LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument

LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. LightCycler MRSA Advanced Test LC MRSA 96 Tests P/N: 05352894 190 LightCycler Advanced Lysis Kit LYS ADV 96 Tests P/N: 05205743 190 TILTENKT BRUK LightCycler MRSA Advanced-testen er en kvalitativ in vitro-diagnostisk test for direkte deteksjon av nasal kolonisering av meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) for å bidra til forebygging og kontroll av MRSA-infeksjoner i helsevesenet. Testen utføres på LightCycler 2.0-instrumentet med nasale penselprøver fra pasienter der det er mistanke om kolonisering. Til preparering av prøver brukes penselekstraksjon og mekanisk lysering. Heretter følger polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere MRSA DNA. Amplifisert DNA detekteres av fluorescensdannende målspesifikke hybridiseringsprober. LightCycler MRSA Advanced-testen skal ikke brukes til å diagnostisere MRSA-infeksjoner eller til å styre eller overvåke behandling av MRSA-infeksjoner. Medfølgende kulturer skal kun brukes til å gjenfinne organismer for epidemiologisk typebestemmelse eller for ytterligere følsomhetstesting. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Staphylococcus aureus er et opportunistisk patogen som bæres som en kommensal organisme på huden og i neseveien hos ca. 30 % av normalbefolkningen og kan potensielt forårsake et bredt spektrum av sykdommer, i cirka 34 % av tilfellene med fatalt utfall i løpet av 30 dager etter infeksjon 1,2. S. aureus kan raskt tilpasse seg selektivt press fra behandlinger med antibiotika, noe som har ført til spredning av meticillinresistente stammer av S. aureus (MRSA). meca-genet er lokalisert på et stort, mobilt genetisk element som kalles SCCmec (stafylokokkenes kassettkromosom mec), og er ansvarlig for resistens mot meticillin og andre β-laktam antibiotika. meca-genet koder for et endret penicillinbindende protein, PBP2a eller PBP2, som har svært lav affinitet for alle β-laktamantibiotika og muliggjør normal syntese av det peptidoglykane laget selv om disse antibiotikatypene er til stede 3. Flere MRSA-stammer har oppstått og spredt seg over hele verden, og SCCmec har overført til ulike linjer av methicillinsensitive S. aureus 4. Hittil er fem SCCmec-typer (I V) funnet, og flere varianter av disse SCCmec-typene er beskrevet 5. Sykehusassosierte infeksjoner (healthcare associated infections, HAI) forårsaket av MRSA har i det siste blitt et alvorlig problem for helseinstitusjoner verden over på grunn av høy grad av infeksjon og mortalitet og høye behandlingskostnader 6-9. I tillegg har samfunnservervet MRSA (CA-MRSA) spredt seg i de siste årene 10 og blitt en del av infeksjonsinnføringsveien til sykehus 11,12, noe som understreker behovet for omfattende infeksjonskontrollprogrammer. I 2008 ble det utarbeidet et sammendrag av alle offentliggjorte retningslinjer fra flere statlige, profesjonelle og offentlige helseorganisasjoner for å hjelpe institusjoner med å prioritere og implementere sine tiltak for å unngå spredning av MRSA. 13 Alle programmer for å forhindre spredning av MRSA må omfatte en rekke nøkkelstrategier, inkludert aktiv kontrollscreening, håndhygiene, pasientisolering og andre tiltak for å hindre spredning. PCR-deteksjon av MRSA i sanntid reduserer deteksjonstiden i betydelig grad (mindre enn 2 timer på laboratoriet) sammenlignet med standard kulturtester og gjør derfor kontroll- og administrasjonsstrategier mer effektive. 1

TESTPRINSIPPER Deteksjon av MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen bygger på 3 hovedprosesser: Preparering av prøve ved mekanisk lysering av den bakterielle celleveggen PCR-amplifisering av mål-dna og deteksjon ved bruk av spesifikke hybridiseringsprober Automatisk resultatgenerering etter smeltekurveanalyse Prøvepreparering Den mekaniske lyseringen av nasale penselprøver utføres av LightCycler Advanced-lyseringskitet og MagNA Lyser-instrumentet. Hodene på penselprøvene skjæres av, legges i lyseringsrør og varmes opp slik at alle bakterier deaktiveres. Etterpå blir lyseringsrørene overført til MagNA Lyser-instrumentet der den mekaniske lyseringen av bakteriecelleveggen finner sted og gir ubehandlede lysatpreparater. Etter en kort sentrifugering der glasskuler og penselprøvefibrer fjernes, blir de behandlede prøvene utsatt for PCRanalyse ved bruk av LightCycler MRSA Advanced-testen. PCR-amplifikasjon Valg av mål Primerne og probene i LightCycler MRSA Advanced-testen detekterer en merkebeskyttet sekvens som indikerer at SCCmec-kassetten er integrert i S. aureus-kromosomet, noe som tyder på tilstedeværelse av MRSA-DNA. Amplifikasjon De preparerte prøvene og amplifikasjonsblandingen som inneholder hot-start Taq-polymerase, plasseres i LightCycler -kapillærene (20 μl), hvor PCR-amplifikasjon vil finne sted. Hver LightCycler MRSA Advanced-testreaksjonen inneholder en intern kontroll som er konstruert for å kontrollere prøveinhibisjon og overvåke reagensintegritet. Enzymet AmpErase (uracil-n-glykosylase) er også tilstede i LightCycler MRSA Advanced-testen. Det gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Siden amplicon som er produsert med LightCycler MRSA Advanced-testen, inneholder deoksyuridin, blir potensielle ampliconkontaminanter eliminert i løpet av et langt oppvarmingstrinn som utføres før PCR-amplifikasjonen starter. En målsekvens i et plasmid blir samtidig amplifisert i den positive kontrollen. Den positive kontrollen skal monitorere reagensfunksjonen og inkluderes i hver analyseserie. Hver analyseserie inkluderer også en negativ kontroll for å påvise reagens- eller miljøkontaminering av MRSA-DNA. Spesifikk deteksjon av PCR-produkter ved bruk av hybridiseringsprober MRSA og interne kontrollampliconer detekteres ved fluorescens ved bruk av et spesifikt hybridiseringsprobepar. Probene fester seg til en spesifikk intern sekvens i det amplifiserte fragmentet og posisjoneres nær hverandre. Ved eksitasjon sender disse bundne probene ut et fluorescenssignal av et spesifikk bølgelengde ved bruk av en prosess som kalles FRET (overføring av resonansfluorescensenergi). Lyset som sendes ut, måles av LightCycler 2.0-instrumentet. MRSA eller interne kontrollspesifikke ampliconer detekteres parallelt i to forskjellige deteksjonskanaler og kan derfor differensieres. Etter at PCR-prosessen er fullført i sanntid blir en smeltekurveanalyse utført automatisk av LightCycler 2.0-instrumentet. Enkelttrådede DNA-ampliconer med bundne hybridiseringsprober utsettes for økte temperaturer. Når PCR-produktene når en spesifikk temperatur, vil en av de to bundne hybridiseringsprobene smelte vekk og føre til tap av fluorescenssignal. Reduksjonen av fluorescenssignalet finner sted ved en spesifikk temperatur og fører til smeltetopper som brukes til å identifisere MRSA- og IC-spesifikke amplikoner. Automatisk resultatgenerering etter smeltekurveanalyse Etter at smeltetoppene er identifisert visuelt ved bruk av T M -stolpene i LightCycler -programvaren, blir testresultatene overført til et dedikert tolkningsverktøy (mikroanalyseprogramvaren), og det opprettes en rapport. 2

