GLYKOPEPTID- OG LINEZOLID- RESISTENS HOS ENTEROKOKKER KRISTIN HEGSTAD Wirth 1994 Eur J Biochem 222:235-46 Reference Centre for Detection of Antimicrobial Resistance, Department of Microbiology and Infection Control, University Hospital of North-Norway Research group for Host-Microbe Interactions, Faculty of Health Sciences, University of Tromsø
ENTEROCOCCI Gram+, normal inhabitants of the gastrointestinal tract Increasingly important nosocomial pathogens Survive extreme environments ph, salt, temperatures, chemical disinfectants E. faecium survive >90 days on hospital fabrics and plastics Intrinsic resistance to several antimicrobial agents Cephalosporins, sulphonamides, lincosamides, β-lactams and low-levels of aminoglycosides Acquire resistance determinants readily Successful clones have accumulated virulence factors Species mainly causing infections E. faecalis > E. faecium Vancomycin resistant enterococci (VRE) E. faecium
Oxazolidinone Modified after Roy-Andre Lyså & Pauline Cavanagh, UiT
VANCOMYCIN RESISTANT E. FAECIUM: EUROPE 2000-2011 2000 2006 2011 EARS-Net
GLYKOPEPTIDANTIBIOTIKA Vankomycin, teikoplanin God effekt på Gram+ Hovedsakelig baktericid virkning, men bakteriostatisk mot enterokokker Hemmer celleveggsyntesen Binder med høy affinitet til D- alanin-d-alanin terminal Hindrer polymerisering og kryssbinding av peptidoglykan Glykopeptidresistens Modifikasjon av target og lavere affinitet for binding av glykopeptid Celleveggsyntesen kan skje tilnærmet upåvirket Alternativ peptidoglycan peptide termini Vankomycin Normal peptidoglycan peptide termini Nicas 1997 Trends Microbiol 5:240-9
GLYCOPEPTIDE RESISTANCE IN ENTEROCOCCI Resistance Acquired Intrisic Level High Variable High Moderate Low Low Type VanA VanB VanM VanD VanE, VanG, VanL, VanN MIC mg/l: Vancomycin Teicoplanin 16 > 8 1 0,5-1 > 256 > 0,75 64 4-64 Localisation a P/C on Tn P/C, Tn/CTn? C C/CTn (VanE) C Transferable + + + - -/+ (VanG) - Distribution E. faecium E. faecalis E. avium E. casseliflavus E. durans E. gallinarum E. hirae E. mundii E. raffinosus S. aureus B. circulans O. turbata A. haemolyticum Paenibacillus Rhodococcus E. faecium E. faecalis E. casseliflavus E. durans E. gallinarum E. hirae S. epidermidis Streptococcus Clostridium Ruminococcus Eggerthella A. minutum a C chromosome, P plasmid, Tn transposon, CTn conjugative transposon E. faecium E. faecium E. faecalis E. avium E. gallinarum E. raffinosus Nonenterococcal flora 6-32 0,5 E. faecalis/ E. faecium (VanN) VanG also in nonenterococcal flora VanC 2-32 0,5-1 Modified Table 2 from Hegstad 2010 Clin Microbiol Infect 16:541-54 E. gallinarum vanc1 E. casseliflavus vanc2/3
VAN CLUSTER SPREAD (1) Can be part of successful hospital adapted (High Risk) clones Three major hospital lineages (ST17, 18 and 78) in E. faecium evolved through recombination, mutation and stress induced selection Putative pathogenicity island Accumulates Virulence genes; mainly surface proteins/adhesins Ampicillin, vancomycin and ciprofloxacin resistance Willems 2012 mbio 3:e00151-12
VAN CLUSTER SPREAD (2) Mobile genetic elements moving between the chromosome and plasmids Plasmids transferring between cells Predominant vanb subtype is integral part of mobile genetic element commonly transferring into enterococci from gut anaerobes during antimicrobial therapy; Hegstad 2010 Clin Microbiol Infect 16:1541-54; Howden 2013 mbio 4:e00412-13
PERSISTENCE; VAN CLUSTER CAN BE PART OF MOBILE GENETIC ELEMENTS CONTAINING ADDICTION SYSTEMS Fig. 2 Hegstad 2010 Clin Microbiol Infect 16:541-54 Johnsen 2005 Appl Environ Microbiol 71:159-68; Bjørkeng 2011 APMIS 119:247-258; Bjørkeng 2013 J Bacteriol Sep 27. [Epub ahead of print]; Hegstad et al. Unpublished results
