SINTEF RAPPORT TITTEL SINTEF Fiskeri og havbruk AS Marin ressursteknologi Postadresse: 7465 Trondheim Besøksadresse: SINTEF Sealab Brattørkaia 17B Telefon: 4000 5350 Telefaks: 932 70 701 E-post: fish@sintef.no Internet: www.sintef.no Foretaksregisteret: NO 980 478 270 MVA Produksjon av kvalitetsrotatorier for oppdrett av torskeyngel Torske-rotatorier FORFATTER(E) Gunvor Øie, Werner Johansen, Jorunn Skjermo, Oulva Djurhuus Hege Lysne, Agnar Steinasson og Rannveig Bjørnsdottir OPPDRAGSGIVER(E) NORA RAPPORTNR. GRADERING OPPDRAGSGIVERS REF. Åpen GRADER. DENNE SIDE ISBN PROSJEKTNR. ANTALL SIDER OG BILAG 820130.01 20 ELEKTRONISK ARKIVKODE PROSJEKTLEDER (NAVN, SIGN.) VERIFISERT AV (NAVN, SIGN.) Gunvor Øie Jorunn Skjermo ARKIVKODE DATO GODKJENT AV (NAVN, STILLING, SIGN.) 2008-11-06 Trine Galloway SAMMENDRAG Målet med prosjektet var å videre utvikle ett produksjonssystem for rotatorier som fører til en sikker, stabil og kostnadseffektiv produksjon. Yngelanleggene som deltok i prosjektet har investert i rotatorie produksjonsanlegg fra Aquatic Ecosystem. Dette systemet er blitt testet og sammenliknet med ett standard gjennomstrømssystem. I tillegg er det blitt utført to forsøk med tilsats av probiotiske bakterier til rotatoriekulturen i resirkuleringssystemet. Det første forsøket med levende bakterier, og det andre forsøket med frysetørkede bakterier Resultatene viste at Aquatic eco-systemet er egnet til produksjon av rotatorier, men resultatene er ikke veldig ulike de fra gjennomstrømssystemer som ofte benyttes i dag. Det kan være flere årsaker til dette. En av disse kan være at systemet fra Aquatic eco-systems har for liten grad av resirkulering. Dette vil si at det under daglig drift må tilføres mye spedevann (nytt vann) til systemet. Rotatoriekulturer har ofte en høy mikrobiell belastning, og det er ønske om å kunne styre bakteriebelastningen i kulturene bedre. Rotatorier produsert i resirkuleringsanlegg med biofilter ble positivt påvirket av behandling med frysetørket preparater av de probiotiske bakterier (isolat 04-394 (Enterococcus thailandicus)). Det STIKKORD NORSK ENGELSK GRUPPE 1 Rotatorier, resirkulering Rotifers, recirculation GRUPPE 2 Aquatic eco-system, probiotika Aquatic eco-system, probiotics EGENVALGTE
2 INNHOLDSFORTEGNELSE 1 Bakgrunn...3 2 Målsetting...3 3 Arbeidsbeskrivelse...4 3.1 Sammenlikning av resirkuleringssystemet til Aquatic ecosystem med ett gjennomstrømssystem for produksjon av rotatorier....4 3.1.1 Metode for dyrking...4 3.1.2 Resultat...5 3.1.3 Konklusjoner/anbefalinger...12 3.2 Tilsats av probiotiske bakterier til ett resikuleringsanlegg...13 3.2.1 Metode...13 3.2.2 resultater...14 3.2.3 Diskusjon og konklusjoner...19 4 Gjennomføring og organisering...20 5 referanser...20
3 1 Bakgrunn Under fjor årets (2008) møte i Sats på torsk, ble det arrangert møter mellom yngeloppdrettere på torsk fra Norge, Færøyene og SINTEF Fiskeri og havbruk AS for å se på muligheter for å etablere et prosjekt der flere yngeloppdrettere deltar med felles problemløsning. I etterkant av møtet meldte forskningsmiljøer i Island interesse for de samme problemstillingene. Interessen for torskeoppdrett har vært økende de senere årene. Selv om antall yngel som produseres er sterkt økende, er yngelkvaliteten varierende. Næringen sliter fortsatt med dårlig tilvekst og ulike typer feilutvikling. Næringen sliter også med et uforklarlig stort svinn etter utsett i sjø, som kan skyldes for dårlig yngelkvalitet. Ett viktig tiltak for å øke yngelkvaliteten er en sikker og stabil produksjon av høykvalitets rotatorier. Rotatorieproduksjonen rundt om på de ulike anleggene er arbeidskrevende, og kvaliteten er varierende. Det kan oppstå perioder med produksjonsproblemer med ciliatforurensinger eller fullstendig kræsj i kulturen. Marinfisk klekkerier i Europa sliter også med uforutsigbare krasj i rotatoriekulturene. Etter hvert som yngelproduksjonen av torsk intensiveres vil det være behov for å produsere ett høyere antall rotatorier, og det er derfor viktig å effektivisere produksjonen, uten at dette går utover kvaliteten. Det finnes mange ulike dyrkingsmetoder for rotatorier. Batch kulturer, semi kontinuerlig produksjon og kontinuerlige kulturer kan benyttes. De fleste yngeloppdretterne produserer i dag i 1-5 m 3 tanker. Produksjonen har de siste årene blitt betraktelig forbedret, men det er fortsatt mulig å forbedre og automatisere produksjonen ytterligere. De siste årene er det blitt utviklet ulike metoder for høytetthetsproduksjon av rotatorier både i Belgia og Japan. Disse metodene er utviklet for små rotatorier, og fungerer ikke tilfredsstillende for store rotatorier. SINTEF