QIAamp DSP virussett 50 Håndbok

Transkript

1 November 2007 QIAamp DSP virussett 50 Håndbok Versjon 1 QIAamp DSP virussett er et generisk system som bruker QIAamp-teknologi for isolering og rensing av virusnukleinsyrer fra humane plasma- eller serum-prøver for in vitrodiagnostikkprosedyrer. For in vitro-diagnostisk bruk NO 11/2007 QIAGEN GmbH, D Hilden, Tlf.: R NO Sample & Assay Technologies

2 Varemerker: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Group); artus, RealArt (artus GmbH); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Registrerte navn, varemerker osv. som brukes i dette dokumentet skal ikke betraktes som ubeskyttet av lov, selv om de ikke spesifikt er merket som dette. PCR-prosessen er dekket av de amerikanske patentene 4,683,195 og 4,683,202 og utenlandske tilsvarende patenter som eies av Hoffmann-La Roche AG QIAGEN, alle rettigheter forbeholdt.

3 Innhold Pakkens innhold 4 Symboler 5 Oppbevaring 6 Kvalitetskontroll 6 Bruksområde 6 Begrenset bruk av produktet 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Introduksjon 9 Prinsipp og prosedyre 12 Utstyr og reagenser som bruker må anskaffe 15 Viktige merknader 16 Viktige momenter før du starter 16 Klargjøre RNA 17 Lagre prøver 17 Klargjøre reagenser og bufre 17 Elutere virusnukleinsyrer 20 Ytelse og kvalitet på virusnukleinsyrer 20 Sette opp QIAvac 24 Plus vakuumsystem 21 Protokoll: Isolering og rensing av virusnukleinsyrer fra plasma og serum23 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007 3

4 Pakkens innhold QIAamp DSP viruskit Katalognr Antall klargjøringer 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute kolonner med vaskerør (WT) (2 ml) 50 EXT Kolonneutvidere (3 ml) 50 ET Elusjonsrør (1,5 ml) 50 VC VacConnectors 50 LT Lysisrør (2 ml) 50 WT Vaskerør (2 ml) 50 AL Lyseringsbuffer* 33 ml AW1 Vaskebuffer 1* (konsentrat) 19 ml AW2 Vaskebuffer 2 (konsentrat) 13 ml AE Elusjonsbuffer (purpurfarget lokk) 4 x 2 ml PS Proteaseløsning 4,4 ml Bærer Bærer-RNA (røde lokk) 310 QP QIAGEN protease 1 vial CD H B 1 Håndbok 1 * Inneholder guanidinhydroklorid. Ikke kompatibel med desinfiseringsmidler som inneholder blekemiddel. Se side 7 for sikkerhetsinformasjon. Inneholder natriumazid som preserveringsmiddel. Resuspensjonsvolum 4,4 ml. 4 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

5 2 C 8 C Ved Symboler i 50 Settet inneholder reagenser til 50 prøveklargjøringer Se informasjonen som gis i håndboken. Skal brukes innen In vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Katalognummer Partinummer Materialenummer Komponenter Volum Temperaturbegrensninger Ved ankomst Lovlig produsent Viktig merknad Skift hansker etter protokolltrinn med dette merket? EtOH levering: lagre QIAamp Mini spinnkolonner ved 2 8 C Skriv ned aktuell dato etter at du har tilsatt flasken etanol Legge til Inneholder Lyofilisert Rekonsituer i Etanol Guanidinhydroklorid Subtilisin Fører til Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007 5