NATIONWIDE OUTBREAK OF A VANCOMYCIN- RESISTANT E. FAECIUM WITH VANB IN SWEDEN NORM/NORM -VET 2009 Majority of isolates have closely related PFGE type which contain vanb2 on CTn on a conjugative plasmid with an addiction system
RESISTENTE ENTEROKOKKER - INFEKSJONER OG KOLONISERING I NORGE Fylke 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Østfold - - 1-1 - - - 2 67 24 Akershus - - 1 1 1 1 1 1 1-2 Oslo - 1 - - - 1-1 13 4 1 Hedmark - - 2 - - 1 - - 1 - - Oppland - 1 1 - - - - - 1 - - Buskerud - - - - - - - 1-1 - Vestfold - - - - 2-1 1-3 2 Telemark - - - - 1 - - - - - 1 Aust-Agder 1-1 - 1 1 - - - - - Vest-Agder 3 - - 2 - - 2 - - - 1 Rogaland 1-1 - - 1 1 3 16 2 6 Hordaland - - - 1-1 - 41 236 84 62 Sogn og Fjordane - - - - 1 - - 2 16 2 3 Møre og Romsdal - 1 - - - - - 1 2 3 1 Sør-Trøndelag - 1 1 - - - - - 1 1 1 Nord-Trøndelag - - - - - - - - - - - Nordland - - 2-1 - 1 - - 1 4 Troms - - - - - - - - - - 3 Finnmark - - - - - - - - - - - Ukjent fylke - - - - - - - - - - - Totalt 5 4 10 4 8 6 6 51 289 168 111 Hovedsakelig vanb E. faecium http://www.msis.no
VRE DETECTION METHODS (1) EUCAST disk diffusion using 5 μg vancomycin disk A B C D A) Sharp zone edge and zone diameter 12 mm should be reported as susceptible B-D) Fuzzy zone edge or colonies within zone should be reported as resistant even if the zone diameter is 12 mm http://www.eucast.org.no
VRE DETECTION METHODS (2) Vanco screen using BHI with 6 mg/l vancomycin BHI BHI with 6 mg/l vancomycin
NORDICAST BRYTNINGSPUNKTER FOR GLYCOPEPTIDER Vankomycin MIC R > 4 mg/l Sonediameter R < 12 mm Teikoplanin MIC R > 2 mg/l Sonediameter R < 16 mm vanb-genotype resistent mot vankomycin (MIC 1-1024 mg/l) følsom for teikoplanin (MIC 2 mg/l) Disk diffusjon: Vanco screen: 12 mm
NORDICAST MULTICENTRE STUDY COMPARING VRE DETECTION METHODS 30 Scandinavian labs included 13 Norwegian 12 Swedish 5 Danish Methods used No. of labs Disk diffusion (6mm disks) 30 BHI agar screen vanco 6 mg/l 18 Chromogenic agar screen 14 Vitek 7 Phoenix 1
NORDICAST STUDY BLINDED MATERIAL (N=30) Species van genotype Vancomycin MIC range mg/l E. faecalis B 4 24 4 E. faecalis E 16 1 E. faecalis G 16 1 E. faecalis ATCC 29212-3 3 E. faecalis ATCC 51299 B 16 3 E. faecium B 8- >256 18 No. of strains Included outbreak isolates with low-level vancomycin resistance from Bergen (1996), Örebro (2002-03), Huddinge (2007) and Västerås (2008) 23 PFGE types 7 MLST types among 17 typed 5 ST within High Risk Clones of E. faecium
NORDICAST STUDY RESULTS TOTAL NUMBERS Method False susceptible samples False resistant samples Vitek 19/162 (12%) 0/18 (0%) Phoenix 4/27 (15%) 0/3 (0%) BHI vanco 6 32/486 (6.6%) 3/54 (5.6%) Chromogenic Agar Screen 8/378 (2.1%) 6/42 (14%) Disk diffusion 53/810 (6.5%) 2/90 (2.2%)
NORDICAST STUDY COMPARING RESULTS BY LABORATORIES EXPERIENCE IN USING THE DETECTION METHODS Method Disk diffusion BHI agar screen Experience (no. of labs) False susceptible samples in % False resistant samples in % Experienced (15) 2.2 0 Inexperienced (15) 11 4.4 Experienced (13) 6.8 0 Inexperienced (5) 5.9 20
NORDICAST STUDY COMPARING MEDIA Method Media (no. of labs) Very major errors in % Disk diffusion BHI Agar screen Major errors in % Oxoid MH (n=16) 3.2 0 BBL MH II (n=10) 14* 6.7 Oxoid MH-F (n=2) 0 0 Merck MH (n=2) 3.7 0 BHI Difco (n=8) 4.2 0 BHI Oxoid (n=5) 11* 0 BHI BD BBL (n=3) 7.4 33 BHI Acumedia (n=1) 3.7 0 BHI Scharlau (n=1) 3.7 0 *Performed significantly worse
