Nutec //, _ NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S. Rapport nr: Revisjon nr: 1 Dato : Prosjekt nr:

Transkript

1 Nutec NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S Postboks 6, 5034 Ytre Laksevåg. Telefon (05) Telex nutec n. Telefax: (05) Rapport nr: Revisjon nr: 1 Dato : Prosjekt nr: Rapportens tittel : Kontrollert av : Effekt av helioks på lufveisepitel in vitro Otto Tnge Molvær Godkjent av : / Einar Thorsen / //, _ Klicnt/oppdragsgiver : FUDT Klientsfkontaktpersons referanse: Cato Hordnes Arbeidet utført av : Sverre K. Steinsvåg, Øystein H. Berg, Otto I. Molvær Rapportskrivers signatur: ( // (_._// Sammendrag: Infeksjoner er hyppigste medisinske problem under metningsdykking. Vi ville undersøke om helioks kunne ha uheldig innvirkning på luftveisslimhinnen, som er første linje i infeksjonsforsvaret mot luftveisinfeksjoner. Human luftveisslimhinne dyrket i kultur ble eksponert for normobar helioks med P 2 = 21 kpa i 10 dager. Kulturrnediet ble skiftet en gang i løpet av eksponeringen. Det ble ikke funnet forskjell på vev eksponert for normobar helioks og kontrollvcv dyrket i luft. Etter en ukes hyperbar heliokseksponering ved 1,6 MPa, svarende til 150 msv, og gjennomsnittlig P 2 = 38 kpa, var der en del degenerative forandringer. Årsakene til dette kan vi ut fra aktuelle esperimenter ikke si noe sikkert om, men det kan ha hatt sammmenheng også med andre faktorer enn helioksat.mosfæren, som f.eks. kompresjonsrate, ph-kontroll og dekompresjonsrate. Når det gjelder den mulige effekten av hyperbar helioks, peker det forhøyede oksygen-deitrykket seg ut som den faktoren det først og fremst kunne være aktuelt å studere nærmere. Emneord på engelsk Heliox Satuartion diving Respiratory mucosa Tissure culture In vitro testing Emneord på norsk Helioks Metningsdykking Luftveisslimhinne Vevskultur In vitro-testing ERKLÆRING VED FORDELING Fortrolig Graderingen gjelder til ISBN: x Fri Distribusjon Un 3iclig ti)lai1e & N UTEC må rppim1 Ikke gjmgis aiut mm I In lellt. Antall Sider: 8

2 2 Innhold. side Introduksjon 3 Metode 3 Resultater 4 Diskusjon 5 Referanser 6 Figurtekster 7 Figurer 8

3 3 Introduksj on. Det er dokumentert at metningsdykkere har mer virusinfeksjoner enn normalbefolkningen (1). De får også redusert sin lungefunksjon raskere enn forventet (2). Man vet ikke sikkert hva dette skyldes. Dykkere oppholder seg i en lukket kammeratmosfære der de eksponeres for kunstige pustegasser som helioks-blandinger. Kammeratmosfæren kan også bli tilført flyktige stoffer fra maling på kammerveggene, lim på varmtvannsdraktene og oljeforurenset vann. I sveisehabitat blir atmosfæren forurenset av dekkgasser, ozon og tungmetaller. Det er nylig publisert en modell for normal luftveisslimhinne i vevskultur (3). I denne modellen kan man studere hvordan slimhinnens struktur påvirkes av ulike faktorer. Man kan også studere funksjon av flimmerhår. Denne modellen ble vurdert som formålstjenelig til å undersøke om dykkernes pustegass i seg selv kunne ha noen skadelige effekter på luftveisslimhinnen. Metode. Biter av nylig fjernede falske mandler fra mennesker overføres til et spesielt vevskultursystem. Bitene, som i utgangspunket er kubiske, runder seg i løpet av fem til ti dager opp til tilnærmede kuler. Disse kulene er dekket av et normalt luftveisepitel med flimmerhår. Strukturen forøvrig er også lik den vi finner i normal luftveisslimhinne hos levende mennesker. Den holder seg stabil i alle fall i 40 dager, som er den perioden vi har observert dem (3). Normobar helioks-eksponering foregikk i et åpent system. Vevsbiter ble samlet i en smalhalset flaske med 10 ml standard vevskulturmedium. En gassblanding som besto av 74%He, 21%02 og 5%C02, boblet direkte ned i kulturmediet. Atmosfæren over mediet ble således mettet med en gassblanding der partialtrykkene var 74 kpa når det gjelder helium, 21 kpa for oxygen og 5 kpa for carbondioxyd. Sistnevnte måtte være til stede for å balansere ph i mediet.

