Effekter og analyser av alkylfenoler. Stepan Boitsov Gruppe Marin Miljøkvalitet, HI

Effekter og analyser av alkylfenoler Stepan Boitsov Gruppe Marin Miljøkvalitet, HI 1 1

OVERSIKT AV PRESENTASJONEN Biologiske effekter av alkylfenoler Etablering og validering av analysemetoder for alkylfenoler i produsert vann og biota Bruk av metoden i pågående forsøk Planlagt arbeid 2 2

Østrogen aktivitet av alkylfenoler OH HO 4-n-oktylfenol HO 17-β -estradiol Alkylfenoler - binder seg til østrogen-reseptor - stimulerer reseptor-transkripsjon - syntese av vitellogenin blir indusert - feminisering 3 3

Østrogen aktivitet av alkylfenoler OH OH OH OH OH OH >> > R R Para Meta Ortho R > = C 8 >C 7 >C 6 >C 9 > C 5 >C 4 >C 3 Tertiær Sekundær Normal 4-tert-Oktylfenol - 1000 ganger mindre potent enn østradiol 4- tert-butylfenol - 1,5 million ganger mindre potent enn østradiol Effekter på torsk (Gadus Morhua): 4-heptylfenol akutt toksisk ved 400 µg/l Langkjedete alkylfenoler hormonelle effekter ved 0.04 µg/l 4 4

Kilder av alkylfenoler i naturen Alkylfenol etoksylater (APE) Oktylfenol, nonylfenol Produksjon reduseres; forbudt i Norge siden 2002 Produsert vann Alle vannløselige alkylfenoler Utslipp økes ortynning faktor 5 5

Etablering av analysemetoder Krav til metodene: Skal kunne brukes for alkylfenoler med forskjellig kjedelengde, fra fenol (C 0 ) til nonylfenol (C 9 ). Anvendelig til biotaprøver med både høyt (>70%) og lavt (<1%) lipidinnhold. Anvendelig til produsert vann prøver med både høyt (fenol) og lavt (C 5 -C 9 -fenoler) innhold av alkylfenoler. Høy selektivitet og følsomhet. Deteksjonsgrense i lavt ppb område. 6 6

Hovedtrinn i metoden (Produsert vann) iltrering av 100 ml vann. astfase ekstraksjon av filtratet på MAX sorbent, eluering med 5% CHOOH/MeOH. Oppkonsentrering av både filtrat og filter ekstrakt med N 2 til ca. 1 ml. Derivatisering med pentafluorobenzoylklorid. GC/MS analyse. Kvantifisering (isotop fortynning). R 3 NH 2 + C O N CH 2 + NR 3 Oasis MAX mixed-mode polymer sorbent har anionbytter-egenskaper N O 7 7

Hovedtrinn i metoden (biota) Ekstraksjon av ca. 1g vev med diklormetan. Opprensing med gel-permeation chromatography (GPC). Derivatisering med pentafluorobenzoylchloride. GC/MS analyse. Kvantifisering (isotop fortynning). 8 8

OH R + Pentafluorobenzoyl-derivatisering Cl C= O OH - Risting 1 min 30 min ved r.t. R O O = - Betingelser: ph = 10.15 (3 ml NaOH/NaHCO 3 buffer); 2 ml heksan; 100 µl pentafluorobenzoylklorid (30 % i isooktan); hydrolyse med 10 ml 1 M NaOH; C ekstraksjon med 2 x 2 ml heksan -Signifikante parametre funnet fra actorial Screening Design-forsøk -ungerer godt for para- og meta-, mindre godt for ortho-alkylfenoler 9 9

Totalionkromatogram av produsert vann (GC/MS, SIM) Abundance Phenol 5000000 o-,m-,p-cresol C 2 -Alkylphenols 2500000 Larger alkylphenols 20.00 30.00 40.00 50.00 Time, min 10 10

Massespektre av 4-n-oktylfenol: A) EI; B) NCI. A) 195 m/z 301 O O C = m/z 195 C 7 H 7 OH C 6 H 5 57 107 78 148 C 6 5 167 301 M +. 400 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 M/ Z M B) - O O C = 400 Mw 400 (- H) M- 20 196 336 380 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 M/ Z 11 11

Linearitet for 4-n-oktylfenol med forskjellige detektorsystemer Måleområde Ikke derivatiserte forbindelser Linearitet GC-MS (EI) 47-6064 pg/µl R 2 =0,9934 Derivater GC-MS (EI) 0,9-760 pg/µl R 2 =0,9906 GC-ECD 1,3-260 pg/µl R 2 =0,9981 GC-MS (NCI) 0,03-1221 pg/µl R 2 =0,9986 12 12

