Vekst, metabolisme og ølbrygging med melkesyrebakterier og gjær. Growth, metabolism and beer brewing with lactic acid bacteria and yeast

Transkript

1 Masteroppgave stp Fakultet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap Vekst, metabolisme og ølbrygging med melkesyrebakterier og gjær Growth, metabolism and beer brewing with lactic acid bacteria and yeast Guro Kvam Matvitenskap produksjon og utvikling

2 I

3 Forord. Denne oppgaven er skrevet som en avsluttende del av mastergradsstudiet Matvitenskap ved Fakultetet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap på Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). Oppgaven utgjør 60 studiepoeng og er gjennomført høst 2016 og vår Arbeidet med oppgaven har vært tidkrevende med mye laboratoriearbeid og lange dager, men også veldig interessant og givende. Jeg vil gjerne benytte anledningen til å takke alle som har bidratt til å gjøre denne oppgaven mulig. I første omgang vil jeg rette en stor takk til min hovedveileder førsteamanuensis Hilde Marit Østlie for god veiledning og tilbakemelding underveis. I tillegg vil jeg takke biveileder professor Trude Wicklund og stipendiat Anna Dysvik for veiledning vedrørende ølbrygging og pilotbryggeriet ved KBM. I tillegg vil jeg takke professor Anne Kjersti Uhlen ved IPV for samarbeidet med Graminor ved innhenting av kornprøver. Jeg vil også rette en stor takk til overingeniør Kari Olsen og postdoktor Davide Porcellato for bearbeiding av prøver og resultater. Jeg ønsker også å takke overingeniør Zhian Salehian for mye hjelp med molekylærbiologiske teknikker. Jeg vil også rette en oppmerksomhet til May, Ahmed og Kari på laboratoriet for all praktisk hjelp og ikke minst kaffe, kake og hyggelige samtaler i en stressende hverdag. Til slutt vil jeg takke min samboer, Anders for all din støtte og tålmodighet. Tusen takk til dere alle! Norges miljø- og biovitenskapelige universitet Fakultet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap Ås, 12 mai 2017 Guro Kvam II

4 Sammendrag. Ølbrygging er et håndverk forbundet med lange tradisjoner, med røtter tilbake til det 12. århundrets Europa. Før dagens mikrobiologiske teknikker ble oppfunnet var all øl spontangjæret med en kompleks sammensetning av ulike gjær- og bakteriestammer. I dag produseres fremdeles enkelte av disse ølsortene under navn som lambic, geuze eller Berliner weisse, og interessen for slike ølsorter har økt betraktelig de siste årene. Mange bryggerier benytter i dag kjente kulturer av gjær og melkesyrebakterier (MSB) i fermenteringen av moderne surøl. I denne oppgaven ble det mikrobiologiske mangfoldet på kornprøver undersøkt før og etter støping og germinering. Det ble undersøkt for likheter og forskjeller mellom tre byggsorter etter innhøsting fra fire ulike dyrkingssteder i Norge. Fra spiret korn ble MSB isolert og identifisert før enkelte stammer ble undersøkt nærmere i vekst- og metabolismeforsøk både som renkulturer og i blandingskulturer med gjærstammene Saccharomyces cervisiae og Brettanomyces bruxellensis. Det ble benyttet tradisjonelle fenotype metoder og molekylære teknikker som 16S rrna sekvensering og Illumina MiSeq totalsekvensering for å undersøke og kartlegge mikrobiell diversitet på kornet. Videre ble det brygget en surøl-variant fermentert med nevnte gjær- og melkesyrebakteriestammer. Den mikrobiologiske analysen av kornet viste at klimatiske forhold kan ha påvirket mikrofloraen i noen grad mens kornsort ikke hadde innvirkning på mikrofloraen. Før germinering ble det påvist en stor andel Enterobacteriaceae, mens andelen MSB økte som følge av germineringen. Lagerassosiert sopp ble ikke registrert på kornet, mens feltsopp i tillegg til Tremellales var dominerende både før og etter spiring. Kornprøvene ble spiret i timer og et klart overtall av Leuconostoc ssp. ble isolert. Til vekstforsøk ble en stamme av Carnobacterium maltaromaticum og en stamme av Lactococcus lactis ssp. lactis valgt ut. I tillegg ble en stamme av Lactobacillus plantaum og en stamme av Lactobacillus brevis valgt ut fra KBMs stammekolleksjon. I vekstforsøk produserte C. maltaromaticum noe melkesyre (500 ppm) og etanol (56 ppm) i tillegg til store mengder acetoin (81 ppm), diacetyl (0,51 ppm) og enkelte aldehyder. Stammen ble ikke inkludert i surøl-poduksjon på grunn av diacetylproduksjon. De resterende MSB dannet mye melkesyre ( ppm) og eddiksyre ( ppm) men bidro i mindre grad til produksjon av flyktige komponenter. Melkesyrebakteriene påvirket ølet i hovedsak med et syrlig og friskt preg. Gjærstammene omformet acetoin og diacetyl produsert av MSB til 2,3- butandiol som påvirker smaken på øl i mindre grad. Gjærstammen B. bruxellensis vokste saktere enn S. cerevisiae men produserte tilsvarende mengder av flyktige komponenter i pilotbrygget surøl. III

5 Abstract. Beer brewing is a traditional craft dating back to the 12. century in Europe. Prior to the microbiological techniques we have today, all beer was spontaneously fermented with a complex diversity of yeast and bacteria strains. Some of these beer varieties are still being produced today, under names like lambic, geuze or Berliner weisse, and the popularity of sour beer have escalated in recent years. Many breweries use known strains of yeast and lactic acid bacteria (LAB) in the fermentation process of modern sour beer. In this thesis, the microbiological diversity on barley grains were studied before and after germination of the grains. Similarities and differences between three barley cultivars harvested at four places in Norway were investigated. LAB was isolated and identified from germinated grains before some strains were studied further in growth and metabolism studies either as pure cultures or as mixed cultures with the yeast strains Saccharomyces cervisiae and Brettanomyces bruxellensis. Traditional microbiological and molecular biological methods like 16S rrna sequencing and Illumina MiSeq massive parallel sequencing were used to study the microbial diversity on the grains. Further on, a variant of sour beer was fermented using the mentioned strains of yeast and LAB. The microbial analysis showed that the microflora on the grains may have been influenced by climate to some degree, while the microflora did not wary between the barley cultivars. Before germination, there were detected a large share of Enterobacteriaceae on the grains, while the share of LAB increased during germination. Storage associated fungi were not detected on the grains while field fungi in addition to Tremellales dominated the microflora before and after germination. After hours of germination Leuconostoc ssp. was the most abundant LAB isolated. One strain of Carnobacterium maltaromaticum and one strain of Lactococcus lactis ssp. lactis were selected for the study of growth and metabolism, in addition to one strain of Lactobacillus plantaum and one strain of Lactobacillus brevis selected from KBMs strain collection. The C. maltaromaticum strain produced some lactic acid (500 ppm), some ethanol (56 ppm) and large amounts of acetoin (81 ppm), diacetyl (0,51 ppm) and certain aldehydes in the growth and metabolism studies. The strain was not included in the production of sour beer due to diacetyl production. The remaining LAB produced large amounts of lactic acid ( ppm) and acetic acid ( ppm) but they did not produce notable amounts of volatile compounds. The LAB strains contribution to the beer were mainly an acetic and fresh taste. The yeast strains metabolised acetoin and diacetyl produced by LAB to 2,3-butanediol, which does not affect beer taste to the same extent. The yeast strain B. bruxellensis grew slower than S. cerevisiae but produced equivalent amounts of volatile compounds in sour beer. IV

6 Innhold 1. Innledning Teori V 2.1. Melkesyrebakterier Funksjonelle egenskaper hos melkesyrebakterier Fenotypisk identifisering av mikroorganismer Genotypisk identifisering S-rRNA-sekvensering Totalsekvensering av mikrober Ølbrygging Malting Mesking Vørterkoking Fermentering Bi-produkter av fermenteringen Mikrober og metabolitter i kommersielt surøl Hensikt med oppgaven Materialer og metoder Innhenting av kornprøver Malting Mikribiologisk analyse av kornprøver Isolering av melkesyrebakterier Katalase-test og Gram-farging Genotyping S-rRNA-sekvensering Polymerasekjedereaksjon (PCR) Agarosegelelektroforese og rensing av PCR-produkt Sanger-sekvensering Totalsekvensering av mikrober på kornprøver Vekst- og metabolismeforsøk Innledende vekstforsøk Stock-løsning Vørtertillaging Vekstforsøk i vørter Måling av CO Celletall

7 HSGC HPLC Ølbrygging Resultater Mikrobiologisk analyse av kornprøver Spiregrad i kornprøver etter germinering Rendyrking og identifisering av melkesyrebakterier Totalsekvenseing av mikrober Sopp Bakterier Vekst- og metabolismeforsøk Innledende vekstforsøk ph i vekstforsøk Cellevekst i vekstforsøk CO 2-produksjon i vekstforsøk Karbohydrater og organiske syrer i vekstforsøk Flyktige komponenter i vekstforsøk Analyse av ferdig øl Diskusjon Mikrobiologisk analyse av kornprøver Vekstforsøk Renkulturer av MSB Renkulturer av gjær og blandingskulturer av gjær og MSB Analyse av ferdig pilotbrygget øl Oppsummering og konklusjon Videre arbeid Referanser I. Omregningstabell for innhold av løselig sukker (Brix), Plato og Spesific gravity (SG) II. Konsentrasjon og podevolum i vekstforsøk III. Omregning av α-syreinnhold i humle til bitterhet i øl IV. Konsentrasjon og podevolum i ølbrygging V. Kalibreringskurve for beregning av CO2-innhold VI. Resultater fra 16S-rRNA-sekvensering VII. Rådata fra vekstforsøk VIII. Analyse av ferdig øl IX. Rådata totalsekvensering VI

8 1. Innledning. Det antas at mennesker har brygget øl siden de begynte å dyrke og lagre korn. Gjennom tidene har øl vært ansett som trygt å drikke og en god måte å konservere kornet på. Det første beviset man har på kommersiell ølbrygging er en tegning av et bryggeri som ble funnet i klosteret Saint Gall i Sveits og datert til år 820. Frem til 1100-tallet var det kun klostre som brygget øl i kommersiell skala, men senere vokste bryggerinæringen i takt med den urbane utviklingen og oppblomstring av puber og vertshus. I 1487 ble den originale renhetsloven Reinheitsgebot utviklet i Tyskland for å unngå at hvete eller rug ble brukt i øl og på den måten opprettholde lave brødpriser. Loven sa at øl kun skulle bestå av bygg, vann og humle. I 1516 ble også gjær inkludert (Pires & Brányik 2015). I Norge ble loven opphevet i 1994 fordi den kunne ansees som en handelshindring i strid med EUs vedtekter. Dette førte til en endring i både bryggerinæringen og import av øl og råfrukt-øl. De større bryggeriene i Norge følger fremdeles renhetsloven på frivillig basis (Renhetloven 2012). De første øl-sortene som ble brygget ble hverken tilsatt humle eller rendyrkede gjærkulturer, og syrnet derfor etter få dager eller uker. Senere ble ølet lagret på eikefat og gjæringen ble kontrollert ved å blande ferdig gjæret og modnet øl i ferskt øl (Tonsmeire 2014). Dette gav en variert mikroflora av ulike gjærstammer, melkesyrebakterier og eddiksyrebakterier (Spitaels et al. 2015b). I dag produseres fremdeles denne typen øl i Tyskland og Belgia under navn som lambic, geuze og Berliner weisse. Disse sortene og denne teknikken har overlevd til tross for at rendyrking av gjærstammer ble vanlig. De fleste bryggeriene dyrket også opp egne stammer av husgjær. Gjennom de senere årene har interessen for ølbrygging generelt og for unike ølsorter spesielt økt betraktelig. Stadig flere mikrobryggerier brygger både spontangjæret øl og ølsorter der ulike gjær- og bakteriekulturer blandes. En fellesbetegnelse for disse sortene kalles surøl. I tillegg til tradisjonell spontangjæring er det utviklet ulike teknikker for å produsere surøl; gjær og melkesyrebakterier kan tilsettes vørteren samtidig, vørteren kan syrnes en tid før gjær tilsettes slik at bakterier og gjær vokser parallelt, ellers kan vørteren syrnes før den pasteuriseres og tilsettes gjær. Fermentering med gjær og bakterier parallelt krever en fermenteringsprosess på et til tre år før tapping på flasker (Tonsmeire 2014). 1

9 2. Teori Melkesyrebakterier. Melkesyrebakterier (MSB) defineres gjerne som Gram-positive, katalase-negative, ikkesporedannende kokker eller staver med melkesyre som hovedfermenteringsprodukt fra karbohydrater. De er også ubevegelige og mikroaerofile. Bakteriene assosieres ofte med næringsrike habitater som for eksempel melk, planter og kjøtt, men enkelte slekter og arter er også viktige for fordøyelsessystemet hos pattedyr. Det er altså stor variasjon mellom MSB. Inndelingen av bakteriene i slekter baseres på ulikheter i morfologi, glukosefermenteringsmønster, vekst ved ulike temperaturer og saltkonsentrasjoner, konfigurasjon av melkesyre og syre- og base-toleranse (Salminen et al. 2004). Grunnlaget for den systematiske klassifiseringen av melkesyrebakterier ble først utarbeidet av Orla-Jensen og publisert i Av de 16 MSB-slektene assosieres 12 slekter med mat (Narvhus & Axelsson 2003). Disse slektene og deres generelle egenskaper er presentert i Tabell Funksjonelle egenskaper hos melkesyrebakterier. Taksanomisk klassifisering av MSB viser at de hører til rekken Firmicutes, klassen Bacilli og ordenen Lactobacillales. De deles inn i familiene Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lacobacillaceae, Leuconostocaceae og Streptococcaceae (Von Wright & Axelsson 2012). Som vist i Tabell 1 er slektene i familien Leuconostocaecae (Weissella og Leuconostoc) og enkelte arter av Lactobacillus (Lactobacillus brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum og Lb. reuteri) obligat heterofermentative og kan omdanne glukose til CO2, etanol og acetat i tillegg til melkesyre gjennom reaksjonsveien pentose fosfoketolase-sporet. De resterende slektene i tabellen, unntatt Lactobacillus er obligat homofermentative og produserer kun melkesyre fra glukose gjennom glykolysen. Tabellen viser også hvorvidt de ulike slektene kan vokse ved ulike temperaturer (10 C og 45 C) og i sure (ph 4,4) eller basiske (ph 9,6) miljøer. Vørter holder gjerne en ph på omtrent 5,5 etter mesking og vekst i sure miljøer er derfor mest relevant (Bokulich & Bamforth 2013). Mange av slektene inkluderer både syretolerante og mindre syretolerante arter. Ifølge Zhang og Cai (2014) har alle slektene et vekstoptimum ved ph 5,5-6,2 og vil derfor kunne produsere melkesyre i vørter. 2

10 Tabell 1: Generelle egenskaper for de ulike slektene av melkesyrebakterier (Von Wright & Axelsson 2012). Familie Slekt Form CO2 fra glucose Aerococcaceae Aerococcus Kokk (tetrad) Vekst ved 10 C Vekst ved 45 C Vekst i 6,5% NaCl Vekst i 18% NaCl Vekst ved ph 4,4 Vekst ved ph 9,6 Melkesyre konfigurasjon L Carnobacteriaceae Carnobacterium Stav Nd b - Nd b - L Enterococcaceae Enterococcus Kokk L Tetragenococcus Kokk (tetrad) Variabel + Vagococcus Kokk Variabel - L Lactobacillaceae Lactobacillus Stav Variabel Variabel Variabel Variabel - Variabel - D, L, DL Pediococcus Kokk (tetrad) - Variabel Variabel Variabel L, DL Leuconostocaecae Leuconostoc Kokk c Variabel - Variabel - D Weissella Kokk ac Variabel - Variabel - D, LD Oenococcus Kokk c Variabel - Variabel - D Streptococcaceae Lactococcus b Kokk Variabel - L a Enkelte Weissella er stavformet. b Nd; ikke bestemt. c Kan også være ovale. Streptococcus Kokk - - Variabel L 3

11 Tabellen viser også at det er varierende vekst ved 10 C og 45 C blant Lactobacillus, Pediococcus og Streptococcus. Enterococcus vokser ved både 10 C og 45 C, mens Aerococcus, Carnobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus og Lactococcus vokser ved 10 C. Øl fermenteres ved enten 12 C eller C (Palmer 2006) og syrning parallelt med primærfermentering er derfor mulig med de fleste stammene. Dersom vørteren syrnes før gjæring kan temperaturen kontrolleres i større grad i forhold til bakteriearten. Ifølge Tonsmeire (2014) kan det være nyttig å lage en vørter med mye dekstriner i surølproduksjon. De halvlange sukkerkjedene er for lange til at bryggegjær kan nyttiggjøre seg av dem, samtidig som de er korte nok for andre mikrober. Mesking ved lav temperatur ( 60 C) gir høyere enzymaktivitet av α-amylase og dermed mer dekstriner. Alternative reaksjonsveier for metabolisme av pyruvat for MSB er illustrert i Figur 1. Melkesyrebakteriene kan konvertere glukose til pyruvat og videre til metabolittene som er ringet rundt i figuren. Diacetyl og acetoin er aromastoffer som ofte dannes av Leuconostoc og meierirelaterte laktokokker ved omsetning av sitrat i melk via pyruvat (Von Wright & Axelsson 2012). Kieronczyk et al. (2004) undersøkte aminosyreomsetning i Lactobacillus og konkluderte med at diacetyl også kan dannes fra aspartat. Diacetyl gir en smøraktig aroma og er derfor ofte uønsket i ølproduksjon. Ved aerobe forhold eller begrenset næringstilgang kan MSB danne maursyre og acetyl-coenzym A. Acetyl-CoA kan videre fungere som elektronakseptor og gi etanol eller fosforiseres og gi acetat i tillegg til syntese av ATP (Von Wright & Axelsson 2012). 4

12 Figur 1: Reaksjonsveier for metabolisme av pyruvat. Stiplet linje indikerer ikke-enzymatisk reaksjon. Enzymatiske reaksjoner er nummerert: 1. diacetylsyntase, 2. acetolaktat syntase, 3. pyruvat-format lyase, 4. pyruvat dehydrogenase, 5. pyruvat oksydase, 6. acetat kinase (Von Wright & Axelsson 2012). Slekten Lactobasillus inkluderer mange arter (>60) med stor variasjon og inndeles derfor i 3 hovedgrupper: Gruppe I obligat homofermentative, gruppe II fakultativt heterofermentative og gruppe III obligat heterofermentative (Lahtinen et al. 2012). Laktobasillene Lb. plantarum (gruppe II) og Lb. brevis (gruppe III) er viktige i fermentering av planteprodukter og spesielt i produksjonen av surfôr. De er meget syretolerante sammenlignet med andre melkesyrebakterier, og vokser gjerne sent i fermenteringsprosessen (Adams & Moss 2008). Paucean et al. (2013) undersøkte karbohydratmetabolismen til Lb. plantarum i surdeig med og uten tilsetting av Saccharomyces cerevisiae. De konkluderte med at Lb. plantarum omdannet maltose til melkesyre, CO2, etanol og acetat gjennom fosfoketolase-sporet. I tillegg ble flyktige komponenter kartlagt ved hjelp av gass-kromatografi (GC-MS) hvor det ble dannet alkoholer (etanol, 2-methyl-1-propanol, 3-methyl-1-butanol, 2-metyl-1-butanol og 1-hexanol) og karbonylderivater (2-metylpropanal, 2,3-butandion, 3-metylbutanal, 2-metylbutanal, hexanal og benzenacetaldehyd) i forholdet 14:1. I surdeigen med S. cerevisiae ble det dannet omtrent 100 ganger mer 3-metylacetat, 20 ganger mer 2,3-butandion og fem ganger mer etanol enn i surdeigen med Lb. plantarum. 5

13 Arter av Leuconostoc er viktige tidlig i fermenteringsprosessen av grønnsaker som kimchi eller sauerkraut. De tar over for den første, i hovedsak Gram-negative mikrofloraen og er med på å utvikle den karakteristiske smakssammensetningen i ferdige produkter. Mange av artene produserer ekstracellulære polysakkarider (EPS) som kan være ønskelig i enkelte produkter der de brukes som fortykningsmidler, men ansees som et problem i andre produkter. De produserer diacetyl og acetat fra sitrat og kan redusere acetaldehyd til etanol (Narvhus & Axelsson 2003). Pediokokker er mye brukt i fermentert mat, ofte som en starterkultur men også på grunn av probiotiske egenskaper. Samtidig kan de også opptre som ødeleggende i enkelte matvarer. Ifølge Martino et al. (2013) er pediokokkene uønsket i vin og øl fordi de ofte produserer EPS, eddiksyre, aminer og diacetyl. Arter av Lactococcus er ekstremt viktige i meieriindustrien, og inngår i flere kommersielle starterkulturer for produksjon av fermentert melk, rømme og ost. Lactococcus lactis ansees som den kommersielt viktigste. Lc. lacits har to underarter; cremoris og lactis der lactis oftest isoleres fra miljøer utenfor meieriet (Narvhus & Axelsson 2003). Bakterier tilhørende slekten Weissella kan isoleres fra mange ulike fermenterte matvarer, som kimchi, fermentert fisk og surdeig, men opphavet til bakterien er fremdeles usikkert. Derimot er det kjent at Weissella confusa metaboliserer karbohydrater gjennom fosfoketolasesporet, og danner syre fra maltose, ribose og sukrose men ikke fra trehalose (Zhang & Cai 2014). Slekten Carnobacterium ble tidligere beskrevet som en atypisk laktobasill som ikke kunne vokse på acetat agar. Den ble først isolert fra vakuumpakket kjøtt. Slekten består av arter med varierende egenskaper der Carnobacterium maltaromaticum oftest isoleres fra mat (Zhang & Cai 2014). Afzal et al. (2010) utførte en omfattende studie av C. maltaromaticum der det ble konkludert med at arten er høyst interessant i forhold til meieriteknologi fordi den kan vokse i ost under modning uten å påvirke starterkulturen hvor den syntetiserer ulike 6

