NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet ProdutKode: 708150, 708155 508150.30, 508155.10 Anvendelsesområde NOVA Lite ANA Plus er en indirekte immunfluorescerende analyse for screening og semikvantitativ bestemmelse av antinukleære antistoffer (ANA), antimitokondrie- (AMA), antiglattmuskel- (ASMA) og gastrisk parietalantistoffer (GPA) i humant serum. Forekomsten av antinukleære-antistoffer kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som støtte i diagnosen av systemisk lupus erythematosus (SLE) og relaterte bindevevs- og revmatiske sykdommer. Sammendrag og forklaring av testen Termen antinukleær-antistoffer beskriver en rekke autoantistoffer som reagerer med bestanddeler av cellekjerner herunder inkludert DNA, RNA og flere proteiner og ribonukleoproteiner. 1 Disse autoantistoffene forekommer hyppig hos pasienter med bindevevseller revmatiske sykdommer, spesielt systemisk lupus erythematosus. Praktisk alle SLEpasienter er ANA-positive. Denne diagnostiske sensitiviteten har ført til at ANA-testing er inkludert i Reviderte kriterier for klassifisering av systemisk lupus erythematosus av 1982 av en underkomité for foreningen for artritt og revmatisme. 2 Mens ANA-testen er en fremragende screeningstest for SLE (et negativt resultat utelukker praktisk talt aktiv SLE 3 ), er det slett ikke en spesifikk test. Pasienter med andre bindevevssykdommer slik som revmatoid artritt, sklerodermi og dermatomyositt er ofte positive og lave ANA-titere kan muligens observeres i andre sykdomstilstander og i normalpopulasjonen. Positive ANA-resultater kan forekomme etter alvorlige betennelser eller virale infeksjoner og er rapportert hos noen normale, friske mennesker, spesielt i høyere aldersgrupper. På grunn av denne manglende spesifisiteten er det anbefalt at alle ANA-positive prøver skal titreres til et endepunkt og at det foretas mer spesifikk testing for autoantistoffer til dobbelttrådet DNA (dsdna) og ekstraherbar nukleær antigen (ENA) autoantistoffer. 1-3 Høye nivåer av AMA er ofte påvist sammen med primær biliær cirrhose. Lave titere av AMA kan kanskje påvises ved andre leverforstyrrelser slik som kronisk aktiv hepatitt og kryptogenetisk cirrhose. 5,6 ASMA finnes i høye titere i serumet til 70% av pasientene med kronisk aktiv hepatitt. 50% av disse pasientene er i tillegg positive for ANA, mens 25% viste lave AMA-titere. Lave ASMA-titere kan kanskje forekomme ved virale infeksjoner, ondartet kreft og hos normale individer. 5,7 GPA forekommer i serumet til 90% av pasientene med pernisiøs anemi. Med andre kliniske og laboratoriedata, hjelper et positivt GPA-resultat å skille mellom autoimmun pernisiøs anemi fra andre megaloblastiske anemier. Selv om den bare er påvist i mindre enn 2% av normalpopulasjonen under 20 år, øker insidensen av GPA hos kvinner over 40 år og kan forekomme hos opp til 16% av normalpopulasjonen over 60 år. 8,9-1 -
Indirekte immunfluorescens er referansemetoden for ANA-, AMA-, ASMA- og GPA-testing. Vanlige substrater er enten tynne bestanddeler av gnagerorganer eller en type cellelinje. Substratet utvalgt for NOVA Lite ANA Plus er optimalt fikserte muse nyre- og magebestanddeler. Konjugatet er affinitetsrenset antihumant IgG. Prosedyreprinsipper I den indirekte immunfluorescerende teknikken, inkuberes prøver med et antigensubstrat og antistoffer som ikke reagerer, vaskes bort. Substratet inkuberes med spesifikk fluoresceinmerket konjugat og reagens som ikke bindes, vaskes bort. Ved å se gjennom et fluorescensmikroskop vil positive prøver for autoantistoff utvise en eplegrønn fluorescens tilsvarende de områdene av cellen eller kjerner hvor autoantistoffer har bundet seg. Reagenser 1. ANA Plus Slides (musenyre/mage), 4 eller 8 brønner/slide med tørkemiddel Kitet Bare 2. Antihumant IgG-konjugat (geit), fluorscein-merket i buffer som inneholder Evans blue og 0,09% natriumazid 3. ANA Homogent mønster positiv kontroll, en ampulle med buffer som inneholder 0,09% natriumazid og humant serum-antistoffer mot cellekjerner, forhåndsfortynnet 4. IFA System Negative kontroll, en ampulle med buffer som inneholder 0,09% natriumazid og humant serum-antistoffer mot ANA Plus, forhåndsfortynnet 5. PBS-konsentrat (40x) 6. Monteringsmedium, 0,09% natriumazid 7. Dekkglass Advarsler 1. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal ANA Homogent mønster positiv kontroll og IFA System Negative kontroll behandles på samme måte som potensielt smittsomt materiale. 10 2. Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 3. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 4. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter med andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking av IFA brønners kan forårsake en høy bakgrunn. - 2 -
4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, styrken av mikroskopet pæren brukte, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Over tid kan det antihumane IgG-konjugatet muligens forandre fargen på grunn av lyseksponering. 7. Streng fastholdelse til denne protokollen er anbefalt. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Fortynnet PBS er holdbar i 4 uker ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer (Kitet) 708150 20 8 brønners ANA Plus substratslide 1 15mL FITC Anti-human IgG-konjugat 1 0.5mL Homogent mønster positiv kontroll 1. 0.5mL IFA System Negative kontroll 2 25mL PBS-konsentrat (40x) 1 7mL Monteringsmedium 1 20 Dekkglass 708155 10 4 brønners ANA Plus substratslide 1 7mL FITC Anti-human IgG-konjugat 1 0.5mL Homogent mønster positiv kontroll 1 0.5mL IFA System Negative kontroll 1 25mL PBS-konsentrat (40x) 1 7mL Monteringsmedium 1 10 Dekkglass - 3 -
Leverte materialer (slide) 508150.30 30 x 8 brønners ANA Plus substratslide 508155.10 10 x 4 brønners ANA Plus substratslide Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 15-1000µL volum Destillert eller deionisert vann Plastflasker eller Pasteurpipetter Fuktighetskammer 1L beholder (for å løse opp PBS) Skål coplin Fluorescensmikroskop med 495nm eksitasjonsbølgelengde og 515nm barrierefilter Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Tynn PBS-konsentratet ut: VIKTIG: Tynn PBS-konsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av PBS-konsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Bland grundig. PBS-bufferen brukes for å fortynne pasientprøver og som en vaskebuffer. Fortynnet buffer kan lagres opp til fire uker ved 2-8 C. 3. Tynn ut pasientprøver: a. Innledende screening: Tynn ut pasientprøver (1:20) med fortynnet PBS-buffer (dvs. bland 50µL serum med 950µL PBS-buffer). b. Titrering: Lag serielle totrinns løsninger fra den innledende screeningsløsningen for alle positive prøvene med fortynnet PBS-buffer (dvs. 1:40, 1:80,... 1:5120). Analyseprosedyre 1. Forbered substratslidene: La substratslidene varmes opp til romtemperatur før du fjerner dem fra posen. Merk det med blyant og plasser det i et passende fuktighetskammer. Tilsett 1 dråpe (70-90µL) av ufortynnet positiv og negativ kontroll til henholdsvis brønn 1 og 2. Tilsett 1 dråpe (70-90µL) av ufortynnet pasientprøve til resterende brønner. 2. Inkubasjon av sliden: Inkuber sliden i 30 (±5 minutter) i et fuktighetskammer (et fuktig kjøkkenpapir plassert vannrett på bunnen av en lukket plastikk-eller glassbeholder) vil opprettholde de riktige fuktighetsbetingelsene. Ikke la substratet tørke ut under analyseprosedyren. 3. Vask sliden: Etter inkubasjon, bruk en plastikkflaske eller pipette for å vaske serum forsiktig av med fortynnet PBS-buffer. Innrett sliden og sprøyt PBS-bufferen slik at vaskeavfall av prøver minimeres mellom brønnene. Unngå å rette strålen direkte på brønnene for å forhindre at substratet skades. Hvis ønsket, plasser slidene i en Coplin skål med fortynnet PBS-buffer i opp til 5 minutter. 4. Tilsetting av fluorescensløsning: Rist av overskytende PBS-buffer. Plasser sliden tilbake i fuktigheteskammeret og dekk umiddelbart hver brønn med en dråpe fluorescensløsning. Inkuber slidene i ytterligere 30 (±5) minutter. 5. Vask sliden: Gjenta trinn 3. - 4 -