120 100 80 60 40 20 0 Gjenvinning av alkylfenoler p-cresol Kresol 4-n- butylfenol 4-n- oktylfenol 13 13 derivatisering Oppkonsentrering (N2 ) GPC GPC Total Total analyse ordampet til tørrhet Kromatografi Total gjenvinning (%)

16000 R ubber stopper m /z 414 14000 for glass funnel 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Bidrag til økte blankverdier 0 4000 5 3.0 5 4.0 5 5.0 5 6.0 5 7.0 5 8.0 5 9.0 6 0.0 H a rd p la stic fro m m /z 414 screw caps 3000 2000 1000 0 1800000 1400000 5 3.0 5 4.0 5 5.0 5 6.0 5 7.0 5 8.0 5 9.0 6 0.0 m / z 4 1 4 soft rubber liner from screw caps 1000000 600000 200000 0 5 3.0 5 4.0 5 5.0 5 6.0 5 7.0 5 8.0 5 9.0 6 0.0 14 14

ordelene og ulempene til metoden: oppsummering Pentafluorobenzoyl-derivatisering gir stabile derivater med gode kromatografiske egenskaper er en robust metode fungerer godt for para- og meta- alkylfenoler ikke ortho-alkylfenoler GC/MS (NCI) svært følsom og selektiv teknikk Hele metoden gir gode (>70%) gjenvinninger god reproduserbarhet (<15% RSD) 15 15

Pågående og planlagt arbeid Analyser av alkylfenoler i sjøvann Bruk av metoden i et forsøk med eksponering av fisk til produsert vann Identifisering av ukjente forbindelser i produsert vann Ukjente alkylfenol-isomerer Andre ukjente forbindelser Analyser av østrogen-forbindelser i sjøvann 16 16

Analyse av østrogen-forbindelser 100000 RIS Isopropylfenol-d12 17-β-østradiol Østron SIS Østron-d4 17-α-etynyløstradiol 10 20 30 40 50 60 70 80 Time, min 17 17

Eksponering-forsøket Kontinuerlig eksponering av torsk fra gyting til avsluttet kjønnsdifferensering. Gruppe ortynningsfaktor Antatt avstand fra utslippet (m) Høy (H) 1:100 (1 %) 0-100 Middels (M) 1:1000 (0,1 %) 100-1000 Lav (L) 1:10000 (0,01%) >2000 Positiv kontroll (P) 10 ppb 17- β-estradiol Kontroll (K) - 18 18

Kontroll av alkylfenol-innhold av vannet i eksponeringsforsøket Konsentrajon av kortkjedete fenoler 10000,0 ug/l 1000,0 enol Sum kresoler Sum C2-fenoler 100,0 10,0 1,0 0,1 0,0 Østrogen Kontroll Lav Middels Høy Produsert Vann 19 19

Total hydrokarbon, mg/l Produsert vann innhold 2001 52,0 2002 11,6 2003 5,8 Alkylfenoler, µg/l 2001* 2002 2003 Phenol 4372 5031 4466 Sum cresols 2772 4051 5064 Sum C 2 -phenols 4793 1004 1624 Sum C 3 -phenols 340 338,8 224 Sum C 4 -phenols 94,5 56,8 38,1 Sum C 5 -phenols 19,1 3,0 4,5 Sum C 6 -phenols 0,58 1,79 0,30 Sum C 7 -phenols 0,28 0,09 0,06 Sum C 8 -phenols 0,15 0,04 0,03 Sum C 9 -phenols 0,20 0,00 0,03 * - data fra SINTE 2004 4934 6612 817 177 65,9 4,6 0,66 0,02 0,02 0,00 47,5 Ukjente C3 54,9 Ukjente C4 14,4 Ukjente C5 2,19 Ukjente C6 0,23 Ukjente C7 20 20

Ukjente alkylfenoler i produsert vann 10000,000 ug/l 1000,000 100,000 10,000 1,000 0,100 0,010 21 21 enol Kresoler C2-fenoler Ukjente C3 Kjente C3 Ukjente C4 Kjente C4 Ukjente C5 Kjente C5 Ukjente C6 Kjente C6 Ukjente C7 Kjente C7-C9

Identifisering av alkylfenol-isomerer i produsert vann Ion 330.00 Standard-løsning Produsert-vann prøve 20.00 40.00 60.00 Time, min 22 22

Ion masse Identifisering av alkylfenol-isomerer i produsert vann Alkyl kjedelengde (for alkylfenoler) Antall kjente alkylfenol isomerer Antall ukjente alkylfenol isomerer 288 C 0 1 0 0 302 C 1 3 0 0 316 C 2 9 0 0 330 C 3 9 10 0 344 C 4 6 24 8 358 C 5 4 31 29 372 C 6 2 39 35 386 C 7 2 32 5 400 C 8 1 0 13 414 C 9 1 3 2 356-0 0 31 370-0 0 14 384-0 0 24 Antall ukjente forbindelser 23 23