- 1 - Gasskromatografi Separasjonsprosessen i gasskromatografi. Mobilfasen (bærergassen): He, N 2 eller H 2. Stasjonærfasen: vanligvis en ikke flyktig væske. Analytt: gass eller flyktig væske. Kapillærkolonner vs. pakkede kolonner. Pakkede kolonner har større kapasitet, mens kapillærkolonner har bedre separasjonsevne, kortere analysetid og større sensitivitet. I kapillærkolonner er leddet som skyldes flere veier gjennom stasjonærfasen (A leddet) i van Deemter likningen eliminert. Kapillærkolonner har derfor bedre oppløsningsevne enn pakkede kolonner i gasskromatografi. Lavere motstand mot gjennomstrømning av gassen gjør at lengre kolonner kan benyttes med samme elueringstid. WCT Wall Coated pen Tubular. I WCT-kolonnene dekker den stasjonære væskefasen den indre veggen i kapillærkolonnen. SCT Support Coated pen Tubular. I disse kolonnene er kapillærveggen først dekket av små partikler av et inert bæremateriale som øker overflaten av kapillærkolonnen. Partiklene fungerer som bæremateriale for den stasjonære væskefasen. PLT Porous Layer pen Tubular kolonne. Her er den indre veggen i kapillærkolonnen dekket av et adsorpsjonsmiddel. Det er hovedsakelig WCT kolonner og i noen grad SCT kolonner som benyttes ved kapillær gasskromatografi. PLT kolonner benyttes kun til spesielle analyser, for eksempel analyse av gasser og andre lavmolekylære forbindelser. Det er utviklet teknikker som gjør det mulig å fremstille kapillærkolonner av silika, såkalte fused silika (Si 2 ) kolonner. Den tynne veggen utsettes imidlertid lett for korrosjon og skader, og for å beskytte den er kapillærkolonnen dekket utvendig av et polyimidlag. Polyimid er termostabilt til 350 C. Silikakolonnene har en meget stor grad av fleksibilitet, og de er enkle å håndtere i det praktiske arbeidet. En annen stor fordel er at silikakolonnene inneholder bare spor av metallforurensninger (mindre enn 1 ppm). Silika er til nå det mest ideelle kolonnematerialet for kapillær gasskromatografi, og silikakolonnene har følgelig en dominerende plass innen kapillærkromatografi. Kolonnens indre diameter er typisk 0,10 til 0,53 mm og typiske lengder er 15 til 100 m.
- 2 - Stasjonærfaser. Nøkkelen til en god separasjon i GC er å velge en kolonne med riktig stasjonærfase. Valget av stasjonærfase avhenger hva slags analyse man skal gjøre og hvor godt polare komponenter retarderes i kolonnen. Når man skal velge en passende stasjonær fase bør man se polariteten av analyttene og velge en stasjonærfase med likende polaritet. En analytt med liknende polare egenskaper som stasjonærfasen vil retarderes godt. Prinsippet om at like løser like gjelder. Polysiloksaner er de mest vanlige stasjonære faser. De er tilgjenglige i stor utvalg. De er stabile, robuste og har mange anvendelsesområder. Standard polysiloksaner karakteriseres med en Si- kjede, der to funksjonelle grupper er bundet til hvert Siatom. Typen og mengden av gruppene karakteriserer stasjonærfaser og gir stasjonærfasen forskjellige egenskaper. De fire mest brukte er metyl, cyanopropyl, trifluorpropyl og fenyl. En av de enkleste polysiloksaner er 100 % metylsubstitutert som DB-1 og HP-1. Når andre grupper er tilstede er mengde indikert som prosent av det totale antall grupper. For eksempel, vil en 5 % difenyl-95 % dimetyl polysiloksan inneholde 5 % fenylgrupper og 95 % metylgrupper. Prefikset "di-" indikerer at hvert silisiumatom inneholder to av den angitte gruppen. Noen ganger utelates prefiks selv om to identiske grupper er tilstede. Dersom prosentinnholdet av metyl ikke er angitt er det underforstått at metyl er tilstede slik at den totale prosenten blir 100. (f. eks. 50% fenyl-metyl polysiloksan inneholder 50 % metylsubstituenter). Cyanopropylfenyl prosentverdier kan være misledende. En 14 % cyanopropylfenyldimetyl polysiloksan inneholder 7% cyanopropyl, 7 % fenyl og 86 % metyl. Cyanopropyl- and fenylgrupper sitter på samme silisiumatom, og mengde av disse summeres. Polyetylenglykoler (PEG) benyttes mye som stasjonærfaser. Stasjonærfaser med wax eller FFAP i navnet er polyetylenglykoler. Polyetylenglykoler er ikke substituerte, stasjonærfasen er altså 100 % polyetylenglykol. Polyetylenglykoler er mindre stabile, mindre robuste og har lavere temperaturgrenser enn de fleste polysiloksaner. De vil typisk ha kortere levetid og være mer utsatt for skade ved oppvarming enn polysiloksaner. Polyetylenglykoler er væsker ved temperaturer som benyttes i GC.
