OPPGAVE NR. 10 Kjemiprogrammet TILGJENGELIGHET Alle Postadresse: Postboks 4 St. Olavs plass, 0130 OSLO Besøksadresse: Pilestredet 35, Oslo Telefon: 22 45 32 00 Telefaks: 22 45 32 05 HOVEDPROSJEKT OPPGAVENS TITTEL Test av muggsoppdrepende midler og test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli. FORFATTER Kristiane Søreng og Siri Trygsland DATO 25 05 07 ANTALL SIDER / BILAG 33/25 VEILEDER Bente Hellum UTFØRT I SAMARBEID MED Mycoteam AS KONTAKTPERSON Johan Mattsson SAMMENDRAG Muggsopp i bygninger er et dagsaktuelt inneklimarelatert problem, og effektive sopphemmende midler kan være helseskadelige for miljø og mennesker. Hensikten med denne delen av prosjektet var å teste en nyprodusert, uskadelig løsning, og sammenlikne den med andre kjente midler mot muggsopp. Midlenes langtidseffekt ble undersøkt ved bruk av to metoder: test på maltekstraktagar og test på gipsplater i fuktkamre. Det kan konkluderes med at testløsningen har bedre hemmende effekt over lengre tid enn de andre midlene den har blitt sammenliknet med. Det finnes få velutviklede metoder som fastslår mengde bakterier som kan forekomme etter vann- og kloakkskader. Omfanget av slike skader kan vise seg å være et stort forsikringsmessig problem. Hensikten i del to av prosjektet var å bestemme mengden den naturlige bakterieforekomsten i bygårdskjellere for å undersøke om ATP-måling kan være en tilstrekkende metode for kvantifisering av bakterier ved en vann- eller kloakkskade. I tillegg skulle forekomst av E. coli etter vann- eller kloakkskader undersøkes. Til kvantifisering ble det benyttet en ATP-måler og kimtelling etter prøvetaking med svaber. Til kvalitativ kontroll ble kontaktplater med nærings- og endoagar benyttet. Det ble ikke funnet noen proporsjonalitet mellom mengde ATP og antall kim. Til dette må det utføres videre forsøk. E coli er ikke vanlig å 3 STIKKORD Muggsopphemmende midler ATP-måler Escherichia coli 1
Forord Vårt avsluttende hovedprosjekt ved Høgskolen i Oslo, avdeling for ingeniørutdanningen, har blitt gjennomført hos Mycoteam AS. Prosjektet har bestått av både laboratoriearbeid og prøvetaking ute i felt. Hovedsakelig har arbeidet på laboratoriet foregått hos Mycoteam, men på grunn av noe manglende utstyr hos dem har også noe av arbeidet foregått på høgskolens laboratorier. Siden prosjektet har hatt to nokså ulike hensikter, har vi valgt å dele oppgaven i to separate deler. Vi vil rette en stor takk til Johan Mattsson som har vært vår veileder ved Mycoteam, og til Bente Hellum, vår veileder ved høgskolen. De har vært til god hjelp og veiledning under arbeidet med dette prosjektet. I tillegg vil vi takke alle ansatte ved Mycoteam, spesielt laboratoriepersonalet for hjelp og veiledning, og Egil Kortnes for at vi har fått være med ut til bygårdskjellere og tatt prøver. For muligheten til prøvetaking i eneboliger vil vi takke Gjensidige forsikring. Ved høgskolen i Oslo vil vi også takke Silje Skau, avdelingsingeniør ved kjemilinjen, for svært god hjelp på laboratoriet. Oslo 24. mai 2007 Siri Trygsland Kristiane Søreng 2
Innhold Sammendrag 3 1. Innledning 4 1.1 Test av muggsoppdrepende midler 4 1.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 5 2. Teori 6 2.1 Test av muggsoppdrepende midler 6 2.1.1 Generelt om muggsopp 6 2.1.2 Skader ved muggsoppangrep 8 2.1.3 Tiltak og forebygging av muggsoppskader 9 2.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 10 2.2.1 Bakterier ved kloakkskader 10 2.2.2 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler 10 2.2.3 Kvantifisering ved bruk av kimtelling 11 2.2.4 Koliforme bakterier og endoagar 11 3. Materialer og metoder 12 3.1 Test av muggsoppdrepende midler 12 3.1.1 Utstyr og kjemikalier 12 3.1.2 Metode 12 3.1.2.1 Test på maltekstraktagar 12 3.1.2.2 Test på gipsplater 13 3.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 15 3.2.1 Utstyr og kjemikalier 15 3.2.2 Metode 15 3.2.2.1 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler 15 3.2.2.2 Kvantifisering ved bruk av svabermetode og kimtelling 15 3.2.2.3 Kvalitative målinger ved bruk av kontaktplater 17 4. Resultat 18 4.1 Test av muggsoppdrepende midler 18 4.1.1 Test på maltekstraktagar 18 4.1.2 Test på gipsplater 19 4.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 23 4.2.1 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler 23 4.2.2 Kvantifisering ved bruk av svabermetode og kimtelling 23 4.2.3 Kvalitative målinger ved bruk av kontaktplater 24 3
5. Diskusjon 26 5.1 Test av muggsoppdrepende midler 26 5.1.1 Test på maltekstraktagar 26 5.1.2 Test på gipsplater 27 5.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 27 5.2.1 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler, svabermetode og kimtelling 27 5.2.2 Kvalitative målinger ved bruk av kontaktplater 29 5.3 Konklusjon 30 5.3.1 Test av muggsoppdrepende midler 30 5.3.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 30 Litteraturliste 31 Vedleggsliste 33 4
Sammendrag Muggsopp i bygninger er et dagsaktuelt, inneklimarelatert problem. De fleste effektive, sopphemmende midlene som finnes på markedet har så høye konsentrasjoner av virkestoffer at de kan være helseskadelige ved gjentatt eksponering. Dette er et stort problem ved bruk av muggsoppdrepende midler til forebygging i forbindelse med fuktskader. Hensikten med den første delen av prosjektet var å teste et nytt, forebyggende middel mot muggsopp som består av en polymer med fem aktive stoffer bundet til seg. Det unike med den nye testløsningen skal være at til tross for den lave konsentrasjonen av virkemidler, som gjør den uskadelig for mennesker, skal den også være svært effektiv. Den nye testløsningen skulle vurderes ved å sammenlikne den med kjente løsninger med andre virkestoffer. Til sammenlikningen av testløsningen med de andre midlene ble det benyttet to metoder: grovtest på maltekstraktagar og langtidstest på gipsplater i fuktkamre med ulik relativ luftfuktighet. Test på maltekstraktagar ble utført ved å dyppe filterbiter i de soppdrepende midlene, deretter plassere dem på agaren, før soppsporer fra ulike muggsoppslekter ble avsatt i midten. Etter to uker ble platene kontrollert. Testen på gipsplater ble utført ved at plater med soppdrepende midler og muggsoppsporer ble inkubert i fuktkamre