14 smakskomponenter inkludert 3-metylbutanal. Videre hemmer den humanpatogene bakterier som Listeria monocytogenes ved produksjon av bakteriosiner og den har aldri vært assosiert med sykdom hos mennesker Fenotypisk identifisering av mikroorganismer. Identifikasjon ved hjelp av fenotyping er en billig og enkel metode med lav brukerterskel. Derimot kan den gi dårlig reproduserbarhet og krever god logistikk i forhold til større forsøk, samt at fenotype metoder har lav taksonomisk oppløselighet. Oppdyrking og rendyrking tar ofte tid og krever en del vedlikehold av kulturen. En fenotypisk identifiseringsmetode for å skille mellom bakteriestammer er katalase-test. Oksygen er giftig for anaerobe organismer, men grunnen til dette er ikke at oksygen i seg selv er reaktivt og påvirker strukturer og funksjoner i cellen. Derimot reagerer oksygen med svært reduserte stoffer som dannes i løpet av metabolismen hos organismene. Det dannes også kationer av kopper eller jern som fungerer som katalysatorer i reaksjonen som danner hydrogenperoksid (H2O2). Aerobe og fakultativt aerobe organismer kvitter seg med oksygenforbindelsene ved å produsere blant annet enzymet katalase, som spalter H2O2 til vann og oksygen. MSB er aerotolerante anaerobe og mangler enzymet (Holland et al. 2013). Derfor kan det utføres en katalase-test for å bestemme om en renkultur av bakterier kan produsere katalase eller ikke. Testen utføres ved at kulturmateriale løses i H2O2. Dersom bakterien er katalase-positiv kan gassdannelse observeres når O2 frigjøres. Gramfarging er en utbredt metode som brukes for å skille mellom bakterier basert på oppbygning av celleveggen. Metoden, som ble beskrevet av Christian Gram og først publisert i 1884 gjør at man enkelt og raskt kan skille mellom Gram+ og Gram- bakterier. Celleveggen til Gram+ celler inneholder omtrent 90 % peptidoglykan fordelt på opptil 25 peptidoglykonlag. Den Gram- celleveggen inneholder derimot 10 % peptidoglykan, i tillegg til et tykkere lag av lipopolysakkarid, som vist i Figur 2 (Madigan et al. 1997). 7

15 Figur 2: Skjematisk fremstilling av celleveggens oppbygning hos (a) gram-positive og (b) gramnegative bakterieceller (Madigan et al. 1997). Gramfargingsmetoden går ut på at fikserte preparater av bakteriekulturer farges med krystallfiolett og jod-løsning før de skylles med etanol. Cellene farges blå med krystallfiolett og det dannes store vannuløselige fargekomplekser etter behandling med jod-løsningen. Skylling med etanol gir en dehydrering av celleveggen hos Gram+ på grunn av lite lipider tilstede. Fargekompleksene kommer dermed ikke ut av cellene og de forblir blå. Hos Grammedfører skylling med etanol at lipidene og fargekompleksene i celleveggen og -membranen løses opp. Deretter kontrastfarges preparatene med safranin, slik at Gram- bakterier fremstår som rosa mens Gram+ forblir blå (Madigan et al. 1997). Melkesyrebakterier er Gram+ og katalase-negative, og en katalasetest og en Gramfarging vil derfor gi en god indikasjon på om renkulturen består av melkesyrebakterier Genotypisk identifisering Til forskjell fra fenotypiske metoder er genotyping basert på DNA og hovedsakelig bruk av polymerase kjedereaksjon (PCR) for identifisering på slekts-, arts- og stammenivå. Metodene har god reproduserbarhet, er raske og gir pålitelige resultater, men er arbeids- og utstyrskrevende. Mange av metodene sammenligner nukleotidsekvenser med kjente sekvenser i en database. 8

16 S-rRNA-sekvensering Polymerase-kjedereaksjon (PCR). PCR er en effektiv metode for å amplifisere spesifikke segmenter av et genom. Metoden har vært banebrytende innen genforskning og benyttes mye i dag. DNA-syntesen utføres ved at isolert DNA tilsettes enzymet DNA polymerase, deoksynukleotider, en buffer og to primere der én går fremover (F) og den andre i revers (R). Ved å heve og senke temperaturen åpner DNA-tråden seg slik at primerne kan feste seg og polymerasen syntetiserer DNA ved å binde deoksynukleotider til hver DNA-tråd (Watson et al. 2014). Trinnene i prosessen er vist i Figur 3. Figur 3: Skjematisk fremstilling av polymerase kjedereaksjonen; dobbelttrådet DNA denaturerer, primere fester seg og DNA polymerase syntetiserer DNA i 5-3 -retning (Watson et al. 2014). Figuren viser hvordan dobbelttrådet DNA denaturerer ved oppvarming slik at primerne kan feste seg på enkelttrådene. Temperaturen senkes og de to primerne fester seg på 5 -enden av 9

17 hver sin templattråd og initierer DNA-kopiering i retning mot 3 -enden. Primer-sekvensen er spesifikk og fester seg på et bestemt sted i genomet slik at en gitt sekvens kopieres. DNA polymerase fester nukleotider (dgtp, datp, dttp og dctp) til DNA-trådene. Etter polymeriseringen står man igjen med to dobbelttråder som er identiske med den opprinnelige DNA-tråden (Watson et al. 2014). Syklusen med denaturering, festing av primere («annealing») og polymerisering gjentas mellom 20 og 30 ganger for å sikre høy konsentrasjon av den ønskede gensekvensen Agarosegelelektroforese. For å undersøke om PCRen har fungert kan det utføres en agarosegelelektroforese, der DNAfragmentene i PCR-produktet separeres etter størrelse og synliggjøres på en gel. DNA er negativt ladet og vandrer mot den positive polen i et elektrisk felt. Vandringen i gelen påvirkes av størrelsen på PCR produktet, hvor store PCR-produkt vandrer kortest og små PCR-produkt vandrer lengst. Størrelsen på DNAet sammenlignes med en molekylvektstandard, også kalt ladder som inneholder fragmenter med kjent størrelse, som vist i Figur 4. Figur 4: 1kb DNA molekylvektstandard ( ladder ) farget med etidiumbromid og satt på en 0,8% agarosegel (New England Biolabs). Figuren viser at styrken på båndene korrelerer med mengde (ng) DNA i fragmentet. Båndet på 3,0 kb er sterkere enn de andre og fungerer som en referanse når PCR-produktet sammenlignes med standarden. Dersom PCR-reaksjonen har gått som den skal vil løsningen inneholde store 10

18 mengder fragmenter i en gitt størrelse og små mengder av fragmenter i andre størrelser (New England Biolabs). En vellykket PCR gir derfor et sterkt bånd med kjent størrelse. Amplifisering av 16S-rRNA-genet gir fragmenter på 1,5kb Sangersekvensering. Sekvensanalyse baserer seg på amplifisering av DNA med samme prinsipp som PCR, men med bruk av kjede-terminerende nukleotider. DNA kopieres da fra en templattråd med en fiksert primer som startsted. DNA polymerase bruker 2 -deonukleotid trifosfat (dntp) som byggesteiner for syntese i 5 3 -retning. De kjede-terminerende nukleotidene 2,3 - dioksynukleotid trifosfat (ddntp) mangler 3 -hydroxygruppen, som vist av strukturformelen i Figur 5. Den manglende OH-gruppen hindrer nye nukleotider fra å feste seg i 3 -enden av tråden, og syntesen avbrytes (Watson et al. 2014). Figur 5: Til venstre; 2 -deoxy ATP kan inkorporeres i en DNA-tråd slik at nye nukleotider kan feste seg videre i tråden. Til høyre: 2 -,3 -dideoxy ATP kan inkorporeres i en DNA-tråd og blokkerer videre vekst av tråden (Watson et al. 2014). I en reaksjonsblanding som brukes til amplifisering av DNA for sekvensering tilsettes både dntper og ddntper i forholdet 100:1. På grunn av de terminerende nukleotidene inneholder PCR-produktet fragmenter av ulike lengder. Når ende-ddntpene merkes med ulike fluoriserende farger kan posisjonene til nukleotidene bestemmes ut fra lengden på fragmentene. Sekvensene med ulike lengder blir separert i en kapillærgelelektroforesekolonne med polyakrylamid gel, laserdetektert og satt sammen til en sekvens, som vist i Figur 6 (Watson et al. 2014). 11

19 Figur 6: Utsnitt av en DNA-sekvens fremstilt ved Sangersekvensering; eksempel på en god sekvens (venstre) og en dårlig sekvens (høyre) (Hall 1999). Figuren viser to utsnitt fra samme sekvens. Basepar 650 til 680 er en god sekvens mens basepar 1350 til omtrent 1380 er en dårlig lesbar sekvens. Dårlige deler av sekvensen ligger oftest i begynnelsen og slutten av sekvensen og kan enkelt fjernes ved hjelp av dataprogrammer som BioEdit Sequence Aligment Editor (Hall 1999). Deretter konverteres sekvensen til et tekstbasert format (FASTA-format) og søkes opp i databaser med kjente sekvenser, for eksempel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI 2016) der en mengde DNA-, RNA- eller aminosyresekvenser er samlet Totalsekvensering av mikrober. En nyere metode for å undersøke den totale mikrobiologisk sammensetningen i en matvare kalles massiv parallell sekvensering (MSP), eller totalsekvensering. Dette er en dyrkningsuavhengig metode som gir raske resultater og kan benyttes på mange prøver samtidig. Metoden baserer seg også på 16S-rRNA-sekvensering, men av all mikrobiota DNA tilstede i prøven. Dette gir en kvantitativ oversikt over det mikrobiologiske samfunnet i prøven, hvor både levende og døde organismer analyseres (Porcellato & Skeie 2016). Illumina MiSeq er en vanlig totalsekvenseringsmetode å bruke Ølbrygging. Byggkornet er sammensatt som vist i Figur 7, med embryo i proximal-enden, scutellum som skiller embryo fra endospermen og aleuronlag rundt endospermen. Kornet er omsluttet av kli, og har langt snerp som vender ut fra akset. Endospermen er kornets opplagsnæring og består i hovedsak av stivelse organisert i stivelseskorn (Lewis & Young 2001b). Stivelseskornene er omsluttet av cellevegger bestående av omtrent 75% β-glukan, 20% arabinoxylan (pentosan) og 5% proteiner i tillegg til noe celluloce og ferulsyre (Kanauchi & Bamforth 2001). 12

20 Figur 7: Skjematisk fremstilling av byggkornet (Lewis & Young 2001a) Malting. Malting er prosessen som omformer kornet til malt før det kan brukes til ølbrygging eller destillering. Maltingsteknikken baserer seg på evnen kornet har til å omforme de lagrede næringsstoffene slik at kornets embryo kan vokse. Bryggeren benytter denne mekanismen til å fremstille malt uten at næringsstoffene går tapt. Når kornet brukes til ølbrygging er det i hovedsak stivelsen man er ute etter, men kornet inneholder også en del proteiner. Modifisering av kornet er et uttrykk som omfatter alle endringer som skjer under fremstillingen av malt (Lewis & Young 2001b). Maltingen deles inn i støping (bløtlegging), germinering (spiring) og kjølling (tørking). Under støpingen sveller kornet opp og respirasjonen øker. Fuktigheten i kornet øker fra 10-12% til 42-46% noe som er avgjørende for modifiseringen av kornet. Skallet tar opp vann raskt, og holder på fuktigheten gjennom hele støpingen. Embryoet tar opp mer vann (55-60%) enn endospermen (30-40%) der opptaket også går tregere. Vann tas opp i endospermen gjennom skutellum og vandrer først langs dorsal ytterkant, før ventral kant og til slutt trenger inn i kjernen. Støpevannet holder gjerne en temperatur på C og støpingen tar mellom 40 og 50 timer. I løpet av prosessen byttes vannet ut minimum en, men gjerne tre eller fire ganger for å kontrollere temperaturen og fjerne urenheter og mikroorganismer. I tillegg får kornet en air rest eller dry stand når vannet byttes for å unngå overoppheting samtidig som det ikke tørker ut. I tillegg kan også luft bobles gjennom kornet i løpet av støpingen for å fjerne akkumulert CO2 (Lewis & Young 2001b). 13

21 Støpingen er ferdig når roten kan skimtes som en hvit prikk på skallet. Da dreneres vannet av og kornet legges til spiring enten i egne spirekammer eller i kombinerte støpe- og spirekammer. Kornet ligger til spiring i 3-5 dager mens det snues jevnlig for å sikre jevn spiring og å hindre at røttene floker seg sammen. I enkelte kammer vendes kornet kontinuerlig, mens i andre snues det to til tre ganger daglig. Fuktig og kjølig luft blåses igjennom for å regulere temperaturen og tilføre O2 samtidig som akkumulert CO2 fjernes. Temperaturen på kornet øker typisk fra C til C i løpet av germineringen. Den viktigste årsaken til at korn maltes er for å stimulere produksjonen av gibberelliner og andre plantehormoner i kornets embryo. Det skjer i løpet av de første dagene mens embryo vokser, altså i støpingen, slik at vannet frakter gibberillinene fra embryo og gjennom skilleveggen mellom scutellum og aleuronlaget. Denne veggen er bedre utviklet på dorsal-siden av kornet, og modifiseringen skjer derfor raskere her. Når aleuronlaget kommer i kontakt med gibberillinene blir det produsert enzymer som igjen bryter ned næringsstoffene i endospermen slik at embryo kan nyttiggjøre seg av disse. Utskillelsen av enzymer skjer under germineringsfasen av maltingen. Enzymene som produseres er i hovedsak α-amylase, β-amylase, limit dekstrinase, β-glukanase og proteaser. Når kornet ligger til spiring bryter β-glukanase og proteasene ned celleveggene rundt stivelseskornene for å gjøre stivelsen tilgjengelig. For bryggeren er det avgjørende at celleveggene brytes ned, men at spiringen avbrytes før amylasene bryter ned mye stivelse (Lewis & Young 2001b). Spiringen avbrytes når bladspiren har grodd til % av kornets lengde (Briggs et al. 2004). Etter germineringen blir enzymene deaktivert gjennom tørking, eller kjølling. Vanninnholdet i kornet senkes raskt til 3-5% slik at enzymene blir mer varmestabile og ikke ødelegges av varmen. Tørkingen skjer i tre steg; free drying der vann fra overflaten av kornet fjernes ved relativt lav temperatur (50-65 C), forced drying der vann fra kjernen av kornet vandrer til overflaten (70-75 C) og til slutt curing der vann bundet til mikromolekylene i kjernen fjernes. Siste steg gjøres ved C avhengig av hvilken type basemalt som produseres, hvilke aromastoffer og hvilken grad av ikke-enzymatisk bruning (Maillard-reaksjoner) som ønskes. Basemalt er de malttypene det brukes mest av i et brygg, og som tilfører fermenterbart sukker og enzymer. Spesialmalt bidrar i hovedsak med farge og aroma og i liten grad enzymer og sukker. Mange av disse sortene kjølles ved høyere temperaturer ( 225 C) eller produseres 14

22 ved å bløtlegge og varmebehandle basemalt på nytt (Lewis & Young 2001b). Tørkingen gjør kornet lagringsstabilt og bevarer enzymene og stivelsen. Booysen et al. (2002) undersøkte hvordan sammensetningen av melkesyrebakterier endret seg gjennom maltingsprosessen av de to byggsortene Clipper og Prisma. Det ble tatt ut prøver av kornet før støping og etter siste dry stand i tillegg til etter en, to og tre dager med germinering og etter kjølling. Celletallene økte gjennom støpingen, fra 1,2*10 3 og 7,6*10 4 kde/ml til 2,4*10 7 og 8,4*10 7 kde/ml, men endret seg lite gjennom de tre dagene med germinering (fra 3,1*10 8 og 2,5*10 7 kde/ml til 3.7*10 7 og 3.2*10 7 kde/ml). Etter kjølling sank celletallet til 1.5*10 4 og 6.9*10 4. Det ble isolert bakterier fra nevnte uttak i tillegg til to vannprøver og to kornprøver under støping; til sammen ti prøveuttak. Totalt ble 67 gram-positive og katalasenegative bakterier isolert. Ulike fenotypiske og genotypiske tester bekreftet at 38 av disse var Leuconostoc sp., 17 var Weissella sp., 7 var homofermentative laktobasiller og 5 var Lactococcus sp. Før spiring og i spirekammeret inneholdt sorten Clipper Leuconostoc lactis, Leuconostoc argentinum, W. confusa, Lactobacillus casei og Lactobacillus rhamnosus, men ikke Weissella paramesenteroides eller Lc. lactis. Prisma inneholdt Le. lactis, Le. argentinum, W. confusa, W. paramesenteroides og Lc. Lactis, men ikke Lb. rhamnosus eller Lb. casei. Etter kjølling var Leu. argentinum og Lc. lactis dominerende Mesking. Før bryggingen kvernes malten for å øke kontaktflaten mellom malt og vann. På den måten optimaliseres nedbrytingen av stivelse og absorberbare nitrogenkomponenter. Meskingen kan utføres på ulike måter; enten ved å varme vann før tilførsel av malt eller ved å blande malt og vann for så å koke opp en del av blandingen og deretter tilbakeføre den for å oppnå riktig mesketemperatur. Uavhengig av metode er målet med meskingen å produsere en vørter ved å aktivere enzymene fra kornet slik at de bryter ned stivelsen til fermenterbare sukkerarter (Pires & Brányik 2015). Figur 8 viser en oversikt over enzymenes optimale temperaturer og phverdier. Mesken har oftest en ph som ligger innenfor dette området (5,1 til 5,5), men ph kan også justeres om nødvendig. Derimot er det viktig å regulere mesketemperaturen. Figuren viser at β-amylasens optimumtemperatur ligger på ca C, mens α-amylase ligger noe høyere, på ca C. β-glukanase og proteaser har lavere optimumstemperatur. 15

23 Figur 8: Optimal temperatur og ph for enzymene forbundet med mesking (Palmer 2006). Figuren viser også at meskingen bør utføres innenfor temperaturområdet som omfatter optimal temperatur for både α- og β-amylase. Stivelse i løsningen består av områder med lineære glukosekjeder bundet sammen av α-(1 4)-bindinger (amylase) og områder med forgreninger av α-(1 6)-bindinger (amylopektin). α-amylase og β-amylase spalter α-(1 4)-bindinger mens limit dextrinase kan spalte α-(1 6)-bindinger (Damodaran et al. 2007). β-amylase spalter kun glukosekjeden i ikke-reduserende ende, og en høy aktivitet av α-amylase lager derfor flere bindingsseter for β-amylase (Pires & Brányik 2015). Etter meskingen inneholder vørteren i hovedsak de fermenterbare sukkerne glukose, maltose og maltotriose i tillegg til ikke-fermenterbare dextriner (Pires & Brányik 2015). Når stivelsen er brutt ned utmeskes vørteren ved >77 C i et par minutter for å stoppe alle enzymatiske reaksjoner i (Palmer 2006) Vørterkoking. Etter meskingen siles vørteren for å fjerne kornrester (mask) og masken skylles enten med vann eller ved å sirkulere vørteren (Palmer 2006). Deretter varmes løsningen opp, og kokes i minutter. Vørterkoking er et viktig trinn i prosessen av flere grunner; sterilisering, koagulering av proteiner slik at disse synker, fordamping av vann og flyktige komponenter som dimetylsulfid (DMS), isomerisering av α-syrer og Maillard-reaksjoner (Pires & Brányik 2015). 16

