NORSK UNDERVANNSINTERVENSJON A.S

iridustrielt NORSK UNDERVANNSINTERVENSJON A.S Postboks 23, 5848 Bergen. Telefon: 55 94 28 00 Telefaks: 55 94 28 04 Rapport nr: 01 01 Revisjon nr: I Dato : Prosjekt nr: 27.04.2001 64010 Rapportens tittel : Kontrollert av Kåre Segadal Limonen - avfettingsrniddel og arbeidsmiljøfaktor. Toksisitet og mekanismer ved samtidig eksponering for oksygen. Godkjent Klient/oppdragsgiver: NHO ved NHOs Arbeidsrniljøfond, Statoil, Norsk Klients/kontaktpersons referanse: Hydro, Exxon Mobil, Statens Forurensningtilsyn, Stolt-Rockwater Joint 5. Møllerud, NITO; E.W. Svendsen, Statoil; H. Venture og Oljedirektoratet Holm, SFT; B. Sandvik, Stolt-Rockwater JV. Arbeidet utført av : Rune Djurhuus, Veslemøy Rolseth, Torill Sage, Anne Gurd Lindrup, Harald Sundland og Asbjøm Svardal. Rapportskrivers signatur: Sammendrag : Limonen er et monoterpen som finnes i en rekke planter og spesielt i sitrusfrukter. Det har vært lansert som et alternativt avfettingsmiddel i industriell sammenheng for å erstatte halogenerte hydrokarboner. Lirnonen og eventuelle reaksjonsprodukter vil i økende grad være aktuelle som kjemiske arbeidsmiljøfaktorer. En arbeidsatmosfære består oftest av en rekke kjemiske faktorer, og noen av disse kan sannsynligvis danne frie radikaler. Slik forurensning kan føre til en overbelastning av cellulære avgiftningsmekanismer og resultere i synergistiske skadeeffekter. I det foreliggende arbeidet er kombinasjonen av lirnonen og oksygen benyttet som en forenklet modell for å undersøke kombinasjonseffekter av kjemisk forurensning i arbeidsatmosfæren. Humane lungeceller i kultur er brukt som biologisk modellsystem og eksponert for limonen i kombinasjon med hhv 20 og 50 % oksygen. Resultatene tyder på at under betingelser som best etterligner in vivo situasjonen har oksygen og antakeligvis andre oksidative forbindelser ikke noen forsterkende gifteffekt på limonen utover en ren additiv effekt. Undersøkelsene støttet ikke andres antydninger om at oksidasjonsproduktet limonen 1,2-epoksid er den aktive komponenten ved limonen giftighet. Resultatene tyder også på at avgiftning av lirnonen i humane lungeceller ikke involverer glutationsysternet og peker på mulige langtidseffekter. Fordi dykkere puster i en atmosfære med forhøyet oksygenpartialtrykk bør man være klar over den additive effekten av limonen og oksygen når kvaliteten på pustegassen til dykkere skal evalueres. Tilgjengelig kunnskap viser at virkningsmekanismen for limonen på biologiske systemer i kombiiiasjon med oksidative forbindelser ikke er klarlagt. I lys av at mennesker hyppig eksponeres for slike kombinasjoner anbefales det en videre forskningsinnsats på dette feltet. Rune Enmeord p engelsk: limonene lung ceils oxygen toxicity Emneord på norsk: limonen lungeceller oksygen giftighet ERKLÆRING VED FORDELING: Fortrolig Graderingen gjelder til ISBN: 82-728i-473-5 x Fri Distribusjon Antall Sider : 10

INNHOLD SIDE i INNLEDNING 2 2 METODER 3 2.1 MODELLSYSTEM 3 2.2 EKSPONERFNG FOR OKSYGEN 3 2.3 MÅLEPARAMETRE 4 2.4 STATISTISKE ANALYSER AV DATA 4 3 RESULTATER 4 3.1 AKUTT-GIFTIGE EFFEKTER AV LIMONEN 4 3.2 KOMBINASJONSEFFEKTER AV LIMONEN OG OKSYGEN 4 3.3 CELLULÆR AVGIFTNING 6 3.4 LANGTIDSEFFEKTER 6 4 KONKLUSJONER 8 5 TILTAK FOR INFORMASJONSSPREDNING 8 6 LITTERATURREFERANSER 8 7 KONTAKTPERSON 9