6. Dekkglass: Dekkglassprosedyrer kan variere fra laboratorium til laboratorium. Imidlertid anbefales følgende prosedyre: a. Plasser et dekkglass på et kjøkkenpapir. b. Påfør monteringsmedium i en kontinuerlig linje til nedre kant av dekkglasset. c. Rist av overskytende PBS-buffer og ta på nedre kant av sliden og før det til kanten av dekkglasset. Senk forsiktig sliden på dekkglasset på en slik måte at monteringsmediet flyter til øvre kant av sliden uten at det dannes luftbobler eller trykk. Kvalitetskontroll ANA Homogent mønster positiv kontroll og IFA System Negative kontroll skal kjøres på hver slide for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer riktig. Egnede tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver som oppbevares ved < -70 o C. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testresultatene betraktes som ugyldige og analysen må gjentas. 1. Homogent mønster positiv kontroll, må være > 3+. 2. IFA System Negative kontroll må være negativ. Tolkning av resultater Negativ reaksjon. En prøve betraktes som negativ hvis spesifikk fargelegging er lik eller mindre enn IFA System Negative kontroll. Prøver kan utvise varierende grader av bakgrunnsfargelegging på grunn av heterofile antistoffer eller lavnivå autoantistoffer mot cytoplasmiske bestanddeler slik som kontraktile proteiner. Positiv reaksjon. Spesifikk fargelegging av cellebestanddeler. En rekke fargeleggingsmønstre kan observeres avhengig av antistoffspesifisitet. Bestem fluorescensgrad eller intensitet ved hjelp av disse kriteriene: 4+ Skarp eplegrønn fluorescens 3+ Klar eplegrønn fluorescens 2+ Helt tydelig positiv fluorescens 1+ Svakest spesifikk fluorescens som gjør det mulig å skille nukleær og/eller cytoplasmisk fargelegging fra bakgrunnsfluorescens Mønstertolkning. En rekke mønstre av nukleær og/eller cytoplasmisk fargelegging kan utvises avhengig av typer og relative mengder av autoantistoffer som forekommer i prøven. Følgende typer av fargeleggingsmønstre kan observeres: Homogent: En solid fargelegging av kjernene med eller uten synlig maskering av nukleolene. Tilstedeværende nukleære antigener: dsdna, ssdna, histoner Sykdomsassosiasjon: Høye titere antyder SLE, lave titere antyder SLE eller andre bindevevssykdommer. Periferisk: En solid fargelegging, hovedsakelig rundt den ytre regionen av kjernene med svakere fargelegging innover mot senteret til kjernen. Tilstedeværende nukleære antigener: dsdna, ssdna, DNP, histoner Sykdomsassosiasjon: Høye titere antyder SLE, lave titere antyder SLE eller andre bindevevssykdommer. Flekket: En fin eller kornet fargelegging av kjernene vises, generelt uten fluorescert fargelegging av nukleolene. Tilstedeværende nukleære antigener: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B og andre antigen- / antistoffsystemer som enda ikke er karakterisert. - 5 -
Sykdomsassosiasjon: Høye titere antyder SLE (Sm-antistoff), kombinert bindevevssykdom (RNP-antistoff), sklerodermi (Scl-70-antistoff), eller Sjögrens syndrom, sicca-kompleks, (SS-B-antistoff) og lavere titere kan antyde andre bindevevssykdommer. Nukleole: Store grove fargelagte flekker innen kjernene, generelt mindre enn 6 per celle, med eller uten finere flekker. Tilstedeværende nukleære antigener: 4-6S RNA og andre ukjente nukleære antigener. Sykdomsassosiasjon: Høye titere er fremherskende i sklerodermi og Sjögrens syndrom. Mitokondrium (AMA): En diskret kornet fargelegging av distale og/eller proksimale ganger til nyren. De metabolsk aktive parietalcellene til magesekken inneholder høye konsentrasjoner av mitokondrium og kan også farges positive. Tilstedeværende antigen: Forskjellige typer av mitokondrieantigener. Sykdomsassosiasjon: Høye titere indikerer primær biliær cirrhose. Glatt muskel (ASMA): En diskret fargelegging av indre muskellag til blodkarene til nyren og/eller muskularis lagene til magesekken betraktes som spesifikk for ASMA. Tilstedeværende antigen: Aktin Sykdomsassosiasjon: Høye titere indikerer kronisk aktiv