i ni uker før de ble kontrollert. Testene viste at av de fire muggsoppdrepende midlene som ble benyttet, er den nye testløsningen det mest effektive. Den stopper ikke veksten fullstendig, men hemmer den i større grad og over lengre tid enn de andre midlene. Prosjektets andre del omhandlet naturlig forekomst av bakterier i bygårdskjellere, testing av et nytt instrument som måler ATP ved hjelp av lyssignaler og bakterieforekomst etter vann- eller kloakkskader. Hensikten med denne delen var å avgjøre om ATP-måleren kan brukes til kvantifisering av bakterier ved vanneller kloakkskader ved å forsøke å finne sammenhengen mellom målt RLU fra ATP-måleren og antall bakterier. I tillegg ble det tatt prøver for å undersøke om E. coli forekommer i den naturlige bakteriefloraen i bygårdskjellere, om den forekommer etter vann- eller kloakkskader samt hyppigheten ved disse tilfellene. Til kvantifisering av bakterier ble det brukt en svabermetode til prøvetaking, før det ble utført kimtelling ved innstøpningsmetoden for å beregne bakteriemengde. Fra samme prøvetakingsområde ble det foretatt målinger med ATP-måleren og kvalitative prøver ved hjelp av kontaktplater med nærings- og endoagar. Det viste seg å være vanskelig å finne proporsjonalitet mellom målt RLU og kim/ml. Dette kan skyldes usikkerhet ved både ATP-måleren og metodene som ble brukt til å kunne utføre kimtellingen. Blant bakteriene i bakgrunnsfloraen var det lite tegn til E. coli, mens det etter en vann- eller kloakkskade ble gjort funn i flere prøver. 5
1 Innledning Det forekommer årlig et stort antall vann- og kloakkskader i bygninger. I forbindelse med dette er det svært viktig med forebygging av skader samt utbedring av de skadene som allerede er etablert. For å kunne gjøre dette optimalt, er det nødvendig dels å kunne påvise eventuelle skader, dels å vite hvordan de kan utbedres på en forsvarlig måte. Hvis dette kan oppnås, kan kompetansen øke hos de ulike aktørene, slik som saksbehandlere, takstmenn, skadebegrensningsfirmaer og huseiere. På den måten kan man optimalisere håndteringen av vann- og kloakkskader, slik at både tiltak og kostnader, samt belastning på inneklima minimaliseres. Prøvetaking av muggsopp kan gjøres ved hjelp av for eksempel tapeavtrekk, materialprøver og luftanalyser. Dette er kjente metoder (10). Forebyggende tiltak som å holde konstruksjoner tørre og utbedring ved å fjerne skadet materiale er også kjent kunnskap. Spørsmålet er hvordan det kan påvises eventuell forekomst av bakterier etter kloakkskader og hvilke kommersielle fungicider det kan være hensiktsmessig å benytte ved behov, enten til forebygging eller utbedring. Dette prosjektet består av to uavhengige forsøk som tar for seg hvert av disse temaene. Den første delen tar for seg muggsopp og forebygging av muggsoppangrep. Ved å teste flere muggsoppdrepende midler over tid skal virkningen av disse sammenliknes. Del to av prosjektet omhandler naturlig bakterieforekomst i bygårdskjellere, testing av et nyprodusert apparat som måler ATP ved hjelp av lyssignaler samt påvisning av E. coli etter en vann- eller kloakkskade. På grunn av denne oppdelingen består hvert kapittel av to delkapitler som igjen omhandler disse to emnene hver for seg. Prosjektet er utført for og hos Mycoteam AS. Den nye muggsopphemmende løsningen som skal testes er utviklet av BioSphere Innovation. Dette firmaet selger også ATP-måleren som skal testes etter forespørsel fra Mycoteam AS, da de har hatt interesse av å vite mer om denne i forhold til forsikringsspørsmål etc. 1.1 Test av muggsoppdrepende midler Bakgrunnen for denne delen av forsøket tar utgangspunkt i problemet med muggsopp i bygninger, skader som følge av dette og mangel på effektive midler mot muggsopp som ikke utgjør en risiko for miljø og helse. Effektive, forebyggende midler som finnes på markedet har gjerne så høy konsentrasjon av virkemidler at de kan være helsefarlige. I dette forsøket skal virkningen av en ny testløsning sammenliknes med andre midler som allerede er å finne i butikkene. Testløsningen består av en polymer med fem aktive stoffer festet til seg. Konsentrasjonen av disse er svært lave, noe som innebærer at løsningen ikke utgjør noen helserisiko. Siden prosjektet kun foregår over et begrenset tidsrom, er det usikkert hvor lenge testløsningen vil virke like effektivt og forebyggende som det forventes at den skal gjøre under testperioden. Det benyttes to konsentrasjoner av testløsningen i dette forsøket. Konsentrasjon A består av 50 ml konsentrat i 950 ml destillert vann og konsentrasjon B består av 100 ml konsentrat i 900 ml destillert vann. En begrensende faktor under forsøket er at SI-enheten og styrken på konsentratet er ukjent da det hittil ikke har vært mulig å få denne informasjonen fra produsenten. 6
Testingen av de soppdrepende midlene skal foregå på to måter: test på maltekstraktagar og test på gipsplater. Testen på maltekstraktagar skal fungere som en grovkontroll, mens testen på gipsplater skal vise hvordan testløsningen fungerer over lengre tid sammenliknet med virkningen av midler med andre virkestoffer. Ut fra kunnskapen om den nye løsningen forventes det at den vil vise bedre forebygging og høyere effektivitet. 1.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli Hvor omfattende en kloakkskade kan vise seg å være er et stort forsikringsmessig problem. Det finnes lite utviklede metoder som nøyaktig fastslår mengde bakterier som kan dannes etter en slik skade. I dette forsøket skal mengden av den naturlige bakterieforekomsten i bygårdskjellere bestemmes. Målet er å finne en sammenheng mellom målt RLU (Relative lysenheter), fra et nytt måleinstrument som bestemmer mengde mikroorganismer ut fra lyssignaler som dannes ved spalting av ATP til AMP, og mengden bakterier. Det skal foretas kvalitative prøver for å undersøke om det er vanlig at E. coli forekommer i den naturlige bakteriefloraen i bygårdskjellere. I tillegg skal forekomsten av E. coli og andre koliforme bakterier etter en vann- eller kloakkskade i kjellere i eneboliger undersøkes. Fordi dette er et lite utforsket område, med få velutviklede metoder, vil mye av arbeidet gå med til metodeutvikling for å prøve å finne fremgangsmåten som vil gi den beste proporsjonaliteten mellom