Fiskeri og havbruk har utviklet ett resirkuleringsanlegg for rotatorier som fører til en betydelig arbeidsbesparelse. I ett pilotforsøk har det vist seg at arbeidsmengden reduseres med over 50% ved bruk av den nye produksjonsmetoden. Dette systemet vil bli optimalisert videre og enkelte faktorer i systemet må forbedres betraktelig, som for eksempel filtreringsenheten. Slik forbedring og optimalisering skal gi en forutsigbar produksjon igjennom hele rotatorieperioden for torskelarvene. Alle yngelanleggene som deltok i prosjektet og SINTEF Fiskeri og havbruk har investert i ett kommersielt enkelt småskala resirkuleringssystem fra Aquatic ecosystem. Noen oppdrettere har gode erfaringer med dette systemet, mens andre har blandete erfaringer med det samme systemet. I dette prosjektet ønsket vi å sammenlikne Aquatic Eqosystem med ett gjennomstrømsanlegg, for å undersøke effekten av de ulike systemene på vannkvalitet, mikrobiell kvalitet, vekst og eggfrekvens hos rotatoriene. I tillegg ble tilsats av probiotiske bakterier i Aquatic Eqosystemet undersøkt. 2 Målsetting Målet med prosjektet var å videre utvikle ett produksjonssystem for rotatorier som fører til en sikker, stabil og kostnadseffektiv produksjon. Yngelanleggene som deltok i prosjektet har investert i rotatorie produksjonsanlegg fra Aquatic Ecosystem. Dette systemet er blitt testet og sammenliknet med ett standard gjennomstrømssystem. I tillegg er det blitt utført to forsøk med tilsats av probiotiske bakterier til rotatoriekulturen i resirkuleringssystemet. Det første forsøket med levende bakterier, og det andre forsøket med frysetørkede bakterier
4 3 Arbeidsbeskrivelse Prosjektet ble delt opp i to deler. Den ene delen sammenliknet resirkuleringssystemet med ett gjennomstrømsanlegg, og den andre delen omhandlet tilsats av probiotika i resirkuleringsanlegget. 3.1 Sammenlikning av resirkuleringssystemet til Aquatic ecosystem med ett gjennomstrømssystem for produksjon av rotatorier. 3.1.1 Metode for dyrking For å lykkes med produksjon av torskeyngel, er det helt avgjørende med en stabil produksjon av høykvalitets rotatorier. Mange yngelanlegg for torsk i Norge er usikre på hvilken produksjonsmetode de skal velge for rotatorier. Enkelte anlegg er fornøyd med Aquatic ecosystem, mens andre mener at dette ikke fungerer bedre enn andre systemer. For å teste ut dette ble Aquatic eco-system testet mot ett gjennomstrømanlegg. Bildene nedenfor viser de to systemene. Figur 1: Aquatic eco-system produksjonssystem for rotatorier Det ene systemet er ett kommersielt tilgjengelig produksjonssystem (Figur 1). Dette systemet består av en produksjonstank (1000 liter), ett biofilter med Kalnes medium og en proteinskimmer. Produksjonstanken har ett sentralt filter og tanken har system for lufting og oksygenering. I tillegg må filtermatter tilsettes i kulturtanken, for å ta ut forurensninger når tettheten blir høy
5 Figure 2. Gjennomstrømsystem for rotatorier Det andre systemet består av en produksjonstank (300 liter) med spesiallaget filter (figur 2). Filteret er skråstilt med lufting for å hindre klogging. Dette systemet har også de samme mulighetene til lufting og oksygenering. Forskjellen på de to systemene er vannbehandlingen. I Aquatic eco-system anlegget skal i prinsippet vannet gjenbrukes, mens vannet går i sluken i gjennomstrømssystemet. Forsøket ble gjennomført ved at produksjonstankene ble tilsatt ca. lik rotatorietetthet ved start. Ett Acuatic eco-system anlegg (RS) og to gjennomstrømstanker (GS1,GS2). Daglige målinger ble gjort på rotatorietetthet, eggratio, temperatur, oksygen og ph. Salinitet, TAN, nitritt, nitrat og partikler (størrelse og antall) ble målt annen hver dag (dag 0,2,4,7). Rotatorietettheten ble fulgt i kulturene både ved hjelp av en rotatorieteller og ved manuelle tellinger. Fordosen ble beregnet ut fra individtettheten i tankene. 3.1.2 Resultat Tetthet og eggratio Ved forsøksstart (29 sep. 2008) var tettheten i resirkuleringssystemet (RS) 539 ind/ml, mens tettheten i gjennomstrømningssystem 1 (GS1) og gjennomstrømningssystem 2 (GS2) henholdsvis var 775 og 677 ind/ml (figur 3). Tettheten økte til mer enn 2000 ind/ml iløpet av fire døgn for alle system. Fra denne dagen av (3 okt.) ble det høstet 25 % av volumet daglig. Høstingen ble gjort manuelt. Tettheten holdt seg rundt 2000 ind/ml for alle system ut forsøksperioden. Eggratio ble beregnet ved manuell telling av egg daglig. Det ble registrert en topp i eggproduksjon etter 3 døgn for alle systemer, med de høyeste verdiene i GS systemene (figur 4). Eggproduksjonen avtok deretter i alle system for så å øke noe på slutten av forsøksperioden.