- 3 - Kovats retensjonsindeks: Figur 24-6 viser hvordan den relative retensjonen av polare og ikke-polare analytter forandres når polariteten av stasjonærfasen forandres. I fig 24-6a elueres de to forbindelse er etter kokepunkt. Den faktoren som bestemmer retensjonen på denne kolonnen er flyktigheten til forbindelsene. I figur 24-6b vil den sterkt polare stasjonærfasen holde tilbake polare løste stoff. De fire alkanene elueres først, deretter de tre ketonene og til sist de tre alkoholene. Hydrogenbindinger til stasjonærfasen er sannsynligvis den faktoren som bidrar mest til retensjon. Dipolare krefter i ketonene er de nest sterkeste kreftene. Kovats retensjonsindeks (I) er for et rettlinjet alkan antall C-atomer ganger 100. For oktan er I = 800 for nonan er I = 900. Et stoff som elueres mellom oktan og nonan har retensjonsindeks mellom 800 og 900.,, log t r ( ukjent) log t r ( n) I = 100 n + ( N n),, log t r ( N) log t r ( n) der n er antall karbonatomer i alkanet som har færrest C-atomer. N er antall karbonatomer i alkanet som har flest C-atomer. t r '(n) er korrigert retensjonstid for alkanet med færrest C-atomer t r '(N) er korrigert retensjonstid for alkanet med flest C-atomer. ppgave 24-11. Ikke-korrigerte retensjonstider i figur 23-7 er 1,0 min. for CH 4 og 12,0 min. for oktan 13,0 min for den ukjente og 15,0 min for nonan. Finn Kovats retensjonsindeks for den ukjente. log(12) log(11) I = 100 8 + (9 8) = 836 log(14) log(11)
- 4 - Temperatur- og trykkprogrammering. Hvorfor er temperturprogrammering nødvendig? Retensjonstiden i GC er avhengig av damptrykket. Dette betyr at blandinger som inneholder komponenter som koker over et bredt område ikke kan separeres tilfredsstillende i en isoterm kjøring. De mer flyktige komponentene kan være godt oppløst, mens høyere kokende materiale vil elueres med lang elueringstid og som brede topper. Dersom kolonnetemperaturen er høy nok til å gi tilfredsstillende topper for mindre flyktige komponenter vil de lavt kokende forbindelsene ikke være godt oppløst. Løsningen på problemet er å heve temperaturen under kjøringen. Dette kalles temperaturprogrammering, Analyser i gasskromatografi kan utføres isotermt, dvs med konstant kolonnetemperatur eller ved temperaturprogrammering hvor kolonnetemperaturen øker som funksjon av analysetiden. Ved isoterme analyser kan de første stoffene elueres som overlappende topper, mens de høyest kokende stoffene i blandingen kan elueres som brede topper med lang retensjonstid. Isoterme analyser er derfor best egnet for analyse av stoffblandinger med nærliggende kokepunkt. Temperaturprogrammering benyttes for analyse av blandinger med stor variasjon i kokepunkt. Starttemperaturen holdes så lav at de første stoffene elueres som smale separerte topper, og etter som temperaturen øker, elueres stoffene med høyere kokepunkt. Ved et godt temperaturprogram kan stoffer i kompliserte blandinger separeres som smale, symmetriske topper på kortere tid enn ved isoterm analyse. Programmering av trykk I flere moderne kromatografer kan trykket av bæregassen som går inne i kolonnen programmeres elektronisk. Økt trykk, og dermed økt mobilfasehastighet nedsetter retensjonstiden. Gjentatt bruk av høy temperatur kan føre til at stasjonærfasen brytes ned. I noen tilfeller kan programmering av trykk benyttes istedenfor temperaturprogrammering for å redusere retensjonstiden av komponenter som elueres sent. Ved slutten av kjøringen kan temperaturen hurtig reduseres til initell temperatur. Man taper ikke tid ved at en varm kolonne må nedkjøles før neste injeksjon. Programmert trykk er nyttig for labile analytter som ikke tåler høy temperatur.