24 Underveis i kokeprosessen tilsettes humle for å gi en konserverende effekt og samtidig bitterhet og aroma i det ferdige ølet. Humle inneholder α-syrene humulon, cohumulon og adhumulon og β-syrene lupulon og colupulon i tillegg til spor av en rekke andre analoger av disse. Under vørterkokingen isomeriseres α-syrene til iso-α-syrer, som er tre ganger mer løselig i vann og ni ganger mer bitre enn α-syrene (Briggs et al. 2004) Fermentering. Bryggegjær er encellede, fakultativt anaerobe eukaryoter som formerer seg gjennom knoppskyting. Hovedsakelig er det to arter av Saccharomyces som brukes i ølbrygging, men også Brettanomyces og andre gjærstammer blir benyttet. Saccharomyces cerevicise kalles også over-gjær fordi den akkumuleres i skummet på ølet under gjæringen, mens S. pastorianus legger seg på bunnen av gjæringstanken og kalles under-gjær. Artene brukes henholdsvis i aleog lager-øl (Lewis & Young 2001a). Begge artene av Saccharomyces kan metabolisere små sukkerenheter som sukrose, glukose, fruktose, maltose og maltotriose. Enzymet invertase hydrolyserer sukrose til glukose og fruktose utenfor cellen, mens de andre sukkerartene fraktes inn i cytoplasmaen for metabolisering. Maltose og maltotriose hydrolyseres til glukose av α-glukosidase. Opptaket av sukker skjer i en bestemt rekkefølge; glukose og fruktose tas opp gjennom samme permease, men glukose har høyere affinitet og tas derfor opp først. Etter fruktose tas maltose og maltotrisoe opp (Figur 9). Gjæren metaboliserer glukose gjennom to reaksjonsveier; den katabolitt-undertrykkende reaksjonsveien og Ras/cAMP/protein kinase reaksjonveien. Førstnevnte undertrykker gener som er involvert i transporten av maltose og maltotriose dersom glukose eller sukrose er til stede, i tillegg til gener koblet til glukonegenese og respirasjon. Sistnevnte regulerer gener koblet til metabolisme, formering og stresstoleranse. I begynnelsen av gjæringsprosessen vil begge reaksjonsveiene være aktive og biomassen vokser raskt (Pires & Brányik 2015). 17

25 Figur 9: Karbohydratsammensetning i en 10 Plato ale vørter gjennom fermentering med en overgjærart ved 18 C (Briggs et al. 2004). Nedbrytningen av glukose starter med glykolyse som foregår i cytoplasma og gir to molekyler pyruvat. Deretter dekarboksyleres pyruvat til acetaldehyd og CO2 før acetaldehyd reduseres til etanol. Selv om bryggegjæren kan utføre aerob respirasjon, vil den oftest velge å produsere etanol gjennom fermentering både ved anaerobe og aerobe betingelser, så lenge konsentrasjonen av sukker er høy. Dette fenomenet kalles crabtree effect og skyldes både at gjærens etanoltoleranse gir den et overtak over konkurrenter, og at den senere kan bruke etanolen som en kilde til energi og karbon (Pires & Brányik 2015) Bi-produkter av fermenteringen. Under fermenteringen dannes det en rekke bi-produkter som påvirker smak og aroma i det ferdige produktet. Mange stoffer gir ølet karakteristikk og velsmak i visse konsentrasjoner, mens andre er uønsket selv i små konsentrasjoner. En forenklet oversikt over bi-produktene som påvirker ølet og metabolismen av disse i en gjærcelle er presentert i Figur 10. Høyere alkoholer er ønskelig i øl og tilstede i høye konsentrasjoner ( 5 ppm). De dannes ved at gjæren absorberer α-amino-syrer og fjerner aminogruppen før de nydannede α-keto-syrene dekarboksyleres og reduseres til høyere alkoholer. Til forskjell fra høyere alkoholer blir det kun dannet små mengder, eller spor av flyktige estere. Likevel er esterne viktige aromakomponenter fordi terskelverdien for å detektere aromaen er svært lav. Esterne blir 18

26 dannet fra organiske syrer og alkohol i starten av primærgjæringen og kan deles inn i to grupper; acetat estere, som dannes fra acetat og etanol, og etylestere dannet fra mellomlange fettsyrer og etanol. Estersammensetningen kan endre seg drastisk under lagring, enten i sekundærfermenteringen eller ved spontane kjemiske reaksjoner mellom organiske syrer og etanol. Dette gjør at ølets friske, fruktige aroma gjerne erstattes med en søtere aroma etter modning. Esterne kan være ønskelige i øl, og er spesielt fremtredende i spontangjærede ølsorter, men dersom konsentrasjonen blir for høy kan de likevel gi uønsket aroma (Pires & Brányik 2015). Figur 10: De viktigste reaksjonsveiene og metabolittene dannet av Saccharomyces i fermentering av vørter. βg, β-glukosidase; DMS, dimetylsulfid; DMSO, dimetylsulfoksid (Bokulich & Bamforth 2013). Det samme gjelder for diacetyl (2,3-butandion), som er et biprodukt av aminosyresyntese under primærfermenteringen når biomassen øker. Diacetyl har lav terskelverdi og gir en smøraroma som er ønskelig i mange meieriprodukter men oftest uønsket i øl. Når ølet modnes blir diacetyl reabsorbert av gjæren og redusert til 2,3-butandiol. Dioler har vesentlig høyere terskelverdi og vil derfor ikke påvirke ølets smak (Pires & Brányik 2015). En oversikt over de flyktige stoffene som forbindes med øl er gitt i Tabell 2. Tabellen inkluderer terskelverdiene for stoffene i tillegg til sensoriske karakteristikker og forventede konsentrasjoner i ale-øl. De forventede konsentrasjonene varierer mye mellom ølsorter, og tilstedeværelse av ulike flyktige stoffer kan påvirke oppfattelsen av andre stoffer i ølet. Derfor er det vanskelig å vurdere en enkelt komponent uten det helhetlige sensoriske bildet av en ale. 19

27 Tabell 2: Flyktige forbindelser i øl, samt forventede konsentrasjoner, terskelverdier og sensorisk karakteristikk av hver enkelt komponent. Flyktig komponent Konsentrasjon i ale (ppm) Alkoholer / høyere alkoholer Terskelverdi (ppm) Etanol Alkohol 1 Sensorisk karakteristikk 1-propanol Alkohol, søtt 2 2-butanol Søt, vinaktig 5 2-metyl-1-propanol Fruktig, whiskey, vin 3 (isobutanol) 3-metyl-1-butanol Alkohol, vinaktig 4 (isoamyl alkohol) 2-metyl-1-butanol Alkohol, vinaktig 4 Phenylethyl alcohol 1,8 1, , 40 2 Roser 2 1-hexanol Urter, treaktig, søt 3 Aldehyder Acetaldehyd Kaffe, eter, vinaktig 3 2-metyl-propanal Banan 3 3-metyl-butanal Fruktig, fersken, syrlig 3 2-metyl-butanal Sjokolade, kaffe 3 trans-2-hexen-1-al 0,55 5 0,365 5 Mandel, eple, grønnsaker, plomme, søtt 3 Ketoner Diacetyl (lager) 1 Smør pentandion Smør, toffee 2 2-butanon Eterisk 3 Aceton Eple, eterisk 3 Acetoin Smør, kremete 3 Svovelforbindelser Dimethylsulfid 0,010-0,10 1 0,030 1 Mais 1 Estere Etylacetat Fruktig, løsemiddel 2 Isoamyl acetat ,2-2 2 Banan 1 Isobutyl acetat 0,01-0,25 1 1,6 1 Banan, søt, fruktig 1 Etyl hexanoat 0,1-0,5 1 0,21 1 Fruktig, søt 1 Eple, banan, ananas 3 1 (Briggs et al. 2004) 2 (Pires & Brányik 2015) 3 (Sigma-Aldrich 2014) 4 (Jackson & Linskens 2002) 5 (Barnes 2013) 6 (Spitaels et al. 2015a) 20

28 2.5. Mikrober og metabolitter i kommersielt surøl. Ifølge Tonsmeire (2014) er Berliner weisse den eneste surølsorten der kun Lactobasillus bidrar til melkesyreproduksjon. Bryggeriene tilsetter enten bakterier og gjær samtidig, eller deler opp vørteren og fermenterer de hver for seg. Spitaels et al. (2015b) undersøkte sammensetningen av mikroorganismer og metabolitter i gueuze-øl etter lagring i to måneder til 17 år. Gueuze ølsorter produseres ved å blande eldre og nyere, vanligvis 3 år og 1 år gamle spontangjærede lambic øl for å oppnå en variert mikroflora som kan bryte ned alle sukkerartene i vørteren. Oppdyrking på agar gav vekst av gjær fra alle årganger, mens bakterier ikke vokste i øl eldre enn fem år. Fermenteringsprosessen kunne deles i tre faser; en måned med Enterobacteriaceaedominert vekst, to måneder med primærfermentering dominert av S. cerevisiae og S. pastorianus, og modning dominert av Pediococcus damnosus og Dekkera bruxellensis der sistnevnte er det seksuelle stadiet av B. bruxellensis. Modningen gav ølet det karakteristiske syrlige og tørre preget. Det ble konkludert med at konsentrasjonen av melkesyre og etyl laktat steg under lagringen (fra 4800 til ppm melkesyre og fra 102,3 til 620,0 ppm etyl laktat) mens etanolkonsentrasjonen forble konstant (mellom 3,7 og 5,2 ppm). Konsentrasjonen av isoamyl acetat og etyl decanoat avtok i løpet av lagringen (fra 0,27 til 0,05 ppm isoamyl acetat og fra 9,2 til 2,7 ppm etyl decanoat). Det ble observert store forskjeller fra flaske til flaske innenfor samme årgang i forhold til melkesyre- og eddiksyreinnhold. Etylacetat var fettsyreetylesteren med høyest konsentrasjon ( ppm) og konsentrasjonen var uavhengig av lagring. Små mengder isobutanol og isoamyl acetat ble observert i alle prøvene og konsentrasjonen avtok under lagring. Den lave konsentrasjonen av isoamyl acetat skyldes at D. bruxellensis produserer en esterase som bryter ned esteren. Derfor er innholdet av isoamyl acetat vesentlig lavere i gueuze-øl sammenlignet med andre ølsorter. Figur 11 viser utviklingen av mikroflora og metabolitter fra en studie av Van Oevelen et al. (1977) der en spontangjæret lambic-øl ble analysert over 24 måneder. Figuren viser de tre fasene i gjæringsprosessen og hvordan de ulike mikroorganismene påvirker sammensetningen av vørteren. Den første fasen er også her dominert av Enterobacteriaceae i tillegg til Kloeckera som senker ph noe ved å produsere eddiksyre. Under primærfermenteringen tar Saccharomyces over sammen med Pediococcus og det dannes etanol, melkesyre og etylacetat. Etter omtrent åtte måneder tar Brettanomyces over sammen med Pediococcus. 21

29 Figur 11: Utvikling av enkelte viktige parametere i spontangjæring av en lambic ølsort. 1-etanol, 2- melkesyre, 3-etylacetat, 4-pH, 5-restsukker (SG), 6-eddiksyre (Van Oevelen et al. 1977) Hensikt med oppgaven. I denne oppgaven ble den mikrobiologiske sammensetningen på kornprøver av norsk bygg undersøkt ved hjelp av dyrkingsavhengige og dyrkingsuavhengige metoder. I tillegg til å se på forskjeller før og etter germinering ble det undersøkt om kornsort og dyrkingssted påvirket det mikrobiologiske mangfoldet på kornet. Deretter ble melkesyrebakterier isolert fra spiret korn og identifisert ved hjelp av klassiske mikrobiologiske og molekylærbiologiske metoder. Det ble utført vekst- og metabolismeforsøk med melkesyrebakteriene i vørter og i blandingskulturer med ulike gjærstammer. Til slutt ble det produsert en surøl-variant der isolerte melkesyrebakterier syrnet vørteren før fermentering med ulike gjærstammer. 22

30 3. Materialer og metoder Innhenting av kornprøver. Kornprøver av sortene Fairytrale, Helium og Brage ble hentet fra fire gårder som Graminor og NMBU samarbeider med. Hagen ligger på Hamar og er nabogården til Graminors forsøksgård Bjørke. Apelsvoll ligger på Kapp, på Toten, Rød ligger i Råde og de resterende prøvene ble dyrket på Ås. Sortene Fairytale og Helium er toradsbygg, mens Brage er seksradsbygg. Alle kornprøvene ble høstet i 2016 og sendt til NMBU direkte etter innveiing og registrering Malting Kornprøvene ble støpet og spiret i kombinerte støpe- og spirekammer fra Custom Laboratory Products (Milton Keynes, England). Kamrene ble skylt i vann ved C for å unngå kontaminasjon utenfra eller fra tidligere behandlede korn før g av hver kornprøve ble støpt og spiret i separate spirekamre. Under støpingen ble kornet bløtlagt og luftet periodevis, som vist i Tabell 3. Kamrene holdt 16 C gjennom maltingen, og kornet ble snudd jevnlig. Etter 24, 48 og 72 timer ble spiregraden estimert ut fra 10 tilfeldige korn. Spiringen ble avsluttet når gjennomsnittet av kornene hadde utviklet en bladspire på 60-80% av kornets lengde. Tabell 3 Program for støping og spiring av korn i kombinert støpe- og spirekammer (Custom Laboratory Products). Alle trinnene utføres ved 16 C. Program Bløtlegging 8 Lufting 16 Bløtlegging 8 Lufting 16 Bløtlegging 2 Spiring Tid (t) a a Variasjon i spiretreghet mellom kornprøvene Mikrobiologisk analyse av kornprøver. For å undersøke den mikrobiologiske sammensetningen i de uspirede kornprøvene ble 10,0 g korn veid ut, tilsatt 90 ml Ringers løsning (Oxoid LTD, Hampshire, England) og homogenisert 23

31 i Waring-blender (Waring Commercial, Stamford, USA). Prøvene av sorten Helium ble kjørt i seks minutter ved høyeste hastighet fordi kornene var hardere å knuse mens Fairytale og Brage ble kjørt i tre minutter ved høyeste hastighet. Prøvene ble deretter fortynnet i Ringers løsning og støpt inn i ulike agarer. Utfyllende informasjon om agarene (produsent, forventet vekst og inkuberingsbetingelser) er gitt i Tabell 4. Agarene ble tilberedt i henhold til produsentens anbefalinger og oppbevart ved 4 C frem til innstøping. De spirede prøvene ble behandlet på tilsvarende måte. Alle kornprøvene ble kjørt i Warring-blenderen i tre minutter med unntak av Helium fra Apelsvoll som ble kjørt i seks minutter, alle ved høyeste hastighet. Alle innstøpinger ble gjort i to paralleller ved de ulike fortynningene. Tabell 4 Oversikt over produsenter, forventet vekst og inkuberingsbetingelser for agarene benyttet i kartleggingen av mikrober på spirede og uspirede kornprøver. Agar Produsent Vekst Inkubasjonstemp. ( C) Inkubasjonstid (døgn) Plate Count agar Oxoid LTD Totalt antall mesofile (PCA) aerobe de Man, Rogosa, Sharp-agar (MRS) a Lactobacillus ssp.-selektiv agar (LBS) Oxoid LTD Melkesyrebakterier Becton, Dickinson and Lactobacillus ssp Conpany, Frankrike CO 2-rik (10%) atmosfære Rose-Bengal agar (RB) Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland Mugg og gjær a MRS-buljong ble tilsatt 12g/l Agar (Merck KGaA) eller Bacto agar (Saween Werner AB, Limhamn, Sverige). Prøvene ble inkubert i henhold til produsentenes anbefalte inkuberingstid og avsluttet når tellbare kolonier ble synlig på skålene. Dersom skålene ikke viste tegn til vekst fikk de stå ut den anbefalte tiden. Antallet kolonidannende enheter (kde) per ml ble beregnet og kolonienes morfologi, størrelser og farger ble registrert. I hovedsak ble kun skåler med mellom 30 og 300 kde registrert, men for enkelte prøver lå antallet utenfor dette. 24

32 3.4. Isolering av melkesyrebakterier. Det ble isolert kolonier for rendyrking fra de spirede kornpeøvene. I utgangspunktet skulle det isoleres 10 kolonier fra LBS-agaren og 10 kolonier fra MRS-agaren, men på grunn av varierende vekst på LBS-agaren ble det for mange prøver kun isolert kolonier fra MRS. Antallet isolerte kolonier varierte også mellom prøvene, men minimum ti kolonier ble isolert fra hver. Koloniene ble overført til 5 ml MRS-buljong ved hjelp av en steril podeøse og inkubert ved 30 C i timer til vekst ble synlig. Deretter ble kulturen strøket ut på MRSagarskåler ved hjelp av en steril podeøse og inkubert ved 30 C i 2-4 døgn, til vekst ble registrert. Dersom det ble observert kolonier med ulik morfologi (størrelse, farge, form etc.) på skålen ble disse rendyrket ved ny poding i MRS-buljong og utstrykning på MRS-agar. De rendyrkede bakteriekulturene ble frosset ned til -80 C for oppbevaring inntil videre analyse. Før nedfrysing ble MRS-buljongkulturene tilsatt 15 % (v/v) glycerol. Forut for analyse ble kulturene oppdyrket ved at en podeskje av den frosne kulturen ble overført til 5 ml MRSbuljong ved hjelp av en steril podeskje og inkubert ved 30 C over natt Katalase-test og Gram-farging. For å undersøke om de isolerte renkulturene kunne produsere enzymet katalase ble en dråpe 3 % H2O2 lagt på et objektglass og renkultur fra agarskålen rørt ut i denne ved hjelp av en steril engangspodenål i plast. Gassdannelse som følge av reaksjon mellom katalase og H2O2 ble registrert. Fordi melkesyrebakterier ikke produserer katalase ble kun katalase-negative kulturer vurdert videre. Det ble laget preparater for Gram-farging ved å røre renkultur fra agarskålen ut i en dråpe Ringers løsning på et objektglass og lufttørke dette før preparatet ble varmefiksert ved å føre det gjennom flammen på en gassbrenner 3-4 ganger. Deretter ble preparatene farget etter Grams metode og mikroskopert med lysfelt ved 1000x forstørring med et Leica DM750 mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Gram-positive kulturer ble observert som blå-fiolette og Gram-negative som rød-rosa Genotyping. Renkulturene ble bearbeidet og sekvensert fortløpende etter rendyrking. I utgangspunktet var 70 kolonier Gram-positive og katalase-negative, men fordi mange kolonier isolert fra samme 25

33 kornprøve var fenotypisk like ble ikke alle sekvensert. Til sammen ble 39 kolonier sendt til sekvensering S-rRNA-sekvensering. En podeskje av de nedfrossede renkulturene ble podet i 5 ml MRS-buljong inkubert ved 30 C over natt. Etter påvist vekst ble 1,5 ml av kulturen overført til 1,5 ml eppendorfrør og sentrifugert ved 3500 rpm i 10 minutter i en Centrifuge 4515D (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Pelleten, som besto av bakterieceller, ble brukt til isolering av genomisk DNA. Til isoleringen ble det benyttet E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I (OMEGA bio-tek, Norcross, Georgia), med enkelte modifikasjoner av produsentens instruksjoner. Bakteriepelleten ble resuspendert i 400 µl Solution 1/RNase A og overført til FastPrep-rør sammen med 0,4 g glasskuler ( 106 µm) (Sigma-Aldrich Co. LLC., USA). Rørene ble ristet i et FastPrep -24 instrument (MB Biomedicals LLC, USA) ved 6 m/s i 20 sekunder for å knuse bakteriecellene slik at genomisk DNA ble tilgjengelig. Deretter ble rørene sentrifugert ved 3500 rpm i 2 minutter for å skille ut glasskuler og uønskede bakteriekomponenter fra det genomiske DNA. Supernatanten ble overført til eppendorf-rør og resten av isoleringen ble utført i henhold til produsentens retningslinjer (OMEGA bio-tek). Etter isolering ble konsentrasjonen av DNA i prøvene bestemt ved hjelp av NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). Prøvene ble oppbevart ved - 20 C inntil videre analyse Polymerasekjedereaksjon (PCR). Det ble utført en PCR for å amplifisere det isolerte DNAet fra de rendyrkede koloniene. En oversikt over reagenser, konsentrasjoner og volum som ble brukt i reaksjonsblandingen er gitt i Tabell 5. Tabell 5: Reagenser og konsentrasjoner i reaksjonsblanding for PCR. Volum er gitt per prøve. Reagens Konsentrasjon Volum tilsatt (µl) One Taq reaksjonsbuffer 5 10 (New England Biolabs, Ipswish, USA) dntp (New England Biolabs) 10 mm 1 Forward primer (11F) 10 mm 1 26

34 Revers primer (5R) 10 mm 1 One Taq DNA Polymerase (New England Biolabs) 1 0,25 Templat DNA Varierende a dh2o - Til 50 a Tilsatt templat DNA avhengig av konsentrasjon DNA; >200ng/µL DNA 2 µl templat; ng/µL DNA 4 µl templat; <100ng/µL DNA 5 µl templat. Reaksjonslandingen ble tilsatt primerne 11F («forward») og 5R (revers) for å amplifisere 16S rrna-genet, som er det ønskede PCR-produktet. Primerne er presentert i Tabell 6. Tabell 6: Oversikt over primerne benyttet i 16S-rRNA-sekvensering. Primer Mål Sekvens (5 3 ) 11 F 16S rdna TAA CAC ATG CAA GTC GAA CG 5 R 16S rdna GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Reaksjonsblandingen med templat DNA ble overført til PCR-rør og amplifisert i en Peltier Thermal Cycler (PTC)-200 (MJ Research Inc., Quebec, Canada) ved hjelp av PCRprogrammet gitt i Tabell 7. Tabell 7: Trinnene i PCR-programmet benyttet til amplifisering av DNA i en PTC-200 (MJ Research Inc.). Program Tid (sekunder) Temperatur ( C) Repetisjoner Innledende denaturering Denaturering Annealing Polymerisering Siste polymerisering Hold Evig 4-27