RLU-verdi fra ATP-måleren og mengde bakterier fra det samme området. Til den kvantitative prøvetakingen skal det utvikles en metode som gir gode og tellbare resultater ved kimtelling. Prøvetakingen gjøres med en svaber. Deretter vil prøven bli bearbeidet videre for kimtelling slik at konsentrasjonen av bakterier i kim/ml kan bestemmes. Prøvetakingen til måling av ATP gjøres med en spesiallaget svaber som er fuktet med luciferin/luciferase, som spalter ATP til AMP og avgir energi i form av lys som registreres av ATP-måleren og uttrykkes i RLU. De kvalitative prøvene tas ved hjelp av kontaktplater med næringsagar for å bekrefte vekst og endoagar for å påvise eventuelle koliforme bakterier, spesielt E. coli. For å få et pålitelig resultat er det ønskelig med flest mulig prøver fra flere områder. Under denne delen av forsøket vil vi være avhengige av å få følge med Mycoteam på inspeksjoner. Siden disse ikke foretas hver dag, og prosjektet i sin helhet kun varer i 3-4 måneder, vil det derfor være begrensninger på hvor mange prøver det er mulig å få tatt i løpet av prosjektperioden. Det er forventet at det finnes en sammenheng mellom RLU og antall bakterier; jo høyere RLU-verdi, jo større mengde bakterier. Det er rimelig å anta at det finnes en naturlig bakterieflora på de fleste steder i bygninger. Derfor forventes det at nesten samtlige av kontaktplatene med næringsagar vil få bakterievekst. Siden E. coli er en tarmbakterie og ofte brukes som en indikator på at det har vært en kloakkskade, er det ikke forventet at den skal forekomme i den naturlige bakteriefloraen, men derimot forekomme der det har vært tilbakeslagsskader. 7
2 Teori 2.1 Test av muggsoppdrepende midler 2.1.1 Generelt om muggsopp Muggsopp er en stor gruppe av ulike, hurtigvoksende sopper som kan forekomme i alle miljøer, både på, og til dels i alle materialer. De fleste typer muggsopp er obligat aerobe; de trenger oksygen for å leve og vokse. Det er fire faktorer som er avgjørende for muggsoppens vekst: Næring, vann, temperatur og tid. De fleste typer muggsopp lever av dødt organisk materiale. Lett tilgjengelige sukkerarter, deriblant cellulose, er blant de viktigste næringskildene. Nitrogen og ulike mineraler er også nødvendig, samt optimal veksttemperatur (vanligvis 25-30 C) og luftfuktighet (vanligvis 95-98 %). Når disse tre faktorene er tilstede over en lengre periode, vil det oppstå muggsoppvekst, se figur 1. Figur 1: Fire viktige faktorer for vekst av muggsopp (8). Muggsopp er bygget opp av mycel, et nettverk av veksttråder som kalles hyfer. De formerer seg ved hjelp av sporer som dannes i store mengder på mycelet, og gir opphav til neste generasjon. Det finnes mange typer muggsopp. I bygninger er de mest vanlige muggsoppslektene blant annet: Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Penicillium og Stachybotrys (7), (8). Aspergillus er normalt en tropisk slekt som har god vekst i 80-90 % relativ luftfuktighet og trives best ved temperaturer på 25-35 C. Den kan også finnes ved innendørs fukt- og vannskader. Dersom man finner Aspergillus i bygninger, selv ved lavt innhold av sporer i luften, skyldes dette antakeligvis en skade som er utviklet over lang tid. Figur 4 viser mikroskopbilde av Aspergillus versicolor. Figur 4: Mikroskopbilde av Aspergillus versicolor som viser hyfer og sporer(9). 8
Chaetomium forekommer vanligvis utendørs på blant annet gamle planterester hvor den effektivt bryter ned cellulose. Av den grunn vil man ved skader innendørs hovedsakelig finne Chaetomium på materialer av gips, treverk, sponplater og papir som har vært utsatt for oppfukting av fritt vann. På grunn av dens karakteristiske utseende som små, brune og hårete kuler på overflaten, er den lett å kjenne igjen, se figur 2. Slekten er også kjent for å kunne gi en relativt kraftig, stinkende lukt. Figur 2: Overflatevekst av Chaetomium globosum på gipsplate. På grunn av dens nedbryting av cellulose danner den ofte gråråte i treverk (9). Cladosporium er en slekt som er vanlig å finne utendørs i planterester. Ofte er den dominerende i uteluften, og kan derfor følge med inn ved lufting av boliger. Sporer kan følge med inn uten at den vil gjøre skade ved å etablere vekst. Derfor kan den bidra som feilkilde ved prøvetaking. Når Cladosporium vokser innendørs er det gjerne ved kondensskader på loft, soverom og i kjølerom, og den kan gi mørk misfarging av materialer. Figur 5 viser bilde av Cladosporium cladosporoides tatt i mikroskop. Figur 5: Mikroskopbilde av Cladosporium cladosporoides. (9) Når muggsopp opptrer i luft innendørs på grunn av en fuktskade, er det vanligvis slekten Penicillium som dominerer. Artene produserer rikelig med små, lette sporer og kan derfor ha stor betydning for inneklimaet. Den opptrer gjerne på frukt, matrester og søppel. Av den grunn er det viktig å være bevisst på når det tas prøver slik at denne type vekst holdes separert fra tilsvarende vekst i forbindelse med etablerte skader i bygningsmaterialer. Figur 3 viser bilde av Penicillium chrysogenum tatt i mikroskop. 9
Figur 3: Mikroskopbilde av Penicillium chrysogenum ved 80 x forstørrelse. Soppen er farget blå i mikroskopipreparatet for å være mer synlig ved analysen. Stachybotrys er en slekt med mange ulike arter, men det har vært spesielt fokus på én av artene, Stachybotrys chartarum. Dette er fordi denne arten under visse betingelser har fått påvist allergen effekt i tillegg til at den er immunforsvarsreduserende. Arten trives godt på celluloseholdige materialer som blant annet gips, tapet og treverk. Makroskopisk er den svært lett gjenkjennelig. Når den vokser på flater som for eksempel gips, er utseendet svart og pulveraktig, se figur 6. Den er også lett identifiserbar i mikroskop. Etter en vannskade er det vanlig å finne Stachybotrys, og den vokser gjerne på steder med langvarig fuktighet (9), (17). Figur 6: Stachybotrys chartarum på gipsplate (9). 2.1.2 Skader ved muggsoppangrep For at et muggsoppangrep skal kunne etablere seg, må det finnes rikelig med fuktighet, næring og ideell temperatur. Siden de fleste bygningsmaterialer består av organiske forbindelser, og derfor representerer næring, kan muggsoppangrep oppstå stort sett hvor som helst der det er god tilgang på fukt. Temperatur er heller ingen begrensende faktor, da det i en bygning normalt vil være cirka 18-22 ºC. Angrepet kan opptre raskt etter oppfuktingen på grunn av sporenes raske spredning og vekst. Skader på hus som skyldes fukt og muggsopp, viser seg i form av lukt og misfarging. Etter hvert kan det også etableres råtesoppskader, som i verste fall kan føre til konstruksjonssammenbrudd. Muggsopp kan skille ut gasser kalt flyktige organiske forbindelser (MVOC), som kan trenge gjennom materialer som plast, bygningsplater og flisvegger. I lukkede konstruksjoner uten luftbevegelser ut i romluften vil sporespredning av etablert muggsoppvekst være nokså beskjedent, så i slike tilfeller vil det være utskillelsen av de flyktige organiske forbindelsene som hovedsakelig står for den største eksponeringen. 10