- 5 - Bæregassen. Man kan man brukes større gasshastighet med H 2 og He som mobilfase, enn man kan med N 2 som mobilfase uten tap av kolonneeffektivitet. Diffusjon av løste stoff i H 2 og He går hurtigere enn i N 2. Innstilling av likevekt mellom løste stoff i mobilfasen og gassfasen går derfor hurtigere. Bæregasser som bør være kjemisk inerte, tørre og oksygenfrie inkluderer helium (He), argon (Ar), nitrogen (N 2 ) and hydrogen (H 2 ). Helium er mye brukt. Kan tørr luft benyttet som bæregass? Nei. Luft inneholder omtrent 20 % oksygen. ksygen er kjemisk reaktiv og kan lett ødelegge GC kolonner. Det er viktig at gassen er av høy renhetsgrad. Forurensing som vanndamp, luft og hydrokarboner kan reagere med prøven og kolonne og også påvirke detektoren. Bæregassen bør være 99,999 % ren. Gassen renses ved at den går gjennom molekylære siler som fjerner fuktighet, kull som fjerner hydrokarboner, og en oksygenfelle som fjerner oksygen. Små variasjoner i bæregassens hastighet vil påvirke kolonnens separasjonsevne og retensjonstiden. Da man ønsker reproduserbare separasjoner er det nødvendig å benytte konstant flow hastighet.
- 6 - Injektorer Væsker injiseres på en gasskromatograf med en sprøyte gjennom et gummiseptum inn i et oppvarmet port som inneholder en silanisert liner. Bærergassen sveiper den fordampede prøven inn i kolonnen. I analytisk kromatografi er det injiserte prøvevolumet typisk 0,1-2 µl. Dekomponerte prøver og ikke-flyktige forbindelser vil langsomt akkumuleres på innsiden av lineren, som må skiftes ut med jevne mellomrom. Forskjellige moder må benyttes for forskjellige typer prøver. Gasser må injiseres i med gasstett sprøyte inn i samme type injektor som benyttes i væskekromatografi. Splitt injeksjon brukes som regel på kapillærkolonner. For meget små mengder benyttes splittløs injeksjon. "solvent trapping" eller "cold trapping" brukes en del ved splittløs injeksjon. Ved "solvent trapping" er den initielle kolonnetemperaturen lav nok til å kondensere løsningsmiddelet ved begynnelsen av kolonne. Løste stoff er meget godt løselige i løsningsmiddelet og fanges i et smalt bånd ved starten av kolonnen. Ved "cold trapping" er den initielle kolonnetemperaturen 150 C lavere enn kokepunktet til de løste stoff, som kondenseres i et smalt bånd ved begynnelsen av kolonnen. I begge tilfeller vil eluering skje når kolonnetemperaturen stiger. n-column injeksjon er brukbar for termisk labile forbindelser som kan dekomponere i den høye temperaturen i injektoren.