6 Oppbevaring QIAamp MinElute-kolonner skal lagres ved 2 8 C ved ankomst. Alle bufre kan lagres ved romtemperatur (15 25 C). Lyofilisert bærer-rna kan lagres ved romtemperatur (15 25 C) inntil utløpsdato. Bærer-RNA kan kun løses i elusjonsbuffer (AVE); løst bærer-rna skal umiddelbart tilføres lyseringsbuffer (AL) slik som beskrevet på side 18. Denne løsningen skal klargjøres fersk og er stabil ved 2 8 C i opptil 48 timer. Ubrukte porsjoner av bærer-rna løst i elusjonsbuffer (AVE) skal fryses i alikvoter ved 20 C. Lyofilisert QIAGEN protease (QP) kan lagres ved romtemperatur (15 25 C) inntil utløpsdato uten reduksjon i ytelsen. Rekonstituert QIAGEN protease (QP) er stabil i inntil 1 år ved lagring ved 2 8 C, men kun inntil utløpsdatoen. Rekonstituert vaskebuffer 1 (AW1) og rekonstituert vaskebuffer 2 (AW2) er stabile i inntil 1 år ved lagring ved romtemperatur (15 25 C), men kun inntil utløpsdatoen. Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs sertifiserte totale kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti med QIAamp DSP virussett mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. Bruksområde QIAamp DSP virussett er et generisk system som bruker QIAamp-teknologi for isolering og rensing av virusnukleinsyrer fra humane plasma- eller serumprøver for in vitro-diagnostikkformål. Alle diagnostiske resultater som er generert ved bruk av prøveklargjøringsprosedyren i sammenheng med downstream diagnostisk NAT-analyse skal tolkes med hensyn til andre kliniske funn eller laboratoriefunn. Produktet er ment for bruk av profesjonelle brukere, slik som teknikere og fysikere som er opplært i molekylær-biologiske teknikker. Det er utformet til å brukes med enhver downstream-applikasjon som bruker enzymatisk amplifisering eller annen enzymatisk modifisering av DNA eller RNA fulgt av signaldetektering eller amplifisering. De isolerte og rensede virusnukleinsyrene kan brukes i både kvalitativ (f.eks. blodscreening) og kvantitativ (f.eks. viruslastovervåkning) diagnostiske NAT-analyser. For å minimere uregelmessigheter i diagnostiske resultater, er produktet ment til bruk med en intern kontroll, samt positive og negative kontroller gjennom 6 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

7 prøveklargjøringsprosessen, og prøveamplifisering og -deteksjon ifølge downstream-analysen som brukes. Produktet er utformet til bruk med QIAvac 24 Plus vakuumsystem eller tilsvarende vakuumsystem. Begrenset bruk av produktet Settet er ikke beregnet til bruk med blod, vev, benmarg eller kulturceller. Settet er heller ikke for isolering og rensing av bakterielle, fungale eller parasittiske nukleinsyrer. Ytelsen til settet når det gjelder å isolere og rense virusnukleinsyrer fra andre cellefri kroppsvæsker, slik som urin og CSF, har ikke blitt evaluert. Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du finne, vise og skrive ut MSDS for hvert QIAGEN-sett og settkomponent. FORSIKTIG: Ikke tilfør blekemidler eller sure løsninger direkte til prøvepreparatavfall. Lyseringsbuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) inneholder guanidinhydroklorid som kan danne sterkt reaktive forbindelser når kombinert med blekemiddel. Hvis væske som inneholder disse bufrene søles, må det rengjøres med egnet laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis væsken som søles inneholder potensielt smittefarlige stoffer, renses det berørte området først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, deretter med 1 % (v/v) natriumhypokloritt. Hvis bufferflaskene er ødelagte eller lekker, bruk hansker og beskyttelsesbriller når flaskene kastes for å unngå personlig skade eller skade på andre. QIAGEN har ikke testet væskeavfall som genereres av QIAamp DSP virusprosedyre for resterende infeksjonsmaterialer. Kontaminering av væskeavfallet med resterende infeksjonsmaterialer er svært usannsynlig, men kan ikke ekskluderes fullstendig. Derfor må væskeavfall betraktes som infeksjonsfarlig og kan håndteres og kastes etter lokale sikkerhetsforskrifter. Følgende risiko og sikkerhetsuttrykk gjelder komponenter for QIAamp DSP virussett. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007 7

