilfeller av dødelighet hos i laks elver i Hordaland og Rogaland (pers.obs). I disse to tilfellene var det store mengder med I. salmonis på hud og gjeller hos omtalte vill-laks med ct-verdier under 10. Prevalens av Ichthyobodo spp. i de fire elvene i Trøndelag varierer fra 55,8 % (Gaula) til 89,3 % i Namsen, mens ct-verdiene spenner fra 12,6 til 38,1. Enkelte fisk (4 individer i Namsen) har så lave ct-verdier at det ikke kan utelukkes at denne parasitten har en negativ innvirkning på disse. Oppsummering Resultatene fra dette prosjektet gir et godt utgangspunkt for fremtidig overvåking av ville laksefisker med henblikk på en eventuell spredning av det introduserte viruset, SAV2, fra lakseoppdrett til villfisk i Trøndelag. Undersøkelsen viser med stor sikkerhet, så langt, at dette viruset ikke er etablert i noen av laksepopulasjonene i de fire store elvene; Namsen, Stjørdal, Orkla og Gaula. Det må imidlertid tas forbehold om at det store flertall av laksen fra disse elvene ble samlet in i perioden Juni August, dvs i en periode med svært få PD utbrudd hos oppdrettslaks i området. I 2013 var hoveddelen av PD-utbruddene i perioden oktober desember. Videre, gir undersøkelsen også et godt utgangspunkt for overvåking av et utvalg av andre patogener som er knyttet til oppdrett av laks i Norge. I fremtidige studier vil det være mulig å kartlegge om svingninger i forekomst av disse hos oppdrettslaks korrelerer med tilsvarende svingninger hos villfisk. Ved hjelp av genotyping av de forskjellige agens vil det også være mulig, til en viss grad, og følge spredningen av disse patogener. I en videreføring av prosjektet bør en vurdere å inkludere både vill laks og ørret i patogenovervåkingen. Videre, bør innsamlingsperioden, hvis mulig, utvides.

20 Litteratur Andersen L., Bratland A., Hodneland K., Nylund A. (2007). Tissue tropism of salmonid alphaviruses(subtypes SAV1 and SAV3) in experimentally challenged Atlantic salmon (Salmo salar L.) Arch Virol 152(10):1871-83. Devold, M., B. Krossoy, V. Aspehaug, and A. Nylund. (2000). Use of RT-PCR for diagnosis of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in carrier sea trout Salmo trutta after experimental infection. Dis Aquat Org 40:9-18 Fiskehelserapporten 2013. Flere forfattere. ISSN 1893 1480. Garseth ÅH, Fritsvold C, Opheim M, Skjerve E, Biering E (2012). Piscine reovirus (PRV) in wild Atlantic salmon, Salmo salar L., and sea-trout, Salmo trutta L., in Norway. J Fish Dis 36(5):483-493. Garseth AH, Ekrem T, Biering E (2013). Phylogenetic Evidence of Long Distance Dispersal and Transmission of Piscine Reovirus (PRV) between Farmed and Wild Atlantic Salmon. PLoS ONE 8(12): e82202. doi:10.1371/journal.pone.0082202 Hodneland K, Brattland A, Christie E, Endresen C, Nylund A (2005). A new subtype of salmonid Alphavirus, Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway. Dis Aquat Org 66: 113 120. Hjortaas MJ, Skjelstad HR, Taksdal T, Olsen AB, Johansen R, Bang-Jensen B, Ørpetveit I, Sindre H. (2013). The first detections of subtype 2 related salmonid alphavirus (SAV2) in Atlantic salmon, Salmo salar L., in Norway. J Fish Dis 36(1):71-74. Isaksen TE, Karlsbakk E, Sundnes GA, Nylund A (2010). Patterns of Ichthyobodo necator sensu stricto infections on hatchery-reared Atlantic salmon Salmo salar in Norway. Dis Aquat Org 17;88(3):207-14 Isaksen T, Karlsbakk E, Watanabe K, Nylund A (2011). Ichthyobodo salmonis sp. n. (Ichthyobodonidae, Kinetoplastida) an euryhaline ectoparasite infecting Atlantic salmon (Salmo salar L.). Parasitology Aug;138(9):1164-75. Epub 2011 Jul 15. Isaksen TE, Karlsbakk E, Repstad O, Nylund A (2012). Molecular tools for the detection and identification of Ichthyobodo spp. (Kinetoplastida), important fish parasites. Parasitol Int Dec;61(4):675-83. doi: 10.1016/j.parint.2012.07.006. Epub 2012 Jul 21 Johansen R (2012) Fiskehelserapporten 2012. Oslo: Veterinærinstituttet; 2013. Karlsen M, Hodneland K, Endresen C, Nylund A (2006) Genetic stability within the Norwegian subtype of Salmonid Alphavirus (Togaviridae). Arch Virol 151: 861 874.

