Clostridium difficile

Transkript

1 Clostridium difficile -påvisning av toksin i cellekultur Hege Enger Svein Arne Nordbø St Olavs Hospital

2 Clostridium difficile Apatogen og patogen form den patogene formen er toksinproduserende men produksjon av toksin alene er ikke nok til å gi sykdom Toksin A: enterotoksin, kjemotaktisk for nøytrofile granulocytter som infiltrerer ileum og frigjør toksiner. Cytopatogen effekt, ødeleggelse av tight junctions mellom cellene og økt permeabilitet av tarmveggen vanndig diare Toksin B: cytotoksin, depolymeriserer aktin, gir ødelagt cytoskjelett colitt De fleste patogene Clostridium difficile har både toksin A og B, men toksin B er ansett å være mer sykdomsfremkallende Ribotype 027 hypervirulent stamme høyere toksinproduksjon i tillegg et binært toksin mer alvorlig klinikk

3 Forutsetning for Clostridium difficile-infeksjon Forstyrrelse av normal tykktarmsflora antibiotikabehandling, spesielt bredspektret normal tarmflora beskytter mot sykdom Eksposisjon for toksinproduserende CD-stamme toksin A og B skjer vanligvis på sykehus eller sykehjem Vertsfaktorer/mottagelighet for infeksjon nyfødte har høy forekomst av toksinproduserende CD, men sjelden sykdom(mangler reseptorer) høy alder alvorlig sykdom Smitte skjer fra person til person(kontaktsmitte) eller via kontaminert miljø(sporene kan overleve i lang tid) Inkubasjonstid: få dager-8 uker

4 Bærertilstand av Clostridium difficile Spedbarn <1 år: %. De utvikler sjelden Clostridium difficile-assossiert sykdom, sannsynligvis fordi tarmcellene mangler reseptorer for toksinet Friske voksne: 3-5 % Hospitaliserte, sengeliggende pasienter: % Romney et al: Laboratory Diagnosis of Bacterial Gastroenteritis(CMR jan 2015)

5 Klinikk Varierende sykdomsgrad Clostridium difficile- assossiert diare Clostridium difficile- assossiert colitt Pseudomembranøs colitt Toksisk megacolon

6 Diagnostikk, St Olav Avføringsprøve uten tilsetning Tidligere: ELISA-test med påvisning av toksin A og B real-time-pcr med påvisning av toksin B, dyrkning av positive Nå: bredt panel av PCR-tester, inkl C.difficile de som bare ber om C.difficile, får inhouse PCR PCR-positive prøver: dyrkning på FA-skål og CD agar Dyrkningspositive->ny PCR for bekreftelse Ribotyping retrospektivt (alle inneliggende)

7 Hvorfor toksinpåvisning i cellekultur? Få laboratorier bruker den i rutinediagnostikken høyt prøvevolum mer ressurskrevende enn f eks PCR Men: Er PCR for sensitivt? Mange publikasjoner støtter dette PCR skiller ikke mellom bærerskap og infeksjon, mulig at toksinpåvisning i cellekultur skiller bedre? Påvisning av toksineffekt versus påvisning av genet for toksinet * Toksinpåvisning i cellekultur historisk ansett som gullstandard *The Lancet Infectious Diseases 2013: Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection

8 Metode Kommersielt kit med toksin og antitoksin (Techlab, Alere) Vi testet ut HE-celler, TMG1 og LLC-MK2-celler, som allerede benyttes i rutinen på virus dyrkningslab HE-celler(Humane Embryonale fibroblaster) fungerte best Sannsynligvis bare toksin B som påvises, toksin A gir bare toksineffekt på spesialceller(ht29-celler)* Prosedyre: forbehandling av fæces fortynning av fæces, toksin og antitoksin tilsetting i cellekultur Avlesning etter timer *Manual of Clinical Microbiology, 10th edition