8 Lyseringsbuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) Inneholder guanidinhydroklorid: skadelig, irriterende. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R22-36/38, S QIAGEN protease (QP) Inneholder subtilisin (fra Bacillus subtilis): sensibilisator, irritant. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R37/ , S /37/ timers nødsinformasjon Medisinsk nødsinformasjon på engelsk, fransk og tysk kan skaffes 24 timer i døgnet fra: Poison Information Center Mainz, Tyskland Tlf.: * R22: Skadelig ved svelging. R36/38: Irriterer øynene og huden. R37/38: Irriterende for åndedrettssystemet og huden. R41 Fare for alvorlig øyeskade. R42: Kan gi allergi ved innånding. S13: Må ikke oppbevares sammen med næringsmidler. S22: Unngå innånding av støv. S24: Unngå hudkontakt. S26: Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. Bruk egnede verneklær. S36/37/39: Bruk egnet verneutstyr, hansker og øye/ansiktsvern. S46: Ved svelging, kontakt lege omgående og vis denne beholderen eller etiketten. 8 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

9 Introduksjon QIAamp DSP virussett bruker veletablert teknologi for simultan isolering og rensing av virus-dna og -RNA. QIAamp DSP virusprosedyre kombinerer de selektive bindeegenskapene til en silica-basert membran med minimale elusjonsvolumer på 20 μl eller 60 μl. Det lineære området for QIAamp DSP virusprosedyre har blitt fastsatt for HIV RNA og HBV DNA i flere diagnostiske downstream-analyser (tabell 1, figur 1 og 2). Tabell 1. Diagnostiske downstream-analyser der det lineære området for QIAamp DSP virusprosedyre har blitt testet Analyse Sett Sanntids RT-PCR av HIV RNA TaqMan -analyse og COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR -test Sanntids PCR av HBV DNA TaqMan analyse og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007 9

10 Lineært område for QIAamp DSP virusprosedyre ved bruk av TaqMananalyser A A log result IU/ml logg resultat IU/ml logg resultat IU/ml B log result IU/ml y = 1,0042x x + 0, R 2 = 0,9974 R 2 = log input IU/ml logg inngang IU/ml y = 0,9725x x + 0, R 2 = 0,9984 R 2 = log input IU/ml logg inngang IU/ml Figur 1. Det lineære området til QIAamp DSP virusprosedyre ved 60 μl elusjonsvolum har blitt bestemt ved bruk av TaqMan-analyser for A HIV RNA og B HBV DNA. 10 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

11 Lineært område for QIAamp DSP virusprosedyre ved bruk av COBAS AMPLICOR MONITOR-tester AA log result IU/ml logg resultat IU/ml B log result IU/ml logg resultat IU/ml y = x R 2 = y = 1,0098 x R 2 = 0, logg input inngang IU/ml y = 0,8839x x R 2 = 0,984 R 2 = logg input inngang IU/ml Figur 2. Det lineære området til QIAamp DSP virusprosedyre ved 60 μl elusjonsvolum har blitt bestemt ved bruk av COBAS AMPLICOR MONITOR Tests for A HIV RNA og B HBV DNA. Prosedyren egner seg for bruk med plasma eller serum; begge kan inneholde citrat eller EDTA. Prøvene kan enten være ferske, lyofiliserte eller frosne, forutsatt at de ikke har vært frosset og tinet opp mer enn én gang. Prosedyren kan brukes for isolasjon av virus-rna og -DNA fra en bred rekke RNA- og DNA-viruser. Prosedyren er utformet for å unngå krysskontaminering fra prøve til prøve og gjør det mulig med sikker håndtering av potensielt smittefarlige prøver. Prosedyren er høyst egnet for simultan prosessering av flere prøver. Virusnukleinsyrer eluteres i elusjonsbuffer (AVE), klar til bruk i amplifiseringsreaksjoner eller lagring ved 20 C. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