2 INNLEDNING Limonen er et monoterpen som finnes i en rekke planter og spesielt i sitrusfrukter. Appelsinskallolje består f.eks. av mer enn 90 % lirnonen. Det brukes kommersielt i lave konsentrasjoner som aromatilsetning i en del næringsmidler, kosmetikk og i en rekke husholdningsartikler, bl.a. rengjøringsmidler. Det har i de senere år vært lansert som et alternativt avfettingsmiddel i industriell sammenheng, bla for å erstatte halogenerte hydrokarboner som bryter ned ozonlaget. I disse produktene varierer innholdet av limonen fra noen få prosent og opp til 100 %. Pinen og karen er to andre terpener som kjemisk sett ligner på limonen og som finnes i betydelige mengder i trevirke. Nylige svenske undersøkelser har indikert at arbeidstakere på sagbruk og snekkerverksteder er eksponert for betydelige mengder terpener, i en del tilfeller over gjeldende grenseverdier for yrkeseksponering. Resultatene indikerer både akutte og kroniske reduksjoner i enkelte lungefunksjonspararnetre (1). Vi har tidligere påvist at lirnonen ofte er tilstede i betydelige mengder i atmosfæren i trykkkamre der dykkere oppholder seg under metningsdykking (2). Det synes klart at limonen og andre monoterpener samt eventuelle reaksjonsprodukter som kan dannes fra disse i atmosfæren i økende grad vil være aktuelle som kjemiske arbeidsrniljøfaktorer. Limonen er bare moderat akutt-giftig i dyreforsøk, og har primært vært betraktet som et allergifremkallende stoff. På grunn av den kjemiske strukturen kan limonen lett oksideres. Tidligere undersøkelser har vist at allergipotensialet økte når limonen ble eksponert for luft, og det har vært antatt at oksidasjonsproduktet limonen I,2-epoksid var den aktive kornponenten (3). En undersøkelse utført på mennesker med frivillige forsøkspersoner viste at når de inhalerte luft forurenset med limonen fikk de en liten, men merkbar reduksjon i vitalkapasiteten (4). Det er godt dokumentert at limonen gir kreft i nyrene, men denne effekten er både arts- og kjønnsspesifikk i det den kun oppstår hos hannrotter, dette pga et spesielt protein som finnes i nyrene til disse dyrene (5). Faktisk er limonen vist å ha effekt mqi en del kreftforrner og er nå under klinisk utprøvning som et kjemoterapeutisk middel mot kreft (6). Dette tilsynelatende motstridende faktum er ikke ukjent, cellegifler som brukes i kreftbehandling er i utgangspunktet giftige og kan ha flere typer effekter, noe som bla er avhengig av sammenhengen det gis i. Bortsett fra studiene om allergisk og kreftfremkallende potensial er kunnskapen om gifteffekter av limonen og dets oksidasjonsprodu1rter begrenset. En arbeidsatmosfære vil dessuten oftest bestå av en rekke kjemiske faktorer, og noen av disse kan sannsynligvis danne frie radikaler. Flere rapporter har pekt på at limonen lett kan reagere med andre kjemikalier og danne nye, mer skadelige forbindelser. Det er da også nylig vist at limonen og ozon hadde synergistiske effekter på luftveiene hos mus (7). Kombinasjonen av