Muggsopp kan være helsefarlige og skadelige for mennesker og miljø. I Norge er Cladosporium og Penicillium noen av muggsopptypene som er oftest innblandet i allergier. Når det gjelder helserisiko er det mange variabler og usikre forhold for måling som gjør det vanskelig å sette en fast grenseverdi. Virkningen på mennesker avhenger ikke bare av konsentrasjonen av ulike arter muggsopp, men også av andre aktive stoffer i inneluften. Den vanligste reaksjonen er allergi i luftveiene fordi muggsoppsporene lett pustes inn i lungene og blir et irritasjonsmoment. Dette viser seg som regel i form av allergisk astma. Andre symptomer som tyder på fukt og muggsopp er blant annet irritasjon i øyne, nese hals og hud, uttørking av slimhinner og psykisk tretthet, hodepine og redusert almenntilstand (5), (6), (15), (19), (20). 2.1.3 Tiltak og forebygging av muggsoppskader Når en muggsoppskade har oppstått er det viktig å redusere vekstbetingelsene, først og fremst tilgangen på fuktighet. Fukttilgjengeligheten angis i relativ luftfuktighet (RF), og defineres som mengde vanndamp i luften, gitt i prosent, i forhold til maksimalt vanndampinnhold ved en gitt temperatur. Under 75 % relativ luftfuktighet (RF) er det stort sett ingen risiko for vekst. Det finnes imidlertid sopptyper som kan vokse med RF på 61 %, men dette vil ikke kunne forekomme på bygningsmaterialer, da disse krever svært god tilgang på næring. Det er hovedsakelig tre grunner til muggsoppskader: byggfukt, bruksfukt og lekkasjer. Innklimaproblemer forebygges best i byggeperioden ved å bygge slik at man i størst mulig grad unngår at fukt bygges inn, spesielt i gips og isolasjon siden dette er materialer hvor muggsopp trives godt. Man må også være påpasselig ved installasjon av luftekanaler slik at man unngår støv og andre urenheter som også kan innholde muggsoppsporer og -produkter. Til bruk ved tiltak og forebygging kan det også benyttes kjemikalier og andre midler mot muggsopp. Noen som kan nevnes blant disse er kjemikalier og midler som inneholder virkestoffene hydrogenperoksid, dodecyl dipropylentriamin og thymol. Hydrogenperoksid er en sterkt oksiderende væske som kan brukes til bleking og desinfisering. Væsken kan avgi damp i form av meget små dråper som kan tilføres rom med muggsoppvekst. Den vil da drepe levedyktig muggsopp der den kommer til, men tar derimot ikke vekst som forekommer på steder som ikke er tilgjengelige for denne dampen. Denne metoden å fjerne muggsopp på kalles fogging. Siden hydrogenperoksid ikke er i stand til å drepe all vekst egner den seg best til etterbehandling, etter fjerning av materialene med skader. Kvaternære ammoniumssalter er vanlig å bruke i midler til desinfisering og kontrollering av bakterier, sopp og alger. Dodecyl dipropylentriamin tilhører denne gruppen og skal hjelpe til med å forebygge muggsoppvekst. Thymol kan skilles ut fra Timian og er en fenol som finnes i flere eteriske oljer. Den virker desinfiserende og kan blant annet hindre infeksjoner ved bakterieangrep. I tillegg kan dens antiseptiske egenskaper hemme muggsopp i å etablere seg. Den kan derfor brukes både til vasking og forebygging av eventuelle muggsoppskader (11), (21), (22), (23), (24), (25). 11
2.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 2.2.1 Bakterier ved kloakkskader Koliforme bakterier er en gruppe bakterier som finnes i tarmen hos både dyr og mennesker. Deres optimale levebetingelser er tilpasset disse forholdene, og kan derfor ikke leve lenge utenfor tarmen. Forekomst av koliforme bakterier i for eksempel drikkevann kan tyde på forurensing med tarmbakterier, men er ingen sikker indikasjon. Som en sikker indikator ved påvisning av kloakkskade kan den koliforme tarmbakterien Escherichia coli brukes, da denne kan leve også utenfor tarmen. E. coli er en stavformet, gram negativ bakterie som finnes naturlig i blant annet tarmen der den hjelper til med fordøying av mat og produksjon av viktige vitaminer. Normalt er E. coli ikke sykdomsfremkallende, men noen arter produserer enterotoksiner som kan gi alvorlige typer diaré. Avløpsvann kan deles inn i to typer: gråvann og sortvann. Gråvann er avløpsvann fra vask, dusj og liknende, og sortvann er avløpsvann fra toalettet. Normalt skilles det ikke mellom gråvann og sortvann, men siden det har praktisk betydning ved tilbakeslagsskader er det viktig å skille mellom disse i slike tilfeller. Her er det først og fremst skader fra sortvann man er bekymret for, siden det her er fare for at det følger med bakterier som kan være skadelige, som for eksempel E. coli (2), (13), (14). 2.2.2 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler Alle levende biologiske organismer, som dyr, planter, bakterier og sopp, har celler som avgir energi i form av adenosin trifosfat (ATP) ved celleånding. ATPmåleren utnytter dette til kvantifisering av mikroorganismer som bakterier og muggsopp. Dette kan være nyttig blant annet når kilden til forurensning fra mikroorganismer skal stedfestes og skadens omfang skal bestemmes. Måleren fungerer ved hjelp av en svaber som fanger opp mikroorganismene. Når organismenes ATP kommer i kontakt med og reagerer med luciferin på svaberen, og deretter blandes med et enzym fra ildfluer, luciferase, spaltes ATP til AMP og avgir energi i form av lyssignaler. ATP-måleren leser av lyssignalene og angir mengden i relative lysenheter (RLU) som er proporsjonale med mengde ATP fra mikroorganismene på et gitt område. Reaksjonen som spalter ATP til AMP er vist i figur 7 (15). (Mg)- ATP + oksygen + D-luciferin Ildflue-luciferase oksyluciferin + karbondioksid + AMP + pyrofosfat + Energi i form av lys Figur 7: Reaksjonslikningen som viser spalting av ATP til AMP og energi ved hjelp av luciferin/ luciferase. 12