35 Agarosegelelektroforese og rensing av PCR-produkt. For å undersøke om amplifiseringen var vellykket ble det gjort en agarosegelelektroforese av PCR-produktene. Agarosegel (1%) ble laget ved å løse 0,5 gram agarose (Sea Kem LE agarose, Lonza, Rockland, USA) i 50 ml 1x TAE (Tris Acetate EDTA, Merck) ved oppvarming og 1 min koking i mikrobølgeovn. Etter nedkjøling til C ble løsningen tilsatt 2 µl Gel green nucleic acid stain (New England Biolabs) og overført til en støpeform med to brønn-kammer. Etter at gelen hadde stivnet ble 5 µl av hver prøve tilsatt 2 µl 10x Gel Loading Dye Blue (New England Biolabs) og påsatt hver sin brønn på gelen. 5 µl 1kb Ladder (New England Biolabs) ble også applisert i en brønn for å markere bånd med 0,5 kb intervall. Gelen i gelkaret ble dekket med 1x TAE-buffer og elektroforesen ble kjørt ved 90 V i omtrent 30 minutter vha en Power Pac 300 (Bio Rad, Hercules, USA). Den ble så tatt bilde av gelen under uv-lys ved hjelp av et Gel Doc XR+ System (Bio-Rad Laboratories, Inc, California). Dersom PCRen var vellykket ble det observert et tydelig bånd på 1,5 kb og PCR-produktet kunne renses for å fjerne primerne. Rensingen ble gjort ved hjelp av et NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel GmbH & Co, Tyskland) og utført etter produsentens instruksjoner Sanger-sekvensering. Etter rensing ble konsentrasjonen av DNA i prøvene bestemt ved hjelp av NanoDrop spektrofotometer. Deretter ble 1,5 2,0 µl av det rensede PCR-produktet overført til to separate eppendorfrør og tilsatt 2,0 µl primer (F-primer i et rør, og R-primer i det andre). Rørene ble tilsatt dh2o til 10 µl før de ble sendt til GATC Biotech AG i Tyskland for Sanger sekvensering. Sekvensene ble deretter bearbeidet ved hjelp av BioEdit Sequence Aligment Editor. Dårlige deler av sekvensene ble klippet bort og de to sekvensene som tilhørte samme prøve ble montert sammen. Sekvensen ble konvertert til FASTA-format og søkt opp i BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Totalsekvensering av mikrober på kornprøver. Alle de spirede og uspirede kornprøvene ble frosset ned ved -20 C etter 10 fortynning i Ringers og homogenisering i Warring-blender. Før sekvensering ble de tint ved 4 C over natt. DNA ble isolert fra alle spirede og uspirede kornprøver ved hjelp av et Mag midi kit (LGC Limited, Teddington, UK), med enkelte endringer i forhold til produsentens fremgangsmåte. Fra hver prøve ble 10 ml overført til 15 ml eppendorfrør og sentrifugert ved 8000 rpm ved 28

36 4 C i 10 minutter i en Heraeus Multifuge x3 (Thermo Scientific, Waltham, USA) før supernatanten ble helt av og pelleten vasket i 1 ml sitratvann. Løsningen ble overført til 1,5 ml eppendorfrør og sentrifugert ved rpm i 3 minutter før supernatanten ble helt av. Vaskingen ble gjentatt til sammen tre ganger. Pelleten ble så resuspendert i 200 µl lysisbuffer (20 mm Tris Cl ph 8.0, 2 mm sodium EDTA, 1.2% Triton X-100) og overført til et rør med 0,5 g glassperler ( 106 µm). Rørene ble ristet i et Fast Prep 96-isntrument (MP Biomedicals LLC, USA) i 50 sek og avkjølt på is i et minutt. Ristingen ble gjentatt til sammen tre ganger før glasskulene ble sentrifugert ned ved rpm i et minutt og 50 µl av supernatanten ble overført til en 96-brønns plate. Deretter ble isoleringen utført i henhold til produsentens manual for Mag midi kit med unntak av at 50 µl Elution buffer BLm ble benyttet i stedet for 63µL. Isolert DNA ble oppbevart ved -20 C. Alle sentrifugeringer av eppendorfrør ble utført i en Centrifuge 4515D (Eppendorf). Sekvensering av isolert DNA og databehandling ble utført av Davide Porcellato (postdoktor ved KBM, NMBU) vha PCR og en Illumina MiSeq platform (Illumina, San Diego, USA) etter metode beskrevet av Porcellato og Skeie (2016). Primerne som ble benyttet er gitt i Tabell 8. Tabell 8: Oversikt over primere benyttet i massiv parallell sekvensering av bakterier (16S rdna) og sopp (ITS rdna) på spirede og uspirede kornprøver. Primer Mål Sekvens (5 3 ) BITS b ITS rdna ACCTGCGGARGGATCA B58S3 b ITS rdna GAGATCCRTTGYTRAAAGTT Uni340F a 16S rdna CCTACGGGRBGCASCAG Bac806R a 16S rdna GGACTACYVGGGTATCTAAT a (Porcellato & Skeie 2016) b (Bokulich & Mills 2013) 3.6. Vekst- og metabolismeforsøk. På bakgrunn av teori om de isolerte bakteriene ble fire av stammene tatt med videre til innledende vekstforsøk. På grunn av lite variasjon i de isolerte stammene ble ytterligere åtte stammer innhentet eksternt. En oversikt over de innhentede bakteriestammene, de isolerte bakteriestammene og innhentede gjærstammer til bruk i vekstforsøk er gitt i Tabell 9. 29

37 Tabell 9: Oversikt over bakteriestammene benyttet i innledende vekstforsøk. Stammer isolert fra ost og soyabønner i tillegg til gjærstammer tilhører stammekolleksjonen til KBM, NMBU. Stamme Lb. plantarum 15D Lb. paracasei 448 Opprinnelse Ost Ost Lb. brevis 152 Soyabønner 1 Lb. fermentum 314 Soyabønner 1 P. pentosacceus 120 Soyabønner 1 W. confusa 76 Soyabønner 1 W. cibaria 187 Soyabønner 1 W. confusa 67 Soyabønner 1 Carnobacterium maltaromaticum 97 Korn 2 Carnobacterium maltaromaticum 101 Korn 2 Lactococcus lactis 103 Korn 2 Lactococcus lactis ssp. lactis 162 Korn 2 S. cerevisiae YJM1307 St. Bernadus Abt. 12 Magnum Edition B. bruxellensis CBS 72 Orval Trappiste 3 1 (Ng ong ola-manani et al. 2015) 2 Isolert fra spiret korn i denne oppgaven 3 (Tanderø 2016) Innledende vekstforsøk. For å undersøke stammenes evne til å vokse i vørter ble de dyrket opp i MRS-buljong over natt og podet videre (1%) i 10 ml vørter. Deretter ble ph målt etter 8, 24 og 48 timer vha et PHM 92 Lab ph-meter (Radiometer, Brønshøj, Danmark). Ut fra syreproduksjonen etter 48 timer ble fire av de tolv stammene valgt ut til videre vekstforsøk. Mengden løselig sukker i vørteren ble målt med et PR-201 refraktometer (ATAGO Inc., Tokyo, Japan) omgjort til Plato ved hjelp av omregningstabellen i Vedlegg I. Vørteren som ble brukt i innledende vekstforsøk hadde et sukkerinnhold på 18,0 Plato og var ikke tilsatt humle. 30

38 Stock-løsning. Det ble laget stock-løsninger med kjent konsentrasjon av hver av de fire bakteriekulturene. Dette ble gjort ved at bakteriene ble podet i 50 ml MRS-buljong og inkubert ved 30 C over natt inntil synlig vekst. Kulturen ble deretter sentrifugert ved 4415 g i 10 minutter i en Heraeus Multifuge x3 (Thermo Scientific) før mediet ble helt av. Pelleten ble vasket i 25 ml Ringers løsning og igjen sentrifugert ved 4415 g i 10 minutter. Pelleten ble så resuspendert i 5 ml Ringers løsning tilsatt 15 % glycerol og fordelt i eppendorfrør. Rørene ble oppbevart ved - 80 C. For å beregne konsentrasjonen av bakterier i stock-løsningene ble et rør fra hver stockløsning tint og fortynnet i Ringers løsning før innstøping i MRS-agar og inkubering ved 30 C i 3 døgn. Konsentrasjonen (kde/ml) ble beregnet på bakgrunn av vekst og fortynningsfaktor Vørtertillaging. Til vekstforsøkene ble det laget en vørter med tilsvarende oppskrift som til den planlagte ølbryggingen, men uten vørterkoking med humle; pilsnermalt (7,5 kg) ble kvernet med kvernstørrelse 0,4 mm og mesket i 40 L vann ved 67 C i 45 minutter og deretter 72 C i omtrent 30 minutter. I løpet av det andre trinnet i meskeprosessen ble det etter 15 min utført en jod-test for hvert femte minutt for å undersøke om stivelsen i vørteren var brutt ned. Et par dråper vørter ble tilsatt et par dråper jodløsning og fargeomslag til mørk blå indikerte resterende stivelse i vørteren. Når testen ikke ga utslag på stivelse ble temperaturen økt til 78 C i to minutter før vørteren ble overført til silkaret og sirkulert gjennom silen i omtrent 15 minutter for å fjerne partikler. Deretter ble vørteren overført tilbake til kokekaret og kokt opp. Etter siling var Plato i vørteren 8,4, noe som var lavere enn planlagt og masken (maltrestene) ble derfor ikke skylt ytterligere. I tillegg ble vørteren kokt inn i omtrent en time, til en Plato på 10,1. Vørteren ble overført til blåtoppflasker (2 L) og oppbevart på kjølerom til neste dag, før den ble frosset ned ved -20 C. Etter behov ble flaskene tint ved 4 C i omtrent 48 timer og deretter autoklavert. 31

39 Vekstforsøk i vørter. Det ble utført vekst- og metabolisme-forsøk i vørter av 4 melkesyrebakterier og 2 gjærstammer, i tillegg til blandingskulturer av disse. Forsøkene ble utført i tre gjentak og på følgende åtte kulturer; Renkulturer: 1. Lb. plantarum 15D 2. Lb. brevis C. maltaromaticum Lc. lactis subsp lactis S. cerevisiae St. Bernadus-P2 6. B. bruxellensis Orvall-P1 Blandingskulturer: 7. S. cerevisiae St. Bernadus-P2, Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis B. bruxellensis Orvall-P1, Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis 162 Gjærstammene ble dyrket opp i vørter ved romtemperatur under lett risting i tre døgn før konsentrasjonen ble beregnet ved celletelling i Bürker tellekammer. Melkesyrebakteriene ble podet direkte fra nedfrossede stockkulturer med kjent konsentrasjon. Vekstforsøkene ble utført ved at stockløsning med melkesyrebakterier og/eller starterkultur av gjær ble podet i 250 ml vørter til en konsentrasjon på omtrent 10 6 kde/ml av hver organisme og fordelt på fire 40 ml sterile sovirell-flasker og fire sterile headspace prøveglass til CO2- måling. CO2-rørene ble forseglet med septa med aluminiumring (20-CBT3 septa, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) Utfyllende informasjon om podevolum og konsentrasjoner av stockløsninger og starterkulturer er gitt i Vedlegg II. Prøvene ble inkubert ved 22 C og uttak ble gjort etter 0, 24, 48 og 96 timer for syrekulturene og 0, 48, 96 og 168 timer for gjærkulturene og blandingskulturene. Podingen ble utført med minutters intervaller for å minimere variasjon i inkubasjonstiden mellom prøvene. For uttaket på 24 timer ble kun celletall og ph undersøkt før resten av prøven ble frosset ned ved -20 C. Ved de 32

40 resterende uttakene ble i tillegg innholdet av CO2, organiske syrer og flyktige komponenter målt kvantitativt Måling av CO2. Kvantitativ analyse av CO2 i prøvene ble målt ved hjelp av en CO2-analysator (ADC 225 MK3, Analytical Development, Hoddeson, England). Prøvene ble opparbeidet ved at 10 ml syrekultur eller 2 ml gjærkultur ble overført til sterile headspace prøveglass (Machery Nagel, Dueren, Tyskland) og forseglet med septa med aluminiumring (20-CBT3 septa). Prøvene ble ristet for hånd i 2 minutter før 0,5 ml, 0,1 ml eller 0,05 ml av gassfasen ble injisert i apparatet ved hjelp av en engangssprøyte. Volumet som ble injisert var avhengig av mengden gassdannelse i prøvene. Alle målinger ble utført i to paralleller. Apparatet ble nullstilt etter behov og injisert med 0,5 ml standardgass av nitrogen og 10 % CO2 i to paralleller før hvert uttak for å bekrefte apparatets stabilitet. Kalibrering ble utført av Tanderø (2016) og kalibreringskurve er presentert i Vedlegg V. Alle målinger ble omregnet til g/l ved hjelp av vedlagt kalibreringskurve Celletall. Celletall av melkesyrebakterier ble bestemt etter fortynning i Ringers løsning og innstøping i MRS-agar. Renkulturer av gjær ble innstøpt i RB-agar mens blandingskulturene ble støpt inn i både MRS- og RB-agar. MRS- og RB-agarskåler ble inkubert ved henholdsvis 30 o C i 3 døgn og 25 o C i 4-5 døgn. Celletall ble beregnet og angitt som kde/ml som nevnt tidligere, men konsentrasjonen av melkesyrebakterier i blandingskulturene ble beregnet ved å trekke celletallet på RB-agarskåler fra celletallet på MRS-agarskåler HSGC. Flyktige forbindelser i prøvene ble analysert ved bruk av headspace gasskromatografi (HSGC) etter en metode beskrevet av Grønnevik et al. (2011) med noen modifikasjoner. Prøvene ble opparbeidet ved at 10,00 g prøvemateriale ble veid inn i headspace -flasker og forseglet med teflonbelagt septa med aluminiumring (PTFA/Si septa, Agilent Technologies) Prøvene som inneholdt gjær ble filtrert gjennom et foldefilter (597 ½ folded filter ø125, GE Healthcare Life Sciences Whatman, Buckingshamshire, UK) for å fjerne akkumulert CO2 før utveiing. 33

41 Filtreringen ble gjort ved 4 C i omtrent 15 minutter. Gjærprøvene til etanolmåling ble etter 48, 96 og 168 timer fortynnet 100 i MilliQ-vann før forsegling. Headspaceflaskene ble frosset ned ved -20 C for oppbevaring og tint ved 4 C over natt før analyse. Prøvene ble plassert i en Agilent Technologies 7679A automatisk headspace sampler med et 6890 GC system og en flamme ioniseringsdetektor (Agilent Technologies). Programvaren som ble benyttet var Open LAB EZChrom (Agilent Technologies). Som bæregass ble det benyttet helium 6.0 (Aga, Norge) med en strøm på 5.0 ml/min. Headspace - badtemperatur var 50 C, manifoldtemperatur var 60 C. Ekvilibreringstiden var på 45 minutter, og prøvene ble mikset under oppvarming med 70 omristninger/min. Headspace -flaskene var trykksatt til 10 PSI før injeksjon, og injeksjonstiden var på 0.5 minutt. En CP-SIL 5CB GC kolonne (Varian, Middelburg, Nederland) ble benyttet for separering av komponentene. Kolonnen hadde en lengde på 25 meter, med indre diameter på 0,53 mm og filmtykkelse på 5,0 μm. Det ble benyttet følgende temperaturprogram under analysen: 35 C, 5 min; økning med 10 C min -1 til 40 C, 2 min; økning med 15 C min -1 til 70 C, 2 min; økning med 30 C min -1 til 130 C, 4 min; økning med 30 C min -1 til 160 C, 4 min; økning med 10 C min -1 til 180 C, 2 min; økning med 10 C min -1 til 200 C, 2 min. De flyktige komponentene ble separert basert på komponentenes ulike flyktighetsgrad og affinitet til kolonnens stasjonære fase. Identifisering og kvantifisering av de ulike forbindelsene ble gjennomført ved kalibrering med standardløsninger med kjent konsentrasjon av følgende komponenter: acetaldehyde, diacetyl, ethylacetate, 2-butanon, 2-hexanol, 2-methyl-butanal, 2- methyl-1-butanol, 2-methyl-1-propanal, 3-methyl-butanal, 3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1- propanol, isobutyl acetate, hexanal, isoamyl acetate, ethyl hexanoate, 3-carene, R-(+)- limonene, ethyl heptanoate, ethyl octanoate, β-citronellol, ethyl nonanoate, ethyl decanoate, phenylethyl alcohol (Sigma-Aldrich), acetoin, aceton, etanol, 1-butanol, 1-propanol, 2- butanol, dimetylsulfide, og 2.3-pentadion (Merck, Tyskland). 34

42 HPLC. De organiske syrene i prøvene ble undersøkt vha high-performance liquid chromatography (HPLC). Analysen ble gjennomført etter en metode beskrevet av Grønnevik et al. (2011) med noen modifikasjoner. Vørterprøvene ble godt blandet før 1,00 g ble veid inn i et 10 ml rør. Prøvene ble tilsatt 2,5 ml ionebyttet vann, 200 l 0,5 M H2SO4 (Merck, Tyskland) og 8 ml acetonitril (Merck). Etter tilsetning av acetonitril ble prøvene ristet for hånd, deretter satt i en MultiRS-60 BIOSAN vendemaskin (Montebello Diagnostics A/S, Oslo, Norge) i 30 min. Prøvene ble sentrifugert i romtemperatur, 15 minutter ved 1470 x g (3400 rpm) i en Kubota 2010 sentrifuge (Kubota Corporation, Tokyo, Japan). Supernatanten ble deretter filtrert med 0,2 m PTFE Membran (Acrodisc CR 13 mm Syringe Filter, PALL, Storbritannia) over i et HPLC-rør (VWR, USA). 25 μl av prøven ble injisert i HPLC-intrumentet. Prøvene ble separert ved hjelp av en Aminex HPX-87H kolonne (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) oppvarmet til 32 C. For beskyttelse av kolonnen ble prøvene først kjørt gjennom en forkolonne av typen Cation-H refill (Bio Rad Laboratories). Kolonnen var koblet til en Perkin Elmer serie 200 pumpesystem (Perkin Elmer, Waltham, MA), en Perkin Elmer Series 200 autosampler (Perkin Elmer) og en Perkin Elmer LC 101 kolonneovn (Perkin Elmer). Den mobile fasen som ble benyttet var 5 mm H2SO4 (Merck), med en hastighet på 0,4 ml/min. Standardløsninger for kalibrering ble preparert på samme måte som prøvene som ble analysert, og komponentene i prøvene ble identifisert og kvantifisert på bakgrunn av retensjonstid sammenlignet med standardløsningene. Karbohydrater benyttet til standardløsning var laktose, glukose og fruktose (Merck) og av organiske syrer ble ravsyre, melkesyre, eddiksyre (Sigma- Aldrich) benyttet til standardløsninger. Karbohydratene og eddiksyre ble detektert ved hjelp av en Perkin Elmer Serie 200 RI-detektor (Perkin Elmer), mens organiske syrer ble detektert ved hjelp av en Perkin Elmer Serie 200 UV/VIS-detektor (Perkin Elmer). 35

43 3.7. Ølbrygging. Ølbryggingen ble utført etter tilsvarende oppskrift som vørterkokingen til vekstforsøkene, men med humletilsats: Malt Mesking 11,5 kg Pilsnermalt 65 C 45 minutter 78 C 2 minutter Koking Humletilsetting 70 minutter 31,6 gram Fuggles humle 60 minutter Omtrent 48 liter vann ble varmet til meskingstemperatur i det koniske kokekaret og tilsatt 11.5 kg pilsnermalt kvernet til en størrelse på 0,4 cm. Etter første trinn i meskeprosessen (45 min.) ble det utført en jod-test, som for alle gjentakene gav negativt utslag, og utmesking ved 78 C satt i gang. Etter mesking ble vørter med kornrester overført til silkaret og sirkulert gjennom silen i 15 minutter før vørteren fikk sige tilbake i kokekaret uten bruk av pumpe. Når væskenivået i karene var like høyt ble resten av vørteren pumpet over. Deretter ble masken skylt med vann på C før dette også ble pumpet over i vørteren. Underveis ble sukkerinnholdet i Plato beregnet som nevnt tidligere og masken ble skylt til vørteren hadde et sukkerinnhold på mellom 8 og 9 P, altså noe lavere enn ønsket sluttverdi. Deretter ble vørteren varmet til kokepunktet og kokt i 70 minutter uten lokk. Etter 10 minutter ble 31,6 g Fuggles humle-pellets tilsatt, slik at den kokte med vørteren i 60 minutter. Mengden humle som ble tilsatt ble beregnet på bakgrunn av α-syre-innholdet og ønsket bitterhet (IBU) i vørteren, som vist i Vedlegg III. Etter koking var sukkerinnholdet i vørteren noe høyere enn tilsiktet og den ble justert ned ved å tilsette vann ved C for å unngå kontaminasjon. Deretter ble vørteren pumpet ut fra karet like overfor den koniske delen og inn igjen omtrent midt på karet. På den måten ble det laget en whirlpooleffekt som gjorde at partikler samlet seg i den koniske bunnen. Deretter ble vørteren pumpet gjennom et filter og nedkjølt til C i en platekjøler før fordeling på to gjæringskar i plast og to i glass. Beholderne var på forhånd desinfisert med Star San HD (Five star chemicals and supplies inc, Commerse city, USA). Glassballongene ble tilsatt omtrent