REAGENSER LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced lyseringskit (P/N: 05205743 190) LYS (Lyseringsreagens) Tris-buffer EDTA < 15 % silisiumperler 0,09 % natriumazid LYS ADV 96 tester 96 x 0,6 ml LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190) LC MRSA 96 tester MRSA RXNMX (MRSA reagensblanding) Tris-buffer < 0,1 % magnesiumklorid Kaliumklorid < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp 0,19 % oktylglukosid 0,03 % bovint serumalbumin (fra pattedyr) < 0,1% FastStart Taq DNA Polymerase (mikrobielt) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobielt) 0,09 % natriumazid MRSA DETMX (MRSA-deteksjonsblanding) 0,05 % Brij 35-løsning Tris-buffer < 0,01 % EDTA < 0,01 % MRSA-primere < 0,01 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for MRSA og internkontrollen for MRSA 0,09 % natriumazid 0,001 % poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder bindingssekvenser for MRSA-primer og en unik probebindingssekvens MRSA (+) C (MRSA positiv kontroll) Tris-buffer < 0,01 % EDTA 0,002 % poly ra RNA (syntetisk) 0,09 % natriumazid < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder MRSA-sekvenser 3 x 0,352 ml 3 x 0,176 ml 1 x 0,176 ml 3

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. B. Denne testen skal kun brukes til nasale penselprøver. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering av reagenser når avpipetterte mengder fjernes fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipetter og pipettespisser anbefales. F. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke blandes. G. Reagenser fra ulike kit lot må ikke blandes. H. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. I. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. J. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. K. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 14 og i CLSI-dokument M29-A3 15. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. L. LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. M. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. N. Kontaminasjon fra positive kontroller og positive prøver kan unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Oppbevar LightCycler Advanced lyseringskit (LYS) stående ved 15 til 25 C ved mottak. B. Oppbevar LightCycler MRSA Advanced-testkitet (MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C) ved -15 til -25 C ved mottak. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, skal det resterende MRSA RXNMX og MRSA DETMX oppbevares ved -15 til -25 C eller ved 2 to 8 C i inntil 30 dager. MRSA RXNMX og MRSA DETMX kan gjennomgå opptil 5 fryse-tine-sykluser. C. Når den er åpnet, skal det resterende MRSA (+) C oppbevares ved -15 til -25 C i inntil 30 dager eller ved 2 to 8 C i inntil 30 dager. MRSA (+) C kan gjennomgå opptil 22 fryse-tine-sykluser. D. Ikke utsett MRSA DETMX for lys. E. Working Master Mix (tillaget ved å tilsette MRSA RXNMX og MRSA DETMX) kan oppbevares beskyttet mot lys i inntil 30 dager ved 2 to 8 C. 4

F. Preparerte prøver er stabile i inntil 30 dager ved -15 til -25 C, i 6 dager ved 2 til 8 C, eller i 1 dag ved 15 til 25 C. G. Amplifikasjon må startes omgående etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt Working Master Mix. Hvis dette ikke er mulig, skal de fylte kapillærene oppbevares beskyttet mot lys i maksimalt 3 timer ved 2 til 8 C. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced lyseringskit (P/N: 05205743 190) LYS ADV LYS (lyseringsreagens) B. LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190) LC MRSA MRSA RXNMX (MRSA-reagensblanding) MRSA DETMX (MRSA-deteksjonsblanding) MRSA (+) C (MRSA positiv kontroll) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare LightCycler 2.0-instrument (P/N: 03 531 414 201) LightCycler -programvaren 4.1 (P/N: 04 898 915 001) eller høyere LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.0 CE (P/N: 05 414 326 190) eller høyere LC-karusellsentrifuge 2.0 [P/N: 03 709 582 001 (230 V) eller P/N: 03 709 507 001 (110V)] eller standard bordmikrosentrifuge som inneholder en rotor for 2,0 ml rør og LC-sentrifugeadaptere (P/N: 11 909 312 001) MagNA Lyser-instrumentet [P/N: 03 358 976 001 (230 V) eller 03 358 968 001 (110 V)] Reagenser og engangsprodukter LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) LightCycler kapillærrør, 20 μl (P/N: 04 929 292 001) ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER BD CultureSwab Liquid Stuart (BD P/N: 220109) eller Copan Venturi Transystem Liquid Stuart (Copan Italia International P/N: 139C); Eller BD CultureSwab pluss Amies-gel uten kull (BD P/N: 220117) eller Copan Venturi Transystem pluss Amies-gel uten kull (Copan Italia International P/N: 134C); Eller BD CultureSwab pluss Amies-gel med kull (BD P/N: 220122) eller Copan Venturi Transystem pluss Amies-gel med kull (Copan Italia International P/N: 136C) Engangshansker, uten pudder Gasbind eller saks 5

Etanol (70 %) Justerbare pipetter*: (mål: 10 μl, 100 μl og 1000 μl) med sterile, DNase-fri mikropipettespisser med filterbarriere eller positiv displassering Varmeblokk ved 95 C (± 2 C): VWR (P/N: 12621-088) eller tilsvarende med 2,0 ml rørblokk : VWR (P/N: 12985-050) Mikrosentrifuge som kan yte en sentrifugalkraft på 8000 20 000 x g med rotor som passer til 2,0 ml rør med skrukork: P/N: Eppendorf-modell 5417R eller tilsvarende Steril 1,5 ml silikonisert mikrosentrifugerør av polypropylen: P/N: Eppendorf bestillingsnr. 0030 108.051 eller liknende Vortexmikser: Fisher (P/N: 12-812) eller liknende Mikrorørverktøy: VWR (P/N: 20170-688) eller liknende * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. PRØVETAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. A. Prøvetaking 1. Fukt prøvepenselen med to dråper (ca. 50 μl) sterilt fysiologisk saltvann eller bruk tørr pensel. 2. Sett penselprøven forsiktig 1,3 cm inn i neseboret (begge penselprøvehodene på samme tid hvis det dreier seg om en penselprøve med to hoder) og roter den mot slimhinnen fem ganger mens det øves lett trykk på utsiden av nesen (for å sikre at penselprøvene kommer i kontakt med innsiden av nesen). 3. Sett den samme penselprøven inn i det andre neseboret og gjenta prosedyren. 4. Legg penselprøven tilbake i beholderen og merk den. B. Transport og oppbevaring av prøver Transport av prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt, statlig og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 16. Prøver kan transporteres ved 2 til 25 C. Prøver kan lagres før behandling (inkludert nødvendig transporttid) som definert nedenfor. Prøver som er tatt med Liquid Stuart penselprøver, er stabile ved 15 til 25 C i opptil 4 dager, ved 2 til 8 C i opptil 5 dager, og -20 C i opptil 30 dager. Prøver som er tatt med Amies-gel penselprøver med eller uten kull, er stabile ved 15 til 25 C i opptil 4 dager. 6