12 Prinsipp og prosedyre QIAamp DSP virusprosedyren består av 4 trinn: Lysere viruspartiklene i prøven Binde virusnukleinsyrene i lysatet til membranen på en QIAamp MinElute-kolonne Vaske membranen Elutere virusnukleinsyrene fra membranen Prosedyren utføres ved bruk av QIAamp MinElute-kolonner på et vakuummanifold. Prøvevolum Deteksjonsgrensen (DL) og kvantifiseringsgrensen (QL) har ifølge ICHretningslinjer 2QA og 2QB blitt bestemt for QIAamp DSP virusprosedyre (med et startprøvevolum på 500 μl og elusjonsvolum på 20 μl og 60 μl) ved bruk av ulike diagnostiske downstream-analyser (tabell 2 og 3). Tabell 2. Deteksjonsgrense for QIAamp DSP virusprosedyre Analyse Elusjonsvolum 95 % cutoff artus RealArt HBV DNA 20 μl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 μl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 μl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 μl 4,73 IU/ml (n=192) 12 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

13 Tabell 3. Kvantifisering for QIAamp DSP virusprosedyre Analyse QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70 % (n=88) TaqMan HIV RNA COBAS AMPLICOR HIV RNA COBAS AMPLICOR HBV DNA COBAS AMPLICOR HCV RNA 52 IU/ml < 60 % (n=88) 100 IU/ml < 60 % (n=88) 30 IU/ml < 60 % (n=88) 700 IU/ml < 60 % (n=66) Lysering av viruspartikler Prøver lyseres under denatureringsbetingelser ved økte temperaturer. Lysering utføres i tilstedeværelse av QIAGEN Protease (QP) og lyseringsbuffer (AL), som sammen sikrer inaktivering av RNaser. Binde nukleinsyrer til QIAamp MinElute-kolonnemembranen For å optimalisere bindingen av virus-dna og -RNA til QIAamp MinElute kolonnemembranen tilsettes først etanol til lysatene. Hvert lysat påføres deretter til en QIAamp MinElute-kolonne, og virusnukleinsyrer adsorberes på silica-gelmembranen etter som lysatet trekkes gjennom ved vakuumtrykk. Fjerne resterende kontaminanter Mens virusnukleinsyrene holder seg bundet til QIAamp MinElutekolonnemembranen, vaskes kontaminantene effektivt bort ved bruk av først vaskebuffer 1 (AW1), deretter vaskebuffer 2 (AW2) og deretter etanol. Elutere rene nukleinsyrer Virusnukleinsyrer eluteres fra QIAamp MinElute-kolonnemembranen ved bruk av elusjonsbuffer (AVE). QIAamp MinElute-kolonner gjør det mulig med elusjonsvolum på 20 μl eller 60 μl. Avhengig av downstream-analysen som brukes, kan nukleinsyreeluatet bestå av inntil 50 % av reaksjonsvolumet uten noen hemmende effekter. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

14 QIAamp DSP Virus Procedure QIAamp DSP virusprosedyre Prøve Sample Lysering Binding Bind Les nøye gjennom protokollen (side 23 før start) Til LT, tilsett 75 μl QP, 500 μl prøve og 500 μl AL Vortex 15 s Inkuber 15 min. (±1 min.) ved 56 C (±1 C) Tilfør 600 μl etanol Vortex 15 s Inkuber 5 min. (±1 min.) ved romtemperatur (15 25 C) Vakuum Vacuum Overføring av lysat til QIAamp MinElute-kolonnen med påfestet EXT Vakuum Vacuum Vask Wash (AW1) Remove Fjern EXT before før vakuum vacuum is påføres applied Tilfør 600 μl rekonstituert AW1 Fjern EXT Vakuum Vacuum Wash Vask (AW2) Wash Vask (ethanol) (Etanol) Tilfør 700 μl rekonstituert AW2 Tilfør 750 μl etanol Vakuum Vacuum Dry Tørr spin spinn Elute Eluer Pure viral nucleic acids Rene virusnukleinsyrer Plasser QIAamp MinElute-kolonnen i WT Sentrifuger 1 min. ved o/min. Plasser QIAamp MinElute-kolonnen i WT Inkuber 3 min. ved 56 C Plasser QIAamp MinElute-kolonnen i ET Tilfør 20 μl eller 60 μl AVE Inkuber 3 min. ved romtemperatur (15 25 C) Sentrifuger 1 min. ved o/min. 14 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