44 kde/ml av bakteriene Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis 162. Et plastkar ble tilsatt 10 6 celler/ml S. cerevisiae P2 (heretter omtalt som S) og det andre 10 6 celler/ml B. bruxellensis P1 (heretter omtalt som B). Gjærstarter ble laget ved å pode 1% gjærceller i vørter og inkubere under lett risting i romtemperatur i 3-4 dager. Konsentrasjonen av gjærceller i starterkulturene ble beregnet ved hjelp av Bürker tellekammer. Etter et døgn ble gjæringskarene med melkesyrebakterier overført til plastkar og ph ble målt jevnlig i opp til 66 timer. Når ph hadde sunket til <5 ble vørteren podet med 10 6 celler/ml gjærkultur, S. cerevisiae P2 i et kar (heretter omtalt som SL) og B. bruxellensis P1 i det andre (heretter omtalt som BL). Gjæringskarene ble oppbevart ved romtemperatur gjennom hele prosessen. På grunn av treg nedgang i ph ble gjæringskarene med syrekultur fra det første gjentaket podet med ytterligere syrekultur etter 24 timer. Dette ga en endelig konsentrasjon på 3, kde/ml Lb. plantarum 15D, 1, kde/ml Lb. brevis 152 og 1, kde/ml Lc. lactis ssp. lactis 162. De to andre gjentakene ble derfor podet med samme cellekonsentrajson direkte etter brygging. Utfyllende informasjon om volum og konsentrasjoner av podemateriale, i tillegg til podetidspunkt, batchstørrelser og Plato i vørterne er gitt i Vedlegg IV. Primærfermenteringen ble fulgt opp ved ukentlige målinger av Plato i dager, frem til sukkerinnholdet var stabilt på 5,2-6,2. Deretter ble bryggene overført til tappekar desinfisert med Star San HB (Five star chemicals and supplies inc) og tilført 5 g rørsukker per liter øl før det ble tappet på desinfiserte flasker. Ølet ble sekundærfermentert ved romtemperatur i to uker og modnet ved 4 C i en uke før videre analyse. Etter en uke ved 4 C ble hvert brygg, 12 til sammen, analysert for innhold av flyktige komponenter, organiske syrer og karbohydrater. Til HPLC ble 1,00 gram øl ble veid ut og tilsatt reagenser på samme måte som i vekstforsøk. Til HSGC ble 10,00 gram øl veid ut etter filtrering gjennom et foldefilter (597 ½ folded filter ø125, GE Healthcare Life Sciences Whatman) og frosset ned ved -20 C. Etter tining ved 4 C over natt ble prøvene analysert på samme måte som i vekstforsøk. 37

45 To flasker fra hvert brygg ble temperert i vann ved omtrent 20 C i minimum en time og analysert i et Anton Paar PBA-B Generation M Packaged Beverage Analyzer-apparat (Anton Paar, Graz, Østerrike). ph ble målt separat ved hjelp av et PHM 92 Lab ph-meter (Radiometer). I tillegg ble det utført en enkel sensorisk vurdering av alle de 12 bryggene for å avdekke likheter og ulikheter mellom ølsortene og eventuelle ulikheter mellom gjentakene innen hver ølsort. 4. Resultater Mikrobiologisk analyse av kornprøver. Det ble utført en kvantitativ analyse av cellevekst på de 12 kornprøvene før og etter germinering. Resultatet fra analysen er presentert i Tabell 10. Tabell 10: Cellevekst (log kde/ml) på kornprøver av tre ulike byggsorter dyrket på fire steder i Norge. PCA, totalt antall mesofile aerobe; MRS, celletall på MRS-agar; LBS, Lactobacillus selektiv agar celletall; RB, Rose Bengal-agar celletall. Dyrkingssted Kornsort Uspiret (log kde/ml) PCA MRS LBS RB Spiret (log kde/ml) Uspiret (log kde/ml) Spiret (log kde/ml) Uspiret (log kde/ml) Spiret (log kde/ml) Uspiret (log kde/ml) Spiret (log kde/ml) Ås Fairytale a Helium a Brage a Hagen Fairytale a Helium a 5.43 a Brage a Rød Fairytale a 4.38 a Helium a 4.88 a Brage a 4.83 a Apelsvoll Fairytale a Helium a Brage a a Agarskålene domineres av mugg eller gjær. 38

46 Tabellen viser at det totale antallet mesofile aerobe på uspirede kornprøver lå mellom 5,48 og 7,48 log kde/ml. Det ble benyttet for lave fortynninger av en del prøver noe som medførte overvokste skåler ved den høyeste fortynningen benyttet, rapportert som 5,48 og 7,48 log kde/ml. Uspirede kornprøver ble dominert av luftbakterier som ga særegne gule og hvite kolonier på PCA-agar. Etter spiring lå totaltallet på 7,79 til 8,56 log kde/ml, altså hadde det steget med 0,7-2 log i kornprøvene med tellbare celletall. Det var stor variasjon i utseendet til koloniene på PCA-agarskålene med spiret korn. Her ble det registrert noe vekst av gjær og enkelte EPS-produserende kolonier men også mange små og mellomstore kremfargede kolonier. Det vokste i hovedsak mugg og gjær på MRS-agarskålene med uspirede kornprøver. Celletallet på skålene varierte mellom 2,78 og 5,48 log kde/ml før spiring og steg med 1-3 log etter spiring, med unntak av kornprøven Fairytale fra Rød som hadde omtrent samme celletall før og etter spiring. Det ble registrert noe mugg på alle MRS-agarsålene, men muggveksten var vesentlig lavere etter spiring. Spiret korn fra Rød hadde generelt mindre cellevekst enn korn høstet andre steder (4,38-4,88 log kde/ml) selv om celletallet før spiring var omtrent likt. De øvrige spirede kornprøvene hadde celletall mellom 5,43 og 6,32 log kde/ml, med unntak av Fairytale fra Apelsvoll (4,38 log kde/ml). Det ble registrert lite eller ingen vekst på LBS-agarskålene, både for spiret og uspiret korn, med unntak av spiret korn av sorten Helium fra Ås og Fairytale fra Hagen. Spirede kornprøver av sorten Helium fra Ås og Fairytale fra Hagen hadde hhv. 5,32 og 6,26 log kde/ml. Øvrige kornprøver gav ingen vekst ved utplating av laveste fortynning benyttet ( 1 og 2) eller vekst av enkelte kolonier. På RB-agarskålene var det stor variasjon mellom kornprøvene. Uspiret korn hadde celletall på 2,54 til 5,48 log kde/ml mens spiret korn hadde celletall fra 4,30 til 7,23 log kde/ml. Økningen i presumptivt gjær og mugg som følge av spiring varierte fra ingen til 3,38 log kde/ml. På agarskåler fra spirede kornprøvene ble det registrert mye vekst av presumptivt gjær i tillegg til noe mugg. 39

47 Spiregrad i kornprøver etter germinering. De 12 kornprøvene ble germinert i timer avhengig av hvor raskt de spiret. Åtte av kornprøvene ble spiret i 50 timer, mens de øvrige fire prøvene ble spiret i 72 timer. Spiregraden til hver prøve ble vurdert ut fra et gjennomsnitt av ti tilfeldige korn, som vist i Figur 12. Alle kornprøvene inneholdt % korn som ikke hadde begynt å spire når maltingen ble avsluttet, disse ble ikke inkludert i beregningen av spiregrad. Den gjennomsnittlige spiregraden var lavest i korn av sorten Fairytale fra Rød og Helium fra Apelsvoll (50 og 60 %) og høyest i korn av sorten Brage fra Apelsvoll og Fairytale fra Ås (91 % og over kornets lengde). Øvrige kornprøver hadde en spiregrad mellom 65 og 75 %. Figur 12: Eksempel på vurdering av spiregrad med ti tilfeldige korn hentet fra spirede kornprøver av sorten Helium (øverst) og Brage (nederst) dyrket på Apelsvoll. Skallet er fjernet for å vise lengden av bladspiren i forhold til kornets lengde. Spiregrad ble vurdert til hhv. 60 og 91 % Rendyrking og identifisering av melkesyrebakterier. Tabell 11 viser resultater fra isoleringen av MSB på spiret korn fra LBS og MRS agar. I tillegg til antallet kolonier som ble plukket fra agarskålene er antallet rendyrkede kolonier og antallet katalase-negative og Gram+ kolonier fra hver kornprøve presentert. MRS-agarskålene med korn dyrket på Rød og Helium fra Hagen var overvokst av mugg, gjær eller EPS-produserende kolonier og det ble derfor plukket færre kolonier fra disse kornprøverne. Mange av koloniene som ble plukket og rendyrket gav også opphav til flere kolonier med ulike morfologiske egenskaper, noe som forklarer differansen mellom antallet isolerte og rendyrkede kolonier. Tabellen viser at kornprøvene som gav vekst på LBS-agar gav flere G+ og katalase-negative kolonier. 40

48 Tabell 11: Antallet isolerte og rendyrkede kolonier, samt katalase-negative og Gram+ kolonier isolert fra spiret korn av ulike byggsorter dyrket på forskjellige steder i Norge. Dyrkingssted Kornsort Antall isolerte kolonier Antall renkulturer Antall kat- og G+ kolonier LBS-agar MRS-agar LBS- og MRS-agar LBS- og MRS-agar ÅS Fairytale Helium b 22 Brage - a Hagen Fairytale b 28 Helium b 4 Brage Rød Fairytale Helium Brage Apelsvoll Fairytale Helium Brage a - ingen isolerte kolonier. b Høyere antall pga. flere kolonityper ved rendyrking. Til sammen ble 223 kolonier isolert og 33 av disse vokste ikke i MRS-buljong etter isolering. Totalt 70 kolonier ble registrert som G+ og katalase-negative og frosset ned (-80 C) for oppbevaring Leuconostoc* Leuconostoc Carnobacterium Enterobacter Lactococcus Enterococcus Figur 13: Oversikt over fordeling (%) av bakterieslekter isolert fra norsk bygg. Identifikasjon ble basert på 16S-rRNA-sekvensering og morfologi ved mikroskopering (Leuconostoc*). n=70 Totalt ble 36 kolonier sendt til 16S-rRNA-sekvensering. Av disse ble 23 kolonier identifisert som Leuconostoc, 6 som Carnobacterium, 4 som Enterobacter, 2 som Lactococcus og 1 som Enterococcus. I tillegg ble til sammen 34 isolerte kolonier identifisert som presumptivt 41

49 Leuconostoc på bakgrunn av morfologi ved mikroskopering (Figur 13). Rådata fra identifiseringen er gitt i Vedlegg VI, og et sammendrag er presentert i Tabell 12. Tabellen viser at Leuconostoc ble isolert fra fem av kornprøvene, uavhengig av sort og dyrkingssted. Ulike arter av slekten Enterobacter ble isolert fra sorten Helium fra Hagen, mens en koloni av slekten Enterococcus ble isolert fra Fairytale dyrket på Ås. To kolonier av Lactococcus ble isolert fra ulike sorter og steder, mens seks kolonier av C. maltaromaticum ble isolert fra Brage dyrket på Hagen. Tabell 12: Resultat fra identifikasjon av melkesyrebakterier isolert fra spirede kornprøver av ulike byggsorter høstet på forskjellige steder i Norge. Identifikasjon ble gjort på bakgrunn av 16S-rRNAsekvensering og fenotypisk identifisering ved mikroskopering. Dyrkingssted Kornsort Identifikasjon Fairytale 2 Leuconostoc citreum /holzapfelii ÅS Helium 5 Leu. citreum /holzapfelii 17 Leuconostoc a Brage - Fairytale 12 Leu. citreum /holzapfelii 16 Leuconostoc a 2 Enterobacter 1 Enterobacter asburiae / canserogenus / Helium aerogenes Hagen 1 Enterobacter enterobacteriace 1 Leu. citreum /holzapfelii Brage 3 Leuconostoc pseudomesenteroides 1 Lc. lactis 6 Carnobacterium maltaromaticum Fairytale - Rød Helium - Brage - Fairytale 1 Enterococcus Apelsvoll Helium 1 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 Leuconostoc a Brage - a Identifisert på bakgrunn av morfologi ved mikroskopering Totalsekvenseing av mikrober. Mikrobene på uspirede og spirede kornprøver ble gruppert og identifisert ved hjelp av totalsekvensering. Grupper av bakterier og sopp oppgis som OTUer ( operational taxanomic units ). Mange OTUer ble identifisert på slekts- og arts-nivå, men i denne oppgaven vil gruppene vurderes som familier og ordener. Figur 14 viser det totale antallet OTUer av 42

50 bakterier og sopp som ble isolert fra de 12 spirede og 12 uspirede kornprøvene. Figuren viser at antallet bakteriegrupper ikke endrer seg som følge av at kornet spirer. Derimot var det større variasjon mellom kornprøvene i forhold til grupper av sopp. Selv om medianen og høyeste måling av UTO var omtrent lik var laveste måling vesentlig lavere for de spirede prøvene. Rådata fra totalsekvenseringen er presentert i Vedlegg IX. Boxplot of Bakterier; Fungi Bakterier Spiret Fungi Uspiret Spiret Uspiret Figur 14: Antallet OTUer gruppert som bakterier og sopp etter totalsekvensering av DNA fra 12 uspirede og 12 spirede kornprøver av norsk bygg. innenfor rektangelet ligger 50 % av dataene der medianen i datasettet er vist som horisontal linje. Stjerner representerer avvik, og vertikale linjer høyeste og laveste måling ekskludert avvik. Mangfoldet av bakterie- og sopp-grupper i kornprøvene ble beregnet vha Shannon diversitets indeks (Figur 15). Mangfoldet av ulike bakteriegrupper stiger ved spiring av kornet, mens antallet grupper av sopp forblir det samme etter spiring. Figur 15: Shannon diversitets indekser for spirede og uspirede kornprøver av norsk bygg. Indeksen viser mangfoldet av bakteriegrupper (venstre) og sopp-grupper (høyre) på kornprøvene. Innenfor rektangelet ligger 50 % av målingene der medianen i dataene er vist som horisontal linje. Sirkler representerer avvik, og vertikale linjer høyeste og laveste måling ekskludert avvik. 43

51 Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Sopp. Sammensetningen av mikrobielle samfunn med hensyn til sopp i kornprøvene ble karakterisert ved bruk av massiv parallell sekvensering av ITS rdna-genet. Det ble registrert til sammen 103 familier av sopp, der 14 av familiene utgjorde 5 % av OTUene i minimum en prøve. De 15 sopp-familiene utgjorde 95 % av det totale antallet OTUer. Fordelingen av familiene er vist i Figur 16, som en prosentandel av antallet OTUer i kornprøvene. Flere av funnene er ikke tildelt familie, men ble registrert som incertae sedis, dvs. usikker plassering. 100% Uspiret korn 100% Spiret korn 90% 90% 80% 80% 70% 70% 60% 60% 50% 50% 40% 40% 30% 30% 20% 20% 10% 10% 0% 0% Ås Hagen Rød Apelsvoll Xylariales_fam_Incertae_sedis Tremellales_fam_Incertae_sedis Sporidiobolales_fam_Incertae_sedis Pleosporaceae Phaeosphaeriaceae Nectriaceae Meruliaceae Malasseziaceae Leucosporidiaceae_fam_Incertae_sedis Hypocreales_fam_Incertae_sedis Filobasidiaceae Davidiellaceae Cystofilobasidiaceae Ås Hagen Rød Apelsvoll Tremellales_fam_Incertae_sedis Sporidiobolales_fam_Incertae_sedis Pleosporaceae Phaeosphaeriaceae Nectriaceae Meruliaceae Malasseziaceae Hypocreales_fam_Incertae_sedis Filobasidiaceae Dothioraceae Cystofilobasidiaceae Figur 16: Relativ fordeling av de 14 sopp-familiene med høyest forekomst i uspirede og spirede kornprøver av tre byggsorter høstet på fire dyrkingssteder. 44

52 Totalt sett utgjorde en familie innen ordenen Tremellales % av OTUene, både i spirede og uspirede kornprøver fra dyrkingssted Hagen, Rød og Apelsvoll. Prøvene fra Ås ble i stedet dominert av Pleosporaceae (42-44 % av OTUene for Fairytale og Helium) og Phaeosphaeriaceae (11-38 %) etter spiring og Pleosporaceae (3-34 %) i tillegg til en familie i ordenen Hypocreales (46 % av OTUene fra sorten Brage) før spiring. Davidiellaceae er tilstede i alle kornprøvene før spiring (2-20 %), men ikke etter spiring. Det samme gjelder for en familie innen Xylariales. Phaeosphaeriaceae øker generelt noe under spiring. Filobasidiaceae var tilstede på prøvene fra Apelsvoll før spiring men ikke i like stor grad etter. Cystofilobasidiaceae var tilstede i nesten alle prøvene, men utpeker seg i spiret korn av sorten Fairytale dyrket på Rød (30%). Dothioraceae var kun tilstede i spirede kornprøver og spesielt i sortene Helium og Brage fra Rød og Fairytale fra Apelsvoll Bakterier. Sammensetningen av mikrobielle samfunn med hensyn til bakterier i kornprøvene ble karakterisert ved bruk av massiv parallell sekvensering av 16S rrna genet. Kornprøvene inneholdt 72 bakterie-familier, der 12 stk representerte 5% av OTUene i minimum en prøve. De 12 familiene utgjorde til sammen 90 % av alle OTUer og fordelingen av disse i kornprøvene er gitt i Figur 17. I tillegg ble 8 OTUer (0,93% av totalt antall sekvenser) ikke koblet til en bakteriologisk gruppe og ble betegnet som unassigned. 45

53 Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage Fairytale Helium Brage 100% Uspiret korn 100% Spiret korn 90% 90% 80% 80% 70% 70% 60% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Ås Hagen Rød Apelsvoll Enterobacteriaceae Flavobacteriaceae Paenibacillaceae Pseudomonadaceae Rhizobiaceae Sphingobacteriaceae Sphingomonadaceae Streptococcaceae Ås Hagen Rød Apelsvoll Comamonadaceae Enterobacteriaceae Flavobacteriaceae Microbacteriaceae Moraxellaceae Oxalobacteraceae Pseudomonadaceae Rhizobiaceae Sphingobacteriaceae Sphingomonadaceae Streptococcaceae Figur 17: Relativ fordeling av de 12 bakterie-familiene med høyest forekomst i uspirede og spirede kornprøver av tre byggsorter høstet ved fire dyrkingssteder. Figuren viser at færre av de 12 familiene var tilstede på uspiret korn i forhold til spiret korn, med 8 familier. Familiene Comaminadaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae og Oxalobacteriaceae forekom kun på spiret korn. Ingen av disse familiene utgjorde en stor andel av OTUene, med unntak av prøven Fairytale fra Hagen der Comamonadaceae utgjorde 33 %. Uspirede kornprøver inneholdt mye Enterobacteriaceae (16-50 %), mens konsentrasjonen var lavere i spirede prøver (3-20 %). Paenibacillaceae var tilstede kun på uspiret korn, men i varierende konsentrasjoner (1-22 %). Rhizobiaceae, Sphingobacteriaceae, Sphingomonadaceae og Streptococcaceae var tilstede i varierende grad på spiret og uspiret korn, med unntak av Streptococcaceae på uspiret korn av Brage fra Apelsvoll (47 %). 46

54 ph 4.4. Vekst- og metabolismeforsøk. Resultater fra alle forsøk, med unntak av innledende vekstforsøk er presentert som gjennomsnitt av tre gjentak. Vekstforsøk ble utført ved inkubasjon av MSB og gjærkulturer i vørter ved 22 C i hhv. 96 og 168 timer. Rådata fra vekst- og metabolismeforsøkene er samlet i Vedlegg VII Innledende vekstforsøk. En oversikt over ph-målinger fra innledende vekstforsøk er vist i Figur 18. Figuren viser at alle de 12 stammene vokste i vørter, men at syreproduksjonen varierte. Laktokokkene og Lb. plantarum 15D senket ph til henholdsvis 3,86, 3,87 og 3,49 etter 48 timer. Lactobacillus casei/paracasei 448 og Lb. brevis 152 endte på en lavere ph etter 48 timer (3,59 og 3,78) men nedgangen var ikke like rask som hos laktokokkene. Begge stammene med Carnobacterium endte på ph 4,58 etter 48 timer. De øvrige artene; Lb. fermentum 314, P. pentosaceus 120, W. confusa 67 og W. cibaria 187 var omtrent like gode syreprodusenter og endte på ph mellom 3,87 og 3, Tid etter poding (t) Lb. plantarum 15D Lb.casei/paracasei 448 Lb. brevis 152 Lb. fermentum 314 P. pentosaceus 120 W. confusa 76 W. cibaria 187 W. confusa 67 C. maltaromaticum 101 C. maltaromaticum 97 Lc. lactis 103 Lc. lactis sp lactis 162 Figur 18: ph-målinger over 48 timer fra innledende vekstforsøk med MSB inkubert i vørter ved 22 C. Bakteriestamme 1-8 er hentet fra KBMs stammekolleksjon og 9-12 isolert fra norsk bygg ph i vekstforsøk. Fire av MSB-stammene fra innledende vekstforsøk ble valgt ut til hovedforsøket av vekst og metabolisme. Resultater fra ph-målinger av renkulturer og blandingskulturer med MSB og gjærstammer i vørter er presentert i Figur 19. Målingene av ph-nedgang hos melkesyrekulturene etter 48 timer gjenspeiler resultatene fra det innledende vekstforsøket, men 47