9 Forbehandling av fæces/fortynning Forbehandling av fæces Flytende konsistens: bruker volum 1-1,5 ml Fastere konsistens: blandes med virusdyrkningsmedium til volum ca 1-1,5 ml Sentrifugeres 10 min Supernatant filtreres gjennom 450 µm membran Fortynning Fæces 1:100 Toksin 1:100 Antitoksin 1:25

10 Utsæd i cellekultur og avlesning Utsæd: av CPE Fortynnet fæcesprøve tilsettes cellekultur med HE-celler Fortynnet fæces + antitoksin tilsettes i parallell brønn med HEceller for å se etter opphevet toksineffekt/nøytralisasjon Avlesning: Kan se ganske umiddelbar toksineffekt i noen tilfeller, men anbefalt avlesning skjer etter timer Positiv test dersom typisk CPE(cytopatogen effekt) i brønn tilsatt fortynnet fæces og dersom toksineffekt oppheves i parallell brønn tilsatt fortynnet fæces og antitoksin

11 Normale HE-celler(negativ kontroll)

12 Positiv kontroll

13 CPE grad 4 i pasientprøve

14 Nøytralisasjon(fæces tilsatt antitoksin)

15 Resultater Til sammen 70 PCR-positive prøver testet Positive i cellekultur: 55 (79 %) Negative i cellekultur: 15 (21 %)(inkludert 1 som var litt usikker) Dersom prøver med sparsomt materiale ble ekskludert: 62 Positive i cellekultur: 50 (81%) Negative i cellekultur: 12 (19%)

16 Resultater Pos i cellekultur Gjennomsnittlig CT-verdi 29,96 32,06 Neg i cellekultur Pos i cellekultur Neg i cellekultur CT 35(12 prøver) 7(58%) 5(42%) Pos i cellekultur CT<35(57 prøver) 48(84%) 9(16%) Neg i cellekultur

17 Konsistens Registrert på 49 av prøvene 10 av 49 prøver hadde fast konsistens CT-verdier: Fast konsistens utelukker ikke positivt resultat (verken for PCR eller cellekultur) Unødvendig prøvetaking, da disse pasientene per definisjon ikke har Clostridium difficile-assossiert diare og etter retningslinjene ikke skal ha behandling. Avvisning av slike prøver har vært praktisert tidligere Pos i cellekultur Neg i cellekultur 10 prøver 7 3

18 Hva med de PCR-positive som ble 15 prøver/pasienter negative i cellekultur? 10 var testet for tarmpatogene: negative 3 var testet for norovirus: negative 1 av disse 3 var også testet for andre virus(adeno og rota): negativ

19 De PCR-positive og cellekultur negative Pas 1 Barn kreft Nøytropen feber Pas 9 Fastlege Ktr. etter beh. Cl.diff Pas 2 ØNH Løs mage Pas 10 Gastro pol Ulcerøs colitt 6 mndr. Pas 3 Gastrokir Diare Pas 11 Ort avd Slim, hyppig avføring Pas 4 Gastrokir Diare x 11, CRP 200 Pas 5 Med OSS Høy feber, red AT Pas 12 Fastlege Løs og hyppig avføring Pas 13 Fastlege Vært i Tyrkia, diare Pas 6 Gastro pol Løs avf 1 mnd Pas 14 Øya helsehus Ingen kliniske opplysninger Pas 7 Med OSS Nitritt pos Pas 15 Ort avd Tyntflytende vanndig diare 1 døgn Pas 8 Nyre/endo Redusert AT, diare

20 Hva skjer videre? Cellekultur i tillegg til PCR på PCR-positive med usikre symptomer? Cellekultur på PCR-negative med høy klinisk mistanke om Clostridium difficile-infeksjon? Vi har ikke testet PCR-negative bortsett fra en prøve med rotavirus(som ble negativ i cellekultur). Sensitivitet har ikke vært beskrevet som et problem med PCR Vi sliter med leveranse av antitoksin..