BRUKSANVISNING Klargjøring av instrumentet A. Installering av mikroanalyseprogramvaren (MAS) For installeringsoppdateringer, sjekk om ytterligere informasjon følger med produktet. 1. Logg deg på som administrator på LightCycler -datastasjonen. 2. Sett LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.0 CE CD (eller høyere) inn i CD-stasjonen på LightCycler -datastasjonen. 3. Førstegangsinstallasjon: a. Hvis Microsoft Data Access Components 2.8 ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Data Access Components 2.8 må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. b. Hvis Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. c. Hvis Microsoft Windows Installer 3.1 ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Windows Installer 3.1 må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. d. Hvis Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer ikke er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. e. Hvis Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. 4. Hvis du blir bedt om å starte maskinen på nytt, skal du bekrefte det ved å klikke på <Yes>. MRSA Advanced-programvaresett i løpet av restart- Merk: Ikke fjern CD-en for LightCycler prosessen. 5. Etter ny oppstart, følg instruksjonene til installasjonsveiviseren. Trykk på <Next> for å starte installering av MAS. 6. Velg <Just Me> hvis bare én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen. Velg <Everyone> hvis mer en én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen. 7. Bekreft at MAS-installeringen var vellykket ved å klikke på <Close> i vinduet <Installation Complete>. 8. Start programmet ved å bruke MAS-ikonet på datamaskinens skrivebord. 9. Datamappen for *.ixo- og *.pdf-filer: <C:\Export to MAS> opprettes automatisk når MAS startes. B. Verifisere installasjon av mikroanalyseprogramvaren (MAS) 1. Kopier korrekturfilene (LightCycler MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo og LightCycler MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf eller høyere) fra LightCycler MRSA Advanced programvaresett v1.0 CE CD (eller høyere) inn i <C:\Export to MAS>-mappen. 2. Hvis MAS ikke er åpen, dobbeltklikk på MAS-ikonet på skrivebordet og trykk på <Load>. 3. Velg MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo (eller høyere) i <C:\Export to MAS>-mappen. 4. Klikk på <NO>, for å angi at LightCycler -rapporten ikke inneholder flagget <User Developed or Modified Test Method>. 7

5. Skriv inn lotnr., utløpsdato og labinfo i de riktige feltene i vinduet MRSA Configuration Settings. Advanced lyseringskit Lot No 11A00000 Expiration Date 12201812 MRSA Advancedtest Lot No 23A00000 Expiration Date 24201812 Personinformasjon Lab Info Roche-lab 6. Velg rapporttypen <MRSA Combined> og fortsett med <OK>. Filen vil bli analysert automatisk, og dataene vil vises. 7. Skriv ut rapporten. 8. Åpne og skriv ut MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf (eller høyere) (plassert i <C:\Export to MAS>-mappen). 9. Pass på at den utskrevne MAS-rapporten og den utskrevne PDF-filen inneholder de samme resultatene. Hvis ikke, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. C. Fjerning av mikroanalyseprogramvaren (MAS) 1. Logg på som administrator på LightCycler -datastasjonen. 2. Klikk på <Start> i oppgavefeltet for LightCycler -datastasjonen. 3. Velg <Start> / <Control Panel> / <Add/Remove Programs> i nederste venstre hjørne av Windows-skrivebordet. 4. En liste over alle installerte programmer vil vises. Klikk på <MAS>. 5. Velg <Remove>, og bekreft dette ved å klikke på <Yes>. Merk: MSS CD-en har en avinstallerings- og reparasjonsfunksjon. Avinstalleringsfunksjonen kan brukes valgfritt som en del av den beskrevne prosessen. Reparasjonsfunksjonen kan brukes til å gjenopprette skadede eller manglende filer for mikroanalyseprogramvaren. D. Installering av LightCycler MRSA Advanced Macros 1. Installer *.lckit macros LightCycler MRSA Advanced MCC Macro v1.0 (MRSA MCC_04484355001A_1.0.Ickit) eller høyere og LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 CE (MRSA_05352894190_1.0.lckit) eller høyere fra LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.0 CE CD (eller høyere). 2. Se operatørmanual A for LightCycler 2.0-instrumentet, kapittelet "Utføre en Roche-makro". 8

E. Flerfargekompensasjonseksperiment ved bruk av LightCycler Multicolor Compensationsett som skal brukes med LightCycler 2.0-instrumentet Bruk de følgende trinnene for å opprette en ny eller for å erstatte en utgått fargekompensasjonsfil. 1. Tin rør 1, 2, 3 og 5. Bland forsiktig og sentrifuger en kort stund, 2. Klargjør en 3-delers fortynning av rør 2 ved å blande sammen: a. 10 μl av blandingen i rør 2 b. 20 μl buffer fra et rør med LYS uten å overføre glasskulene 3. Pipetter 10 μl av hver komponent inn i et LightCycler kapillærrør (20 μl). a. Kapillærrør nr. 1: rør 1 b. Kapillærrør nr. 2: fortynningstrinn E2 c. Kapillærrør nr. 3: rør 3 d. Kapillærrør nr. 4: rør 5 Merk: Kast fortynningen av rør 2 etter at analyseserien er fullført. 4. Pipetter 10 μl buffer fra et rør med LYS (uten å overføre glassperlene) inn i hvert kapillærrør slik at du oppnår et totalt volum på 20 μl. 5. Forsegle hvert kapillærrør med et kork ved bruk av Capping-verktøyet. 6. Sentrifuger kapillærrørene ved bruk av LC-karusellsentrifuge 2.0 eller en standard sentrifuge og sentrifugeadaptere. Rørene skal være i følgende posisjon i karusellen: a. Karusellposisjon 1: CCB (rør 1) b. Karusellposisjon 2: CC530 (rør 2) c. Karusellposisjon 3: CC610 (rør 3) d. Karusellposisjon 4: CC670 (rør 5) Merk: Ikke reduser det volumet som ble brukt for hvert kapillærrør. 7. Overfør LightCycler prøvekarusell til LightCycler 2.0-instrumentet. Hvis det ble brukt en vanlig sentrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler prøvekarusell i den rekkefølgen som er beskrevet i trinn E6. Merk: Ikke endre rekkefølgen for reagensene i karusellen. 8. Start og lagre fargekompensasjonseksperimentet (CCE). a. For bruk av MRSA Advanced MCC-makro, se operatørmanual A for LightCycler 2.0- instrumentet, kapittelet "Utføre en Roche-makro". Merk: Ikke bruk feltet <assay lot number>. Hvis du ønsker å legge til analysens lotnummer til forsøket, må du taste inn opplysningene i det tilsvarende feltet i prøveredigereren. b. Lagre omgangen ved bruk av et kort unikt navn (f.eks. MRSA_CCE_ÅÅMMDD-xx, Å=år, M=måned, D=dag, xx=analyseserienummer). c. Etter at analyseserien er fullført, opprettes det en rapport automatisk. d. Skriv ut rapporten. 9