Svaberenheten som brukes til måling av ATP er vist i figur 8. Væskestabilt reagens med luciferase Svaber fuktet med luciferin Figur 8: Svaberenhet brukt til ATP-måling med enzymet luciferase til venstre (topp) og svaber med luciferin til høyre (bunn) (15). 2.2.3 Kvantifisering ved bruk av kimtelling Levende bakterier kan kvantifiseres ved hjelp av kimtelling. Når de overføres til fast næringsmedium gir hver enkelt bakterie opphav til en koloni. Det utføres dekadisk fortynning av bakterieprøven som skal telles. Hver fortynning overføres til hver sin næringsagarplate, enten ved utplatingsmetoden eller innstøpningsmetoden. Utplatingsmetoden gjøres på ferdig støpte plater ved at et lite volum fra hver fortynning pipetteres ut på platene og fordeles jevnt med en steril drigalsk spatel helt til platenes overflate har blitt tørre. Innstøpningsmetoden utføres ved at et lite volum av hver fortynning pipetteres ut på tomme skåler, før skålene fylles med steril, flytende næringsagar. Ved denne metoden kan det tilsettes et større volum av prøven, noe som er en fordel ved lave kimtall. Begge metodene krever inkubering av skålene i to døgn ved ideell veksttemperatur for de ønskede bakteriene før antall kolonier telles. Til kontroll brukes de platene som har mellom 30-300 kolonier per plate. For å regne ut antall kim per ml i den ufortynnede prøven, multipliseres fortynningsfaktoren med antall kolonier på platen, likning 1. Dersom flere plater er tellbare, beregnes et gjennomsnitt av de beregnede kimtallene (1), (3), (4). Kim/mL = antall kolonier x 10 x (1) der 10 x er prøvens fortynningsfaktor 2.2.4 Koliforme bakterier og endoagar Koliforme bakterier kan forklares som bakterier som bryter ned laktose og omdanner den til gass og syre. Ved å utnytte denne egenskapen kan endoagar benyttes til påvisning av slike bakterier, spesielt E. coli. På endoagar vil E. coli danne kolonier med metallisk glans, og andre koliforme bakterier vil danne rødlige kolonier. Endoagaren inneholder stoffer som blant annet nitrogen, vitaminer og mineraler, samt laktose som karbohydratkilde og peptoner som karbonkilde. I tillegg inneholder den fargestoffet pararosanilin (fuchsin) og natriumsulfitt. Når disse reagerer med acetoaldehyder, produsert av laktosefermenterende bakterier, dannes det røde kolonier på agaren. E. coli omdanner laktose til aldehyder raskere enn andre koliforme bakterier, og slik oppstår den metalliske fargen. Bakterier som ikke bryter ned laktose vil danne blanke, ufargede kolonier (12), (17). 13
3 Materialer og metoder 3.1 Test av muggsoppdrepende midler 3.1.1 Utstyr og kjemikalier Utstyr: - Agarskåler, 55 mm - Inkubatorskap, Termaks, 22 C - Akvarium, 60 L - Gipsplate, 9 mm Gyprock - Hydrologg, rotronic, apparat til måling av temperatur og relativ luftfuktighet (RF) - Sensorer, Hygroclip - Kromatografispray - Analysevekt, Satorius TE 313S-DS - Filterpapir - Mycotape Mikroorganismer: - Muggsopp: Cladosporium herborum Penicillium chrysogenum Aspergillus versicolor Chaetomium globosum Stachybotrys chartarum Kjemikalier: - Testløsning, 5 % (A) og 10 % (B), BioSphere Innovation - Thymol, 0,23 %, NAC Europe - Hydrogenperoksid, 10-30 % blandet med destillert vann i forholdet 1:7, Proff Norge AS - Dodecyl dipropylentriamin, 1-5 % blandet med destillert vann i forholdet 1:10, Carix International Services - Kaliumklorid, KCl, Merck - Vaskeløsning med Tween 80, ca 0,02 % - Maltekstrakt, Merck - Pepton, BD (Beckton, Dickinson and Company) - Agar, Prolabo 3.1.2 Metode 3.1.2.1 Test på maltekstraktagar Det ble laget 2 % maltekstraktagar til dyrking av muggsopp etter oppskrift gitt i tabell 1, vedlegg 1. De fire produktene som skulle testes inneholdt virkestoffene hydrogenperoksid, thymol, dodecyl dipropylentriamin, og den nyproduserte testløsningen inneholdt en polymer med fem forskjellige aktive stoffer bundet til seg. Av sistnevnte produkt ble det testet to ulike konsentrasjoner. Den ene med 50 ml konsentrat og 950 ml destillert vann (konsentrasjon A), den andre med 100 ml konsentrat og 900 ml destillert vann (konsentrasjon B). 14
Filterpapir ble dyppet i testproduktene, tørket og klippet opp i små biter. Bitene ble lagt nord, sør, øst og vest på skålene med maltekstraktagar. Det ble også laget tre nullprøver der filterbitene ble dyppet i destillert vann og tre prøver der de ble dyppet i saltvann. Sporer fra tre forskjellige muggsopper ble overført til midten av hver sin agarplate ved hjelp av en skalpell, tre paralleller av hver sopp til hvert av testproduktene. Metoden ble utført sterilt og i avtrekk. Agarskålene ble pakket i plast og inkubert ved 22 C før de ble kontrollert etter to uker. Forsøksoppsettet er vist i figur 9. Figur 9: Oppsett for test på maltekstraktagar 3.1.2.2 Test på gipsplater Fem ulike muggsopparter ble rendyrket på 55 mm agarskåler ved at sporer fra hver muggsopp ble plantet på seks ferdigstøpte agarskåler, tre med maltekstraktog tre med DG18-agar. Sporene ble overført med skalpell. Rendyrkingen ble utført sterilt og i avtrekk. Artene som ble benyttet var Aspergillus versicolor, Chaetomium globosum, Cladosporium herborum, Penicillium chrysogenum og Stachybotrys chartarum, som alle er vanlig forekommende i fuktskadede bygninger. Til dyrking av muggsopp i tre fuktkamre med ulik luftfuktighet ble det skåret ut biter på ca. 7x10 cm fra en gipsplate Fuktkamrene, to med mettede saltløsninger og ett med kun destillert vann, ble laget med henholdsvis NaCl for å oppnå relativ luftfuktighet (RF) på 76 %, KCl for å oppnå RF på 86 %, og destillert vann for å få RF på 100 %. Oversikt over mengde salt som gir mettet løsning er gitt i tabell 1. Tabell 1: Mengde salt som er nødvendig for å oppnå mettet løsning ved 20 C. Salttype Relativ luftfuktighet(%) Mengde (g/l) NaCl 76 400 KCl 86 350 Fuktkamrene ble satt i et klimarom for å oppnå stabil temperatur og luftfuktighet. For å kontrollere dette ble det benyttet fire hydrologger: én for å kontrollere 15