6 Rotatorier (ind/ml) 3000 2500 2000 1500 1000 500 RS GS1 GS2 0 29-sep 30-sep 01-okt 02-okt 03-okt 04-okt 05-okt 06-okt 07-okt Dato Figur 3. Automatisk beregning av rotatorietetthet i et resirkuleringssystem (RS) og to like gjennomstrømningssystem (GS1 og GS2). 1,2 1,0 0,8 RS GS1 GS2 ER 0,6 0,4 0,2 0,0 29-sep 30-sep 01-okt 02-okt 03-okt 04-okt 05-okt 06-okt 07-okt Dato Figur 4. Manuell beregning av eggratio (ER) for rotatorier i et resirkuleringssystem (RS) og to like gjennomstrømningssystem (GS1 og GS2). Fôring Alle systemene ble fôret med Rotifer Diet som er konsentrerte alger bestående av en blanding av mikroalgene Nannochloropsis sp. og Tetraselmis sp. Fôringen ble gjort med et automatisk system som kontinuerlig pumper ut fôr basert på faktisk tetthet, ønsket tetthet, ER og ønsket høsterate. Systemet er ennå i en uttestingsfase men resultatene fra dette og andre forsøk indikerer at dette systemet vil bli et viktig verktøy for å styre biomassen i systemer for dyrking av rotaorier. Rotatorier filtrerer vannet for å ta til seg næring. Konsentrasjonen av næringspartikler er derfor avgjørende for vekst. Ved lav tetthet (< 1000 ind/ml) er det nødvendig å overfôre kulturene noe for å sørge for at konsentrasjonen av næring er tilstrekkelig for god vekst. Individdosen vil derfor
7 være høy inntil tettheten i kulturen øker (figur 5). Ved økende tetthet vil individdosen avta frem til den tettheten fôrregulatoren har blitt innstilt på. Resirkuleringssystemet fra aquatic ble også testet med en blanding av vanlig bakgjær (0,9g pr million) og Rotifer Diet (0,1g pr million) som fôr. Denne testen ble gjort på lav tetthet (100-200 rotatorier/ml) og viste at gjær kan benyttes som fôr hvis det er ønskelig. Bruk av gjær til fôring av rotatorier er godt utprøvd hos SINTEF og er først og fremst et middel for å redusere kostnader i produksjonen. Verken Rotifer Diet eller gjær har tilstrekkelig næringsinnhold til å produsere rotatorier for bruk i startfôring av torsk. Det er derfor nødvendig å anrike rotatoriene før de kan benyttes som fôr. 3,00 2,50 Individdose µg 2,00 1,50 1,00 RS GS1 0,50 GS2 0,00 29-sep 30-sep 01-okt 02-okt 03-okt 04-okt 05-okt 06-okt 07-okt Dato Figur 5. Individdose (µg) for rotatorier i et resirkuleringssystem (RS) og to like gjennomstrømningssystem (GS1 og GS2). Vannkvalitet Vann fra alle systemer ble undersøkt for TAN, nitritt (NO - 2 ) og nitrat (NO - 3 ). For resirkuleringssystemet ble det analysert prøver både fra produksjonstank og biofilter. Både TAN, nitritt og nitrat hadde gjennomgående høyere verdier i resirkuleringssystemet sammenlignet med gjennomstrømningssystemene (figur 6, 7 og 8). I resirkuleringssystemet hadde produksjonstanken høyere gjennomsnittlige verdier av TAN sammenlignet med biofilteret, mens dette var motsatt for nitritt og nitrat. Det ble målt en kraftig økning av nitritt og nitrat i både produksjonstank og biofilter de første syv dagene. Fra dag 7 av ble alle kulturer fortynnet 25 % daglig, noe som bidro til å redusere både nitritt- og nitrat verdiene. Dette indikerer at vannbehandlingen i resirkuleringssystemet ikke var tilstrekkelig. For gjennomstrømningssystemet ble det målt lavere verdier av alle nitrogenholdige komponenter gjennom hele forsøksperioden.
8 8 6 TAN Produksjonstank (RS) Biofilter Gjennomstrømning 4 mg/l 2 0 0 2 4 6 8 10 12 Dager Figur 6. TAN (mg/l) i et resirkulerings- (både biofilter og produksjonstank) og et gjennomstrømningssystem. 30 25 Nitritt Produksjonstank(RS) Biofilter Gjennomstrømning 20 NO 2 -N mg/l 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Dager Figur 7. Nitritt (mg/l) i et resirkulerings- (både biofilter og produksjonstank) og et gjennomstrømningssystem.
9 40 30 Nitrat Produksjonstank(RS) Biofilter Gjennomstrømning NO 3 -N mg/l 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 Dager Figur 8. Nitrat (mg/l) i et resirkulerings- (både biofilter og produksjonstank) og et gjennomstrømningssystem. Det ble målt en kraftig økning i partikkel innhold 48 timer etter igangsetting av begge system (figur 9). Denne økningen var kraftigst for resirkuleringssystemet. For å fjerne partikler ble det benyttet filtermaterialet fra dag 2 (figur 10) for begge system. Nedgangen i partikler etter dag 2 tyder på at dette filteret er godt egnet for å redusere partikler i systemene. Mot slutten av forsøket ble det registrert en ny økning av partikler, trolig som en følge av at bunnsedimenter hadde begynt å løsne. Particles 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 29- Sep 30- Sep 1- Oct 2- Oct 3- Oct 4- Oct 5- Oct 6- Oct RAS FT2 FT3
10 Figur 9. Innhold av partikler i et resirkuleringssystem (RAS) og to gjennomstrømningssystemer (FT2 og FT3). Figur 10. Bildet viser filtermateriale som ble benyttet for å fjerne partikler i systemene. Andre fysiske parametere ph 6.92-8.04 Temperature 21.8-24.8 Salinity 29-35 ppt Mikrobiologi Det ble tatt ut vannprøver for mikrobiologi på dag 0, 2, 4, 7 og 14 fra resirkuleringsanlegget. Dette representerer bakteriefloraen i vannet før (dag 0) og etter oppstart (dag 2) av kulturen, samt etter noen dagers dyrking (dag 4 og 7) og en uke etter nedvasking og dyrking ved lav fôring. Fra gjennomstrømskulturene ble det tatt ut prøver på dag 7 og 14, der dag 7 representerer kulturen i god vekst med høy tetthet og intensiv fôring, mens på dag 14 går kulturen med lav fôring. Både totalt antall kolonidannende bakterier og andel hurtigvoksende bakterier ble registrert. De hurtigvoksende bakteriene er de som danner synlige kolonier allerede på dag 2 etter utsåing av vannprøvene. Dette er opportunister som kan være uheldige for rotatoriene og fiskelarvene, og det er derfor ønskelig at denne andelen er lav (<20%). Resten av koloniene kommer opp i løpet av de neste 2-3 ukene og er mer saktevoksende. Resultater og diskusjon Før det ble tilført rotatorier til resirkuleringsanlegget var bakteriemengden 225.000 CFU/ml (Fig.11). Andel hurtigvoksende bakterier var svært lav, bare 6,6%, og det tyder på at biofilteret fungerte bra med den organiske belastningen som næringsinnholdet i sjøvannet representerte. Bakterietallet økte svært mye etter tilførsel av rotatoriene, både på grunn av tilførsel av bakterier via rotatoriene og av fôr til rotatoriene. Andel hurtigvoksende bakterier er trolig mye høyere enn det som vises på Fig 12., da det var umulig å kvantifisere mesteparten av disse bakteriene på dag 2. Den voldsomme bakterieveksten i anlegget kan tyde på at biofilteret og protein-skimmeren hadde for liten kapasitet til å holde bakterietallet stabilt når det ble tilført organiske næringsstoffer.