15 Utstyr og reagenser som bruker må anskaffe Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, vennligst se gjeldende HMS-datablad (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. Etanol ( %) Pipetter* og pipettspisser (for å unngå krysskontaminering anbefaler vi sterkt å benytte pipettspisser med aerosolbarrierer) Éngangshansker Varmeblokk* for lysering av prøver ved 56 C (vi anbefaler Eppendorf Thermomixer comfort med termoblokk for 2,0 ml mikrotestrør ) Mikrosentrifuge* Målesylinder (50 ml) Vortexer QIAvac 24 Plus vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr , QIAvac tilkoblingssystem, kat.nr og vakuumpumpe, kat.nr ), eller tilsvarende generelt laboratorievakuumsystem * For å sikre at prøvene behandles tilstrekkelig i QIAamp DSP virusprosedyren, anbefaler vi på det sterkeste at instrumenter (f.eks. pipetter og varmeblokker) kalibreres ifølge produsentenes anbefalinger. Dette er ikke en fullstendig liste over leverandører og inkluderer ikke mange viktige forhandlere av biologiske varer. Tilgjengelig innen midten av 2004, se Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

16 Viktige merknader Viktige momenter før du starter Etter mottak av settet, kontroller settkomponentene for skade. Hvis boblepakningene eller bufferflaskene er skadet, ta kontakt med QIAGENs tekniske service eller din lokale leverandør. Ved søl av væske, se "Sikkerhetsinformasjon" (side 7). Ikke bruk skadede komponenter, siden bruk av disse kan føre til dårlig settytelse. Bruk alltid RNase-fritt utstyr. Lagre etanol ( %) på is under prosedyren. Skift alltid pipettespissene ut mellom væskeoverføringer. For å unngå krysskontaminering anbefaler vi sterkt å benytte pipettspisser med aerosolbarrierer. Alle sentrifugeringstrinn utføres ved romtemperatur (15 25 C). Bruk alltid engangshansker, og kontroller regelmessig at de ikke er kontaminert med prøvemateriale. Kast hanskene hvis de blir kontaminert, og minst ved alle trinn som er merket med hanskesymbolet. For å unngå krysskontaminering, åpne kun ett rør om gangen. Ikke bruk settkomponentene fra andre sett med det settet du bruker i øyeblikket, med mindre partinumrene er identiske. Unngå mikrobiell kontaminasjon av settreagensene. For å sørge for sikkerhet mot potensielt smittefarlig materiale, anbefaler vi å jobbe under laminar air-flow-forhold inntil prøvene er lysert. Dette settet skal kun brukes av personale som er opplært i in vitrodiagnostisk laboratoriepraksis. Prosedyren gir instruksjoner for behandling av en enkelt plasma- eller serumprøve. Inntil 24 prøver kan imidlertid behandles samtidig på QIAvac 24 Plus vakuumsystem. 16 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