9. Validering av analyseserien Rapporten vil ikke indikere hvorvidt MCC-analyseserien var vellykket (gyldig). Gyldigheten av MCCanalyseserien blir kun etablert ved den første MRSA Advanced analyseserien etter MCCanalyseserien. a. Hvis rapporten for LightCycler flerfargekompensasjonssett er flagget (f.eks., <User Developed or Modified Test Method>), er analyseserien ugyldig. Gjenta analyseserien. b. Hvis rapporten for LightCycler flerfargekompensasjonssett ikke er flagget, fortsett til neste trinn. Merk: Hvis den negative kontrollen (NC) eller MRSA (+) C for LightCycler MRSA Advancedtesten vedvarende er ugyldig, kan LightCycler flerfargekompensasjonsfilen være ukorrekt. Gjenta analyseserien for flerfargekompensasjonen, eller kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. 10. Opprette et fargekompensasjonsobjekt (CCO). a. Aktiver analysemodusen for fargekompensasjon, og trykk på knappen <save CC object>. b. Opprett et kort unikt navn. For at mikroanalyseprogramvaren skal kunne utføre en entydig identifisering, er navnemønsteret for et fargekompensasjonsobjekt følgende: MRSA_CCO_ÅÅMMDD-xx (Å=år, M=måned, D=dag, xx=analyseserienummer). c. Dette objektet brukes for videre analyse med LightCycler MRSA Advanced-testen. Prøve- og kontrollpreparering A. Prøvepreparering 1. Merk et LYS-rør med adekvat merking for hver pasientprøve. Merk: Ikke merk rørene på toppen av korken. 2. Fjern penselprøven fra transportbeholderen. 3. Plasser en enkelt penselprøve i et LYS-rør. 4. Hold penselprøven i pinnen nær kanten på røret, løft penselprøven noen få millimeter fra bunnen og bøy pinnen mot kanten på røret for å brekke den. Alternativt kan det brukes en saks for å klippe over pinnen på penselprøven nær kanten på røret. Tørk saksen med en klut som er fuktet med etanol 70 % (eller Mikrozid) mellom hver penselprøve som klippes. Merk: Bruk gasbind for å minimere risikoen for kontaminering når penselprøven brekkes. Bruk et nytt gasbind for hver penselprøve. 5. Sett LYS-korken tett på. B. Preparering av negativ kontroll Merk: Den negative kontrollen skal prepareres samtidig med prøvene som skal testes. 1. Merk et LYS-rør for negativ kontroll. Merk: Ikke merk rørene på toppen av korken. 2. Plasser en steril penselprøve i transportbeholderen. Se "Annet materiell som kreves, men som ikke medfølger" for en liste over anbefalte penselprøver. 3. Inkuber i romtemperatur i minst 1 minutt. 4. Fjern penselprøven fra transportbeholderen. 10

5. Plasser en enkelt penselprøve i et LYS-rør. 6. Hold penselprøven i stilken nær kanten på røret, løft penselprøven noen få millimeter fra bunnen og bøy stilken mot kanten på røret for å brekke den. Alternativt kan det brukes en saks for å klippe stilken av penselprøven nær kanten på røret. Merk: Bruk et nytt gasbind for å minimere risikoen for kontaminering når penselprøven brekkes. Sett LYS-korken tett på. C. Preparering av prøver og kontroller 1. Varm opp prøver og negative kontroller ved 95 ± 2 C i 2 minutter i en varmeblokk. 2. Lyser prøver og negative kontroller i MagNA Lyser-instrumentet i 70 sekunder ved en hastighet på 5000 rpm. Se operatørmanualen for MagNA Lyser-instrumentet for detaljer om bruken. 3. Sentrifuger prøven og den negative kontrollen ved 8000 20 000 x g ved romtemperatur i 1 minutt. 4. Preparerte prøver og negative kontroller er stabile i inntil 1 dag ved 15 til 25 C eller 6 dager ved 2 til 8 C eller inntil 2 måneder ved -15 til -25 C. Klargjøring av reagenser 1. Tin MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C ved romtemperatur. Pass på at reagensene er fullstendig opptint før bruk. 2. Virvle MRSA RXNMX og MRSA DETMX og MRSA (+) C i 3-5 sekunder og sentrifuger raskt for å samle opp materiale i bunnen av røret. 3. Klargjør Working Master Mix for det antallet prøver og kontroller som skal testes, i et sterilt silikonisert mikrosentrifugeringsrør av polypropylen. (Bruk tabell 1 som veiledning.) Merk: De anbefalte volumene omfatter 2 reaksjoner for den negative kontrollen og den positive kontrollen og et ekstra volum for å kompensere for dødvolum og for å lette pipettering ut av mastermiksrøret og inn i LC-kapillarrørene. Merk: Bruk mikrorørverktøyet (VWR P/N 2017-688) eller liknende for å lette åpningen av MRSA RXNMX og MRSA DETMX om nødvendig. 11

Tabell 1 Klargjøring av Working Master Mix Antall prøver Volum av MRSA RXNMX (μl) Volum av MRSA DETMX (μl) Totalt volum (μl)* 1 40 20 60 2 50 25 75 3 60 30 90 4 70 35 105 5 80 40 120 6 90 45 135 7 100 50 150 8 110 55 165 9 120 60 180 10 130 65 195 11 150 75 225 12 160 80 240 13 170 85 255 14 180 90 270 15 190 95 285 16 200 100 300 17 210 105 315 18 220 110 330 19 230 115 345 20 240 120 360 21 260 130 390 22 270 135 405 23 280 140 420 24 290 145 435 25 300 150 450 26 310 155 465 27 320 160 480 28 330 165 495 29 340 170 510 30 350 175 525 *Omfatter volum for NC, MRSA (+) C, og dødvolum. 12