limonen og en oksiderende forbindelse kan derfor være en forenklet og anvendelig modell for å undersøke kombinasjonseffekter av kjemisk forurensning i arbeidsatmosfæren. 3 Alle dyr og mennesker er utstyrt med en rekke systemer som beskytter oss mot forskjellige skadelige påvirkninger. En av de sentrale forsvarsmekanismene som finnes i alle celler i kroppen hos pattedyr er glutationsysternet. Det avgifter både oksidative forbindelser, frie radikaler og en rekke andre kjemiske forbindelser. Dersom organismen samtidig utsettes for en rekke forskjellige kjemikalier kan disse forsvarsmekanismene overbelastes og føre til betydelige skadevirkninger. Det er kjent fra tidligere at oksygen i seg selv kan være skadelig, og rnerkbare skadelige effekter av oksygen er bl.a. dokumentert hos offshoredykkere som hadde vært eksponert for et forhøyet oksygenpartialtrykk (8). Dette tyder på at i denne sammenhengen klarer forsvarsmekanismene ikke å yte full beskyttelse. Vi har tidligere ved eksperimentelle studier dyrket humane lungeceller i kultur og vist at oksygen har akutt-giftige effekter, har gitt forbigående reduksjon i avgiftningsmekanismen glutation, og at det førte til en vedvarende reduksjon i formeringsevnen til cellene (9, 10). Formålet med det foreliggende arbeidet var derfor å studere kombinasjonseffektene av limonen og oksygen på humane lungeceller ved å benytte oksygen som en modellsubstans for en oksidative forbindelse som er tilstede over alt. Samtidig ønsket vi å skaffe informasjon om mekanismen bak disse effektene ved å sammenligne med effekten av et.de viktigste oksidasjonsproduktene av limonen, og å undersøke hvilken rolle avgiftningssysternet glutation spiller i denne sammenheng. 2 METODER 2.1 MODELLSYSTEM Humane lungeceller (CCD-l9Lu, American Type Culture Collection, USA) ble dyrket i kultur ved 37 C. Cellene ble dyrket på skåler av plast (6 cm i diameter) eller i brønnplater (24 bronner pr. plate, 1, 6 cm i diameter) i et dyrkningsmedium (EMEM) tilsatt 10 % varmeinaktivert, føtalt kalveserum. Cellene ble eksponert for limonen og lirnonen 1,2- epoksid ved å løse de konsentrerte forbindelsene i etanol, og deretter tilsette de i aktuelle mengder til cellekultunnediet. Etter endt eksponeringstid (24-72 timer) ble cellene høstet for måling av forskjellige pararnetere som angitt, eller cellene ble gitt nytt medium uten tilsetninger for å undersøke langtidseffekter. 2.2 EKSPONERTNG FOR OKSYGEN Cellekulturene ble eksponert for oksygen ved å plassere dem i et sylindrisk trykk-kammer i syrefast stål, og deretter skifte ut luften inne i trykk-kammeret med en gassblanding bestående av oksygen på hhv 20 eller 50 %, 5 % karbondioksid (for å holde riktig surhetsgrad i kultunnediet) og resten helium. I tillegg ble det i hvert eksperiment

4 inkludert en kontroligruppe som ble behandlet likt med de øvrige bortsett fra at denne ble dyrket i en standard inkubator ved 37 C i en atmosfære bestående av 5 % karbondioksid i luft, 2.3 MÅLEPARAMETRE Flere sentrale cellulære funksjoner ble undersøkt i tråd med tidligere beskrevne metoder (9, 10). Forrneringsevne ble målt ved å telle antall celler før og etter eksponering relativt til en kontroligruppe. Gifteffekter ble uttrykt som en reduksjon i formeringsevnen i løpet av eksponeringsperioden. Cellenes omsetningsaktivitet (metabolisme) ble bestemt ved å måle aktiviteten av et enzym som finnes i mitokondriene i cellene. Cellenes evne til å feste seg på en overflate, deretter dele seg og danne kolonier av celler (klonogent assay) ble også undersøkt ved forskjellige eksponeringer. Avgifiningsmekanismen glutation ble undersøkt ved å måle nivået av både totalt og redusert glutation inne i cellene etter eksponering for lirnonenloksygen. Langtidseffekter ble undersøkt ved å måle tilveksten (antall celler) i kulturene i inntil syv døgn etter endt eksponering. 2.4 STATISTISKE ANALYSER AV DATA Resultatene ble beregnet som gjennomsnitt ± standardavvik a parallelle observasjoner. De ble evaluert vha Students t-test og ved variansanalyse (ANOVA) med Scheffés F, Bonferroni/Dunn og Tukey-Kramer sine prosedyrer for multiple sammenligninger. Effekter ble antatt å være signifikante når p < 0,05. 3 RESULTATER 3.1 AKUTT-GIFTIGE EFFEKTER AV LIMONEN Eksperimenter med økende doser av lirnonen viste at limonen hadde økende gifieffekter på de hurnane lungecellene. Limonen konsentrasjoner opptil 100 jim hadde ikke negative effekter, mens konsentrasjoner over 500 iim var meget giftig og førte til omfattende celledrap i alle de forskjellige metodene som ble benyttet. In vivo data fra dyrestudier har vist at limonen er moderat giftig ved iimtak gjennom murmen sammenlignet med f.eks. fenol (11). Tidligere undersøkelser ved vårt laboratorium og de foreliggende resultatene indikerer derimot at lirnonen er mer giftig enn fenol overfor humane celler og celler fra mus. Denne forskjellen kan tyde på at for noen kjemikalier er celler i kultur en mer sensitiv indikator for lokale skadeeffekter enn det man observerer når man bestemmer dødelige doser etter inntak gjennom munnen på hele dyr. 3.2 KOMBINASJONSEFFEKTER AV LIMONEN OG OKSYGEN Når cellekulturene ble eksponert for limonen og oksygen under betingelser som best etterligner situasjonen for et helt individ (dvs, in vivo) hadde de to kun additive effekter. Det vil si at kombinasjonseffekten var lik summen av effektene limonen og oksygen hadde

5 120 2 0-100 80 0 100 200 300 400 [Limonen], 1iM Fig.1: Cellulær (metabolsk) aktivitet i humane lungeceller eksponert i 24 timer for lirnonen samtidig med hhv 20 eller 50 % oksygen. Resultatene er fra et representativt eksperiment og er vist i % av de respektive kontrollgrupper (hhv 20 og 50 % oksygen) uten limonen tilsats. Hvert punkt er gitt som gjennomsnittet av seks paralleller ± standardavvik. hver for seg. Et eksempel på dette er vist i Fig. 1, der den cellulære (metabolske) aktiviteten i cellene er en indikasjon på cellenes helsetilstand. Resultatet er her angitt som prosent av kontrolignippen (uten limonen) i hver av de to gruppene eksponert for hhv 20 og 50 % oksygen. Ut fra den kunnskapen man hadde tilgjengelig kunne man forvente at kombinasjonseffekten var større enn summen av de to effektene hver for seg (synergistisk effekt). Flere cellulære parametre ble undersøkt ved tilsvarende eksponeringsbetingelser i en rekke forsøk. Selv om enkelte av disse viste mindre forskjeller og en viss økning i gifteffekt, viste en samlet statistisk analyse (ANOVA) av alle resultatene at oksygen ikke forsterket