NORDICAST STUDY AVERAGE ZONE MM RECORDED FOR EACH ISOLATE FROM LABORATORIES USING EITHER OXOID MH (WHITE) OR BBL MH II AGAR (BLACK BARS) 18 16 Zone diameter (mm) 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 29 30 Isolate number
Wilson 2008 PNAS 105:13339-13344 LINEZOLID Oxazolidinone Tre aromatiske ringer: God effekt på Gram+ Bakteriostatisk virkning Blokkerer initiering av proteinsyntese ved å binde til 50S og hemme dannelsen av funksjonelt initieringskompleks mellom trna, mrna og ribosomet
NORDICAST BRYTNINGSPUNKTER FOR LINEZOLID Linexolid MIC R > 4 mg/l Sonediameter R < 19 mm 19 mm
MUTASJONSBASERT LINEZOLIDRESISTENS (1) Mutasjoner i 23S rdna domene V Hovedsakelig G2576U mutasjon både hos enterokokker og stafylokokker Funnet flere andre mutasjoner i stafylokokker Mutasjoner i ribosomal protein L3 og L4 hos stafylokokker og enterokokker Long & Vester 2012 AAC 56:603-12
MUTASJONSBASERT LINEZOLIDRESISTENS (2) Flere kopier av 23S rrna genet 4 i E. faecalis 6 i E. faecium Reversibel resistens så lenge ikke alle kopiene har fått mutasjonen Første mutasjonen som gjerne opptrer under seleksjon er ratebegrensende trinn De andre kopiene byttes ut vha rekombinasjon Resistensnivået korrelerer med antall kopier som har mutasjonen Vanligvis minimum 2 kopier for å detektere resistens
OVERFØRBAR LINEZOLIDRESISTENS cfr (chloramphenicol-florfenicol resistens) gen koder for metyltransferase som katalyserer metylering av A2503 i 23S rrna V domenet gir resistens mot 5 antibiotikaklasser fenikoler, lincosamider, pleuromutiliner, streptogramin A og oxazolidinoner utbredt i stafylokokker og rapportert i enkelte dyreisolater i enterokokker frem til 2012 påvist på overførbart plasmid i humant E. faecalis isolat i Thailand (Diaz 2012 AAC 56; 3917-22) 5 skotske, 1 Canadisk (Patel 2013 Diagn Microbiol Infect Dis doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2013.08.012) og 1 norsk VRE E. faecium
FØRSTE TILFELLE AV LINEZOLIDRESISTENS BESKREVET I NORGE I 2012 Eldre mann med kronisk nyresvikt Linezolid 600mg x 2 intravenøst i totalt 19 dager pga bakteriemi med koagulase-negative stafylokokker Klinisk sepsis pga linezolidresistent E. faecalis (MIC 16 mg/l) ti dager etter avsluttet linezolidbehandling E. faecalis resistent mot linezolid samt høygradig nivå av gentamicin isolert fra flere blodkulturer, dialyse katetertupp og -insesjonssted 32 dialysepasienter screenet negative Indekspasienten screenet positiv igjen 4 mnd etter endt linezolidbehandling 23S rdna mutasjon avslørt ved PCR og restriksjonskutt Mutasjon gir restriksjonssete og 2 ekstra bånd Bonora 2006 JCM 44:1153-5 Thilesen 2013 APMIS doi: 10.1111/apm.12100
FØRSTE TILFELLE AV OVERFØRBAR LINEZOLIDRESISTENS FUNNET I NORGE I 2012 Norsk eldre dame brakt hjem fra Indisk sykehus på dødsleiet Rutinescreening avdekket VRE (vana) og ESBL (NDM) VRE E. faecium var resistent mot linezolid, vancomycin, teicoplanin, ampicillin, clindamycin, kloramfenikol samt høygradig nivå av gentamicin og streptomycin cfr gen påvist vha PCR og sekvensering (Kehrenberg & Schwarz, 2006 AAC 50:1156-63) kontroller Cfr+ VRE
TAKE HOME MESSAGES De vanligste typene overførbar vankomycinresistens hos enterokokker vana - høygradig resistens mot vankomycin og teikoplanin vanb - vankomycin MIC 1-256 mg/l og følsomhet for teikoplanin vanb kan være vanskelig å fange opp med tilgjengelige fenotypiske metoder vanb transposon kan komme fra den anaerobe tarmfloraen Vanligste form for linezolidresistens hos enterokokker mutasjon i ribosomet (særlig i 23S rrna) Overførbar linezolidresistens (cfr gen) som gir metylering i 23S rrna begynt å spre seg i kliniske isolater cfr+ vana E. faecium funnet i Norge