4. Vortex Working Master Mix i 3-5 sekunder og sentrifuger raskt for samle opp materiale på bunnen av røret. Working Master Mix kan oppbevares beskyttet mot lys i 30 dager ved 2 til 8 C. Klargjøring av preparerte prøver og kontroller 1. Plasser det ønskede antall LightCycler kaplillærrør i LC-karusellen eller i sentrifugeadapterne. Et kapillærrør (1) for PC-en (posisjon 1), 1 kapillærrør for den preparerte NC (posisjon 2), og 1 kapillærrør for hver av de preparerte prøvene (posisjon 3 og høyere) trengs. Merk: Hold LightCycler kapillærrørene i det øvre plastreservoaret av kapillærrøret. 2. Pipetter 15 μl Working Master Mix til hvert kapillærrørreservoar. 3. Pipetter 5 μl med klar supernatant fra hver preparerte prøve i kapillærrør nr. 3 og høyere. Bytt pipettespissen etter hver prøve. 4. Pipetter 5 μl av den preparerte negative kontrollen i kapillærrør nr. 2. Merk: De gjenværende preparerte prøvene og kontrollene kan oppbevares ved -15 til -25 C i opptil 2 måneder. Hvis det brukes frosne preparerte prøver skal de tines ved romtemperatur, vortexes i 10 sekunder og så sentrifugeres ved 8000 20 000 x g ved romtemperatur i 1 minutt. 5. Pipetter 5 μl av den opptinte MRSA (+) C i kapillærrør nr. 1. 6. Forsegle hvert kapillærrør med en kork ved bruk av Capping-verktøyet. 7. Sentrifuger kapillærrørene i LC-karusellsentrifuge 2.0 eller ved bruk av en standardsentrifuge og sentrifugeadaptere. 8. Overfør LightCycler prøvekarusell til LightCycler 2.0-instrumentet. Merk: Hvis det ble brukt en vanlig sentrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler prøvekarusell i den rekkefølgen som er beskrevet i trinn 1. Merk: Amplifikasjon skal startes omgående etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt Working Master Mix. Hvis dette ikke er mulig kan de fylte kapillærrørene lagres i maksimalt 3 timer beskyttet mot lys, ved 2 til 8 C. Innlasting og betjening av LightCycler 2.0-instrumentet 1. Logg deg på til LightCycler -programvaren. 2. Start LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 CE (MRSA_05352894190_1.0.Ickit) eller høyere (se operatørmanual A for LightCycler 2.0-instrumentet, kapittelet "Utføre en Roche-makro"). Merk: Ikke bruk feltet <assay lot number>. Hvis du ønsker å legge til analysens lotnummer til analyseserien, må du legge inn opplysningene i det tilsvarende feltet i prøveredigereren. 3. Navngi analyseserien ved å bruke en unik identifikasjon. 4. Reduser standard innlastingsliste til det antallet prøver som skal testes. Hvis for mange kapillærrør er blitt slettet ved et uhell, skal prosedyren startes fra trinn 2. 5. Skann strekkodeetikettene for prøvene, skriv inn prøvenavnene manuelt i prøvenavnfeltet, eller behold standardinnstillingene. Feltet <Run Note> kan brukes til å legge inn data om det er påkrevd. Merk: Ikke endre standardnavnet for positive og negative kontroller. 6. Følg instruksjonen på skjermen og start analyseserien med LightCycler MRSA Advanced-testen. 13

RESULTATER Identifikasjon av topper og automatisk resultatanalyse: Merk: Ikke start en dataanalyse mens en LightCycler -analyseserie pågår. Manual T M Calling krever manuell betjening i to T M Calling-moduler som kommer opp automatisk. Absolute Quantification-modulene brukes ikke for analysen av denne testen. I smeltetopp-vinduet vises alle kurver for de valgte grafene. T M -stolpene for hver analysemodul er forhåndsdefinert i MRSA avansert makro. Det er mulig å velge eller velge bort T M -stolper uten å opprette et flagg. Baseline for hver analysemodul er predefinert i MRSA avansert makro i henhold til den følgende tabellen og må ikke velges bort eller endres. Hvis baseline blir endret utilsiktet, skriv inn de korrekte verdier fra tabell 2. Tabell 2 Baseline-verdier CH 610 CH 670 Baseline-verdi 0,085 0,100 Merk: Følgende innstillinger må ikke endres: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> eller <Peak Width>. Topper defineres som maksima over baseline. Skuldre er ikke topper. Eksempler på typisk positiv kontroll (graf 1, kanal 610) og intern kontroll (graf 2, kanal 670) topper og topper med skulder (graf 3): Graf 1 Graf 2 14

Graf 3 Justering av T M -stolper: 1. Etter at analyseserien er avsluttet, viser eksperimentveiviseren meldingen <Analyses have been created>. 2. Flytt meldingsvinduet ned til bunnen av skjermen for å se T M og baseline-verdiene (ikke trykk på <Finish>). 3. Klikk på T M Calling 610-analysemodulen. En oversikt over alle posisjonene vises. 4. Reduser størrelsene på grafvinduet ved å skyve venstre håndtak i dette vinduet til høyre. Kolonnene "Baseline", "TM1" og "Height1" skal nå være synlige. Merk: Hvis mer enn én posisjon er valgt, vil innstillingene for det første valgte kapillærrøret vises. Merk: Stolpeforskyvninger har innvirkning på alle valgte kapillærrør. 5. Klikk på posisjonen for den positive kontrollen (#PC#) for å velge den. 6. Hvis T M -stolpen ikke er posisjonert ved toppmaksima (over baseline), skal den flyttes til toppmaksima med fokus på de spesifiserte T M -områdene (se tabell 3). 7. Hvis det ikke er noen topper over baseline, skal T M -stolpen forbli i standardposisjon. Pass på ingen stolper er plassert på stigningen for noen gjeldende topper (dvs. utenfor det spesifiserte T M - området). 8. Pass på at ingen verdier vises i kolonnene "TM1" og "Height1" for denne prøven (alle verdier). Hvis det ikke vises noen verdier (tomt område), omplasser T M -stolpen til toppmaksima. Det skal nå vises verdier i kolonnene "TM1" og "Height1". Tabell 3 Spesifiserte T M -områder MRSA (CH 610) Intern kontroll (CH 670) Lav T M ( C) Høy T M ( C) 57,00 62,00 57,00 62,00 Merk: For prøver uten topper (f.eks. i negativ kontroll) vil autoskalering justeres etter den høyeste bakgrunnsverdien. Predefinert baseline er kanskje ikke synlig i dette tilfellet. Hvis du ønsker at baseline skal være synlig, velg denne kapillærrørposisjonen sammen med den positive kontrollen. Merk: Avmerkede topper utenfor det spesifiserte T M -området vil bli rapportert i MAS-rapporten. 9. Fortsett med toppdeteksjon som beskrevet i trinn 5 til 8 ovenfor for alle gjenværende posisjoner (kontroller og prøver). 15