11 Etter 4 dager hadde bakterietallet sunket til et relativt lavt nivå igjen, mens andelen hurtigvoksende bakterier var høy. På dette stadiet hadde rotatoriene doblet tettheten på 2 dager og kulturen var i en veldig god vekst og kondisjon Den lave bakterietettheten skyldes derfor trolig at rotatoriene filtrerte unna bakteriene effektivt. Det kan også antas at den høye andelen med hurtigvoksende bakterier skyldes at bakteriene er avhengig av en høy veksthastighet for å overleve under det høye beitepresset. På dag 7 hadde bakterietallet i vannet økt igjen, det samme hadde andel hurtigvoksende bakterier. På dette stadiet hadde rotatoriekulturen høy tetthet men lavere veksthastighet enn på dag 4, og kulturen begynte å bli svært skitten. Den ble deretter vasket og fôringen redusert. På dag 14 var bakterietallet omtrent som på dag 7, men mindre intensiv fôring av kulturen gav et bakteriesamfunn med høy andel saktevoksende bakterier. Gjennomstrømskulturen hadde høyere bakterietetthet enn resirkuleringsanlegget, men lik andel opportunistiske bakterier. Dette kan tyde på at resirkuleringsanlegget har en evne til å redusere bakteriemengden i rotatoriekulturene, enten ved at rotatoriene i anlegget er i bedre kondisjon og spiser flere bakterier eller ved at bakterier fjernes fra anlegget i skimmeren. Biofilteret ser ut til å ha hatt mindre effekt ved høy rotatorietetthet og intensiv fôring, men det er mulig at et større biofilter og mer effektiv proteinskimmer, for eksempel med UV eller ozon, vil ha effekt på sammensetningen av bakteriesamfunnet i kulturen. Slik anlegget ble kjørt nå virker det som at rotatorienes beitekapasitet var mer avgjørende for bakteriesamfunnet enn selve anlegget. 1,0E+08 1,0E+07 CFU/ml 1,0E+06 1,0E+05 Resirkulering Gjennomstrøm 1,0E+04 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Dag Figur 11. Totalt bakterietall i rotatoriekulturene (CFU/ml = bakterier pr ml vann) (SEM mellom replikate agarskåler).
12 % opportunister 45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0-0 2 4 6 8 10 12 14 16 Dag Resirkulering Gjennomstrøm Figur 12. Prosent opportunistiske (hurtigvoksende) bakterier i rotatoriekulturene (SEM mellom replikate agarskåler). 3.1.3 Konklusjoner/anbefalinger Et hovedmål for prosjektet har vært å teste resirkuleringssystemet som leveres av Aquatic ecosystems og komme med anbefalinger til drift og mulige forbedringer. Som resultatene overfor viser er systemet egnet til produksjon av rotatorier, men resultatene er ikke veldig ulike de fra gjennomstrømssystemer som benyttes i dag. Det kan være flere årsaker til dette. En av disse kan være at systemet fra Aquatic eco-systems har for liten grad av resirkulering. Dette vil si at det under daglig drift må tilføres mye spedevann (nytt vann) til systemet. Anlegget til Aquatic eco-systems som ble testet hadde et totalt volum på 1500L, fordelt på produksjonstank (1000L) og vannbehandlingskomponenter (500L). Da ønsket tetthet ble oppnådd (2000 rotatorier/ml) ble det høstet 25 % daglig fra tanken (250L), noe som utgjør 16,7 % av det totale volumet i systemet. Det betyr at det må tilføres 250L spedevann til systemet daglig. I tillegg må alt vann som fjernes via proteinskimmer erstattes. Dette vanntapet varierer fra dag til dag, avhengig av hvor mye skum som dannes i proteinskimmeren. Dette ble ikke målt i forsøket men lå sannsynligvis under 20L pr døgn. Ifølge produsent kan det høstes opptil 50 % daglig fra systemet, dette vil i så fall doble behovet for spedevann og bety at > 30 % av vannvolumet i systemet skiftes ut daglig. Når en så stor mengde vann må erstattes daglig, vil stabiliteten i resirkuleringsanlegget svekkes. Et av hovedargumentene for å benytte resirkulering i produksjon av rotatorier har vært et ønske om å styre den mikrobielle sammensetningen i en rotatoriekultur. Høy mikrobiell belastning er ofte problemer i rotatoriekulturer, og kan føre til problemer for fiskelarvene I tillegg er det en rekke tiltak som kan gjøres for å at dagens systemer skal bli mer kostnadseffektive: 1. Sammenkobling av rotatorieteller og utforingssystem 2. Måling av svømmehastighet som velferdsindikator i rotatoriekulturer. 3. Optimal bruk av røktearm i kulturtanker 4. Bedre sil/filter system 5. Sedimentasjonskammer evt. filter for å fjerne organisk materiale Dette er områder vi ønsker å jobbe videre med.