- 7 - Detektorer Varmetrådsdetektoren Bæregassen (He eller H 2 som begge har stor varmeledningsevne) strømmer over et oppvarmet filament.
- 8 - Gassen avkjøler filamentet ved å absorbere varme. Forskjellige gasser har forskjellig evne til å absorbere varme, og derved til å avkjøle filamentet. Hvis den elektriske strøm som varmer filamentet holdes konstant, og bæregasshastigheten holdes konstant vil det hurtig innstilles en likevektstemperatur i filamentet. Temperaturen kan måles som elektrisk motstand over filamentet. Hvis bæregassens sammensetning forandres, vil også gassens varmeledningsevne forandres. Dette resulterer i temperaturforandringer i filamentet som igjen registreres som forandring av elektrisk motstand. Flammeionisasjonsdetektor (FID) Den elektriske ledningsevnen i en gass er proporsjonal med konsentrasjonen av ladede partikler i gassen. Bæregassen fra kolonnen blandes med H 2 og forbrenner med overskudd av luft som ledes inn i detektoren. Det er lagt en spenning (300 V) mellom to elektroder, flammespissen som er negativt ladet og kollektorelektroden som er positivt ladet. Under forbrenningen i flammen dannes ioner og frie elektroner i den reduserende delen av flammen. Det vil gå en strøm i detektoren som vil være proporsjonal med mengde stoff som forbrennes. Når bæregassen strømmer gjennom detektoren, kan urenheter i kolonnen og bæregassen gi opphav til en liten konstant respons. Denne bakgrunnsresponsen, som man bør sørge for at er så liten som mulig, kan nullstilles på elektrometret.
- 9 - På skriveren får man da en rett linje kalt grunnlinjen eller basislinjen. Når et organisk stoff forbrenner i flammen, vil det elektriske signal (10-8 til 10-12 A) forsterkes av elektrometret og skrives ut som en topp på skriveren. Detektoren er ikke sensitiv for ikke-hydrokarboner som H 2, He, N 2, 2, C, C 2, H 2, NH 3, N, H 2 S og SiF 4 og er derfor ikke universal. Elektronaffinitetsdetektoren (electron capture detector, EC-detektor) inneholder en radioaktiv β-emitter 3 H eller 63 Ni. Bærergass: N 2 eller 5-10 % innblanding av CH 4 i Ar er de vanligste på pakkede kolonner. H 2 eller He på kapillærkolonner. Det stilles imidlertid de største krav til bæregassens renhet da EC detektoren kontamineres lett. Den radioaktive isotopen ioniserer bæregassen og gir langsomme elektroner. For nitrogen skjer ioniseringen på følgende måte. β + N 2 N 2 + e - Når et potensial blir lagt over to elektroder vil elektronene vandre til anoden slik at det går en konstant strøm på ca 10-8 A. Hvis et stoff AB som inneholder elektronfangende grupper induseres i detektoren reduseres strømmen: ΑΒ + e - ΑΒ Dette strømtapet er et mål for mengden av stoff og dets elektronfangende egenskaper. På grunn av faren for lekkasje har 3 H-detektoren en øvre temperaturgrense på 225 ºC. 63 Ni-detektoren kan brukes opp til 300 ºC. Den spesifikke aktiviteten av 63 Ni-detektoren er 1/3 av 3 H-detektoren. 63 Nidetektoren brukes i analyser hvor det er behov for høy detektortemperatur. EC-detektoren er svært følsom for kontaminering. Hvis høytkokende forbindelser kondenserer i detektoren, medfører dette drastiske tap av følsomhet. høy følsomhet for stoffer som inneholder elektroforer (elektronfangende grupper) o halogener, konjugerte karbonyler og nitratestere. o ingen respons for hydrokarboner, alkoholer og etere. EC-detektoren anvendes for sporanalyser av pesticider og legemidler. Responsen av et stoff kan økes ved derivatisering med reagens som inneholder elektrofore grupper.