gifteffekten av limonen utover en ren additiv effekt. Dette tyder på at oksidasjon eller radikaldannelse fra limonen ikke spiller en vesentlig rolle i virkningsmekanismen for giftigheten av limonen. Dette støttes også av det faktum at limonen var mer giftig eim limonen I,2-epoksid ved de fleste metodene som ble benyttet. Dette var noe oveltaskende ettersom andre har indikert at limonen oksideres lett og at limonen i.2-epoksid er den mest aktive komponenten i limonen som er eksponert for luft (12). Det virker usannsynlig at 50 % oksygen ikke vil gi i det minste en delvis oksidasjon av lirnonen. Når de foreliggende

resultatene viser at limonen I,2-epoksid var mindre giftig enn limonen og at oksygen ikke reduserte giftigheten av limonen, kan dette tolkes som at oksidasjon av limonen ikke primært resulterer i dannelse av limonen i,2-epoksid men går til andre produkter. 6 3.3 CELLULÆR AVGIFTN1G Forsøkene viste at oksygen økte glutationnivået betraktelig i tråd med tidligere undersøkelser (10), men at limonen ikke hadde noen signifikant effekt, verken alene eller i kombinasjon med oksygen (Fig. 2). Denne mangelen på respons etter eksponering for limonen kan tyde på at glutationsystemet ikke spiller noen stor rolle i avgiftning av lirnonen, men at evt. beskyttelse foregår via andre mekanismer. (-) 0 ( i I. 0 H 0 10 25 50 100 150 200 [Limonen], j.im Fig. 2: Nivå av avgiflningssystemet glutation i humane lungeceller eksponert i 24 timer for limonen samtidig med hhv 20 eller 50 % oksygen. Totalt glutation er summen av redusert og oksidert glutation i nmol pr. million celler, og hvert punkt er gitt som gjennomsnittet av tre paralleller ± standardavvik. 3.4 LANGTIDSEFFEKTER Tidligere undersøkelser ved vårt laboratorium har vist betydelig og vedvarende reduksjon i veksthastighet hos humane lungeceller i kultur etter at eksponering for oksygen var

7 avsluttet (10). De foreliggende resultatene viste at eksponering i 72 timer for et visst nivå av limonen (250 jim) førte til en merkbar reduksjon i veksten (Fig. 3). Etter flere døgn i kultur så det ut som cellene var delvis restituert, men de stoppet å formere seg på et signifikant lavere nivå enn kontrollgruppen. Dette kan tyde på langtidseffekter av limonen. Ved høyere nivå av limonen (300 jim i Figur 3) ble alle cellene enten drept eller fullstendig inaktivert mhp formeringsevne, noe som kan tyde på at der er en skarp grense mellom nivået der limonen ikke har effekter og der det har store skadeeffekter. 1O o o Kontroll 200 im unionen 250 im lirnonen 300 tm limonen cj) a) -4 i o I o 0 4 8 12 16 Døgn etter at cellene ble satt i kultur 20 Fig. 3: Langtidseffekter av lirnonen: Celler i aktiv vekst i kulturskåler ble eksponert for lirnonen som angitt i 72 timer. Deretter fikk cellene nytt, friskt medium uten limonen og ble dyrket videre. Antall celler pr. skål ble bestemt på de angitte tidspunkt. Hvert punkt er gitt som gjennomsnittet av tre paralleller ± standardavvik. Den horisontale linjen indikerer tidsrommet for eksponering for limonen. For mer utførlige resultater henvises det til manuskript utarbeidet på bakgrunn av dette prosjektet og sendt inn til publisering i internasjonalt, vitenskapelig tidsskrift (13).