13 3.2 Tilsats av probiotiske bakterier til ett resikuleringsanlegg 3.2.1 Metode Dyrking og behandling av probiotiske bakterier To potensielt probiotiske bakterie isolater hadde før vært isolert fra torskelarver (isolat 04-279) og algal paste (isolat 04-394) i et nasjonalt prosjekt på Island. Isolatene ble selektert med hensyn på veksthemmende effekt på kjente sykdomspatogener for fisk, vekst karakteristikker, ekstracellulære produkter og potensial for etablering i cellelinjer fra fisk. Selektering av bakterie isolatene er nærmere beskrevet i Lauzon et al. (2008). Isolatene ble identifisert ved sekvensering av 16S rdna: Isolat 04-394 melkesyrebakterie (99% likhet med Enterococcus thailandicus FP48-3, GeneBank # EF197994) Isolat 04-279 (100% likhet med Arthrobacter bergerei, GeneBank # AJ609631) Isolat 04-394 viste seg at svært effektivt hindre vekst av kjente sykdomspatogener for fisk (bredspektret effekt), mens isolat 04-279 hindret svært effektivt vekst av Vibrio anguillarum (Lauzon et al., 2008). Isolatene ble oppdyrket i næringsmedia som beskrevet i Lauzon et al., (2008) og både flytende og frysetørrket kulturer anvendt ved behandling. Veksthemmende effekt på kjente sykdomspatogener for fisk (Aeromonas salmonicida achromogenes, Aeromonas salmonicida salmonicida, Vibrio salmonicida og Vibrio anguillarum) ble undersøkt i både ferske og frysetørrkete kulturer for at undersøke om frysetørrking påvirket den veksthemmende aktiviteten som anses som en av de egenskapene som karakteriserer potensielt probiotiske bakterier. For behandling ble isolatene dyrket opp ved 15 C i 2-3 døgn i Tryptic Soy Broth (TSB; Difco) tilsatt 0.6% yeast-extract og oppløst i 70% filtrert sjøvann (TSBye-sw). Alikvoter på 0.5 ml ble deretter inokulert på overflaten av TSAye-sw agarskåler og dyrket ved 15 C i 5 døgn. Veksten ble deretter skrapet av overflaten og overført til iskald peptone-sjøvann (p-sw) som beskrevet i Lauzon et al., (2008). Ved behandling med flytende kulturer ble bakteriekulturen lagret på is inntil bruk innen 8 timer og antall bakterier (cfu) i hver ml bestemt på TSAye-sw. Frysetørrket kultur ble lagret ved -20 C i 3 uker før behandling og bestemmelse av antall cfu i hver g pulver på TSAye-sw. Behandling med probiotika bakterier En blanding av de to potensielt probiotiske bakterieisolatene ble tilsatt rotatoriekulturer og biofilter i Aquatec Eco systemet i samarbeid med Havforskningsinstituttet i Island. Rotatoriene (Branchionus plicatilis, større typen) i forsøket ble fôret daglig med 2x300 ml algepasta (Nannochloropsis oculata, instant algae paste from Reed Mariculture, USA) med tetthet på ca. 1800 rotatorier pr. ml og ClorAm-X (ammonium neutraliser) tilsatt noen ganger hver dag i tillegg til stadig dripp i karet. I karet henger 2-3 mikrofibermatter som store partikler setter seg på. Disse ble tatt opp og renset daglig. Ca. 25% av rotatoriekulturen ble høstet hver morgen og deretter fyllt opp med tilsvarende volum av 25 C rent sjøvann. Systemet ble startet opp med rotatoriekulturer og daglig fôring i noen uker før forsøket startet. De probiotiske isolatene ble tilført i to adskilte men sammenhengende forsøk som varte i tilsammens 30 dager i perioden nov des 2008. Forsøk 1. Enkelt behandling med flytende kultur av de probiotiske bakteriene: Isolat 04-279: 1.1*10 6 cfu/ml i rotatoriekultur og 1.5*10 6 cfu/ml i biofilter
14 Isolat 04-394: 5.7*10 4 cfu/ml i rotatoriekultur og 7.7*10 4 cfu/ml i biofilter. Prøver ble samplet av rotatorier (200 ml), sjøvann i rotatoriekultur (200 ml), algepasta (10 ml), plaststykker fra biofilter (5 stk) og sjøvann fra biofilter (200 ml) før tilsetning av de probiotiske bakteriene (dag 0) og deretter 24 timer og 4 dager etter behandling med bakteriene. Forsøk 2. Behandlig daglig i 5 dager med frysetørrket bakteriekultur som inneholdt like mange cfu av de to isolatene. Pulveret ble oppløst i sjøvann fra hvert av karene før behandling: Isolat 04-279: 10 6 cfu/ml i rotatoriekultur og biofilter Isolat 04-394: 10 5 cfu/ml i rotatoriekultur og biofilter Bakteriene ble tilsatt systemet daglig fra dag 17 til dag 21. Prøver ble samlet som beskrevet ovenfor, en dag etter avsluttet behandling (dag 22), tre dager (dag 24) og åtte dager (dag 29) etter avsluttet behandling. Behandling og analyse av prøver Prøver ble analysert mhp antall dyrkbare bakterier ved dyrkning på selekterte næringsmedia; MA og TSAye-sw for bestemmelse av total antall dyrkbare bakterier, TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar, Difco) oppløst i 70% sjøvann (TCBS-sw) for bestemmelse av antall Vibrio bakterier og NAP (Nitrit-Astidione-Polymyxin agar, ph 5.5) (Davidson og Cronin, 1973) for bestemmelse av antall melkesyrebakterier. Den totale bakterie populasjonen i prøvene ble også undersøkt ved hjelp av PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction og Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) metoden beskrevet av Muyzer et al. (1993). Prøver ble behandlet på følgende måte: Rotatorier: kulturer ble filtrert gjennom 2 µm steril filter, og rotatoriene deretter veiet, fortynnet i p-sw og til slutt homogenisert i 4*10 sek med 10 sek pauser (Ultra Turrax T25; IKA - 133 rotasjoner/sek). Sjøvann fra rotatoriekulturene ble også samlet og fortynninet i p-sw. Algepasta: fortynninger laget i p-sw og deretter homogenisert som beskrevet ovenfor Biofilter (5 plastikk enheter i hver prøve): plastikk enhetene ble samplet i sterile 10 ml glass og 5 ml av steril p-sw deretter tilsatt for at unngå uttørking. Etter kraftig risting i 60 min på is ved romtemperatur, ble væsken fortynnet videre i p-sw Sjøvann fra biofilter: 10 ml samlet direkte fra karet og fortynnet i p-sw. Diverse fortynninger av hver prøve ble inkubert på selekterte næringsmedia for bestemmelse av antall dyrkbare bakterier. Agarskålene ble dyrket ved 15 C i 7-10 dager før bestemmelse av antall kolonier, farge og utseende. Sammensetning av den totale bakterie populasjonen i 1/10 fortynning av prøvene ble analysert vha. PCR-DGGE og partial sekvensering av bakterielt 16S rdna gjennomført i produkter (bånd) som ble samplet fra gelene. Metoden er nærmere beskrevet i Bjornsdottir et al. (2008). 3.2.2 resultater Veksthemmende effekt av de selekterte probiotika bakteriene Resultatene viser at isolat 04-279 (Arthrobacter bergerei) hemmet vekst til tre av de fire patogenene testet (alle untatt Vibrio salmonicida) og effektene ble ikke redusert ved frysetørrking av isolatet (14-16 mm sone rundt koloniene). Veksthemmende effekt av 04-394 (Enterococcus thailandicus), var næsten like kraftige (12-15 mm sone rundt koloniene) når testet i frysetørrket form, men distinkt redusert effekt ble observert når flytende kultur av isolatet ble testet (< 5 mm sone rundt kononiene). Dessuten hemmet ferske kulturer av isolatet ikke vekst av V.salmonicida mens veksten ble hemmet når effektene ble testet i frysetørrket kultur.