- 10 - Primære og sekundære aminer, alkoholer og fenoler kan f. eks. acyleres med heptafluorsmørsyreanhydrid, trifluoreddiksyre anhydrid eller trikloracylklorid. rganiske syrer kan derivatiseres med pentaflurobenzylbromid. Alkaliflammeionisasjonsdetektoren kalles også nitrogen/fosfor detektor (NPD). AFID er flammeionisasjonsdetektor med et alkalisalt plassert ved flammen. Når stoffet brenner i flammen, skapes en rikere ionestrøm for de stoffene som inneholder N og P, men ionestrømmen undertrykkes for hydrokarboner sammenlignet med FID. AFID anvendes til sporanalyser av stoffer som inneholder N og P, f. eks. pesticider, herbicider, legemidler og narkotika. En flammefotometrisk detektor måler emisjon fra fosfor, svovel, bly, tinn og andre utvalgte element. Når eluatet passerer en H 2 /luft flamme som i en FID detektor vil eksiterterte atomer emittere karakteristisk lys, P ved 536 nm og S ved 394 nm. Linjene kan isoleres med et filter og detekteres med et fotomultiplikatorrør. Fotoionisasjonsdetektor bruker en UV kilde til å ionisere aromatiske og umettede forbindelser og gir liten eller ingen respons til mettede hydrokarboner eller halogener. Chemiluminiscens. I en svovel chemiluminiscens detektor vil gasser fra en FID detektor der svovel er oksidert til S blandes med 3 og danne en eksitert tilstand av S 2 som sender ut blått lys og UV-stråling. Emisjonen er proporsjonal med massen av svovel i eluatet, uavhengig av kilden og sensitiviteten er 10 7 ganger større enn sensitiviteten for karbon. Svovel forbindelser! S + produkter S + 3! S 2 * + 2 S 2 *! S 2 + hν I en nitrogen chemiluminiscens detektor vil gasser fra en FID detektor, der nitrogen er oksidert til N, blandes med 3 og danne et eksitert molekyl. Emisjonen er proporsjonal med massen av nitrogen i eluatet, uavhengig av kilden og sensitiviteten er 10 7 ganger større enn sensitiviteten for karbon. Atomemisjon. Eluatet fra kolonna føres inn i en heliumplasma i en mikrobølgehule. Alle elementene i periodesystemet produserer karakteristisk atomemisjon som kan detekteres med en fotodiodearray.
- 11 - Derivatisering. Det er flere årsaker til at det lages derivater av stoffer som skal analyseres med gasskromatografi. Mange legemidler og stoffer som har miljømessig betydning er lite flyktige og har polare funksjonelle grupper som gjør dem lite egnet for gasskromatografisk analyse. Hensikten med derivatisering er da å lage flyktige, termisk stabile derivater av stoffene slik at de blir velegnet for gasskromatografi. Vanligvis gjøres dette ved å omdanne protiske funksjonelle grupper til termisk stabile upolare grupper. Da unngår en også uønskede kolonneinteraksjoner som kan gi adsorpsjon og haledannelser. Derivatisering brukes også for å øke detekterbarheten av stoffene. Spesielt ved bruk av EC-detektor derivatiseres stoffene med EC-sensitive reagenser. Dette kalles detektororientert derivatisering. Silylering. Alkylsilylreagensene er de mest universelle reagensene for polare molekyler som inneholder protiske funksjonelle grupper, hydroksyl, karboksylsyrer, aminer, tioler og fosfater). Nesten alle funksjonelle grupper som gir problemer i gasskromatografi kan silyliseres. De mest vanlig derivater som dannes er trimetylsilylderivater (TMS-derivater). H byttes ut med SiMe 3 TMS donorer. (Reaksjonene går uten bireaksjoner i løpet av 5 minutter.) CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C NH CH 3 CH 3 Si Cl CH Si Si 3 CH 3 Trimetylklorosilan CH 3 CH 3 Heksametyldisilazan CH 3 CH 3 F CH 3 C N Si CH 3 F C C N Si CH 3 CH 3 F CH 3 CH 3 N-metyl-N-(trimetylsilyl)acetamidN-metyl-N-(trimetylsilyl)trifluoroacetamid H CF 3 NH CH 3 Si CH 3 TMS CH 3 Acylering. Funksjonelle grupper som gir acylerte derivater er aminogrupper, hydroksygrupper og tioler Anhydrider og syreklorider kan benyttes som reagenser. Halogenholdige reagensene vist seg å gi stabile, flyktige derivater velegnet for gasskromatografi.