55 ph ph synker ytterligere fra 48 til 96 timer. Etter 96 timer endte ph på 3,28, 3,34, 3,64 og 4,10 for hhv. Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152, Lc. lactis ssp. lactis 162 og C. maltaromaticum 101. Renkulturen med S. cerevisiae P2 stabiliserte seg på 4,30 mens B. bruxellensis P1 endte på ph 4,47 etter 168 timer Tid etter poding (t) Lb. plantarum 15D Lb. brevis 152 C. maltaromaticum 101 L. lactis sp lactis 162 S. cerevisiae P2 B. bruxellensis P1 S. cerevisiae P2 + MSB B. bruxellensis P1 + MSB Figur 19: ph-målinger fra vekstforsøk med renkulturer og blandingskulturer av MSB og gjærstammer inkubert i vørter ved 22. MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis Cellevekst i vekstforsøk. Celletall av MSB og gjær i vekstforsøk er vist i Figur 20 og Figur 21. Figur 20 viser celleveksten av renkulturer av MSB. Det kommer frem av figuren at podevolumet varierte fra 6,0 til 6,6 log kde/ml mellom bakteriestammene til tross for forsøk på lik poding, men at alle vokste raskt og nådde stasjonær fase allerede etter 24 timer. Etter 96 timer lå celletallene i området 8,38-8,52 log kde/ml for Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis 162, mens C. maltaromaticum 101 hadde et celletall på 7,87 log kde/ml. 48

56 Vekst (log kde /ml) Vekst (log kde/ml) Tid (t) Lb. plantarum 15D Lb. brevis 152 C. maltaromaticum 101 L. lactis sp lactis 162 Figur 20: Vekst av MSB gjennom fermentering i vørter ved 22 C. Figur 21 viser cellevekst av renkultur av S. cerevisiae P2 og blandingskulturer med MSB og gjær, henholdsvis S. cerevisiae P2 og B. bruxellensis P1. Heltrukne linjer representerer celletall av MSB i log kde/ml, mens stiplede linjer representerer celletall av gjærstammen S. cerevisiae P2 i renkultur og blandingskultur. Celletall av B. bruxellensis P1 er ikke registrert da gjærstammen ikke vokste Rose Bengal agar. Figuren viser at gjær og bakterier vokste omtrent like raskt og var kommet opp i 7,4 log kde/ml for gjær og 8,00-8,27 log kde/ml for MSB etter 48 timer. Celletall for gjær lå mellom 0,42 og 1,13 log lavere enn celletall for bakterier fra 48 til 168 timer. Celletallet av MSB var omtrent det samme i begge blandingskulturene, med 8,08-8,35 log kde/ml fra 48 til 168 timer S. cerevisiae P2 Tid (t) S. cerevisiae P2 + MSB S. cerevisiae P2 + MSB B. bruxellensis P1 + MSB Figur 21: Vekst av gjær og MSB i renkulturer av gjær og blandingskulturer med gjær og MSB gjennom fermentering i vørter ved 22 C. Heltrukne linjer=msb; stiplede linjer=s. cerevisiae P2. Vertikale linjer viser standardavvik. MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. 49

57 CO2 (g/l) CO2 (g/l) CO2-produksjon i vekstforsøk. Mengden CO2 produsert av bakterie- og gjærstammene over tid er presentert i Figur 22. Figuren viser at Lb. brevis 152 produserte 2,14 g/l CO2 mens Lb. plantarum 15D og C. maltaromaticum 101 produserte 1,23 og 0,98 g/l CO2 etter 96 timer. Laveste måling ble gjort av Lc. lactis ssp. lactis (0,55 g/l) Tid (t) 96 Lb. plantarum 15D Lb. brevis 152 C. maltaromaticum 101 L. lactis sp lactis Tid (t) S B S + MSB B + MSB Figur 22: Mengde CO 2 (g/l) produsert av renkulturer av melkesyrebakterier over 48 og 96 timer fermentering (venstre) og renkulturer av gjær i tillegg til blandingskulturer av gjær og MSB over 48, 96 og 168 timers fermentering (høyre) etter inkubering i vørter ved 22 C. Vertikale linjer viser standardavvik. S = S. cerevisiae P2, B = B. bruxellensis P1, MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. Både renkultur og blandingskultur med S. cerevisiae P2 produserte raskt CO2 og etter 48 timer var det produsert 60,64 og 56,47 g/l. Deretter var mengde produsert omtrent uendret etter både 96 og 168 timer. Kulturene med B. bruxellensis P1 produserte CO2 saktere og etter 48 timer var det produsert 2,77 g/l i renkultur og 4,40 g/l i blandingskultur. Konsentrasjonen steg deretter til 17,17 g/l etter 96 timer og 32,06 g/l etter 168 timer for renkulturen og 20,53 g/l og 40,93 g/l etter henholdsvis 96 og 168 timer for blandingskulturen Karbohydrater og organiske syrer i vekstforsøk. En oversikt over organiske syrer produsert av bakterie- og gjærstammer i vekstforsøk over 96 og 168 timer er presentert i Figur 23 og Figur 24. Konsentrasjon av melkesyre er vist med heltrukken linje og eddiksyre med stiplet linje. 50

58 Melkesyre (ppm) Eddiksyre (ppm) Tid (t) Lb plantarum 15D Lb. brevis152 C. maltaromaticum 101 Lc. lactis sp. lactis 162 Lb plantarum 15D Lb. brevis152 C. maltaromaticum 101 Lc. lactis sp. lactis 162 Figur 23: Syreproduksjon (ppm) i renkulturer med MSB etter inkubasjon i vørter ved 22 C i 48, 96 og 168 timer. Heltrukne linjer: melkesyre, stiplede linjer: eddiksyre. Figur 23 viser syreproduksjon av MSB-stammene fra vekstforsøk i vørter. Lactobacillus brevis 152 og Lb. plantarum 15D produserte omtrent like mye melkesyre med 2402,54 til 2319,66 ppm etter 48 timer og henholdsvis 3586,21 ppm og 3969,52 ppm etter 96 timer fermentering. Lactococcus lactis ssp. lactis 162 produserte 1738,53 ppm melkesyre etter 48 timer og omtrent like mye etter 96 timer (1874,46 ppm) mens C. maltaromaticum 101 produserte lite melkesyre med 556,27 ppm etter 96 timer fermentering. Laktobasillene produserte mest eddiksyre med 290,91 og 192,34 ppm etter 96 timer fermentering for henholdsvis Lb. brevis 152 og Lb. plantarum 15D mens Lc. lactis ssp. lactis 162 og C. maltaromaticum 101 produserte 16,23 og 22,85 ppm eddiksyre etter 96 timer. 51

59 Melkesyre (ppm) Eddiksyre (ppm) Figur 24 viser melkesyre- og eddiksyreproduksjon for gjærkulturene over 168 timers fermentering. Renkulturen av S. cerevisiae P2 viste ingen produksjon av melkesyre, mens noe eddiksyre ble produsert (48,82 ppm etter 96 timer og 101,22 ppm etter 168 timer). Det samme gjaldt renkulturen av B. bruxellensis P1, som produserte 85,16 ppm eddiksyre etter 168 timer og ikke noe melkesyre. Blandingskulturen med S. cerevisiae P2 og melkesyrebakterier viste en jevn økning i konsentrasjonen av begge syrene og endte på melkesyrekonsentrasjon 1910,75 ppm og eddiksyrekonsentrasjon 326,68 ppm etter 168 timer. Blandingskulturen med B. bruxellensis P1 produserte mest melkesyre (3492,40 ppm) og omtrent like mye eddiksyre som blandingskulturen med S. cerevisiae P2 (321,38 ppm) etter 168 timer Tid (t) S B S + MSB B + MSB S B S + MSB B + MSB Figur 24: Syreproduksjon (ppm) i renkulturer av gjærstammer og blandingskulturer med gjær og MSB inkubert i vørter ved 22 C i 48, 96 og 168 timer. Heltrukne linjer: melkesyre, stiplede linjer: eddiksyre. S = S. cerevisiae P2, B = B. bruxellensis P1, MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. 52

60 Figur 25 viser karbohydratutviklingen i vørter podet med MSB og gjærkulturer. Gjærstammene omsatte karbohydratene i vørteren adskillig raskere og mer fullstendig enn melkesyrebakteriene. Bakteriestammene omsatte mellom 1489 og 3123 ppm glukose og mellom 1286 og 3128 ppm fruktose. Bare Lb. brevis 152 viste omsetting av maltose (1312 ppm). Matosekonsentrasjonen i vørter umiddelbart etter poding med gjær- og blandingskulturer var omtrent ppm. Konsentrasjonen sank til 0 ppm etter 168 timer for begge S. cerevisiae P2-kulturene (med og uten MSB) og til ppm etter 168 timer for begge B. bruxellensis P1-kulturene (med og uten MSB). Glukosekonsentrasjonen sank fra 5800 ppm til hhv. 19,31 ppm og 16,66 ppm etter 168 timer for S. cerevisiae P2-kulturene med og uten MSB og 1786 ppm og 1536 ppm for B. bruxellensis P1-kulturene med og uten MSB. Konsentrasjonen av fruktose sank også mer for kulturene med S. cerevisiae P2 med og uten MSB (fra 4250 ppm til 214 ppm og 180 ppm etter 168 timer) enn kulturene med B. bruxellensis P1 med og uten MSB (fra 4500 og 4000 ppm til 3118 ppm og 2846 ppm etter 168 timer). 53

61 S B S + MSB B + MSB S B S + MSB B + MSB S B S + MSB B + MSB S B S + MSB B + MSB Karbohydrat (ppm) Karbohydrat (ppm) Maltose Glukose Maltose Glukose 0 timer 48 timer 96 timer 168 timer Fruktose 0 timer 48 timer 96 timer Fruktose Figur 25: Karbohydratutviklingen (ppm) i vørter ved 22 C gjennom fermenteringen. S = S. cerevisiae P2, B = B. bruxellensis P1, MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis Flyktige komponenter i vekstforsøk. Konsentrasjonen av etanol (ppm) produsert av renkulturer av MSB, renkulturer av gjær og blandingskulturer av MSB og gjær i vørter er vist i Figur 26. Figuren viser at etanolproduksjonen varierte mye mellom bakteriekulturene: Lb. plantarum 15D og Lc. lactis ssp. lactis 162 produserte lite etanol (0,65 ppm og 1,95 ppm), C. maltaromaticum 101 produserte 56,0 ppm og Lb. brevis 152 produserte 207,5 ppm etanol etter 96 timer. Carnobacterium sin etanolproduksjon ser ut til å stabilisere seg etter 48 timer, mens etanol produsert av Lb. brevis 152 økte mye også fra 48 til 96 timer. Renkultur og blandingskultur med S. cerevisiae P2 inneholdt omtrent ppm etanol etter både 96 og 168 timer, mens kulturene med B. bruxellensis P1 økte jevnt til 5559 ppm (renkultur) og 4615 ppm (blandingskultur) etter 168 timer. 54

62 Etanol (ppm) Etanol (ppm) Lb. plantarum 15D Lb. brevis 152 C. maltaromaticum 101 Lc. lactis sp lactis S. cerevisiae P2 B. bruxellensis P1 S. cerevisiae P2 + MSB B. bruxellensis P1 + MSB Figur 26: Etanolproduksjon (ppm) i renkulturer med MSB (vestre) og renkulturer av gjær i tillegg til blandingskulturer av MSB og gjærstammer (høyre) i vørter ved 22 C. Vertikale linjer viser standardavvik. MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. En oversikt over flyktige komponenter produsert av MSB-kulturene etter 96 timer er vist i Figur 27. Konsentrasjonen av acetoin og acetaldehyd er presentert til høyre i figuren hvor Lb. plantarum 15D og C. maltaromaticum 101 produserte henholdsvis 40,0 ppm og 80,8 ppm acetoin og 13,0 ppm og 6,3 ppm acetaldehyd. Det er verdt å merke seg at Lb. plantarum 15D og C. maltaromaticum 101 produserte henholdsvis 0,62 ppm og 0,51 ppm diacetyl etter 96 timers fermentering. I tillegg skiller C. maltaromaticum 101 seg fra de andre stammene ved produksjon av 3-metyl-butanal (1,10 ppm), 2-metyl-butanal (0,18 ppm) og 3-metyl-1-butanol (0,54 ppm). I tillegg produserte C. maltaromaticum 101 0,78 ppm fenyletyl alkohol som er 0,38 ppm mer enn det de andre MSB produserte. Alle MSB produserte noe 2-metyl-1-butanol (0,06-0,14 ppm etter 96 timer). I tillegg produserte alle MSB bortsett fra Lb. brevis 152 noe aceton ( 0,21 ppm), men konsentrasjonen varierte mye mellom gjentakene. De flyktige komponentene dimetylsulfid, 2-metylpropanal, 2-butanon, 2-butanol, etylacetat, 2,3- pentadion, trans-2-hexen-1-al, isobutyl acetat, isoamyl acetat og etyl hexanoat ble ikke detektert ( 0,006) og er utelatt fra figuren. Komponentene merket med stjerne indikerer at minst en av bakteriestammene med hensyn til denne komponenten er signifikant forskjellig fra de andre (95%) på bakgrunn av Kruskall-Wallis test. 55

63 Flyktige komponenter (ppm) Flyktige komponenter (ppm) Lb. plantarum 15D Lb. brevis 152 C. maltaromaticum 101 Lc. lactis sp lactis 162 Figur 27: Flyktige stoffer produsert av renkulturer av melkesyrebakterier i vørter ved 22 C etter 96 timer fermentering. * p 0,05 (Kruksal-Wallis test). Flyktige komponenter produsert av gjærkulturer og blandingskulturer i vørter er vist i Figur 28. Konsentrasjonene var generelt høyere enn i melkesyrekulturene, med unntak av acetoin og acetaldehyd. Renkultur og blandingskultur av S. cerevisiae P2 produserte hhv. 9,82 ppm og 6,84 ppm acetaldehyd, mens renkultur av B. bruxellensis P1 produserte 1,40 ppm og blandingskulturen viste ingen produksjon av acetaldehyd. Etter 168 timer ble det ikke registrert acetoin hos noen av gjærkulturene, men renkultur av S. cerevisiae P2 viste 8,67 ppm etter 48 timer og 6,79 ppm etter 96 timer fermentering mens blandingskultur av S. cerevisiae P2 viste 1,70 ppm etter 48 timer og ingen produksjon etter 96 timer. Ingen av B. bruxellensis P1- kulturene produserte acetoin. Kulturene med S. cerevisiae P2 dannet mye 1-propanol (8,58 ppm og 8,79 ppm) i forhold til kulturene med B. bruxellensis P1 (0,85 ppm og 0,59 ppm). Det samme gjelder for komponentene etylacetat, 2-metyl-1-propanol, 3-etyl-1-butanol og 2-metyl- 1-butanol hvor S. cerevisiae P2-kulturene produserte 4,73-7,78 ppm etylacetat, 5,73-7,39 ppm 2-metyl-1-propanol, 19,51-20,37 ppm 3-metyl-1butanol og 6,01-7,29 ppm 2-metyl-1butanol, mens B. bruxellensis P1-kulturene produserte 1,48-1,77 ppm etylacetat, 0,14-0,29 ppm 2- metyl-1-propanol, 0,00-0,15 ppm 3-metyl-1-butanol og 0,03-0,05 ppm 2-metyl-1-butanol. 56

64 Flyktige komponenter (ppm) Alle gjær-kulturene produserte fenetyl alkohol etter 168 timer, men S. cerevisiae P2-kulturene produserte omtrent det dobbelte av B. bruxellensis P1-kulturene (10,53-11,08 ppm og 4,21-5,10 ppm). Renkultur og blandingskulturene med S. cerevisiae P2 produserte esteren isoamyl acetat (0,10 og 0,16 ppm etter 96 timer og 0,10 og 0,20 ppm etter 168 timer). I tillegg inneholdt S. cerevisiae P2-kulturene 0,13 og 0,25 ppm etyl hexanoat etter 168 timer mens B. bruxellensis P1-kulturene inneholdt ubetydelige mengder (0,05 og 0,02 ppm). De øvrige komponentene aceton, dimetylsulfid, 2-metylpropanal, diacetyl, 2-butanon, 2-butanol, 3-metylbutanal, 2- metylbutanal, 2,3-pentadion, trans-2-hexen-1-al, 1-hexanol og isobutylacetat ble ikke detektert eller detektert i ubetydelige mengder og er utelatt fra figuren S B S + MSB B + MSB Figur 28: Flyktige stoffer produsert i vørter ved 22 C av renkulturer av gjær og blandingskulturer med gjær og MSB etter 168 timer fermentering. S = S. cerevisiae P2, B = B. bruxellensis P1, MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. * p 0,05 (Kruksal-Wallis test) Analyse av ferdig øl. Bryggene som ble gjæret med S. cerevisiae P2 omtales heretter som S (renkultur) og SL (blandingskultur) mens bryggene gjæret med B. bruxellensis P1 omtales som B (renkultur) og BL (blandingskultur). Resultater fra Anton Paar-analysen og de øvrige analysene av ferdig øl er presentert i Tabell 13. Alle målingene i tabellen er gitt som gjennomsnittet av tre gjentak med to paralleller (flasker) per gjentak. ph i ølet var høyest for S (4,41) og SL (4,11) og lavest 57

65 for B (3,91) og BL (3,77). Konsentrasjonen av alkohol var omtrent like høy i alle bryggene og lå i området 4,71 til 4,84 %. Det ble registrert enkelte ulikheter mellom gjentakene der brygget som skilte seg mest ut var gjentak 2 av BL. Dette brygget hadde lavest forgjæringsgrad (80,27 %), og derfor også høyest restsukkerkonsentrasjon (Er, 2,13 %), lavest alkoholprosent (4,57 %) og høyest CO2-kosentrasjon (8,19 g/l) noe som påvirket standardavvikene. To av gjentakene med SL hadde høyere forgjæringsgrad (87,38 og 91,23 %) mens det siste var på tilsvarende nivå med de øvrige bryggene (82,05 %). Tabell 13: Analyse av ferdig øl målt med PBA-B Generation M Packaged Beverage Analyzer (Anton Paar), ph-meter og refraktometer. Målingene er presentert med tilhørende standardavvik S. cerevisiae P2 (S) B. bruxellensis P1 (B) S. cerevisiae P2 + MSB (SL) B. bruxellensis P1 + MSB (BL) ph a 4.41 ± ± ± ± 0.02 Alkohol (% v/v) 4.80 ± ± ± ± 0.17 Original extract %Plato (% w/w) OG (% Plato, % w/w) bc Er (Real extract) (% w/w) ± ± ± ± ,3 ± 0,08 10,3 ± 0,08 10,3 ± 0,08 10,3 ± 0, ± ± ± ± 0.10 ADF (% w/w) d ± ± ± ± 1.51 CO 2 (g/l) 4.51 ± ± ± ± 1.88 a Målt med et PHM 92 Lab ph-meter (Radiometer). b Målt med PR201 refraktometer (ATAGO Inc.). c OG = sukkerinnhold før fermentering. d ADF = forgjæringsgrad. Forskjellene mellom gjentakene gjenspeiles også i resultatene fra HSGC- og HPLC-analysene, som vist i Figur 29 for flyktige komponenter og Figur 30 for karbohydrater og organiske syrer. 58

66 Flyktige komponenter (ppm) S B SL BL Figur 29: Flyktige stoffer i ferdig øl fermentert med renkulturer av S. cerevisiae P2 (S) og B. bruxellensis P1 (B), samt blandingskulturer av de samme gjærstammene og MSB (SL) og (BL). Vertikale linjer viser standardavvik. MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. * p 0,05 (Kruksal-Wallis test). Figur 29 viser konsentrasjonen (ppm) av flyktige komponenter i de ferdige bryggene. Figuren viser at S og SL inneholdt mer acetaldehyd (3,79 ppm og 4,03 ppm) enn B og BL (0,51 ppm og 0,99 ppm). Det samme gjelder for 1-propanol (11,63 ppm og 12,79 ppm for S og SL og 4,47 ppm og 7,49 ppm for B og BL), 2-metyl-1-propanol (13,37 ppm og 12,55 ppm for S og SL, og 6,43 ppm og 7,55 ppm for B og BL), 2-metyl-1-butanol (13,53 ppm og 12,66 ppm for S og SL, og 3,11 ppm og 3,93 ppm for B og BL) og 3-metyl-1-butanol (31,24 ppm og 37,87 ppm for S og SL, og 10,43 ppm og 14,84 ppm for B og BL). Konsentrasjonen av etylacetat og fenyletyl alkohol varierte lite mellom bryggene, fra 14,94 til 18,93 ppm etylacetat og 19,12 til 23,24 ppm fenetyl alkohol, men standardavvikene viser at det var vesentlige ulikheter mellom gjentakene for enkelte av bryggene da standardavvikene er forholdsvis høye (±7,27 ppm og ±6,77 ppm for etylacetat produsert i B og BL, og ±8,55 ppm og ±8,21 ppm for fenetyl alkohol produsert av B og SL). Esterne var tilstede i lave konsentrasjoner, men det var også her variasjon mellom bryggene. Øl brygget med S og SL inneholdt 0,72 og 0,61 ppm isoamylacetat og 0,46 og 0,42 ppm etylhexanoat, mens B og BL inneholdt begge 0,01 ppm isoamylacetat og 0,23 og 0,14 ppm 59