17 Klargjøre RNA Ved klargjøring av virus-rna, jobb hurtig gjennom de manuelle trinnene i prosedyren. Elusjonsbuffer (AVE) inneholder natriumazid*, et antimikrobielt middel som forhindrer vekst av RNase-produserende organismer. Men siden denne bufferen ikke inneholder noen RNase-nedbrytende kjemikalier, vil den ikke aktivt hindre RNaser som introduseres gjennom uegnet håndtering. Det må utvises ekstrem forsiktighet for å unngå kontaminering med RNaser ved håndtering av elusjonsbuffer (AVE). Lagre prøver Etter innsamling og sentrifugering, kan plasma eller serum oppbevares ved 2 8 C i opptil 6 timer. For langsiktig oppbevaring anbefales frysing ved 20 C eller 80 C i alikvoter. Frosne plasma- eller serumprøver må ikke tines opp mer enn én gang. Gjentatte frysinger-opptininger fører til nedbrytning og presipitering av proteiner, noe som fører til reduserte virustitre og derfor reduserte avgivelser av virusnukleinsyrer. I tillegg vil kryopresipitater som er dannet under frysing-opptining tilstoppe QIAamp MinElute-kolonnemembranen. Hvis kryopresipitater er synlige, skal de pelleteres ved sentrifugering ved omtrent 6800 x g i 3 minutter. Den rensede supernatant skal aspireres og prosesseres umiddelbart uten å forstyrre pellet. Klargjøre reagenser og bufre Klargjøre QIAGEN protease Tilfør hele innholdet av flasken med 4,4 ml proteaseløsning (PS) til flasken med lyofilisert QIAGEN protease (QP), og bland forsiktig. For å unngå skumming, bland ved å vende flasken flere ganger. Se til at QIAGEN protease (QP) er helt oppløst. i Ikke tilfør QIAGEN protease (QP) direkte til lyseringsbufferen (AL). * Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

18 Tilføre bærer-rna og intern kontroll til lyseringsbuffer Bærer-RNA har to formål. For det første øker den bindingen av virusnukleinsyrer til QIAamp MinElute kolonnemembranen, spesielt hvis det er svært få målmolekyler i prøven. For det andre reduserer tilføringen av store mengder bærer-rna sjansen for virus-rna-nedbrytning i det sjeldne tilfellet at RNase-molekylene ikke nedbrytes av de kaotropiske saltene og rengjøringsmiddelet i lyseringsbufferen (AL). Hvis bærer-rna ikke tilføres lyseringsbufferen (AL), kan dette føre til redusert virus-rna eller -DNAgjenoppretting. Bærer-RNA kan også inkluderes i noen interne kontrollreagenser for kommersielle downstream-analyser. I disse tilfellene, se relevant bruksanvisning fra produsenten av downstream-analysen. Bruk av en intern kontroll anbefales på det sterkeste ved bruk av QIAamp DSP virussett i kombinasjon med diagnostiske amplifiseringssystemer. Intern kontroll-rna eller -DNA og rekonstituert bærer-rna skal tilføres lyseringsbufferen (AL) og blandet grundig ved å vende røret 10 ganger. For å unngå skumming, ikke utfør vortex. Se produsentens instruksjoner for å bestemme optimal konsentrasjon av internkontroll. Bruk av en annen konsentrasjon enn den som anbefales, kan føre til feil resultater. Ved kalkulering av riktig mengde internkontroll til bruk, ta beregning for startvolum av prøven og elusjonsvolumet. Husk på at QIAamp DSP virussett bruker startprøvevolum på 500 μl. For å klargjøre bærer-rna-løsningen, tilfør 310 μl elusjonsbuffer (AVE) til røret som inneholder 310 μg lyofilisert bærer-rna for å oppnå en løsning på 1 μg/μl. Løs opp bærer-rna grundig, del det i alikvoter i passende størrelse, og lagre det ved 20 C. Ikke frys-tin alikvoter med bærer-rna mer enn 2 ganger. Merk at bærer-rna ikke løses opp i lyseringsbuffer (AL). Det må først løses i elusjonsbuffer (AVE) og deretter legges til lyseringsbufferen (AL). Se til at bærer- RNA er fullstendig oppløst i riktig volum av elusjonsbuffer (AVE) før det blandes med lyseringsbuffer (AL). i Bruk alltid riktig internkontroll for downstream-analysen. Se produsentens instruksjoner for mer informasjon. Kalkuler volumet på lyseringsbuffer (AL)/bærer-RNA-blandingen som er nødvendig pr. prøveomgang ved å velge antall prøver som skal behandles samtidig fra tabell 4 (side 19). Volumene er kalkulert ved bruk av følgende prøvekalkulering: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 μl/ml = z μl 18 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