- 12 - Derivatene kan detekteres med flammeionisasjonsdetektor. Halogenholdige derivater kan gi deteksjonsgrenser i pg området med ECdetektor. Fluorerte derivater har bedre gasskromatografiske egenskaper og høyere flyktighet enn derivater med klor og brom. Vanligvis gir monoklorerte og diklorerte derivater høyere respons med ECdetektor enn trifluorerte derivater. Derivater med klor eller brom har imidlertid ikke så gode gasskromatografiske egenskaper som de fluorerte derivatene. De har lavere stabilitet og flyktighet og gir lenger retensjonstid. Innføring av flere fluoratomer i reagensene gir imidlertid høyere ECrespons uten nevneverdig forhøyelse av retensjonstiden. Heptafluorbutansyreanhydrid har vist seg å være et godt kompromiss mellom derivatenes flyktighet og respons med EC-detektoren. R C Cl + R' NH 2 R C NHR' + HCl H 3 C CH 2 H + CF 3 CF 3 CH 2 H 3 C CF 3 CF 3 H 3 C CH 2 H N + CH 2 + N H 3 C CF 3 Alkylering. Betegnelsen alkylering dekker en rekke reaksjoner hvor et aktivt hydrogen erstattes med en alkylgruppe, f. eks. en metylgruppe eller en etylgruppe. En rekke reagenser og metoder benyttes, slik som reaksjon med alkylhalogenider, diazoalkaner og N,N'-dimetylformamid dialkylacetal. NH N Estrifikasjon. R C H + R' H R C R' + H 2
- 13 - Prøveopparbeidelse. Fast-fase mikroekstraksjon SPME Fast-fase mikroekstraksjon SPME er en enkel teknikk for å ekstrahere forbindelser fra væsker, luft eller en oppslemming uten bruk av løsningsmiddel. En kvartsfiber er dekt med en 10-100 µm film av en ikke-flyktig stasjonærfase. Stasjonærfasen er av liknende type som stasjonærfaser som benyttes i gasskromatografi. Fiberen er festet til basis av en sprøyte med en metallnål. Fiberen kan trekkes ut fra nålen og trekkes tilbake inn i nålen. Fiberen eksponeres for løsningen (el. gassen over løsningen) i et bestemt tidsrom, mens løsningen røres og i enkelte tilfelle varmes. Kun en fraksjon analytt i prøven ekstraheres inn i fiberen. Deretter trekkes fiberen inn i sprøyten og injiseres i gasskromatografien. Fiberen skyves inn i sprøyten og injiseres i "lineren". Her vil analytten desorberes (motsatt av å absorberes) fra fiberen. Man benytter splittløs mode. "Cold trapping" samler analytten som er desorbert på inngangen til kolonnen. m = KV C V KV f f 0 s + V s V f volumet av film på fiberen V s volumet av løsning som analytten skal ekstraheres fra. C o initial konsentrasjon av analytt K partisjonskoeffisienten for analytt mellom film og løsning. K = C f /C s Purge and trap Dette er en metode for å fjerne flyktige analytter fra væsker eller faste stoff, konsentrere analyttene og injisere de i gasskromatografen. I motsetning til fast-fase mikroekstraksjon som kun fjerner en del av analytten fra prøven, er målet med purge and trap å fjerne 100 % av analytten fra prøven. Kvantitativ fjerning av polare analyter fra polare matrikser kan være vanskelig. Ved "purge and trap" samles all analytt fra den ukjente og alt injiseres på den kromatografiske kolonnen.
- 14 - Splittløs injeksjon kreves for at ikke analytt skal gå tapt under injeksjon. Ethvert tap av analytt vil lede til feil i den kvantitative analysen