21 Karlsen M, Gjerset B, Hansen T, Rambaut A. (2014). Multiple introductions of salmonid alphavirus from a wild reservoir have caused independent and self-sustainable epizootics in aquaculture. J Gen Virol. 95:52-59 (Epub: 2013) Karlsbakk E, Sæther PA, Høstlund C, Fjellsøy KR, Nylund A (2002). Parvicapsula pseudobranchicola n. sp. (Myxozoa), a myxosporidian infecting the pseudobranch of cultured Atlantic salmon (Salmo salar). Bull Eur Assoc Fish Pathol 22:381-387. Krkošek, M., Revie, C.W., Gargan, P.G., Skilbrei, O.T., Finstad, B., and Todd, C.D. (2012). Impact of parasites on salmon recruitment in the Northeast Atlantic Ocean. Proc R Soc B 20122359 Kristoffersen AB, Viljugrein H, Kongtorp RT, Brun E, Jansen PA (2009) Risk factors for pancreas disease (PD) outbreaks in farmed Atlantic salmon and rainbow trout in Norway during 2003 2007. Preventive Veterinary Medicine 90: 127-136. Multiple authors (2005). Experiments with ISAV infected broodfish (Atlantic salmon). Can the ISAV be transmitted via gonadal products? (Report in Norwegian, http://www.salmobreed.no). Pp 1-31. Nylund A, Plarre H, Karlsen M, Fridell F, Ottem KF, Bratland A, Sæther PA. (2006). Transmission of infectious salmon anaemia virus in farmed populations of Atlantic salmon (Salmo salar). Arch Virol 152 (2007): 151-179. Nylund A, Watanabe K, Nylund S, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009a). En mikrosporidie bak laksedødelighet. kyst.no 9 Feb. 2009 (http://www.kyst.no/index.php?page_id=95&article_id=83982) Nylund A, Watanabe K, Nylund S, Sævareid I, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009b) Mikrosporidie hos oppdrettslaks: Årsak til HSMB, CMS og PGD? Intervet Agenda 2009(6): 3 p.. Nylund A, Watanabe K, Nylund S, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009c). Nytt patogen gammel sykdom. Norsk Fiskeoppdrett 2: Nylund A, Watanabe K, Nylund S, Sævareid I, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009d) Lakselus. Biologisk vektor for lakseparasitt.. Naturen 133 (4): 217 222. Nylund S, Nylund A, Watanabe K, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009e). Paranucleospora theridion n.gen., n. sp. (Microsporidia, Enterocytozoonidae) with a life cycle in the salmon louse (Lepeophtheirus salmonis, Copepoda) and Atlantic salmon (Salmo salar). Proceedings from the 14 th EAFP meeting in Parague September 14 19, 2009. p 35. Nylund A, Watanabe K, Nylund S, Sævareid I, Arnesen CE, Karlsbakk E (2009f). Lakselus er vektor for en ny art mikroporidie. Norsk Fiskeoppdrett 34(6a):20 33.

22 Nylund S, Nylund A, Watanabe K, Arnesen CE, Karlsbakk E (2010). Paranucleospora theridion n.gen., n.sp. (Microsporidia, Enterocytozoonidae) with a life cycle in the salmon louse (Lepeophtheirus salmonis, Copepoda) and Atlantic salmon (Salmo salar). J Euk Micr 57(2):95-114 Nylund A (2013). Patogener hos Vossolaksen i perioden 2009 2011. (I DN-utredning 1-2013, B. Barlaup. Redningsaksjonen for Vossolaksen) side: 175-180 Nylund S, Andersen L, Saevareid I, Plarre H, Watanabe K, Arnesen CE, Karlsbakk E, Nylund A (2011). Diseases of farmed Atlantic salmon Salmo salar associated with infections by the microsporidian Paranucleospora theridion. Dis Aquat Organ. 2011 Mar 16;94(1):41-57. Olsvik, P. A., K. K. Lie, A. E. O. Jordal, T. O. Nilsen, and I. Hordvik. (2005). Evaluation of potential reference genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon. Bmc Mol Biol 17: 6-21 Plarre H, Devold M, Fridell F, Nylund A (2005). Prevalence of infectious salmon anaemi virus (ISAV) in wild salmonids collected in Western Norway. Dis Aquat Org. 66: 71 79. Plarre H (2012). Infectious salmon anaemia virus (ISAV): Evolution, genotyping, reservoirs and transmission. Dr. Thesis, University of Bergen. Plarre H, Nylund A, Karlsen M, Brevik Ø, Sæther PA, Vike S. (2012). Evolution of Infectious Salmon Anaemia virus (ISAV). Arch Virol Sveen S, Øverland H, Karlsbakk E, Nylund A (2012). Paranucleospora theridion (Microsporidia) infection dynamics in farmed Atlantic salmon Salmo salar put to sea in spring and autumn. Dis Aquat Org 10(1): 43 49 Vike S, Nylund S, Nylund A (2009). ISA virus in Chile: evidence of vertical transmission. Arch Virol 154: 1-8 (E.pub. 2008) Viljugrein H, Staalstrom A, Molvaer J, Urke HA, Jansen PA (2009) Integration of hydrodynamics into a statistical model on the spread of pancreas disease (PD) in salmon farming. Dis Aquat Org 88:35-44 Watanabe K, Karlsen M, Devold M, Isdal E, Litlabø A, Nylund A (2006) Virus-like particles associated with heart and skeletal muscle inflammation (HSMI). Dis Aquat Org. 70: 183 192.