forholdene i klimarommet, og en i hvert av fuktkamrene. Sensorene i fuktkamrene ble plassert i samme høyde over vannstanden som gipsplatene senere skulle henge. Målingene ble gjentatt hvert minutt de fire siste døgnene før forsøksstart, og deretter de fire siste ukene av forsøket. Vedlegg 2 viser stabiliteten i form av grafer hvor temperatur og luftfuktighet i klimarommet og de tre fuktkamrene er plottet mot tiden. Figur 1-4 viser stabiliteten før forsøksstart, og figur 5-8 viser stabiliteten de fire siste ukene av forsøket. Gipsplatene ble merket med navn på virkemiddel og hvilket fuktkammer de skulle henge i. Deretter ble de sprayet med de muggsopphemmende midlene som skulle sammenliknes og hengt opp til tørk. Det ble laget ni paralleller per produkt, ni plater uten middel, som skulle brukes som nullprøver, og ni plater uten verken middel eller soppsporer. De ni parallellene ble fordelt med tre i hvert fuktkammer. Det ble laget sporeekstrakt av tre av de rendyrkede muggsoppartene; Aspergillus versicolor, Penicillium chrysogenum og Cladosporium herborum. Dette ble utført ved å skylle sporer fra 18 av vekstskålene ned i seks erlenmeyerkolber ved bruk av vaskeløsning, slik at sporene løsnet fra mycelet og ble skylt ned gjennom filtre av bomull. Vaskeløsningen bestod av destillert vann og Tween 80 slik at konsentrasjonen ble på cirka 0,02 %. Tween 80 ble brukt for at sporene lettere skulle løsne. Filtratene fra erlenmeyerkolbene ble overført til en kromatografispray. Sporeblandingen ble sprayet på gipsplatene, totalt 54 stykker, 15 ganger på hver side. Deretter ble platene hengt opp i fuktkamrene, se figur 10. Der ble de hengende i ni uker for senere å bli kontrollert. Figur 10: Oppsett for test på gipsplater i fuktkammer. Hydrologgen er vist til venstre på bildet. For å få en midlertidig oversikt over midlenes effektivitet underveis ble muggsoppveksten på platene kontrollert etter fire uker i fuktkamrene. Mycoteams egen metode for å anslå mengde sopp ble benyttet til kontrollen, se vedlegg 3. Det var ingen synlig vekst i fuktkamrene med 76 % og 86 % RF. Derfor var det bare gipsplatene fra fuktkammeret med 100 % RF som ble kontrollert, da disse hadde mye synlig vekst. Den samme metoden ble brukt til kontroll etter ni uker. 16
3.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli 3.2.1 Utstyr og kjemikalier Utstyr: - Varmeskap - Ristevannbad - 90 mm petriskåler - 55 mm petriskåler - ATP-måler, SystemSureII - Svaber til ATP-måler, Ultrasnap - Svaber til kimtelling - Cryorør - Eppendorfrør Kjemikalier: - Næringsbuljong, Merck - Agar, Prolabo - m-endo-agar LES, Merck 3.2.2 Metode For å finne ut hva som er normalt å finne av bakterier i hus- og bygårdskjellere ble det tatt prøver fra fem kjellere i eneboliger og fem bygårdskjellere. Eneboligene var normale, innredede kjellere uten noen form for vann- eller kloakkskade. I bygårdene var kjellerne av forskjellig standard med tanke på lys, fukt, renhet og liknende. Felles var at ingen av dem hadde hatt noen form for kloakkskader den seneste tiden og ingen hadde synlige tegn til vekst av mikroorganismer. I tillegg ble det tatt kvalitative prøver i tre kjeller i eneboliger der det nylig hadde vært tilbakeslag. Skadene var vasket og delvis tørket. Til kvalitative målinger ble det brukt kontaktplater med nærings- og endoagar. Til kvantitative målinger ble det tatt prøver med ATP-måler. I tillegg ble det utført kimtelling, for å prøve å finne en sammenheng mellom mengde avgitt ATP (RLU) og antall bakterier, der svabere ble brukt til prøvetakingen. Kimtellingene ble utført sterilt under hele forsøket. 3.2.2.1 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler Et område på 10x10 cm ble svabret med Ultrasnap-enheten. Toppen av Ultrasnapenheten ble knekt av slik at luciferase ble blandet med luciferin og ATP fra mikroorganismene. Enheten ble plassert i ATP-måleren og RLU-verdien ble avlest. Disse verdiene skulle brukes til å finne en sammenheng mellom mengde bakterier og RLU. De avleste verdiene er gitt i tabell 1-5, vedlegg 4. 3.2.2.2 Kvantifisering ved bruk av svabermetode og kimtelling Svaberne til kimtellingen ble fuktet med springvann og et område på 10x10 cm ble svabret. Deretter ble den lagt i en steril pose. En svaber med bare springvann ble brukt som nullprøve. For å vaske ut bakteriene fra svaberne ble de lagt i 17
reagensrør med 5 ml fysiologisk saltvannsløsning. Disse ble ristet på whirlimikser. For å finne antall kim fra prøvene tatt i eneboligene ble det laget en dekadisk fortynningsrekke fra 10-1 til 10-7 for hver av dem. Denne ble laget ved å overføre 360 µl fysiologisk saltvannsløsning til syv eppendorfrør. Deretter ble 40 µl overført fra bakteriesuspensjonen til det første røret, som ga en 10-1 fortynning. Fortynningen ble blandet ved å suge opp og blåse ut av automatpipettene fem ganger. Andre fortynning ble laget ved å overføre 40 µl fra det første røret til det andre røret. Slik fortsatte det til alle fortynningene var laget ferdig. Bakteriene ble platet ut på romtempererte og tørre agarskåler ved å pipettere ut 0,1 ml fra fortynningene på agarplater merket fra 10-1 til 10-7. Glasstaver ble sterilisert i 96 % etanol og brent av i en gassflamme. Bakterieprøvene ble fordelt på agaren med glasstavene til platene var nesten tørre. Deretter ble platene inkubert i varmeskap ved 37 C i to døgn. Kimtellingen fra prøvene tatt i eneboligene ga dårlig resultat, så metoden måtte endres. Nye prøver ble tatt, også denne gang i eneboliger, men nå ble bakteriene vasket ut med næringsmedium i stedet for fysiologisk saltvann. Prøvene ble satt på ristevannbad ved 37 C for å sette i gang bakterieveksten. Etter 3,5 timer i vannbadet ble det laget dekadiske fortynningsrekker av prøvene på samme måte som tidligere. Prøvene ble platet ut på næringsagarskåler som tidligere forklart, og satt i inkubatorskap ved 37 C i to døgn. Det ble tatt flere nye prøver fra fem bygårdskjellere fra flere ulike områder ved hjelp av samme metoder som tidligere. Siden tidligere prøver hadde gitt lite resultat ble svaberne fra nå av lagt direkte i cryorør med næringsmedium for å forhindre at bakteriene skulle dø på vei fra prøvetakingsstedet til laboratoriet. Etter prøvene var tatt ble de satt på is for å unngå formering av eventuelle bakterier. Av prøvene fra den første bygårdskjelleren ble det laget dekadiske fortynningsrekker som ble platet ut på ferdigstøpte skåler med næringsagar. Til å begynne med var fortynningene fra 10-1 til 10-7, men etter hvert viste resultatene at det var nok å fortynne til 10-5. Platene ble inkubert ved 37 C i to døgn. I tillegg til utplatingsmetoden skulle også innstøpningsmetoden prøves. Det ble laget dekadiske fortynningsserier av de opprinnelige prøvene med fortynninger 10-1 til 10-7. Også her viste resultatet at det ville være nok med fortynninger til 10-5. Disse ble laget i sterile reagensrør med 4,5 ml fysiologisk saltvann og 0,5 ml prøve. Fysiologisk saltvann ble overført til reagensrørene ved hjelp av en dispenser. 