Luftveisinfeksjoner - PCR-basert diagnostikk Anne-Marte Bakken Kran Overlege, førsteamanuensis Mikrobiologisk avd. UOS Ullevål
Temaer PCR-basert mikrobiologisk diagnostikk Klinisk betydning av funn/fravær av funn Når teste? For hva? Hva med hurtigtester?
Arvemateriale Sekvens Dobbeltrådet DNA Mikroorganisme Arvemateriale Bakterier, Sopp, parasitter: DNA Virus: DNA eller RNA Retrovirus: RNA cdna
Dobbelttrådet DNA Hydrogenbindinger Cytosine (C) Adenine (A) Thymine (T) Guanine (G) Guanine (G) Thymine (T) Adenine (A) Cytosine (C) Deoxyribose Fosfatgruppe
Dobbelttrådet DNA Bindingen er reversibel, styrken avhengig av: Temperatur Nukleinsyretrådenes lengde og basesammensetning Hydrogenbindinger mellom de komplementære basene: Adenine (A) = Thymine (T) Guanine (G) = Cytosine (C) Komplementaritet
PCR Isolering/rensing av DNA/RNA Oppformering av et område av DNA med PCR Påvisning av PCR-produkt
Primere: Spesifikke for mikroben man skal påvise Primersekvensene må være unike for mikroorganismen Primere må binde seg til et område av DNA som ikke varierer innen mikroorganismen
PCR 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon No. No. kopier av syklus målsekvensen 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824
PCR syklus 1) DNA-trådene separeres 2) Primere bindes til hver sin målsekvens 3) DNA syntese 4) Påvisning av PCR produkt
PCR kurve Pasientprøver
Direktepåvisning, PCR Amplifikasjon av mikrobens arvemateriale Rask diagnostikk God spesifisitet Bedre sensitivitet enn dyrkning Pris ca 100 kr pr analyse (reagenser)? NB Redusert sensitivitet pga: Prøve tatt sent i forløpet Ikke representativ prøve
Falsk positiv PCR (kontaminasjon: ved prøvetaking / i lab.) Agens påvist med PCR: Klinisk betydning Behøver ikke være årsak til sykdom påviser også latente virus, kolonisering, bærerskap Behøver ikke være smitteførende påviser også arvematerialet fra døde mikroorganismer Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet
Absence of detection is NOT Detection of absence
Negativ PCR utelukker ikke infeksjon Prøven Valg av prøvemateriale og riktig prøvetaking (Prøven må tas fra der smittestoffet er) Tidspunkt i forhold til infeksjonsforløpet (Prøven må tas når smittestoffet er der) Prøvevolum Oppbevarings-tid og -temperatur (degradering av RNA og DNA) Primer-/probesekvenser (eks. ny Chlamydia-variant i Sverige 2001-2007) Hemming av PCR reaksjonen
Hvor dyp er egentlig en dyp neseprøve? Foto: ArcDia Ltd
PCR ANALYSER VED LUFTVEISINFEKSJON
PCR analyser ved luftveisinfeksjon: Analyser ved mikrobiologisk avd OUS Luftveisvirus: Influensavirus A, B subtyping A(H1 el.h3) Parainfluensavirus 1, 2, 3, 4 Respiratorisk syncytialvirus (RS) Humant metapneumovirus Adenovirus Rhinovirus (Enterovirus D68) Luftveisbakterier: Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Bordetella pertussis Legionella (ved RH)
Luftveis PCR < 2 uker etter symptomdebut (virus) < 4 uker etter symptomdebut (bakt) Materiale: Nasopharynxaspirat eller dyp neseprøve + halspensel (virustransportmedium, UTM) Prøve fra nedre luftveier Virusinfeksjon: Avtagende sensitivitet av PCR etter 1. sykdomsuke (adenovirus trolig positiv lenger)
Nytteverdi? Betydningen av positivt Årsak til infeksjon? PCR-funn? Asymptomatisk bærerskap/lett klinisk kolonisering i perioder, spesielt i sesongen? Langvarig utskillelse etter infeksjon? Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet. Ofte påvises flere agens samtidig
Flere ulike agens påvist i samme prøve Klinisk betydning? Semikvantitativ PCR: Positive funn graderes internt hos oss (sterk, moderat og svak reaksjon) Veiledning ved vurdering av flere funn samtidig?
Når er det aktuelt å ta prøve? Sykehistorien er kort (< 2 uker) OG Pasienten har luftveissymptomer OG Svaret får klinisk betydning
Når har svaret klinisk betydning? Behandlingskonsekvenser? Influensa (i sesong), Mycoplasma/chlamydophila (klinikk/målgruppe), Kikhoste Risikogrupper? Differensialdiagnostisk? Foreskriver man mindre antibiotika hvis virus påvises? Ett agens utelukker ikke et annet Annet?
Kliniske opplysninger på rekvisisjonen er avgjørende for god diagnostikk
Hvilke agens er av interesse? Influensa Mycoplasma/chlamydophila Svært få tilfeller utenom mini-epidemier Kikhoste Andre?
Funn luftveissesongen hittil i 2015
Funn luftveissesongen 2014/2015
http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_
http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_
Hva med hurtigtester?? Høy spesifisitet, lavere sensitivitet sammenliknet med molekylære metoder/dyrkning Relativt dyre Egnethet må vurderes mot hvor hyppig den aktuelle infeksjonssykdommen opptrer
Hurtigtester, luftveisagens Agens Sensitivitet Spesifisitet Materiale S. pyogenes (GAS) ag. 65 80 % > 98% Hals Pneumokokk ag. 50 80% 97 % Urin Legionella pneumophila ag. 92 % > 99% Urin Influensavirus ag. 60 80 % >95% Nasoph. RS-virus ag. 50-85% 90-98% Nasoph.
PCR: man finner bare det man leter etter Manglende påvisning utelukker ikke infeksjon Prøve må tas tidlig i sykdomsforløpet Klinisk indikasjon K ommunikasjon med laboratoriet (rekvisisjon, telefon, prøvesvar, nettsider)