67 Karbohydrat/melkesyre (ppm) etylhexanoat. Komponenter merket med stjerne indikerer at minst et av bryggenes innhold av gitte komponent er signifikant ulik fra de andre (95%), basert på Kruskal Wallis-test S B SL BL Glukose Fruktose Lactic acid Figur 30: Glukose, fruktose og melkesyre i ferdig øl fermentert med renkulturer av S. cerevisiae P2 (S) og B. bruxellensis P1 (B), samt blandingskulturer av de samme gjærstammene og MSB (SL og (BL). Vertikale linjer viser standardavvik. MSB = Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152 og Lc. lactis ssp. lactis. Konsentrasjonen av karbohydrater og melkesyre i de ferdige bryggene er vist i Figur 30. Bryggene med S inneholdt ikke melkesyre, mens de andre inneholdt 45,12 ppm (B), 64,34 ppm (SL) og 84,25 ppm (BL). Bryggene B, SL og BL inneholdt små mengder glukose, hhv. 18,77 ppm, 16,06 ppm og 21,60 ppm. Fruktose var tilstede i alle bryggene, men høyere for B og BL (204,78 ppm og 159,08 ppm) enn for S og SL (36,34 ppm og 25,90 ppm). Det ble ikke detektert hverken maltose eller eddiksyre i noen av bryggene. Den sensoriske vurderingen viste at bryggene fermentert med blandingskultur generelt var noe syrligere enn renkulturene med gjær. Dette gjorde oppfatningen av ølet noe friskere og mer smaksrik. Brygget S hadde generelt lite smak og lite fylde. Bryggene B og BL hadde en krydret, røkt og fruktig smak der BL også var syrligere. Brettanomyces bruxellensis P1 gav en spennende og uvant ettersmak sammenlignet med S. cerevisiae P2. 60

68 5. Diskusjon Mikrobiologisk analyse av kornprøver. Det er vanskelig å konkludere noe på bakgrunn av cellevekst på agarskålene. På grunn av at forsøket ble utført i ett gjentak vil ikke feil i målingene avdekkes. Det så likevel ut til at celletallet på PCA, MRS, LBS og Rose Bengal agar økte som følge av germineringen. Mye vekst av mugg og gjær på MRS-agarskålene vanskeliggjorde registreringen av melkesyrebakterier og uspiret korn viste spesielt mye vekst av sopp. Det ble registrert en økning på 1-3 log kde/ml på MRS-agarskålene etter timer spiring, men på grunn av soppveksten kan det tenkes at det reelle celletallet av MSB var lavere enn registrert og dermed at økningen som følge av spiring var høyere enn registrert. Resultatene fra forsøket kan sammenlignes med resultatene fra Booysen et al. (2002) der celletallet på MRS-agarskålene økte med tre til fire log etter støping og tre dager germinering. Resultatene i denne oppgaven viste ingen klare forskjeller mellom celleveksten på de tre byggsortene. Heller ikke dyrkingssted så ut til å påvirke celletallet, bortsett fra korn dyrket på Rød gård, som viste lavere celletall på MRS-agarskålene etter spiring sammenlignet med de andre dyrkingsstedene. Den generelle økningen i celletall etter støping og germinering skyldes de gunstige betingelsene for enzymaktivitet og cellevekst under maltingen (Bokulich & Bamforth 2013). Totalsekvenseringen viste at det totale antallet bakterie-otuer ikke endret seg etter spiring, men at sammensetningen av det mikrobielle samfunnets bakteriefamilier var ulik før og etter spiringen. Ikke uventet inneholdt uspiret korn en stor andel Enterobacteriaceae, men veksten avtok som følge av germinering. Familien Paenibacillaceae så heller ikke ut til å overleve spiringen. Derimot skjedde en oppblomstring av en rekke andre grupper, noe som bekreftes av Shannon diversitets-indeksen som viste at mangfoldet av bakteriegrupper økte i spiret korn. Streptococcaceae var den eneste MSB-familien som ble registrert på kornprøvene. Den omfatter slekten Lactococcus og var tilstede på alle spirede og uspirede kornprøver. På bakgrunn av vekst på MRS-agarskålene så det ut til at celletallet av MSB økte under germineringen. Når totalsekvenseringen viste at det totale antallet bakterie-otuer ikke endret 61

69 seg under spiring men at mangfoldet av bakteriegrupper økte tyder det på at germinering av kornet er gunstig for blant annet melkesyrebakterier. Noots et al. (1999) undersøkte mikrofloraen av sopp på byggkorn etter innhøsting, under lagring og i løpet av malting. Til sammenligning ble soppveksten på kornet i denne oppgaven undersøkt direkte etter innhøsting og etter spiring. Artikkelen viste at kornet inneholdt feltrelaterte sopp som stammet fra jord, luft og vegetasjon etter innhøsting. Feltsoppene omfattet slektene Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium og Helminthosporium, hvor alle slektene klassifiseres innen Pleosporaceae, Dothioraceae, Davidellaceae og Nectriaceae. Lagerrelatert sopp besto av slektene Aspergillus og Penicillum, som er klassifisert innen familien Trichocomaceae. Lagersopp stammet ikke fra omgivelsene på jordet men vokste under lagring av kornet. De nevnte lagersoppene forekom hverken på spirede eller uspirede kornprøven i denne oppgaven. Familiene Pleosporaceae og Nectriaceae vokste både på spiret og uspiret korn og veksten så ikke ut til å påvirkes av germinering i nevneverdig grad. Davidellaceae vokste på alle uspirede kornprøver men veksten avtok under støping og spiring. Dothioraceae var kun tilstede på spiret korn, noe som tyder på at forholdene under maltingen var gunstige for denne familien. Dette stemmer med resultatene fra Noots et al. (1999) med hensyn til forekomst av feltsopp og fraværet av lagersopp på kornet. Familien Tremellales omtales ikke i artikkelen, men var den mest tallrike soppfamilien på både spiret og uspiret korn i denne oppgaven. Dette indikerer at soppen kan stamme fra etterbehandling (veiing, sending) av kornet. Tremellales er også tilstede i lavest konsentrasjon i kornprøvene med kortest forsendelsesvei (Ås) noe som kan tyde på at etterbehandlingen av kornet har påvirket veksten. Kornet ble ikke lagret mellom innhøsting og malting, som forklarer fraværet av de mest vanlige lagersoppene Aspergillus og Penicillum innen familien Trichocomaceae. Det ble ikke registrert forskjeller mellom kornsortene eller dyrkingsstedene på bakgrunn av totalsekvenseringen. Som nevnt er det vanskelig å luke ut feilmålinger eller bekrefte de målinger som ble gjort uten å analysere flere gjentak. Ifølge Bokulich og Bamforth (2013) er mikrofloraen på kornet ikke bare påvirket av omgivelsene, men også i stor grad vær og klima. Derfor, og på grunn av lagersopp-vekst kunne det vært interessant å undersøke den mikrobiologiske sammensetningen på korn dyrket og høstet førskjellige år. Resultatene viste at det ble isolert flest MSB fra korn dyrket på Hagen (43 kolonier) i tillegg til at mangfoldet av 62

70 MSB også var størst på disse kornprøvene, med fire ulike slekter. Fra korn dyrket på Apelsvoll ble det isolert kun tre kolonier MSB, men koloniene tilhørte ulike slekter. Mangfoldet i korn både fra Hagen og Apelsvoll kan skyldes lignende vær og klimaforhold på disse stedene med tanke på at dyrkingsstedene ligger såpass nærme hverandre. Kornets spiregrad ble målt til mellom 65 % og 75 % med unntak av fire prøver der to hadde høyere og to hadde lavere spiregrad. Den høye andelen av korn som ikke hadde begynt å spire når germineringen ble avsluttet (10-20 %) har sannsynligvis påvirket hvilke stammer som ble isolert fra kornprøvene og burde vært inkludert i beregningen av spiregrad. Spiregrad så ikke ut til å påvirke mikrofloraen på kornet men det er igjen vanskelig å si på bakgrunn av ett gjentak. Mesteparten (81,5 %) av de isolerte MSB ble identifisert som Leuconostoc sp. Som tidligere nevnt vokser Leuconostoc tidlig i en fermenteringsprosess og dersom kornet hadde ligget lenger i spirekammeret ville sannsynligvis mer syretolerante MSB, som Lactobacillus sp. utviklet seg. Noots et al. (1999) rapporterte at vekstraten av mikrober på korn var lav inntil to dager germinering, men steg vesentlig i løpet av dag tre, noe som kan forklare hvorfor få kolonier med melkesyrebakterier ble isolert da de fleste prøveuttakene ble foretatt etter 50 timer Vekstforsøk Renkulturer av MSB På bakgrunn av teori om de isolerte MSB ble fire av de isolerte stammene fra spirede kornprøver tatt med til innledende vekstforsøk. To av stammene var C. maltaromaticum og de to andre Lc. lactis. På grunn av lite variasjon blant de isolerte stammene, samt innhold av slekter som normalt ikke er ønsket i øl ble ytterligere åtte stammer tilhørende sju arter og tre slekter hentet fra KBMs stammekolleksjon. Resultatene fra det innledende vekstforøket viste at alle de til sammen 12 stammene vokste i vørter, men at syreproduksjonen varierte. De to Carnobacterium og Lactococcus-stammene viste tilnærmet lik vekst til tross for at de var isolert fra to ulike steder, og kun en av hver ble derfor med videre. De fire stammene Lb. plantarum 15D, Lb. brevis 152, C. maltaromaticum 101 og Lc. lactis ssp. lactis 162 ble analysert videre i vekstforsøk. Laktobasillene ble tatt med fordi de er meget syretolerante og fordi Lactobacillus ofte brukes i surølproduksjon (Tonsmeire 2014). Det ble også utført vekst- 63

71 og metabolismeforsøk hos stammene i blandingskulturer med to gjærstammer hentet fra KBMs stammekolleksjon. På grunn av målt diacetylproduksjon (0,51 ppm etter 96 timer) og usikkerhet med hensyn til negativ påvirkning på smaken på øl ved brygging ble ikke C. maltaromaticum 101 inkludert i pilotproduksjon av øl. Lactobacillus platarum 15D produserte også diacetyl i vekstforsøk (0,82 ppm etter 96 timer), men ble likevel inkludert i brygging og videre vekstforsøk da denne arten er vanlig i surøl. Resultatene fra HSGC-analysen viste at Lb. brevis 152 og C. maltaromaticum 101 produserte henholdsvis 208 og 56 ppm etanol i vørter, noe som stemmer med litteratur som sier at Lb. brevis og C. maltaromaticum er heterofermentativ og kan produsere etanol fra glukose (Adams & Moss 2008; Afzal et al. 2012; Leisner et al. 2007). Samtidig bekrefter Cocaign-Bousquet et al. (1996) at Lc. lactis er homofermentativ og i hovedsak produserer melkesyre. Lactobacillus plantarum er fakultativ heterofermentativ men produserte ikke etanol i vekstforsøk. Den heterofermentative Lb. brevis 152 produserte også mer CO2 enn de andre MSB selv om det ble registrert noe CO2-produksjon fra alle stammene. Metoden for analyse av CO2 kan gi usikre resultater fordi det er vanskelig å injisere nøyaktig mengde i apparatet ved høy CO2- prouksjon. Likevel vitnet lave standardavvik om at målingene var korrekte og at det ble produsert omtrent like mye CO2 av Lb. plantarum 15D og C. maltaromaticum 101. Også Lc. lactis ssp. lactis 162 produserte noe CO2 etter 96 timer fermentering. Det er kjent at Lc. lactis ssp. lactis var. diacetylactis frigjør CO2 ved nedbrytning av sitrat via pyruvat til diacetyl og acetoin (Carr et al. 2002; Hugenholtz & Starrenburg 1992). Det samme skjer ved et overskudd av pyruvat, men det er ikke kjent om Lc. lactis ssp. lactis reduserer pyruvat på samme måte. Det er også vanlig at MSB frigjør CO2 ved metabolisering av aminosyrer, noe som kan forklare produksjonen av CO2 av Lc. lactis ssp. lactis (Christensen et al. 1999; Fernández & Zúñiga 2006). Carnobacterium maltaromaticum 101 produserte mindre melkesyre og eddiksyre enn de andre renkulturene med MSB samtidig som celleveksten over 96 timer var lavere. Derimot ble det dannet større konsentrasjoner av en rekke flyktige komponenter sammenlignet med de andre stammene. Tre av stoffene ble dannet i store nok konsentrasjoner til å overstige terskelverdiene 64

72 for ale. Det ble produsert 1,09 ppm 3-metyl-1-butanal hvor terskelverdi er 0,6 ppm og 80,75 ppm acetoin som har en terskelverdi på 50 ppm. Disse stoffene gir fruktig, syrlig smak og kremet smøraroma. I tillegg ble det produsert 0,51 ppm diacetyl, som har terskelverdi på 0,15 ppm. Diacetyl gir smørsmak og er et langt mer potent stoff på grunn av den lave terskelverdien. Afzal et al. (2012) bekrefter at C. maltaromaticum produserer 3-metyl-1-butanal fra leusin gjennom ulike reaksjonsveier, og omtaler smaken i øl som malt- eller sjokoladepreget. Det kunne vært interessant å undersøke metabolismen hos C. maltaromaticum 101 i blandingskulturer med gjær under ølbrygging og se hvilke metabolitter man kan finne igjen ølet. Samtidig kan vanlig bryggegjær metabolisere aldehyder til høyere alkoholer, det vil si omdanne 3-metyl-butanal til 3-metyl-butanol og i tillegg omdanne acetoin til 2,3-butandiol (Briggs et al. 2004; Hazelwood et al. 2008; Hill 2015). På grunn av de høye terskelverdiene for høyere alkoholer er det usikkert hvor stor innvirkning C. maltaromaticum 101 ville hatt på smak og aroma i et surøl. Som forventet var laktobasillene gode syreprodusenter og produserte 3586 til 3970 ppm melkesyre over 96 timer, kontra Lc. lactis ssp. lactis 162 og C. maltaromaticum 101 som produserte henholdsvis 1879 og 556 ppm melkesyre etter tilsvarende tid. Lactobacillus brevis 15D og Lc. lactis ssp. lactis 162 produserte noen få flyktige stoffer etter 96 timer, men ingen stoffer i høye nok konsentrasjoner til å overstige terskelverdiene. Lactobacillus plantarum 15D produserte 40 ppm acetoin, som er like under terskelverdien på 50 ppm, i tillegg til 0,62 ppm diacetyl som er langt over terskelverdien på 0,15 ppm. Som nevnt kan bryggegjær metabolisere diacetyl videre til 2,3-butandiol som har høyere terskelverdi på 4500 ppm (Briggs et al. 2004; Hill 2015; Pires & Brányik 2015). Det ble ikke detektert diacetyl i metabolisme-forsøkene med blandingskulturer av gjær og MSB og det forventes derfor at mengden diacetyl produsert av Lb. plantarum 15D ikke vil påvirke ferdig øl i stor grad Renkulturer av gjær og blandingskulturer av gjær og MSB. Det ble ikke registrert celletall av B. bruxellensis P1 fordi gjærstammen ikke vokste på Rose Bengal agar. Da Tanderø (2016) isolerte B. bruxellensis P1 fra kommersielt øl ble vekst og metabolisme i vørter ved 22 C undersøkt. Det ble rapportert at B. bruxellensis P1 vokste noe saktere enn S. cerevisiae P2 i vørter og differansen mellom stammene var 1,61 log kde/ml etter 24 timer, 0,67 log kde/ml etter 96 timer og 0,35 log kde/ml etter 168 timer. Det kan 65

73 derfor antas at celletall for B. bruxellensis P1 utviklet seg tilsvarende i dette forsøket. Målingene av CO2 og karbohydratomsetning i vekstforsøk gir også en indikasjon på utviklingen til gjæren. Begge kulturene med S. cerevisiae P2 produserte omtrent samme mengde CO2 etter 48 og 168 timer (60 g/l), mens mengden produsert av B. bruxellensis P1- kulturene steg gradvis gjennom hele forsøket og endte på mellom 20 og 25 g/l lavere CO2- mengde enn S. cerevisiae P2 etter 168 timer. Samtidig ble det omsatt vesentlig mindre karbohydrater av B. bruxellensis P1-kulturene etter 168 timer. Dias et al. (2003) bekreftet at B. bruxellensis vokser vesentlig saktere enn S. cerevisiae både på agar-medie og i druejuice. I vekstforsøk produserte blandingskulturen med S. cerevisiae P2 og MSB 1911 ppm melkesyre, mens blandingskulturen med B. bruxellensis P1 og MSB produserte 3492 ppm melkesyre. Gobbetti (1998) påpekte at vekst og metabolisme hos MSB kan gå saktere i blandingskulturer med gjær. Andre kilder sier derimot at gjær og MSB ikke påvirker hverandres vekst (Paramithiotis et al. 2006; Viljoen 2006). En studie gjort på fermentering av en alkoholholdig sorghumbasert drikk viste en signifikant (p<0,05) reduksjon av melkesyre i blandingskulturer av S. cerevisiae, Lb. plantarum og Lc. lactis sammenlignet med blandingskultur av de samme MSB (Mukisa et al. 2016). I artikkelen påpekes det at stor syreproduksjon fra Lb. plantarum kan føre til en uønsket og overdreven syrlig smak og at reduksjonen i melkesyreproduksjon motvirker denne uønskede syrningen så lenge ønsket konsentrasjon av melkesyre er oversteget. Resultatene fra denne oppgaven tyder på at det samme er tilfelle her. Det er også mulig at den sene veksten av B. bruxellensis P1 førte til mindre konkurranse om næringen og at MSB av den grunn produserte mye melkesyre tidlig i fermenteringen. Analysen av flyktige komponenter produsert i vekstforsøk med gjærstammer viste at produksjonen av acetoin var adskillig lavere i gjærkulturene enn i bakteriekulturene. Etter 168 timer ble det ikke registrert acetoin hos noen av gjærkulturene. Kulturene av B. bruxellensis P1 produserte ikke acetoin ved noe tidspunkt, til tross for at blandingskulturen inneholdt Lb. plantarum 15D, som produserte 40,00 ppm etter 96 timer fermentering. Romano et al. (2003) rapporterte at B. bruxellensis produserer lite acetoin sammenlignet med S. cerevisiae, noe som stemmer med resultatene fra denne oppgaven. Renkulturen av S. cerevisiae P2 produserte 8,67 ppm etter 48 timer og 6,79 ppm etter 96 timer mens blandingskulturen med S. cerevisiae P2 og MSB viste 1,70 ppm etter 48 timer og viste ingen produksjon etter 96 timer. Som nevnt kan 66

74 både gjær og MSB omforme acetoin til 2,3-butandiol (Pires & Brányik 2015; Von Wright & Axelsson 2012). Det ser derfor ut til at begge gjærstammene omdannet acetoin til 2,3-butandiol i vekstforsøkene med gjærkulturer. Diacetyl og acetoin er mellomprodukter i omsetningen av et pyruvat-overskudd til 2,3-butandiol og det ble derfor ikke registrert diacetyl i noen av gjærkulturene (Bartowsky & Pretorius 2009; Coghe et al. 2005). Mukisa et al. (2016) undersøkte vekst og metabolisme hos MSB i blandingskultur med S. cerevisiae ved fermentering av den alkoholholdige sorghumbaserte drikken Obushera, og viste at S. cerevisiae reduserte diacetyl og acetoin produsert av Lb. plantarum og Lc. lactis betraktelig (81-92 %). Saccharomyces cerevisiae P2-kulturene inneholdt generelt høyere konsentrasjoner av estere, høyere alkoholer, acetaldehyd, etylacetat og fenyletyl alkohol enn B. bruxellensis P1-kulturene. På grunn av den trege veksten av B. bruxellensis P1 kan det være misvisende å sammenligne stammenes produksjon av flyktige stoffer etter 168 timer. Dette kommer tydelig frem av analysen av det ferdige pilotbryggede ølet der produksjonen av flyktige komponenter er mer lik for øl tilsatt S. cerevisiae P2 og B. bruxellensis P1. Resultatene tydet ikke på at melkesyrebakteriene påvirket sammensetningen av flyktige komponenter i vekstforsøk med gjærkulturer. Kulturene med S. cerevisiae P2 produserte noe isoamylacetat, men ikke nok til å overstige terskelverdien på 1,4 ppm. Som forventet ble det ikke registrert isoamylacetat i B. bruxellensis P1-kulturene på grunn av gjærens produksjon av en estrase som bryter ned esteren (Spitaels et al. 2015b). Det ble produsert 0,25 ppm etyl hexanoat i kulturen med S. cerevisiae P2 og MSB. Terskelverdien for etyl hexanoat er 0,21 ppm og den gir en fruktig og søt smak av eple, banan og ananas. Etylesterproduksjon er vanlig for S. cerevisiae og kan være et problem i moderne bryggerier som benytter high gravity brewing der næringsinnholdet i vørter og øl er forhøyet. Denne formen for brygging gir gjerne en ubalansert smaksprofil med overproduksjon av estere. For eksempel kan esterproduksjonen øke fire til åtte ganger ved en dobling av næringsinnholdet i vørteren (Saerens et al. 2008; Verstrepen et al. 2003). I vekstforsøk i denne oppgaven ble det benyttet en svak vørter med sukkerinnhold på 10,1 P, som kan forklare den lave esterproduksjonen. 67