15 De veksthemmende effektene ble ikke redusert ved ½ fortynning av kulturene. I sammenfatning gir resultatene en indikasjon på at veksthemmende effekt mot noen patogener kan bli redusert ved frysetørrking, men muligens fremhevet mot andre patogener. Effekt og etablering av probiotiske bakterier i resirkuleringssystemet Antall dyrkbare bakterier Lignende antall dyrkbare bakterier (TVC) ble observert ved dyrkning på MA og TSAye-sw næringsmedia. Antall bakterier var likevel meir stabilt ved dyrking på MA og de resultatene derfor brukt her. Relativt antall kolonier av forskjellig farge og form var likt i prøver innsamlet på forskjellige tidspunkt og disse resultatene derfor ikke vist her. Antall dyrkbare bakterier (TVC) i forskjellige prøver av algepasta var stort sett stabil gjennom forsøket (10 6 10 7 bakterier/g) (Fig 1). Fig 1. Andall dyrkbare bakterier i hvert gram af algepasta som ble tilsatt til rotatorie kulturen to ganger hver dag gjennom forsøket. Figuren viser total antall dyrkbare bakterier (TVC) og antall Vibrio og melkesyrebakterier ved dyrkning på selekterte næringsmedia. Figur 1 viser at melkesyrebakterier utgjør stor del av det totale antallet dyrkbare bakterier i algepasta og at Vibrio bakterier er ganske fåtallige. En interessant forbindelse ble observert mellom antall Vibrio og melkesyrebakterier, med tilsynelatende økning i antall Vibrio bakterier som følge av redusert antall melkesyrebakterier og visa versa. Antall dyrkbare bakterier i rotatoriekulturen var relativt stabilt gjennom perioden og behandling med probiotika bakterier så ikke ut til at påvirke total antall dyrkbare bakterier ellert antall dyrkbare Vibrio bakterier (Fig 2).
16 Fig 2. Antall dyrkbare bakterier i hvert gram rotatorier sampled på selekterte tidspunkt gjennom forsøket. Figuren viser total antall dyrkbare bakterier (TVC), antall Vibrio og melkesyrebakterier ved dyrkning på selekterte næringsmedia. Asterisks indikerer tidspunkt ved behandling med probiotika bakterier. Behandling med probiotiske bakterier resulterte på den andre siden økt antall melkesyrebakterier (Fig 2). Bakteriene så på den andre siden ikke ut til at etablere seg i rotatoriekulturene og gradvis redusert antall ble observert i prøver samlet etter behandling (Fig 2). Antall melkesyrebakterier var noenlunde likt ved behandling kun en gang og gjentatt behandling 5 dager på rad. Total antall dyrkbare bakterier og Vibrio bakterier i sjøvann fra rotatoriekulturer var relativt stabilt gjennom perioden og behandling med probiotika bakterier så ikke ut til at påvirke antall dyrkbare bakterier (resultater ikke vist). Antall dyrkbare bakterier i plastikk enheter fra biofilter ble kraftig redusert som resultat av behandling med ferske kulturer av de probiotiske bakteriene (Fig 3). Antall bakterier ser ut til at være på vei opp noen dager etter gjentatt behandling i 5 dager på rad men er likevel fortsatt ca. 2 log-enheter lavere sammenlignet med sampling før første behandling. Større variasjoner i antall bakterier ble observert i sjøvann fra biofilter hvor antall Vibrio og melkesyrebakterier økte med ca. 2 log-enheter som resultat av første behandling men ble deretter redusert til opprinnelig antall 4 dager etter behandling og var relativt stabilt gjennom resten av perioden, uavehengig av gjentatt behandling 5 dager på rad (resultater ikke vist). Fig 3. Antall dyrkbare bakterier i biofilter (plastikk enheter) på selekterte tidspunkt gjennom forsøket. Figuren viser total antall dyrkbare bakterier (TVC), antall Vibrio og melkesyrebakterier ved dyrkning på selekterte næringsmedia. Asterisks indikerer tidspunkt ved behandling med probiotika.