1 ml av hver fortynning ble pipettert på hver sin tomme petriskål. Deretter ble næringsagar på cirka 40 C helt over og innholdet i skålene ble blandet godt. Skålene ble satt i romtemperatur over natten slik at agaren stivnet, før den ble satt i varmeskap ved 37 C i 1,5 døgn. Kimtellingene fra disse skålene viste at det ville være tilstrekkelig med fire fortynninger ved prøveopparbeiding. Ved sammenligning av utplatings- og innstøpningsmetoden var det sistnevnte som ga best resultater, så det ble bestemt at denne metoden var den beste å bruke til resten av prøvene i forsøket. 18
3.2.2.3 Kvalitative målinger ved bruk av kontaktplater Til de kvalitative målingene ble det brukt kontaktplater. Disse ble laget ved at 55 mm petriskåler ble fylt til kanten med næringsagar og endoagar. Oppskriftene er gitt i tabell 2 og 3, vedlegg 1. Næringsagaren ble brukt for å konstatere bakteriell aktivitet på prøvetakingsstedet, mens endoagaren ble brukt for å kontrollere om det fantes koliforme bakterier, spesielt E. coli. Kontaktplatene ble presset mot gulvet slik at eventuelle bakterier kunne feste seg til agaren. Etter prøvetakingen ble platene inkubert i varmeskap ved 37 C i to døgn før de skulle analyseres videre. Til den kvalitative kontrollen av bakterieforekomst, da spesielt av E. coli, etter en kloakkskade, ble det tatt prøver fra kjellere i tre eneboliger der det hadde vært tilbakeslag. Skadene var 3-7 dager gamle, det meste hadde blitt vasket, og det som var igjen av skadene var forholdsvis tørt. Prøvene ble tatt ved hjelp av kontaktplater med endoagar som forklart over. Platene ble satt i varmeskap ved 37 C i to døgn før de ble videre kontrollert. 19
4 Resultat 4.1 Test av muggsoppdrepende midler 4.1.1 Test på maltekstraktagar For grovtesting av effektiviteten av fire forskjellige midler mot muggsoppvekst ble små filterbiter som var dyppet i testproduktene lagt nord, sør, øst og vest på hver sin skål med maltekstraktagar. I midten av hver skål ble det plantet soppsporer. Skålene ble satt i varmeskap ved 22 ºC. Etter to ukers inkubering ble platene kontrollert for å se hvor effektivt de forskjellige testproduktene hadde holdt soppveksten unna filterbitene. Det ble laget et diagram ut fra veksten på testskålene, vedlegg 5, der den hemmende effekten er rangert fra 0-4, som tilsvarer henholdsvis ingen, lite, middels, god og svært god hemmende effekt. Diagrammet er vist i figur 11. 4 Cladosorium herborum Penicillium chrysogenum Aspergillus versicolor Hemmende effekt 3 2 1 0 Saltvann Destillert vann Hydrogenperoksid Thymol Dodecyl dipropylentriamin Testløsning, konsentrasjon A Testløsning, konsentrasjon B Figur 11: Diagram som viser den hemmende effekten mot muggsopp de ulike midlene som er testet har, rangert fra 0-4, som tilsvarer henholdsvis ingen, lite, middels, god og svært god hemmende effekt. 20
Resultatene viste at testløsningen hadde større sopphemmende effekt enn de andre midlene. Figur 12 og 13 viser resultatet fra skålen med testløsningen, henholdsvis konsentrasjon A og B. Figur 12: Resultat fra forsøk med testløsning, konsentrasjon A, på maltekstraktagar med muggsoppen Penicillium chrysogenum. Figur 13: Resultat fra forsøk med testløsning, konsentrasjon B, på maltekstraktagar med muggsoppen Cladosporium herborum. Det er tydelig at testløsningen, spesielt konsentrasjon B, virker hemmende, da det er svært lite synlig soppvekst på filterbitene. Av figur 11 vises det at de andre testproduktene også hemmer soppveksten, men i mindre grad enn testløsningen. Det eneste middelet som viser like god hemmende effekt som testløsningen er middelet med virkestoffet dodecyl dipropylentriamin. Resultatene viser også at samtlige av de soppdrepende midlene hadde vekst av Aspergillus versicolor i varierende grad på filterbitene, men også her fungerer testløsningen bedre enn de andre. 4.1.2 Test på gipsplater For å teste varig effektivitet av de fire forskjellige midlene mot muggsoppvekst ble gipsplater, som var satt inn med midlene, sprayet med soppsporer og hengt opp i fuktkamre med forskjellig relativ luftfuktighet. 21
Etter fire uker ble det foretatt en grovkontroll av gipsplatene for å se om forsøket fungerte som planlagt, det vil si om det fantes vekst og om vekstmengden varierte på de ulike parallellene. Resultater fra kontrollen er gitt i tabell 2. Tabell 2: Oversikt over muggsoppvekst på gipsplater etter 4 uker ved 100 % RF. Muggsoppmiddel Vekst (%) Testløsning, konsentrasjon A Sparsom vekst, ~ 5 % Testløsning, konsentrasjon B Ingen vekst Hydrogenperoksid Moderat vekst, 5-10 % Dodecyl dipropylentriamin Moderat vekst, ~ 10 % Thymol Moderat vekst, 5-10 % Nullprøve Moderat vekst, ~ 10 % Ren gipsplate Sparsom vekst, ~ 10 % Etter ni uker i fuktkamre ble muggsoppveksten på gipsplatene kontrollert ved mikroskopering etter Mycoteams egen metode for å anslå mengde sopp, se vedlegg 3. Prøvene som skulle mikroskoperes ble tatt ved tapeavtrekk med Mycotape på begge sider av hver plate i alle fuktkamrene, og mikroskopipreparater ble laget. Et utvalg av platene etter ni ukers inkubering ved 100 % relativ luftfuktighet er vist i figur 14. Figur 14: Viser eksempel på gipsplater med muggsoppvekst fra fuktkammeret med 100 % relativ luftfuktighet. Antall ruter med hyfer i et rutenett på 360 ruter ble telt, og et gjennomsnitt av disse ble beregnet, se tabell 1,2 og 3, vedlegg 6. Ut fra disse verdiene ble den prosentvise veksten beregnet. For å tydeliggjøre den prosentvise vekstforskjellen av hyfer på gipsplatene med de ulike testproduktene ble det laget et søylediagram med nøyaktige prosentverdier fra mikroskoperingen. Diagrammet er vist i figur 15. Det ble også laget et diagram som viser sporeforekomst på de forskjellige parallellene. Sporeforekomsten er rangert fra 0-3, som tilsvarer henholdsvis ingen, lite, moderat og rik forekomst, se figur 16. 22