23 Appendix A Utgifter i forbindelse med innsamling av vevsprøver fra laks i elvene i Trøndelag ble dekket av SalmonCamera. Utdrag av Årsregnskap for SalmonCamera er gitt nedenfor:

24 APPENDIX B Rapport fra Professor Arild Folkvord. Bergen 31 mars, 2014 Beskrivelse av øresteinsanalyser Vi fikk tilsendt fire lakseøresteiner (otolitter) fra fisk som var fanget i tilknytning til Namsen vassdraget. Otolittene var dissekert ut fra prøvefiskene av prof. Are Nylund og var oppbevart tørt i små plastbeholdere. Det videre arbeidet med otolittene ble utført av tekniker Julie Skadal på fiskelaboratoriet ved BIO, UiB. Otolittene ble først forsiktig rengjort, og deretter fotografert hele mot svart bakgrunn. Det ble benyttet overlys, stereolupe og Nikon digital kamera. Tre av otolittene (fisk 1-3) var høyre otolitter, og den fjerde en venstre otolitt. En av otolittene (fra fisk 3) hadde tydelige tegn til krystallisering (sannsynligvis vateritt), mens en av otolittene (fra fisk 4) manglet en del av rostrum (sannsynligvis brukket av under dissekering). Man kunne se antydning til årssoner på noen av de hele otolittene, men vi valgte å støpe otolittene inn i hardplast og deretter lage snitt for å få frem mer tydelige strukturer (Panfili et al. 2002). Dette ble gjort med vanlig metode med et transversalt snitt gjennom kjernen, og påfølgende montering av snitt på objektglass. Snittene ble deretter fotografert under fluorescens mikroskop for deteksjon av eventuelle fluoriserende bånd innleiret etter en evt. antibiotikabehandling (f.eks. Oxytetracyclin). Snittene ble deretter fotografert med gjennomgående belysning ved ulike forstørrelser under vanlig mikroskop for deteksjon av årringer og andre makrostrukturer (Panfili et al. 2002, Wells et al. 2003). Vi fant ingen fluoriserende soner eller bånd i noen av øresteinene. Dette utelukker ikke et oppdrettsopphav, da bruk av Oxytetracyclin ikke er vanlig forekommende lenger. På den annen side kan forekomsten av en delvis krystallisert otolitt heller ikke brukes som et sikkert kjennetegn på oppdrettsopphav da dette også forekommer blant villfisk, om enn i mindre grad enn hos oppdrettsfisk. De vedlagte bildene fra snittene viser tydelige soneringer innerst mot kjerne som er typisk for ferskvannsfasen hos laks (Wells et al. 2003). For alle de fire fiskene var antallet årringer fra ferskvannsfasen tre, selv om den innerste soner for fisk 4 var noe mindre tydelig enn for de tre andre fiskene. Soneringen i otolittene i sjøvannsfasen (den ytre opake delen av øresteinene), er ikke like lett å bestemme, men består anslagsvis av en eller to soner. En

25 nærmere undersøkelse av primærsonene i denne delen av øresteinen ville bekrefte om det var snakk om en eller to soner (Wells et al. 2003). Det ble imidlertid ikke avsatt tid eller funnet nødvendig med nærmere analyser av denne delen av de innsendte otolittene i denne omgang. Vår konklusjon er at disse otolittene stammer fra fisk som har hatt tre sesonger i ferskvann, og deretter minst ett år i sjø. Det er derfor mye som tyder på at det er snakk om villfisk, evt. oppdrettsfisk som har rømt tidlig i ferskvannsfasen. For å være enda sikrere i vår konklusjon skulle vi gjerne ha hatt «sikker» oppdrettsfisk og villfisk fra området, slik at vi kunne sammenfatte strukturene i otolittene fra disse fiskene opp mot de otolittstrukturene vi allerede har analysert. Prof. Arild Folkvord BIO/UiB Referanser Panfili, J., Troadec, H., Pontual, H.d., Wright, P.J., 2002. Manual of fish sclerochronology. Ifremer-IRD coedition, Brest, France. Wells, B.K., Friedland, K.D., Clarke, L.M., 2003. Increment patterns in otoliths and scales from mature Atlantic salmon Salmo salar. Mar. Ecol. Prog. Ser. 262, 293-298.