17 Total bakterie-populasjon Den totale bakterie populasjonen ble undersøkt ved hjelp av PCR-DGGE som har vært etablert for analyse av bakterie populasjonen i sampler fra produksjon av kveitelarver. Metoden har også vist seg at gi et relativt godt bilde av mønsteret til den totale bakterie populasjonen i prøver samlet fra produksjon av torskelarver. Kun de mest dominerende arter blir analysert ved bruk av denne metoden og derfor sannsynlig at en rekke andre arter finnes i tillegg men i relativt lavere antall sammenlignet med de som blir analysert. Renkulturer av de probiotiske bakteriene ble analysert sammens med diverse prøver samlet fra resirkuleringssystemet. Produkter observert i lignende områder i gelene ble deretter samlet for sekvens analyse og identifisering gjennom gen-banker. Resultatene er en indikasjon på relativt homogen bakterie populasjon som dominerer ved kultivering av rotatorier i resirkuleringssystem med biofilter (Fig 4). Kun 1-4 produkter ble observert i forskjellige prøver samlet fra systemet og behandling med probiotiske bakterier så ikke ut til at påvirke mønsteret. Fig 4. DGGE profiler i selekterte sampler av rotatorier, sjøvann i rotatoriekulturer, algepasta, biofilter og sjøvann fra biofilter. Sampler ble samlet før behandling med probiotika (dag 0) og på forskjellige tidspunkt etter kun en og gjentatt behandling med probiotika (1, 4, 22, 24 og 29 dager). Inkludert i begge geler er profiler av renkulturer av probiotika bakteriene (04-279, 04-394) og standard (Std). Asterisks (*) indikerer isolat 04-279 og bånd som ble identifisert som samme art vha. sekvens analyse. Isolat 04-279 (Arthrobacter bergerei) ble opprinnelig isolert fra sjøvann ved produksjon av torskelarver. Et produkt av samme mobilitet ble observert i en prøve av rotatorier samlet før behandling med isolatet. noe som indikerer at isolatet opprinnelig stammer fra rotatorier. Dette isolatet ble ikke observert i andre prøver samlet gjennom perioden og derfor lite sannsynlig at isolatet representer dominerende bakteriearter i rotatorier. Isolat 04-394 (Enterococcus thailandicus) ble ikke observert i prøver samlet fra rotatorier, hverken før eller etter behandling med isolatene, og ser derfor ikke ut til at etablere seg blandt dominerende bakterier i systemet. Prøve samlet fra biofilter (plastikk enheter) før behandling med probiotika bakteriere ble desverre ødelagt og av den grunn ikke mulig at undersøke om de probiotiske bakteriene forårsaket forandringer i det bakterielle samfunnet. Analyse af prøver samlet etter behandling gir en indikasjon på at det bakterielle samfunnet i biofilter er relativt meir heterogen sammenlignet med rotatoriekulturen (Fig 4). Resultatene viser dessuten at det bakterielle samfunnet i selve biofilteret (plastikk enhetene) er meir heterogen sammenlignet med sjøvann fra biofilteret, noe som kan indikere at rekke forskjellige bakteriearter klarer at etablere seg i selve biofilteret mens kun få
18 arter finnes i sjøvannet i biofilteret. De probiotiske isolatene ser ikke ut til at etablere seg som en del av det dominerende bakterie samfunnet i biofilteret. Bakterie samfunnet var relativt likt i de forskjellige prøvene av algepasta som ble samlet gjennom perioden. Isolat 04-394 (Enterococcus thailandicus) ble opprinnelig isolert fra algepasta, men bli ikke observert i noen av de prøvene som ble samlet av algepasta i dette prosjektet, noe som kan være en indikasjon på at arten ikke representerer en dominerende art i algepasta. Rotatoriekulturer Oksygen, ph, temperatur, gjennomstrømming av sjøvann, fôring og fôrmengder samt tetthet og vekst i rotatoriekulturen ble registrert daglig gjennom perioden. Ca. 25% av rotatoriekulturen ble høstet daglig og tilsvarande volum rent sjøvann tilsatt. Stor variasjon i tetthet og vekst i rotatoriekulturen ble observert fra dag til dag gjennom perioden (Fig 5). ph ble drastisk nedsatt som følge av behandling med flytende kulturer av probiotiske bakterier (dag 0), noe som resulterte i total kollaps av rotatoriekulturen (dag 4-8). På den andre siden forårsaket gjentatt behandling med frysetørrket bakteriepulver ikke en ph-reduksjon i rotatoriekulturen. Høsting av rotatorier var noe varierende gjennom perioden men stor økning ble observert som følge av gjentatt behandling med frysetørrkete bakterier (dag 17-21) med 118 million rotatorier høstet pr. dag sammenlignet med gjennomsnittlig 38 million rotatorier høstet pr. dag før behandling med probiotiske bakterier (resultater ikke vist). Fig 5. Antall rotatorier (millioner/400l) og vekst (millioner/dag) i gjennom forsøket. Asterisks indikerer tidspunkt ved behandling med probiotika. Drastisk fall i ph er også vist på figuren (dag 4-8). Resultatene gir derfor en indikasjon på at behandling med de probiotiske bakteriene i frysetørrket form kan ha positiv effekt på vekst og tetthe i rotatoriekultur i resirkuleringsanlegg med biofilter.