hepatitt, autoimmun hepatitt. Gastrisk parietalcelle (GPA): Fargelegging av parietalcellecytoplasma. Disse cellene er lokalisert i magesekkens gastriske mukosa. Da AMA også fargelegger parietalceller, bør også nyregangene kontrolleres før det rapporteres GPA. Hvis prøven er GPA-positiv, vil nyregangene være negative. Tilstedeværende antigen protonpumpe (h/k ATPase) Sykdomsassosiasjon: Disse antistoffene finnes i pernisiøs anemi og atrofisk gastritt. Det er viktig å advare brukeren mot å stole på mønstre for å bestemme autoantistoff spesifisitet, med unntak av nukleole og centromer-mønstre hvor hver av antigenene er godt definerte og deres mønstre karakteristiske. Da mange autoantistoffer eller kombinasjoner derav kan fremkalle et homogent eller flekket mønster, er det anbefalt at spesifikk oppfølgingstesting av autoantistoff (slik som for dsdna og ENA) utføres på alle de flekkede eller homogene prøvene. Prosedyrebegrensninger 1. Høytitert ANA antyder bindevevssykdom, men skal ikke betraktes diagnostisk. ANAresultatet skal betraktes sammen med andre serologiske resultater, samt pasientens generelle kliniske historie. 2. ANA-mønstre endres ofte når prøven titreres ut til endepunktet. Dette fenomenet skyldes at lavtiterantistoffer går under sensitiviteten til systemet da en mer fortynnet prøve testes. 3. En rekke eksterne faktorer påvirker testsensitiviteten inkludert type fluorescensmikroskop brukt, lampestyrken og alder, brukt forstørrelse, filtersystemet og observatøren. 4. Hvis et båndpassfilter brukes istedenfor en 515 barrierefilter, er det mulig å observere økt kunstig fargelegging. 5. Bare blyant skal brukes for å merke slidene. Bruk av annet skrivemateriale kan forårsake kunstig fargelegging. 6. Alle coplin skålene som brukes for slidene skal være fri for fargestoffavfall. Bruk av coplin skåler som inneholder fargestoffavfall kan forårsake kunstig fargelegging. 7. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 8. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Slides som selges separate er klassifisert som analysespesifikke reagenser. Det er bare som en komponent i NOVA Lite ANA Plus kitet at analytiske data er etablert. - 6 -
Forventede verdier Ved bruk av NOVA Lite ANA Plus-testen ble en hel rekke bindevevssykdomspasienter, pasienter med autoimmune leversykdommer, pasienter med pernisiøs anemi og 200 tilfeldig utvalgte blodgiver testet. Resultatene vises under: Antall Positiv* NOVA Lite ANA Plus Pasientgruppe Antall ANA AMA ASMA GPA SLE 105 101 5 9 1 Legemiddelsindusert lupus 24 24 0 0 0 Revmatisk artritt 40 28 1 1 0 Kronisk aktiv hepatitt 25 10 4 21 0 Primær biliær cirrhose 30 5 27 3 0 Pernisiøs anemi 15 0 0 0 14 Normalt 200 3 2 6 1 * Total antall positive kan overgå antall testede grunnet flere mønstre i én enkel brønn. - 7 -
Referanser 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL: Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. 4. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiol Scand. 84:215-220, 1976. 5. Peter JB, Dawkins RL: Evaluating autoimmune diseases. Diagnostic Medicine: 68-76, September-October, 1979. 6. Doniach D, Roitt IM, Walker JG, Sherlock S: Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clinical Experimental Immunology 1:237-262, 1966. 7. Toh BH: Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clinical Experimental Immunology 38:621-628, 1979. 8. Cavallaro JJ, Palmen DF, Bigazzi PE: Immunofluorescent detection of Autoimmune Diseases, Immunology Series No. 7. Center for Disease Control, Atlanta GA, 1976. 9. Loveridge N, Bitensky L, Chayen J, Hausamen TU, Fisher JM, Taylor KB, Gardner JD, Bottazzo GF, Doniach D: Inhibition of parietal cell function by human gammaglobulin containing gastric parietal cell antibodies. Clinical and Experimental Immunology 41:264-270, 1980. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007. Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 info@inovadx.com Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628150NOR July 2010 Rev. 1-8 -