10. Klikk på T M Calling 670-analysemodul. 11. Fortsett med toppdeteksjon som beskrevet i trinn 4 til 8 ovenfor for alle posisjoner (kontroller og prøver). Avslutt T M calling: 1. Flytt eksperimentveiviseren til midten av skjermen og trykk på <Finish>. 2. En LightCycler -rapport blir opprettet automatisk og må skrives ut. 3. Sjekk LightCycler -rapporten for flagg og hvorvidt <run state: complete> vises. Hvis det vises flagg eller andre feilmeldinger, se avsnittene "Kvalitetskontroll" og "Tolkning av resultater". 4. Analyseserien lagres automatisk. Merk: Hvis det gjøres endringer ved prøvenavnfelt i LightCycler -programvaren etter lagring må operatøren oppdatere databasen ved å velge og klikke på ikonene "Abs Quant 610" og "Abs Quant 670" og lagre filen på nytt. Skriv ut LightCycler -rapporten på nytt. 5. Eksporter *.ixo-filen ved å klikke på <File> \ <Export> til mappen <C:\Export to MAS>. Automatisk resultat-calling ved bruk av mikroanalyseprogramvare (MAS): 1. Dobbeltklikk på MAS-ikonet på datamaskinens skrivebord og trykk på <Start>. 2. Velg analyseserien som skal analyseres, fra mappen <C:\Export to MAS> og last inn *.ixo-filen. 3. Svar på spørsmålet "Does the LightCycler report contain the flag <User Developed or Modified Test Method>?" på en passende måte, dvs. i overensstemmelse med LightCycler -rapporten. 4. Skann eller legg inn informasjon manuelt om lotnummer og utløpsdato som kommer sammen med Advanced lyseringskit og LightCycler MRSA Advanced-testen. 5. Legg inn personlig informasjon (f.eks. operatørnavn) om ønsket. Merk: Den siste informasjonen som ble lagt inn i MAS, vil bli brukt heretter. 6. Velg et egnet rapportformat (tabellarisk, gruppert eller kombinert). 7. *.ixo-filen analyseres automatisk, og dataene vises i en rapport i det valgte rapportformatet. 8. Skriv ut MAS-rapporten og/eller eksporter den som *.pdf. 16

TOLKNING AV RESULTATER 1. Resultatene blir beregnet av LightCycler -programvaren ut fra målte fluorescenssignaler og innebygde beregningsalgoritmer og presentert med mikroanalyseprogramvaren (MAS). 2. Validering av analyseserien, kontroller og prøver blir automatisk utført av MAS. Merk: Flagg og kommentarer kan genereres for RUN STATUS, CONTROLS STATUS og SAMPLE STATUS. Operatøren må sjekke MAS-rapportutskriftene for flagg eller kommentarer i alle boksene. 3. Resultater fra gyldige analyseserier tolkes på følgende måte: CH 610- resultat (MRSA) POSITIV CH 670- resultat (IC) POSITIV eller NEGATIV MRSAresultat Kommentar DETECTED - NEGATIV NEGATIV IC not detected NEGATIV POSITIV NOT DETECTED - Tolkning Prøven er positiv for MRSA- DNA. Antatt nasal kolonisering av MRSA. Ugyldig resultat. Gjenta PCR-prosedyren med nylig tinte preparerte prøver eller nye prøver. Prøven er negativ for MRSA- DNA. Nasal kolonisering av MRSA usannsynlig. Tilleggskommentarer angående positiv kontroll, negativ kontroll og prøveresultat kan rapporteres av MAS: Kommentar Peak(s) outside Target T M range Peak(s) outside IC T M range Tolkning Amplicon detektert utenfor spesifisert MRSA T M -område Amplicon detektert utenfor spesifisert IC T M -område 17

4. De følgende flaggene kan vises av MRSA: Flagg Kommentarer Tolkning Status Korrigerende tiltak Repeter forsøk. Sjekk at Invalid makroen i LightCycler - File could not Run macro Feil makro er brukt programvaren eller MRSA be loaded version Advanced-programvaresett er riktig. User Developed or Modified Test Method Lysis Kit expired MRSA Test expired CCO expired on YYMMDD 1 - CCO NAME MULTIPLE CCO USED NO CCO USED LCS VERSION BASELINE - - - - - - - - Mulige årsaker er beskrevet i operatørmanualen for LightCycler 2.0-instrumentet (f.eks. modifisering av standardinnstillinger for makroen). LightCycler Advancedlyseringskit utløpt LightCycler MRSA Advancedtest utløpt Fargekompensasjonsobjektfilen er eldre enn seks måneder. Fargekompensasjonsobjekt har uriktig navn Det er brukt forskjellige fargekompensasjonsfiler i analysemodulene. En eller flere fargekompensasjonsfiler mangler i analysemodulene. Det er brukt feil versjon av LightCycler SW-versjon for prosedyren. Baseline-verdiene kan ha blitt endret utilsiktet. Run Run Run Run Run Run Run Run Run Hvis det vises flere flagg, se det korrigerende tiltaket som er oppgitt for det respektive flagget. Hvis det ikke vises flere flagg, skal eksperimentet gjentas. Hvis dette flagget stadig blir vist, ring din lokale Roche servicetjeneste. Gjenta eksperimentet med reagenser som ikke er utløpt. Gjenta eksperimentet med reagenser som ikke er utløpt. Opprett et nytt fargekompensasjonsforsøk og opprett et nytt fargekompensasjonsobjekt. Opprett et nytt fargekompensasjonsobjekt som følger navnemønsteret. Åpne den originale *.ixo filen i LightCycler - programvaren og velg riktig fargekompensasjonsfil. Lagre, skriv ut LightCycler -rapporten og eksporter igjen. Åpne den originale *.ixo filen i LightCycler - programvaren og velg riktig fargekompensasjonsfil. Lagre, skriv ut LightCycler -rapporten og eksporter igjen. Åpne LightCycler - programvaren og sjekk at det er riktig versjonsnummer. Åpne den originale *.ixofilen i LightCycler - programvaren, og sjekk baseline-verdier i henhold til tabell 2. Lagre, skriv ut LightCycler -rapporten og eksporter på nytt. 18

NC PC NC NAME PC NAME NC: Target peak(s) detected NC: IC not detected PC: PC not detected 1 MAS gir en advarsel 30 dager før reagenset utløper. - - Amplicon detektert i MRSA T M -området til den negative kontrollen Ingen IC detektert i negativ kontroll Ikke noe MRSA-målsekvens detektert Standardnavnet for den negative kontrollen er endret. Standardnavnet for den positive kontrollen er endret. Controls Controls Controls Controls se avsnittet "Kvalitetskontroll" se avsnittet "Kvalitetskontroll" Åpne den originale *.ixo filen i LightCycler - programvaren og legg inn #NC#. Lagre, skriv ut LightCycler -rapporten og eksporter igjen. Åpne den originale *.ixo filen i LightCycler - programvaren og legg inn #PC#. Lagre, skriv ut LightCycler -rapporten og eksporter igjen. KVALITETSKONTROLL 1. Hver LightCycler MRSA Advanced-reaksjon inneholder en intern kontroll (IC). Den interne kontrollen er utformet for å kontrollere prøveinhibisjon og kontrollere reagensintegritet. a. Internkontroll (IC) Internkontrollen må være detektert positiv i alle MRSA-negative prøver, også i den negative kontrollen (NC). Hvis internkontrollen er negativ i en negativ prøve, er prøven ugyldig, og PCR-prosedyren må gjentas med en nylig opptint preparert prøve. Hvis internkontrollen er negativ i NC, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. Internkontrollresultatet ignoreres i MRSA-positive prøver og i en gyldig positiv kontroll siden MRSA-amplifikasjon kan konkurrere med denne kontrollen. 2. Minst 1 positiv kontroll og 1 NC må behandles i hver analyseserie. Den positive kontrollen skal monitorere reagensfunksjon. NC brukes til å påvise kontaminering av reagens eller miljø ved hjelp av MRSA-DNA. Amplifikasjonsreagenser inneholder et enzym for å hindre kontaminering med MRSA-ampliconer. LightCycler -programvaren angir posisjonen i instrumentet for begge kontrollene automatisk. a. Negativ kontroll (NC) Den negative kontrollen må være negativ, mens dens internkontroll må være positiv. Hvis NC ikke imøtekommer disse kriteriene, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. b. Positiv kontroll (PC) PC må være positiv (med IC enten positiv eller negativ). Hvis PC ikke imøtekommer dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Rochekontor. 19