4 4 Eksponeringen foregikk i ti dager. Det ble gjort fem eksperimenter under normobare forhold, med til sammen 144 vevsfragmenter. Hyperbar gass-eksponering skjedde i et trykk-kammer ved NUTEC. Kompresjonstiden var 30 minutter, og totaltrykket 1,6 MPa, svarende til 150 meters dyp i sjøen. Oksygenets partialtrykk varierte mellom 20 og 41 kpa under dykkene. Dette gir en gjenomsnittsverdi på 38 kpa. Dette er normal dykkedybde på Statfjord-feltet. Dykkene varte i en uke, og i løpet av denne tiden ble mediet ikke skiftet. Det ble gjort tre hyperbare eksperimenter. Dykk 1 og 2 forløp uten komplikasjoner. Ved dykk 3 ble dekompresjonstiden ved en feiltagelse på i underkant av to timer i motsetning til de fire timene som var planlagt. Vevet var svært preget av dette, og forsøket ble derfor ekskludert. Ved forsøkenes avslutning ble bitene undersøkt v.h.a. et invertert fasemikroskop (IPM) for å lokalisere flimmerhår. Der slike var til stede ble de videofotografert. Ved hjelp av en avansert videoavspillingsmaskin ble flimmerhårenes slagfrekvens beregnet. Deretter ble bitene fiksert og brakt fram til lysmikroskopi (LM) og elektronmikroskopi (EM) (3). Resultater. IPM: Etter ti dagers eksponering for helioks (74/2 1) under normobare forhold, kunne man fortsatt se tallrike flimmerhår på overflaten av vevsfragmentene (Fig. 1 og 2). Slagfrekvensen var ca. 10 pr. sekund. Dette var det samme som det vi fant på kontroll-vevet som hadde blitt eksponert for luft. Vevsfragmentene som hadde stått en uke under trykk uten skifting av kulturmedium, var dekket med en del løse celler som gjorde det vanskelig å se flimmerhårene. Der man kunne se dem, var deres bevegelighet så hemmet av de løse cellene at måling av deres slagfrekvens ikke ble gjort. LM og EM. Etter normobar eksponeringen var bitene dekket av et flerlaget luftveisepitel med flimmerhår. Cellegrensene var tette og det underliggende vevet hadde normal struktur. Flimmerhårenes karakteristiske ultrastruktur var også intakt (Fig. i og 2).

5 5 Vi hadde snitt fra til sammen åtte vevsbiter fra dykk i og 2. Disse hadde områder med normale flimmerhår og et intakt luftveisepitel. Sentralt fant vi stedvis et normalt bindevev. Vi fant imidlertid også områder med klare degenerative forandringer. Epitelet var uregelmessig. Epiteicellene var flate, spoleformede med få eller ingen flimmerhår. En del slike celler hadde også løsnet. Både i epitelet og i stroma fant vi celler fulle av autofagosomer og med brudd både i celle og kjerne-membraner. Slike forandringer kan også sees i vevsbiter som lever under standard vevskulturbetingelser. De var imidlertid mer uttalte i disse åtte bitene enn i vev eksponert for normobar luft. Diskusj on. Man kan diskutere i hvilken grad undersøkelser av vev i kultur er en egnet metode til slike studier som dette. Det er generelt akseptert at vevskultur kan brukes til å studere strukturelle og funksjonelle forandringer i vev som følge av endringer i dets levevilkår. Vi har brukt en modell som i utgangspunktet har en struktur som er svært lik den en finner i normal slimhinne hos mennesker. Strukturen er stabil over mange uker under standard vevskulturbetingelser. Vi mener derfor at undersøkelser av denne modellen etter kontrollerte endringer i kulturbetingelsene over et begrenset tidsrom, vil kunne si noe om hvilke konsekvenser de samme endringene har for normal luftveisslimhinne hos mennesker. Denne undersøkelsen har vist at ti dagers eksponering for helioks (74/21) under normobare forhold ikke ser ut til å påvirke strukturen i den slimhinnemodellen vi har brukt. Flimmerhårenes slagfrekvens ser heller ikke ut til å endres. Ut i fra erfaringer med denne slimhinne modellen i andre sammenhenger er den meget følsom for endringer i kulturforholdene. Våre funn tyder derfor på at helioks (74/2 1) i seg selv ikke har noen uheldige effekter på luftveisslimhinne hos mennesker. Etter en ukes eksponering for samme gassblanding under trykk, viste vevet forandringer som tydet på at vevet ikke levde under optimale forhold. Det er flere mulige forklaringer på dette. Komprimering og dekomprimering vil kunne være en stor påkjenning for vevet. Vevsbitene som ble dekomprimert over to timer var klart