8 4 KONKLUSJONER Det foreliggende arbeidet har vist at limonen i konsentrasjoner opp til 100 im ikke hadde negative effekter, mens konsentrasjoner over 500 jim var meget giftig overfor hurnane lungeceller i kultur. Resultatene tyder på at under betingelser som best etterligner in vivo situasjonen har oksygen og antakeligvis andre oksidative forbindelser ikke noen forsterkende gifteffekt på limonen utover en ren additiv effekt. Undersøkelsene støtter ikke andres forslag om at lirnonen 1,2-epoksid er den aktive komponenten ved giftighet av lirnonen. Resultatene tyder også på at avgiftning av limonen i hurnane lungeceller ikke involverer glutationsystemet og peker på mulige langtidseffekter. For dykkere som puster i en atmosfære med forhøyet oksygenpartialtrykk bør man være klar over den additive effekten av limonen og oksygen når kvaliteten på pustegassen til dykkere skal evalueres. Den tilgjengelige kunnskapen viser at virkningsmekanismen for limonen på biologiske systemer og spesielt i kombinasjon med oksidative forbindelser ikke er klarlagt. I lys av at mennesker hyppig eksponeres for slike kombinasjoner anbefales det en videre forskningsinnsats på dette feltet. 5 TILTAK FOR INFORMASJONSSPREDNING I tillegg til den foreliggende rapporten og den vitenskapelige publikasjonen planlegges det å presentere resultatene på det 48. Nordiske arbeidsmiljømote i Trondheim 3-5.09.200 1. 6 LITTERATURREFERANSER 1. Eriksson, K.A., Levin, J.O., Sandström, T., Lindström-Espeling, K., Lindén, G. and Stjernberg, N.L. 1997. Terpene exposure and respiratory effects among workers in Swedishjoinery shops. Scand. J. Work Environ. Health, 23: 114-120. 2. Segadal, K., Malvik, B., Djurhuus, R., Viker, H., Eknes, E. and Hag, R. 1994. Utvikling av standard prosedyre for prøvetaking og analyse av kjemisk forurensning i dykkeratmosfære. NUTEC-rapport 23/94. 3. Karlberg, A-T. and Lindell, B. 1993. Limonene. In: Beije, P. aud Lundberg, P. (Eds.), Criteria Documents from the Nordic Expert Group 1993, Nordic Council., Arbete och Hälsa 1993:35: 207-246. 4. Falk-Filipsson, A., Löf, A., Hagberg, M., Hjelm, E.W. and Wang, Z. 1993. d Limonene exposure to humans by inhalation: Uptake, distribution, elimination, and effects on the pulmonary function. J. Toxicol. Environm. Health 38: 77-88. 5. Whysner, J. and Williarns, G.M. 1996. d-limonene mechanistic data and risk assessment: Absolute species-specific cytotoxicity, enhanced cell proliferation, and tumnor promotion. Pharmacol. Ther. 71: 127-136.

9 6. Crowell, P.M. 1999. Prevention and therapy of cancer by dietary monoterpenes. J. Nutr. 129: 775S-778S. 7. Wolkoff, P., Clausen, P.A., Wilkins, C.K. and Nielsen, G.D. 2000. Formation of strong airway irritants in terpene/ozone rnixtures. Indoor Air 10: 82-91. 8. Thorsen, E., Segadal, K., Reed, J.W., Elliott, C., Gulsvik, A., and Hjelle, J.O. 1993. Contribution ofhyperoxia to reduced pulmonary function after deep saturation dives..j.appl. Physiol. 75: 657-662. 9. Djurhuus, R.., Svardal, A.M. and Thorsen, E.T. 1998. Toxicity of hyperoxia and high pressure on C3H/1OT1/2 ceils and effects on cellular glutathione. Undersea Hyperbar. Med. 25: 33-41. 10. Djurhuus, R., Svardal, A.M. and Thorsen, E.T. 1999. Glutathione in the cellular defense of hurnan lung celis exposed to hyperoxia and high pressure. Undersea Hyperbar. Med. 26: 75-85. 11. RTECS. 2000. Registry oftoxic Effects to Chemical Substances (RTECS). CD-ROM, National Institute for Occupational Safety and Health, USA. 12. Karlberg, A-T., Shao, L.P., Nilsson, U., Gäfvert, E. and Nilsson, J.L.G. 1994. Hydroperoxides in oxidized d-lirnonene identified as potent contact allergens. Arch. Dermatol. Res. 286: 97-103. 13. Rolseth, V., Djurhuus, R. and Svardal, A.M. 2001. Additive toxicity of limonene and 50 % oxygen and the role of glutathione in detoxification in human lung celis. Submitted for publication. NIJI report 04-01. 7 KONTAKTPERSON Spesialist Rune Djurhuus, NUT AS Pb. 23, 5848 Bergen Tif. 55 94 28 35/00 Fax: 55 94 28 04 E-post: rdjnui.no