3. Flagg og kommentarer kan genereres av mikroanalyseprogramvaren (MAS). Operatøren må kontrollere analyseutskriften(e) for flagg og kommentarer for å verifisere at analyseserien er gyldig. Kontroll Negativ kontroll Positiv kontroll CH 610- resultat (MRSA) CH 670- resultat (IC) Tolkning NEGATIV POSITIV Analyseserie gyldig, ingen tiltak POSITIV NEGATIV POSITIV NEGATIV POSITIV eller NEGATIV NEGATIV POSITIV eller NEGATIV POSITIV eller NEGATIV Analyseserie ugyldig, analyser nye prøver Analyseserie ugyldig, gjenta serien fra fryste, preparerte prøver (eller nye prøver). Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. Analyseserie gyldig, ingen tiltak Analyseserie ugyldig, gjenta serien fra fryste, preparerte prøver (eller nye prøver). Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. 4. Ekstern positiv kontroll (EPC) MicroBioLogics KWIK-STIK MRSA positiv kontroll (P/N: 0158MRSA) kan brukes for opplæring, kompetansetesting og ekstern kvalitetskontroll av LightCycler MRSA Advanced-testen. En MRSA-stamme som er representativ for RE2-typene, brukes for denne positive kontrollen. MRSA-stammer som representerer RE3 og RE7-typer, hvis de er tilgjengelige, kan brukes som ytterligere eksterne positive kontroller for å kontrollere analyseprimere og prober som ikke er direkte kontrollert i analysen. Eksterne kontroller kan brukes i samsvar med lokale, nasjonale og regionale akkrediteringsorganisasjoner, om det er relevant. Følg trinnene i KWIK-STIK pakningsvedlegget for klargjøring av penselprøver, men ikke plasser penselprøven på kulturmediet. Etter at penselprøven er mettet med det hydrerte materialet, følg pakningsvedlegget for LightCycler MRSA Advanced-testen for preparering av prøver og testing av penselprøven. Merk: Hittil er fem SCCmec-typer (I V) funnet, og flere varianter av disse SCCmec-typene er beskrevet 5. LightCycler MRSA Advanced-testen er basert på et merkebeskyttet deteksjonssystem som kan påvise MRSA-stammer med forskjellige molekylære sekvenser i det området som omgir RE-krysset (krysset for høyre ekstremitet) for SCCmec-kassetten med orfx-genet. De forskjellige RE-typene som påvises av LightCycler MRSA Advancedtesten, er omtalt som RE2, RE3 og RE7 (merkebeskyttet nomenklatur). FORSIKTIGHETSREGLER 1. Som for andre laboratorieprosedyrer er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. 20

TESTENS BEGRENSNINGER 1. Selv om det forekommer sjelden, kan mutasjoner innenfor regionen av bakterielt genom som er dekket av LightCycler MRSA Advanced-testens primere og/eller probe, føre til manglende evne til å påvise bakterien. Sjeldne former av MSSA-stammen som bærer en genetisk variant av SCCmeckassetten, kan gi positive resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen. 2. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å bestemme de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 3. Denne testen er kun validert for bruk med humane nasalprøver. 4. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. 5. Tilstedeværelse av AmpErase-enzymet i LightCycler MRSA Advanced-reagensblandingen reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Kontaminering fra MRSA (+) C og kliniske prøver kan kun unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 6. Dette produktet skal kun brukes av opplært personell. 7. Dette produktet skal kun brukes sammen med LightCycler 2.0-instrumentet. YTELSESKARAKTERISTIKA Interfererende substanser Substanser som kan interferere med deteksjon av MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen og potensielt generere ugyldige resultater, omfatter blod og overskytende mengder gel med kull som kan ha blitt overført fra prøvepenselbeholderen til lyseringsrøret. De følgende eksogene substanser (se tabell 4), som er komponenter i midler mot kongestion og substanser som brukes til å lette tørrhet og/eller irritasjon i nesen, har vist seg å ikke interferere med deteksjon av MRSA ved bruk av LightCycler MRSA Advanced-testen. Tabell 4 Eksogene substanser som er testet for interferens med LightCycler MRSA Advanced-testen Handelsnavn Aktivt stoff InfectoPyoderm Mupirocin 20 mg/g (antibiotikum) Turixin Mupirocin-kalsium 21,5 mg/g (antibiotikum) Bepanthen nesesalve Dexpanthenol 50 mg/g (pro-vitamin B5) Accumed 12-timers nesespray Oxymetazolin hydroklorid 0,05 % (dekongestant) Otriven Xylometazolin 0,1 % (dekongestant) 21

VURDERING AV ANALYTISK YTELSE A. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten for LightCycler MRSA Advanced-testen ble bestemt ved bruk av 3 stammer MRSA som representerer de tre RE-typene som denne analysen er rettet mot (høyre ekstremitet av SCCmec/orfX-krysset (RE) type 2, 3, og 7). Kulturer fra disse stammene ble kvantifisert, fortynnet til verdier som dekket et område på 100 til 400 koloniformende enheter (CFU) per pensel og absorbert inn i prøvepensler som tidligere var blitt dyppet i ulike transportmedier. Alle fortynninger nær LOD-verdien ble testet i replikater på minst 60. Den deteksjonsgrensen som ble oppnådd for hver stammetype og prøvepenseltype som ble testet, representerer det laveste antallet CFU/prøvepensel der et positivt resultat vil bli oppnådd med minst 95 % sikkerhet. Tabell 5 Deteksjonsgrense (LOD) for hver MRSA RE-type testet på forskjellige prøvepenseltyper MRSA-typer Penselprøvetyper 1 RE2 RE3 RE7 Liquid Stuart-transportmedier Amies-gel uten kulltransportmedier Amies-gel med kulltransportmedier 240 cfu/prøvepensel 180 cfu/prøvepensel 140 cfu/prøvepensel 224 cfu/prøvepensel 240 cfu/prøvepensel 240 cfu/prøvepensel 240 cfu/prøvepensel 224 cfu/prøvepensel 240 cfu/prøvepensel 1 Se "Annet materiell som kreves, men som ikke medfølger" for en detaljert liste over anbefalte prøvepensler og artikkelnumre. 22