20 17 15 13 13 Vekst (%) 10 11 10 7 6 5 0 Ren gipsplate Nullprøve Hydrogenperoksid Thymol Dodecyl dipropylentriamid Testløsning, konsentrasjon A Testløsning, konsentrasjon B Figur 15: Søylediagram som viser prosentvis vekst av muggsopp på gipsplatene ved 100 % relativ luftfuktighet. 3 Sporeforekomst 2 1 0 Ren gipsplate Nullprøve Hydrogenperoksid Thymol Dodecyl dipropylentriamid Testløsning, konsentrasjon A Testløsning, konsentrasjon B Figur 16: Søylediagram som viser sporeforekomst på gipsplatene ved 100 % relativ luftfuktighet. Forekomsten er rangert fra 0-3, som tilsvarer henholdsvis ingen, lite, moderat og rik forekomst. I fuktkammeret med 86 % relativ luftfuktighet var det ikke forventet mye vekst fordi dette er på grensen til hva muggsopp trenger for å vokse. På de fleste platene ble det ikke observert verken vekst eller sporer, bortsett fra platene med hydrogenperoksid. Resultatene fra kontrollen av muggsoppvekst og sporeforekomst ble beregnet på samme måte som tidligere, og er vist i henholdsvis figur 17 og 18. 23
5 4 Veskt (%) 3 2 1 0 0 0 0,8 0 0 0 0 Ren gipsplate Nullprøve Hydrogenperoksid Thymol Dodecyl dipropylentriamid Testløsning, konsentrasjon A Testløsning, konsentrasjon B Figur 17: Søylediagram som viser prosentvis vekst av muggsopp på gipsplatene ved 86 % relativ luftfuktighet. 3 Sporeforekomst 2 1 0 Ren gipsplate Nullprøve Hydrogenperoksid Thymol Dodecyl dipropylentriamid Testløsning, konsentrasjon A Testløsning, konsentrasjon B Figur 18: Søylediagram som viser sporeforekomst på gipsplatene ved 86 % relativ luftfuktighet. Forekomsten er rangert fra 0-3, som tilsvarer henholdsvis ingen, lite, moderat og rik forekomst. På platene fra fuktkammeret med 76 % relativ luftfuktighet ble det ikke observert verken muggsoppvekst eller sporeforekomst. Dette var forventet resultat, siden den relative luftfuktigheten var under normalt påkrevd grense for vekst. 24
4.2 Test av ATP-måler, kvantifisering av naturlig bakterieforekomst og påvisning av E. coli Til kvantitative målinger av naturlig bakterievekst ble det testet ut to ulike prøvetakingsmetoder for å senere forsøke å finne en sammenheng mellom disse. Det ble brukt ATP-måler, som måler mengde ATP fra mikroorganismer ved hjelp av lyssignaler, og kimtelling etter prøvetaking med svaber. Som kvalitativ kontroll ble det brukt kontaktplater med nærings- og endoagar. 4.2.1 Kvantifisering ved bruk av ATP-måler For å tydeliggjøre forskjellen av mikrobiologisk aktivitet funnet med ATPmåleren på de ulike prøvetakingsområdene ble det laget et søylediagram som illustrerer gjennomsnittlig RLU fra hvert område. De høyeste RLU-verdiene ble målt på mørkere og fuktigere områder enn områdene der de lavere verdiene ble målt. Diagrammet ble laget ut fra tallene i tabell 1-5, vedlegg 4, og er vist i figur 19. 2500 2422 2000 Gjennomsnittlig RLU 1500 1000 500 0 554 78 155 48 1 2 3 4 5 Prøvetakingsområde Figur 19: Søylediagram som viser gjennomsnittlig målt RLU fra fem forskjellige prøvetakingsområder. 4.2.2 Kvantifisering ved bruk av svabermetode og kimtelling Det ble laget to serier med prøver fra kjellere i eneboliger til metodeutviklingen. Etter to døgns inkubering hadde ingen bakterier vokst opp på platene i den første serien, så disse måtte derfor forkastes. I den andre serien var det etter to døgn lite tegn til vekst på platene. Etter nok et døgn var det blitt noe mer vekst, hovedsakelig bare i kantene på platene og ved ulogiske fortynninger, se tabell 1, vedlegg 7. Veksten i kantene var så tett at kolonier vanskelig kunne telles, og platene ble derfor forkastet. 25
Fem nye prøveserier fra bygårdskjellere ble laget. Både utplatings- og innstøpningsmetoden ble utført på den første av disse fem, og etter to døgns inkubering ga innstøpningsmetoden de beste resultatene, se tabell 1 og 2, vedlegg 7. Denne metoden ble derfor brukt på de fire siste prøveseriene. Kimtellingsresultatene fra disse prøvene er gitt i tabell 3-6, vedlegg 7. Antall kim per ml for hver av prøvene ble beregnet ved hjelp av likning 1. Verdiene brukt til utregningene er hentet fra tabell 2-6, vedlegg 7. Ut fra gjennomsnittlig kimtall per ml fra hvert av prøvetakingsstedene, funnet ut fra de beregnede kimtallene i tabell 1-5, vedlegg 8, ble det laget et søylediagram som er vist i figur 20 7,0E+03 6,7E+03 6,0E+03 Gjennomsnittlig kimtall 5,0E+03 4,0E+03 3,0E+03 2,0E+03 1,6E+03 2,8E+03 1,7E+03 2,9E+03 1,0E+03 0,0E+00 1 2 3 4 5 Prøvetakingsområde Figur 20: Søylediagram som viser gjennomsnittlig beregnet kimtall fra fem forskjellige prøvetakingsområder. 4.2.3 Kvalitative målinger ved bruk av kontaktplater Etter to døgns inkubering ved 37 ºC ble skålene med kontaktagar fra bygårdskjellerne kontrollert for vekst av mikroorganismer. Samtlige næringsagarplater viste tegn til forekomst av både bakterier og muggsopp. De positive prøvene som indikerte forekomst av E. coli og andre koliforme bakterier skulle gi utslag i form av henholdsvis metallfargede og rødlige kolonier på endoagaren. Av 48 plater med endoagar som ble brukt til påvisning av E. coli, var det kun én som ga positivt resultat, og på denne fantes det bare én koloni som var metallfarget og dermed indikerte E. coli. Denne prøven var fra prøvetakingssted 5, som ut fra figur 19 og 20 ser ut til å være det området med mest mikrobiologisk aktivitet. 26
I eneboligene der det hadde vært tilbakeslagsskader ble det også brukt kontaktplater med endoagar som ble analysert etter to døgns inkubering ved 37 ºC. Som forventet ble det her funnet større innslag av bakterier enn fra prøvetakingsstedene uten skader. Det prosentvise antallet av positive prøver ble regnet ut og illustrert i et søylediagram som er vist i figur 21. 100 E. coli Andre koliforme bakterier 90 Antall positive prøver (%) 80 70 60 50 40 30 20 43 71 67 33 25 50 10 0 1 2 3 Prøvetakingssted Figur 21: Prosentvis antall prøver som testet positivt for E. coli og andre koliforme bakterier etter tilbakeslag fra tre kjellere i eneboliger. 27