19 der: n = antall prøver som skal behandles samtidig y = kalkulert volum av lyseringsbuffer (AL) z = volum av bærer-rna/elusjonsbuffer (AVE) som skal tilføres lyserings- buffer (AL) Tabell 4. Volum lyseringsbuffer (AL) og bærer-rna/elusjonsbuffer (AVE) som er nødvendig for QIAamp DSP virusprosedyre Ant. prøver Vol. AL (ml) Vol. bærer- RNA/AVE (μl) Ant. prøver Vol. AL (ml) Vol. bærer- RNA/AVE (μl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43, ,45 117,0 8 4,40 49, ,00 123,2 9 4,95 55, ,55 129,4 10 5,50 61, ,10 135,5 11 6,05 67, ,65 141,7 12 6,60 73, ,20 147,8 Klargjøre vaskebuffer 1 Bruk en målesylinder, tilfør 25 ml etanol ( %) til flasken som inneholder 19 ml vaskebuffer 1 (AW1)-konsentrat. Lagre den rekonstituerte vaskebufferen 1 (AW1) ved romtemperatur (15 25 C). i Bland alltid den rekonstituerte vaskebufferen 1 (AW1) ved å vende flasken flere ganger før prosedyren startes. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

20 Klargjøre vaskebuffer 2 Bruk en målesylinder og tilfør 30 ml etanol ( %) til flasken som inneholder 13 ml vaskebuffer 2 (AW2)-konsentrat. Lagre den rekonstituerte vaskebufferen 2 (AW2) ved romtemperatur (15 25 C). i Bland alltid den rekonstituerte vaskebufferen 2 (AW2) ved å vende flasken flere ganger før prosedyren startes. Klargjør elusjonsbuffer Fire rør elusjonsbuffer (AVE) leveres med settet. Pass på å ikke kontaminere bufferen med RNaser. Ved gjennomføring av 4 renseprosedyrer eller mindre ved bruk av et enkelt sett, anbefaler vi å kaste røret med elusjonsbuffer (AVE) på slutten av hver prosedyre. Elutere virusnukleinsyrer For downstream-applikasjoner som krever små startvolum (f.eks. noen PCR- og RT-PCR-analyser), kan bruk av virusnukleinsyre eluert i 20 μl elusjonsbuffer (AVE) øke analysesensitiviteten. Volumet med virusnukleinsyrer som er eluert fra en QIAamp MinElute-kolonne kan være inntil 5 μl mindre enn volumet til elusjonsbufferen (AVE) som påføres kolonnen. For eksempel fører eluering av virusnukleinsyrer med 60 μl elusjonsbuffer (AVE) til et eluat på omtrent 55 μl, mens eluering med 20 μl resulterer i omtrent 15 μl eluat. Eluatvolumet som gjenopprettes avhenger av type prøve. Hvis volumet på gjenopprettet eluat er for lavt for downstream-analysen, øk volumet ved å legge til mer elusjonsbuffer (AVE). Eluerte virusnukleinsyrer samles opp i elusjonsrør (ET). Ved lagring av virusnukleinsyrene i opptil 24 timer, anbefaler vi lagring ved 2 8 C. Ytelse og kvalitet på virusnukleinsyrer Ytelsen og kvaliteten på de isolerte virusnukleinsyrene egner seg for alle typer downstream-deteksjonsprosedyrer i molekylær diagnostikk. Diagnostiske analyser skal utføres ifølge produsentenes instruksjoner. 20 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