B. Analytisk spesifisitet Inklusivitet 10 MRSA-isolater som er representative for epidemiologiske kloner (oppført i tabell 6) og skaffet gjennom Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA)-programmet støttet under NIAID/NIH kontraktnr. HHSN272200700055C. Alle isolater testet positivt med LightCycler MRSA Advanced-testen. Tabell 6 MRSA-isolater som er representative for epidemiologiske kloner skaffet gjennom Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA)-programmet NARSA stamme- ID NRS382 USA100; 626 NRS383 USA200; 96758 NRS482 NRS123 Alias-stamme Arter Beskrivelse USA300; FPR 3757 USA400; MW2; C1999000459; 99065 NRS385 USA500; 95938 NRS22 USA600; HIP07930; 99758 NRS386 USA700; 1078 NRS387 USA800; 1045 NRS483 NRS484 USA1000; AIS 2006061 USA1100; HIP 12899 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Dominerende amerikansk sykehusassosiert PFT, også kjent som New York/ Japan-klonen. Nest vanligste amerikanske sykehusassosierte PFT. EMRSA 16-klone USA 300, hel genomsekvens En multi-susceptibel samfunnservervet MRSA kjent for å bære Panton-Valentine leukokidin-gener og andre virulensgener som er forskjellige fra sykehuservervede MRSA-stammer. Sykehusrelatert MRSA Sykehusrelatert MRSA Stammen er assosiert med både samfunnservervede og sykehuservervede infeksjoner. Også kjent som pediatrisk klone USA 1000 USA 1100 23

Eksklusivitet Spesifisiteten for LightCycler MRSA Advanced-testen ble evaluert ved testing av kryssreaktivitet overfor patogene organismer og overfor kontaminanter som potensielt er til stede i normal nasal mikroflora. Artene som ble testet, besto av 6 virale, 45 bakterielle og 2 fungale arter. Mikroorganismene ble testet enten som kulturer i konsentrasjoner på 1000 cfu/reaksjon eller som genomiske DNA-preparater i konsentrasjoner på 1000 til 10000 kopier/reaksjon. I tillegg ble humant DNA i en konsentrasjon på 5 ng/reaksjon testet. Alle arter og humant DNA som ble testet, ble funnet negative overfor MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen. Tabell 7 Arter testet for kryssreaktivitet med LightCycler MRSA Advanced-testen Arter Staphylococcus aureus Haemophilus parainfluenza Staphylococcus haemolyticus Influensa A Staphylococcus epidermidis Influensa type B Staphylococcus lugdunensis Klebsiella pneumoniae ozeanae Staphylococcus hominis Legionella pneumophila Staphylococcus saprophyticus Microbacterium testaceum Staphylococcus sciuri Micrococcus lutae Adenovirus Moraxella catarrhalis Acinetobacter baumannii Morganella morganii Actinobacillus actinomycetemcomitans Mycobacterium avium Actinomycetes odontolyticus Mycoplasma pneumoniae Aspergillus fumigatus Mycoplasma salivarium Bacteroides vulgatus Neiserria meningitides Bacteroides uniformis Parainfluensa 1 Bacteroides fragilis Parainfluensa 3 Bordetella parapertussis Peptostreptococcus Bordetella pertussis Proteus mirabilis Bordetella bronchioseptica Proteus vulgaris Burkholderia cepacia Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Pseudomonas putida Citrobacter freundii Rhodococcus equi 5 Corynebacterium glutamicum Respiratorisk syncytialt virus Eikenella corrodens Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecium Streptococcus pyogenes Escherichia coli Streptococcus viridans Haemophilus aphrophilus Veillonella atypica Haemophilus influenzae Humant DNA I tillegg ble 117 isolater av meticillinresistente koagulasenegative stafylokokker, 104 isolater av meticillinsensitive koagulasenegative stafylokokker og 100 isolater av meticillinsensitiv Staphylococcus aureus skaffet fra forskjellige europeiske sentre og testet ved konsentrasjoner på 10e4 til 10e5 cfu/reaksjon. Ingen av disse isolatene ble påvist positive av analysen: Spesifisiteten var 100 %. 24

REFERANSER 1. Kuehnert MJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, 2001-2002. JID 2006; 193:172-9. 2. Wyllie DH, et al. Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in Oxfordshire, 1997-2003: cohort study. BMJ. 2006; 333 (7562):281. 3. Pinho MG, Filipe SR, de Lencastre H, Tomasz A Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2A in Staphylococcus aureus. : J Bacteriol. 2001 Nov; 183(22):6525-31. 4. Deurenberg RH, Vink C, et al. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2007; 13:222-235. 5. Deurenberg RH, et al., The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 222 235. 6. Cosgrove SE, et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-Resistant and Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia:A Meta-analysis. CID 2003:36, 53-59. 7. Engemann JJ, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis. 2003; 36(5):592-598. 8. Abramson MA, et al. Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infect Control Hosp Epidemiol. 1999; 20(6):408-411. 9. Muto CA, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003; 24(5):362-386. 10. Association for Professionals in Infection Control & Epidemiology, Inc (APIC). National prevalence study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S. healthcare facilities. Executive summary. June 25, 2007. 11. Klevens RM, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 2007; 298(15):1763-1771. 12. Witte W. Nosocomial and community MRSA infections. EH ONLINE. http://www.europeanhospital.com/topics/article/4288.html. Accessed November 7, 2008. 13. Calfee DP, et al. Strategies to prevent transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in acute care hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008; 29(suppl 1):S62 S80. 14. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 15. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3. Wayne, PA:CLSI, 2005. 16. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41 st Edition. 2000. 704pp. 25

26

27

LightCycler Advanced Lysis Kit og LightCycler MRSA Advanced Test produsert av: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Medlem av Roche-gruppen Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: 1-877 273 3433) 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics S.L. 2, Avenue du Vercors Av. de la Generalitat, s/n 38240 Meylan, France E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnóstica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, 1729 20052 Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal ROCHE, LIGHTCYCLER, FASTSTART, MAGNA LYSER, MRSA ADVANCED, LC og AMPERASE er varemerker som tilhører Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemerke som tilhører Roche. KWIK-STIK er et varemerke for MicroBioLogics, Inc. BD CultureSwab er et varemerke for Becton, Dickenson and Company. Copan Transystem er et varemerke for Copan Diagnostics, Inc. Brij er et varemerke for Croda International, PLC. InfectoPyoderm er et varemerke for Infectopharm GmbH. Turixin er et varemerke for GlaxoSmithKline. Bepanthen er et varemerke for Bayer Healthcare. Otriven er et varemerke for Novartis. Cyaninfargestoffene i dette produktet er underlagt pasientrettighetene for GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er lisensiert til Roche utelukkende for innlemmelse i forskningekomponenter og in vitro-diagnostiske kit. Enhver bruk av slike kit til annet formål enn forskning eller in vitro-diagnostikk krever underlisenser fra GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA. Copyright 2009. Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 2/2009 (05446082001-01ENGL) Doc Rev. 1.0 05540186001-01 28