75 5.3. Analyse av ferdig pilotbrygget øl. Bryggene ble primærgjæret i omtrent fem uker før ølet ble tappet på flasker, sekundærgjæret i to uker og modnet en uke. Før gjæring ble halvparten av bryggene syrnet med MSB i 42 til 66 timer. ph i vørteren lå i området 5,64 til 5,69 og sank til under 5 i løpet av syrningen. Ut fra nedgangen i ph og de lave målingene av melkesyre i ferdige brygg kan det konkluderes med at vørteren enten burde vært syrnet lenger før gjær ble tilsatt eller at vørteren burde blitt podet med en større konsentrasjon av MSB. Samtidig tok det lang tid (omtrent 5 uker) før sukkerinnholdet i vørteren hadde stabilisert seg og bryggene kunne tappes på flasker. Dette tyder på at gjærkonsentrasjonen også burde vært høyere ved poding. Pires og Brányik (2015) og Briggs et al. (2004) bekrefter at normal podekonsentrasjon er 1,0*10 7 kde/ml ved fermentering av vørter med sukkerinnhold rundt 10 P. I denne oppgaven ble vørter podet med 1,0*10 6 kde/ml, og en høyere podekonsentrasjon ville sannsynligvis kortet ned fermenteringstiden en del. Samtidig ville en høyere konsentrasjon av MSB sannsynligvis gitt lavere ph og mer syre i det ferdige ølet og dermed et friskere produkt som skilte seg mer fra ølvariantene som ble fermentert kun med gjær. Spitaels et al. (2015b) undersøkte mikrobiologisk og kjemisk sammensetning i en industrielt fremstilt lamcic. De konkluderte med at melkesyrekonsentrasjonen økte fra 4800 til 5700 g/l etter to års lagring. Samtidig ble det registrert en økning i eddiksyrekonsentrasjon fra 1860 til 3040 ppm. Ølet som ble brygget i denne oppgaven inneholdt ikke eddiksyre og innholdet av melkesyre var adskillig lavere. Likevel viser studiet at melkesyrekonsentrasjonen kan øke mye under lagring og endre de sensoriske egenskapene ved surølet. Analysene av flyktige komponenter i vekstforsøk og ferdig øl viser sammenlignbare resultater, men konsentrasjonene av mange komponenter var høyere i øl. Alle bryggene inneholdt omtrent like mye etylacetat (14,94 til 18,93 ppm) og fenyletyl alkohol (19,12 til 23,24 ppm). I tillegg var forskjellen mellom gjærstammenes produksjon av høyere alkoholer mindre i bryggene enn i vekstforsøk. Dette skyldes høyst sannsynlig den sene veksten til B. bruxellensis P1 som fikk tid til å utvikle seg i ølet. Innholdet av acetaldehyd var lavere i ølet enn vekstforsøk på grunn av gjærens evne til å omdanne acetaldehyd til etanol over tid (Bokulich & Bamforth 2013). Alle bryggene inneholdt noe etyl hexanoat. Saccharomyces cerevisiae P2 produserte 0,46 ppm i renkultur og 0,42 ppm i blandingskultur mens B. bruxellensis P1 produserte 0,23 ppm i 68

76 renkultur og 0,14 ppm i blandingskultur. Terskelverdien for stoffet er 0,21 ppm og det gir en fruktig søt smak i øl. Ingen andre estere ble detektert i høyere konsentrasjoner enn terskelverdien. Den sensoriske vurderingen av ølet viste at det var enkelte forskjeller mellom de to gjærstammene. Bryggene som ble fermentert med B. bruxellensis P1 hadde en røkt, krydret og fruktig smak som ikke ble gjenkjent i bryggene fermentert med S. cerevisiae P2. Forskjellene ble ikke fanget opp av HSGC-analysen da ingen av bryggene skilte seg ut i forhold til flyktige komponenter. Flere kilder rapporterer at B. bruxellensis produserer de flyktige fenolforbindelsene 4-etylfenol og 4-etylguaiacol ved fermentering av vørter (Bartowsky & Pretorius 2009; Bokulich & Bamforth 2013; Loureiro & Malfeito-Ferreira 2006). Stoffene gir en smak som beskrives som jord, røyk eller låve i øl og øker bitterhet og astringens i vin. Det ble ikke undersøkt for fenolforbindelsene i denne oppgaven men tilstedeværelse av stoffene kan muligens forklare noen av de sensoriske forskjellene mellom byggene fermentert med B. bruxellensis P1 og S. cerevisiae P2. Bryggene som ble fermentert med gjær og MSB ble beskrevet som noe mer syrlig og friskere enn bryggene fermentert kun med gjær, noe som forklares av den noe lavere phen og melkesyre produsert av MSB. 69

77 6. Oppsummering og konklusjon. I denne oppgaven ble mikrofloraen på norsk bygg undersøkt og det ble isolert melkesyrebakterier fra spiret byggkorn. Bygg av sortene Fairytale, Helium og Brage ble dyrket på Ås, Kapp, Hamar og i Råde og høstet i Resultater fra mikrobiologisk analyse og totalsekvensering av mikrober på kornet avdekket ingen forskjeller mellom mikrofloraen på de ulike kornsortene. Klimatiske forskjeller kan ha påvirket mikrofloraen i noen grad, men det er vanskelig å konkludere ut fra en måling. Uspiret korn inneholdt mye Enterobacteriaceae mens spiret korn inneholdt et større mangfold av bakteriegrupper. Lagerassosierte sopp ble, som forventet ikke detektert på kornet da nyinnhøstet korn ble analysert, men feltsopp ble funnet både på spiret og uspiret korn. Etter timer germinering ble det isolert 70 kolonier av melkesyrebakterier der 81,5 % ble identifisert som Leuconostoc sp. Dersom kornet hadde ligget lenger til spiring ville sannsynligvis mer syretolerante stammer dominert mikrofloraen. Vekstforsøk viste at C. maltaromaticum 101 produserte aldehyder og høyere alkoholer i vørter, noe som kunne gitt et spennende preg på en surøl, men stammen ble ikke inkludert i brygging på grunn av diacetylproduksjon. I vekstforsøk produserte Lb. brevis 152 mer CO2 og etanol enn de andre MSB mens produksjonen av melkesyre og eddiksyre var omtrent like høy i Lb. brevis 152 og Lb. plantarum 15D. Det ble registrert produksjon av acetoin og diacetyl fra Lb. plantarum 15D og C. maltaromaticum 101 men i vekstforsøk med gjærstammer ble stoffene redusert videre til 2,3-butandiol som ikke påvirker smaken på øl i større grad. Gjærstammen B. bruxellensis vokste saktere enn S. cerevisiae men produserte tilsvarende flyktige komponenter i ferdig øl. Gjærstammene produserte enkelte høyere alkoholer og estere i vørter. Melkesyrebakteriene (1,9-3,0*10 6 kde/ml) dannet noe syre i ølet, men på grunn av liten nedgang i ph burde en større konsentrasjon blitt podet i vørteren. Gjærstammene (1,0*10 6 kde/l) brukte 5 uker på å fermentere vørteren og en høyere podekonsentrasjon burde også her blitt benyttet. Bruken av MSB i pilotproduksjonen viste ingen nevneverdig produksjon av flyktige forbindelser, men påvirket ølet i hovedsak med et syrlig og friskt preg. 70

78 Sensorisk vurdering av ølsortene som ble brygget viste en større forskjell mellom gjærstammene enn det de kjemiske analysene klarte å avdekke. Bryggene ble ikke undersøkt for enkelte fenolforbindelser som gjerne forbindes med B. bruxellensis metabolisme Videre arbeid. Videre kan det være svært interessant å følge utviklingen i det ferdige ølet over tid. Tradisjonelle surøl fermenteres over flere år før de oppnår ønsket smaksprofil på grunn av samspillet mellom gjær og melkesyrebakterier. Den trege veksten av B. bruxellensis P1 gjør det særlig interessant å følge med på metabolitter i dette ølet. Samtidig inneholdt ingen av surølene særlig mye melkesyre etter til sammen 8 uker fermentering, men MSB kan produsere mer syre under lagring. Det ble registrert produksjon av en rekke høyere alkoholer i ferdig øl, noe som gjæren kan omforme til estere under modning og derved kan smaksprofilen endre seg noe. Det kan også være spennende å benytte den isolerte stammen av C. maltaromaticum i et surøl. Stammen ble ikke benyttet i pilotproduksjonen på grunn av diacetylproduksjon i vørter innledningsvis, men den registrerte konsentrasjonen av diacetyl produsert av Lb. plantarum 15D i vørter så ikke ut til å være et problem i ferdig øl. Det ble også produsert en del flyktige komponenter som kan gi en positiv effekt på ølet. I tillegg kan det være interessant å undersøke effekten av ulike temperaturer på metabolismen hos de isolerte MSB-stammene. Eventuelt kan metabolismen hos stammene undersøkes i blandingskulturer med andre gjærstammer, for eksempel Saccharomyces pastorianus som brukes i lagerøl og har en optimaltemperatur for vekst som er lavere enn hos S. cerevisiae. På grunn av liten variasjon i isolerte bakteriestammer fra de spirede kornprøvene kunne det også vært spennende å isolere MSB fra korn etter en lenger germineringsperiode. De fleste kornprøvene i denne oppgaven ble spiret i 50 timer, og ved en lengere spiretid vil høyst sannsynlig mer syretolerante laktobasiller vokse. 71

79 7. Referanser Adams, M. & Moss, M. O. (2008). Food Microbiology, b. Third Edition. Cambridge, UK: The royal society of chemistry. Afzal, M. I., Jacquet, T., Delaunay, S., Borges, F., Millière, J.-B., Revol-Junelles, A.-M. & Cailliez-Grimal, C. (2010). Carnobacterium maltaromaticum: Identification, isolation tools, ecology and technological aspects in dairy products. Food Microbiology, 27 (5): Afzal, M. I., Delaunay, S., Paris, C., Borges, F., Revol-Junelles, A.-M. & Cailliez-Grimal, C. (2012). Identification of metabolic pathways involved in the biosynthesis of flavor compound 3- methylbutanal from leucine catabolism by Carnobacterium maltaromaticum LMA 28. International Journal of Food Microbiology, 157 (3): Barnes, T. (2013). The Complete Beer Fault Guide v Tilgjengelig fra: (lest ). Bartowsky, E. J. & Pretorius, I. S. (2009). Microbial formation and modification of flavor and offflavor compounds in wine. I: H. König, G. Unden, & J. Fröhlich (2009) Biology of Microorganisms on grapes, in must and in wine. Berlin, Tyskland: Springer-Verlag. Bokulich, N. A. & Bamforth, C. V. (2013). The microbiology of malting and brewing. Microbiology and molecular biology reviews, 77 (2): Bokulich, N. A. & Mills, D. A. (2013). Improved Selection of Internal Transcribed Spacer-Specific Primers Enables Quantitative, Ultra-High-Throughput Profiling of Fungal Communities. Applied and Environmental Microbiology, 79 (8): Booysen, C., Dicks, L. M. T., Meijering, I. & Ackermann, A. (2002). Isolation, identification and changes in the composition of lactic acid bacteria during the malting of two different barley cultivars. International Journal of Food Microbiology, 76 (1 2): Briggs, D. E., Boulton, C. A. & Brookes, P. A. (2004). Brewing: Science and Practice: Taylor & Francis. Carr, F. J., Chill, D. & Maida, N. (2002). The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical Reviews in Microbiology, 28 (4): Christensen, J. E., Dudley, E. G., Pederson, J. A. & Steele, J. L. (1999). Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 76 (1): Cocaign-Bousquet, M., Garrigues, C., Loubiere, P. & Lindley, N. D. (1996). Physiology of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis. Antonie van Leeuwenhoek, 70 (2): Coghe, S., D'Hollander, H., Verachtert, H. & Delvaux, F. R. (2005). Impact of Dark Specialty Malts on Extract Composition and Wort Fermentation. Journal of the Institute of Brewing, 111 (1): Damodaran, S., Parkin, K. L. & Fennema, O. R. (2007). Fennema's Food Chemistry, Fourth Edition: CRC Press. Dias, L., Pereira-da-Silva, S., Tavares, M., Malfeito-Ferreira, M. & Loureiro, V. (2003). Factors affecting the production of 4-ethylphenol by the yeast Dekkera bruxellensis in enological conditions. Food Microbiology, 20 (4): Fernández, M. & Zúñiga, M. (2006). Amino Acid Catabolic Pathways of Lactic Acid Bacteria. Critical Reviews in Microbiology, 32 (3): Gobbetti, M. (1998). The sourdough microflora: Interactions of lactic acid bacteria and yeasts. Trends in Food Science & Technology, 9 (7): Grønnevik, H., Falstad, M. & Narvhus, J. A. (2011). Michrobiological and chemical properties of Norwegian kefir during storage. International Dairy Journal, 21 (9): Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Symp. Ser. 41:

80 Hazelwood, L. A., Daran, J. M., van Maris, A. J., Pronk, J. T. & Dickinson, J. R. (2008). The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol, 74 (8): Hill, A. (2015). Brewing Microbiology: Managing Microbes, Ensuring Quality and Valorising Waste: Elsevier Science. Holland, K. T., Knapp, J. S. & Shoesmith, J. G. (2013). Anaerobic Bacteria. New York, USA: Springer Science. Hugenholtz, J. & Starrenburg, M. J. C. (1992). Diacetyl production by different strains of Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis and Leuconostoc spp. Applied Microbiology and Biotechnology, 38 (1): Jackson, J. F. & Linskens, H. F. (2002). Analysis of Taste and Aroma. Berlin, Heidelberg: Springer- Verlag. Kanauchi, M. & Bamforth, C. W. (2001). Release of beta-glucan from cell walls of starchy endosperm of barley. Cereal chemistry, 78 (2): Kieronczyk, A., Skeie, S., Langsrud, T., Le Bars, D. & Yvon, M. (2004). The nature of aroma compounds produced in a cheese model by glutamate dehydrogenase positive Lactobacillus INF15D depends on its relative aminotransferase activities towards the different amino acids. International Dairy Journal, 14 (3): Lahtinen, S., Ouwehand, A., Salminen, S. & Wright, A. (2012). Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. USA: Taylor and Francis group, LLC. Leisner, J. J., Laursen, B. G., Prévost, H., Drider, D. & Dalgaard, P. (2007). Carnobacterium: positive and negative effects in the environment and in foods. FEMS Microbiology Reviews, 31 (5): Lewis, M. J. & Young, T. W. (2001a). Brewing. Boston, MA: Springer US. Lewis, M. J. & Young, T. W. (2001b). Malting technology: malt, specialized malts and non-malt adjuncts. I: Brewing, s Boston, MA: Springer US. Loureiro, V. & Malfeito-Ferreira, M. (2006). Dekkera/Brettanomyces spp. I: de W Blackburn, C. (2006). Food Spoilage Microorganisms. Cambridge, England: Woodhead Publishing Limited. Madigan, M. T., Brock, T. D., Martinko, J. M. & Parker, J. (1997). Brock biology of microorganisms. 8th ed. utg. Upper Saddle River, N.J: Prentice-Hall. Martino, M. E., Maifreni, M., Marino, M., Bartolomeoli, I., Carraro, L., Fasolato, L. & Cardazzo, B. (2013). Genotypic and phenotypic diversity of Pediococcus pentosaceus strains isolated from food matrices and characterisation of the penocin operon. Antonie van Leeuwenhoek, 103 (5): Mukisa, I. M., Byaruhanga, Y. B., Muyanja, C. M. B. K., Langsrud, T. & Narvhus, J. A. (2016). Production of organic flavor compounds by dominant lactic acid bacteria and yeasts from Obushera, a traditional sorghum malt fermented beverage. Food Science & Nutrition. Narvhus, J. A. & Axelsson, L. (2003). Lactic acid bacteria. I: Enclypedia of food science, technology and nutrition, s Amsterdam, Nederland: Academic press. NCBI. (2016). I: National Center for Biotechnology Information. Tilgjengelig fra: (lest ). New England Biolabs. 1 kb DNA Ladder. USA: New England Biolabs Inc. Tilgjengelig fra: (lest ). Ng ong ola-manani, T. A., Wicklund, T., Mwangwela, A. M. & Østlie, H. M. (2015). Identification and Characterization of Lactic Acid Bacteria Involved in Natural and Lactic Acid Bacterial Fermentations of Pastes of Soybeans and Soybean-Maize Blends Using Culture-Dependent Techniques and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Food Biotechnology, 29 (1): Noots, I., Delcour, J. A. & Michiels, C. W. (1999). From field barley to malt: detection and specification of microbial activity for quality aspects. Crit Rev Microbiol, 25 (2): Palmer, J. (2006). How to brew: everything you need to brew beer right the first time. Colorado: Brewers Publications.. 73

81 Paramithiotis, S., Gioulatos, S., Tsakalidou, E. & Kalantzopoulos, G. (2006). Interactions between Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria in sourdough. Process Biochemistry, 41 (12): Paucean, A., Vodnar, D.-C., Socaci, S.-A. & Socaciu, C. (2013). Carbohydrate metabolic conversions to lactic acid and volatile derivatives, as influenced by Lactobacillus plantarum ATCC 8014 and Lactobacillus casei ATCC 393 efficiency during in vitro and sourdough fermentation. European Food Research and Technology, 237 (5): Pires, E. & Brányik, T. (2015). Biochemistry of Beer Fermentation: Springer International Publishing. Porcellato, D. & Skeie, S. B. (2016). Bacterial dynamics and functional analysis of microbial metagenomes during ripening of Dutch-type cheese. International Dairy Journal, 61: Renhetloven. (2012). Store norske leksikon. Tilgjengelig fra: (lest 23.02). Romano, P., Granchi, L., Caruso, M., Borra, G., Palla, G., Fiore, C., Ganucci, D., Caligiani, A. & Brandolini, V. (2003). The species-specific ratios of 2,3-butanediol and acetoin isomers as a tool to evaluate wine yeast performance. International Journal of Food Microbiology, 86 (1 2): Saerens, S. M., Delvaux, F., Verstrepen, K. J., Van Dijck, P., Thevelein, J. M. & Delvaux, F. R. (2008). Parameters affecting ethyl ester production by Saccharomyces cerevisiae during fermentation. Appl Environ Microbiol, 74 (2): Salminen, S., Wright, A. & Ouwehand, A. (2004). Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition. USA: Marcel Dekker Inc. Sigma-Aldrich. (2014). Ingredients Catalog: Flavors & Fragrances. USA: Sigma-Aldrich Co. LLC. Tilgjengelig fra: (lest ). Spitaels, F., Van Kerrebroeck, S., Wieme, A. D., Snauwaert, I., Aerts, M., Van Landschoot, A., De Vuyst, L. & Vandamme, P. (2015a). Microbiota and metabolites of aged bottled gueuze beers converge to the same composition. Food Microbiology, 47: Spitaels, F., Wieme, A. D., Janssens, M., Aerts, M., Van Landschoot, A., De Vuyst, L. & Vandamme, P. (2015b). The microbial diversity of an industrially produced lambic beer shares members of a traditionally produced one and reveals a core microbiota for lambic beer fermentation. Food Microbiology, 49: Tanderø, L. N. (2016). Vekst, metabolisme og ølbrygging med ulike stammer av gjær Ås: MNBU, KBM. Tonsmeire, M. (2014). American sour beers: innovative techniques for mixed fermentations. Boulder, Colorado: Brewers Publications. Van Oevelen, D., Spaepen, M., Timmermans, P. & Verachtert, H. (1977). MICROBIOLOGICAL ASPECTS OF SPONTANEOUS WORT FERMENTATION IN THE PRODUCTION OF LAMBIC AND GUEUZE. Journal of the Institute of Brewing, 83 (6): Verstrepen, K. J., Derdelinckx, G., Dufour, J.-P., Winderickx, J., Thevelein, J. M., Pretorius, I. S. & Delvaux, F. R. (2003). Flavor-active esters: Adding fruitiness to beer. Journal of Bioscience and Bioengineering, 96 (2): Viljoen, B. (2006). Yeast Ecological Interactions. Yeast Yeast, Yeast Bacteria, Yeast Fungi Interactions and Yeasts as Biocontrol Agents. I: Querol, A. & Fleet, G. (2006) Yeasts in Food and Beverages. Berlim, Tyskland: Springer-Vorlag. Von Wright, A. & Axelsson, L. (2012). Lactic Acid Bacteria: An Introduction. I: Lahtinen, S., Ouwehand, A.C., Salminen, S. and von Wright, A., Eds., Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, 4th Edition. Boca Raton: Tayor & Francis Group LLC, CRC Press. Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P. & Gann, A. (2014). Molecular Biology of the Gene: Pearson. Zhang, H. & Cai, Y. (2014). Lactic Acid Bacteria: Fundamentals and Practice. Dordrecht: Dordrecht : Springer. 74

82 Vedlegg I. Omregningstabell for innhold av løselig sukker (Brix), Plato og Spesific gravity (SG). 75