19 3.2.3 Diskusjon og konklusjoner Rotatorier produsert i resirkuleringsanlegg med biofilter ble positivt påvirket av behandling med frysetørrket preparater av de probiotiske bakteriene og i den konsentrasjonen som ble brukt i forsøket. Resultatene gir en indikasjon på at isolat 04-394 (Enterococcus thailandicus) opprinnelig stammer fra rotatoriekulturer men representerer ikke en del av den dominerende bakterie populasjonen i rotatorier dersom et produkt identisk med isolatet ble kun isolert fra ett rotatoriesampel samlet i løpet av perioden. Behandling med de probiotiske isolatene så ikke ut til at påvirke sammensetningen av bakterie populasjonen i systemet, hverken i rotatoriene eller biofilteret. Antall dyrkbare bakterier i biofilter var relativt høgt før sammenlignet med etter behandling med de probiotiske bakteriene, noe som kan gi en indikasjon på forurensning av prøven. Resultatene kan på den andre siden også gi en indikasjon på at behandling med flytende kulturer i den konsentrasjonen som ble brukt, forårsaket en reduksjon i antall bakterier som hadde etablert seg i biofilteret. Dette kan ha forårsaket at biofilteret ikke fybgerte normalt, med kraftig reduksjon i ph og følgende kollaps av rotatoriekulturen som resultat. Gjentatt behandling med frysetørrket preparater av bakteriene forårsaket ikke fall i ph, noe som kan gi en indikasjon på at behandling med bakteriene i frysetørket form bør foretrekkes. Sjøvann blir resirkulert i systemet med 7.2 L/min strøm i begynnelsen av perioden og reduksjon til 1.5 L/min lenger ut i perioden (dag 20). Tilføring av fersk sjøvann var derfor rundt 40-50 % pr. døgn. Resultater fra DGGE analyse gir en indikasjon på at de probiotiske bakteriene ikke rakk at etablere seg som en del av den dominerende bakterie populasjonen i rotatorier eller biofilter, mens analyse av antall dyrkbare bakterier gir en indikasjon på at behandling resulterte i økt antall melkesyrebakterier i rotatiekulturen. Antall melkesyrebakterier ser dessuten ut til at økes i biofilteret mot slutten av forsøket. Det er derfor sannsynlig at behandling med i hvert fall det ene isolatet (Enterococcus thailandicus) må skje mer hyppig hvis antall bakterier skal bli vedlikeholdt i rotatoriekulturer i resirkuleringssystem med biofilter. DGGE methoden forutsetter at hver enkel bakterieart kun gir ett produkt (bånd) i gelen etter gjennomført elektroforese. Resultatene gir på den andre siden en indikasjon på at store mengder DNA i prøvene (renkulturer bakterieisolater) resulterer i ekstra bånd (skygger) i gelen. Disse ekstra båndene blir ikke registrert som bånd i prøver som inneholder mindre relative mengder bakterier av samme art, sammenlignet med renkulturer av bakteriene Analysering av renkulturer gir ett kraftig farget bånd (som resultater fra sekvens analyse viste at var et produkt identisk med bakterieisolatet), men også noen ekstra bånd som ikke fremtrer like klart i prøver som inneholder en blanding av forskjellige bakteriarter og mindre mengder bakterier av hver enkel art. Resultatene gir derfor en indikasjon på at PCR reaksjonen må justeres for analyse av sampler fra produksjon av rotatorier. Dette innebærer seleksjon av primere mhp at meir spesifist kunne multiplisere 16S DNA områder som viser størst variasjon mellom de forskjellige artene som dominerer i produksjonssystemet. Tilstedeværelse av de probiotiske isolatene ble analysert ved at sammenligne DGGE mønsteret i forskjellige prøver, med merking av både hovedbåndet og også de forskjellige ekstra båndene (skyggene). Sekvens analyse av produkter fra båndene ble også sammenlignet og resultatene viser at de probiotiske isolatene kun ble identifisert i noen få prøver samlet gjennom perioden. Antall dyrkbare bakterier og den totale bakterie populasjonen i algepasta viste seg at være relativt stabil i forskjellige prøver samlet gjennom perioden. En interessant relasjon ble observert mellom antall Vibrio og melkesyrebakterier hvor økt antall melkesyrebakterier så ut til at forårsaka en reduksjon i antall Vibrio bakterier og visa versa. Melkesyrebakterier kan derfor muligens brukes for at holde i sjekk antallet Vibrio bakterier, men denne gruppen representerer en rekke forskjellige arter patogene for fisk. I konklusjon gir resultatene en indikasjon på at behandling med frysetørket pulver av de bakteriene som ble anvendt har en positiv innvirkning på vekst og tetthet i rotatoriekulturen.
20 Frysetørking av bakteriene så ikke ut til at påvirke veksthemmende effekt på kjente fiskepatogener og frysetørking er i tillegg en ønskelig måte for produksjon, lagring og transport av probiotiske bakterier for bruk i oppdrettsanlegg lokalisert i lange avstander fra produksjonsstedet. 4 Gjennomføring og organisering Forsøkene ble utført ved SINTEF Fiskeri og havbruk og ved MATIS, og deretter ble resultatene implementert ved de ulike yngelanleggene. I august 2008 ble det avholdt ett prosjektmøte ved SINTEF Fiskeri og havbruk i Trondheim. På dette møtet deltok Fiskaaling (Færøyane) v/oulva Djurhuus, MATIS (Island) v/rannveig Bjørnsdottir, Nordland Marin Yngel(Norge) v/hege Lysne, SINTEF Fiskeri og havbruk (Norge) v/gunvor Øie, Jorunn Skjermo og Kari Attramadal. På dette møtet ble prinsippene for resirkulering diskutert. I tillegg ble prosjektplanen diskutert. Ved prosjektavsluttning ble det avholdt ett møte i Bergen (februar 2009) for orientering om resultater og sammenstilling av sluttrapport. ACKNOWLEDGEMENT Vi takker Nordisk Atlantsamarbejde (NORA) for deres støtte til prosjektet. Samarbeidet mellom SINTEF Fiskeri og havbruk, Matis, Fiskaaling og Nordland Marin Yngel har vært ett produktivt og hyggelig samarbeid. Helene L. Lauzon takkes for probiotika isolater brukt i forsøket som ble gjennomført på Havforskningsinstituttet i Island som også takkes for god innsats og produktivt samarbeide. María Pétursdóttir og Eydís Elva Þórarinsdóttir hos Matis i Akureyri takkes for bakterieanalyser og Sólveig Pétursdóttir og andre forskere på Matís-Prokaría takkes for sekvensering av bakterielt DNA. Kari Attramadal ved NTNU takkes for gode råd innen resirkuleringsteknologi. 5 referanser Bjornsdottir, R. Johannsdottir J, Coe J, Smaradottir H, Sigurgisladottir S. & Gudmundsdottir B.K. 2009. Survival and quality of halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.) in intensive farming: Possible impact of the intestinal bacterial community. Aquaculture 286:53 63 Davidson, A.P. & Cronin, F. 1973. Medium for the selective enumeration of lactic acid bacteria from foods. Appl Microbiology 26 (3), 439 440 Lauzon, H.L., Gudmundsdottir, S., Pedersen, M.H., Budded, B.B., & Gudmundsdottir, B.K. 2008. Isolation of putative probionts from cod rearing environment. Veterinary Microbiology. 132(3 4):328 339 Muyzer, G., De Waal E.C. & Uitterlinden, A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rrna. Appl. and Env. Microbiology. 59:695 700