6 6 dårligere enn de som ble dekomprimert over fire timer. Oksygen hadde et partialtrykk på gjennomsnittlig 38 kpa i den hyperbare eksponeringsperioden i motsetning til 21 kpa under normobar eksponering. Det er tidligere beskrevet at hyperbar oksygen kan ha toxiske effekter på lungene(4). En slik effekt er også en mulig forklaring - på de degenerative forandringene vi ser i vevsbitene. Ut fra dykkeprotokollene har temperaturen under dykkene variert fra mellom 35,6 37,8 C. Dette er så små variasjoner at vevet under normale forhold ikke burde affiseres av det. I hvilken grad ph i mediet holdt seg stabil under dykkene, hadde vi ingen mulighet til å kontrollere. Mediet, som inneholder en ph-indikator, hadde imidlertid normal farge ved avsluttet dekompresjon. Vi konkluderer med at helioks (74/21) under normobare forhold ikke ser ut til å ha skadelige effekter på normal luftveisslimhinne i vevskultur. Under hyperbar eksponering skjedde det degenerative forandringer i vevet. Årsakene til dette kan vi ut fra de aktuelle undersøkelsene ikke si noe sikkert om. Re fe ran ser 1. Todnem K, Nyland II, Kambestad BK. Aarli J. Influence of occupational diving upon the nervous system: an epidemiological study. Br J md Med 1990;47: Thorsen E, Segadal K, Kambestad B,.Gulsvik A. Divers lung function: small airways disease? Br J Inustr Med 1990;47: Steinsvåg SK, Strand M, Berg 0, Miaguchi M, Olofsson J. Human respiratory mucosa in a nonadhesive organ culture system. Laryngoscope 1991;1O1: Thorsen E, Segadal, K, Kambestad, B.K. Mechanisms of reduced pulmonary function after a saturation dive. Eur Respir J 1994; 7: 4-10.

7 7 Takk. Prosjektet ble finansiert av Statoil, Norsk Hydro, Saga Petroleum og Olje direktoratet. Uten velvillig assistanse fra Rune Djurhus, Harald Sundland og Anne Gurd Lindrup, NUTEC, hadde de hyperbare eksponeringene ikke vært mulig. Figurtekster. Fig. 1. Del av slimhinnen etter 10 dagers normobar eksponering for helioks (74/21). Viser et normalt utseende flerlaget luftveisepitel med tallrike flimmerhår. Lysmikroskopi, toluidinblå farge, x Fig. 2. Overflaten på et slimhinnefragment etter 10 dagers normobar eksponering for helioks (74/21). Viser et luftveisepitel med flimmerhår, microvilli og tette cellegrenser slik en forventer å finne det i luftveiene hos friske mennesker. Scanning elektronmikroskopi, x Fig 3. Del av slimhinnen etter syv dagers hyperbar eksponering for heliox (74/21). Viser et uregelmessig epitel med få flimmerhår. En ser også at enkelte epitelceller har løsnet. Lysmikroskopi, toluidinblå farge, x

8 [-å. cx fl t J -Ij I-å. LQ 1

9 (N (fl I-i