21 Sette opp QIAvac 24 Plus vakuumsystem Se til at du gjennomfører oppsett av kolonneforlenger (EXT), QIAamp MinElutekolonne, VacConnector (VC) og VacValve på riktig måte (se figur 3) Figur 3. Montering av komponenter i QIAamp DSP virussett for vakuumprosessering av prøver: 1: VacValve (leveres med vakuumsystemet) 3: QIAamp MinElute-kolonne 2: VacConnector (VC) 4: Kolonneforlenger (EXT) Vi anbefaler å merke lyseringsrørene (LT), elusjonsrørene (ET) og QIAamp MinElute-kolonnene for bruk på QIAvac 24 Plus vakuumsystem etter skjemaet i figur 4 for å kunne unngå sammenblanding av prøver. Denne figuren kan kopieres og merkes med navnene på prøvene. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

22 Dato: Operatør: Kjørings-ID: Figur 4. Merkingsskjema for lyseringsrørene (LT), elusjonsrørene (ET) og QIAamp MinElutekolonnene for bruk på QIAvac 24 Plus vakuumsystem. 22 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

23 Protokoll: Isolering og rensing av virusnukleinsyrer fra plasma og serum For isolering og rensing av virusnukleinsyrer fra 500 μl EDTA- eller citratbehandlet plasma og serum. Ting du skal gjøre før du starter Ekvilibrer prøvene til romtemperatur (15 25 C), og se til at de blandes godt. Tilfør bærer-rna rekonstituert i elusjonsbuffer (AVE) eller internkontroll til lyseringbuffer (AL) ifølge instruksjonene på side 18. Se til at vaskebuffer 1 (AW1), vaskebuffer 2 (AW2) og QIAGEN protease (QP) har blitt klargjort etter instruksjonene i "Viktige bemerkninger" på side 16. Ekvilibrer elusjonsbuffer (AVE) til romtemperatur (15 25 C) for bruk i trinn 18. Hvis mulig, bruk fersk elusjonsbuffer (AVE) for hver prosedyre (4 rør medfølger). Still inn en varmeblokk til 56 C for bruk i trinn 4 og 17. For å unngå krysskontaminering, sett inn en VacConnector (VC) i hver lueradaptor på vakuumsystemet. Se til at avfallsflasken til vakuumsystemet er tom og at alle koblinger er tilkoblet riktig. For detaljer om operasjon av vakuumsystemet, spesielt vedlikehold, se håndboken som medfølger. Prosedyre 1. Pipetter 75 μl QIAGEN protease (QP) inn i et lyseringsrør (LT). i Kontroller utløpsdatoen på den rekonstituerte proteasen før bruk. 2. Tilfør 500 μl plasma eller serum til lyseringsrøret (LT). 3. Legg til 500 μl lyseringsbuffer (AL) (som inneholder 11,2 μg/ml bærer-rna) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland med puls-vortex i 15 s. For å sikre effektiv lysering, er det avgjørende at prøven og lyseringsbufferen (AL) blandes grundig for å fremskaffe en homogen løsning. i Lyseringsbuffer (AL) inneholder internkontroll. Siden lyseringsbufferen (AL) har en høy viskositet, se til å tilføre riktig volum av lyseringsbufferen (AL) ved å pipettere forsiktig eller ved bruk av en egnet pipett, slik som en Eppendorf multistep-pipette eller tilsvarende. Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

24 i Ikke tilfør QIAGEN protease (QP) direkte til lyseringsbufferen (AL). 4. Inkuber ved 56 C (±1 C) i 15 min. (±1 min.). 5. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 6. Skift hansker, og åpne lyseringsrøret (LT) forsiktig. 7. Tilfør 600 μl etanol ( %) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland grundig ved pulsvortex i 15 s. Inkuber i 5 min. (±1 min.) ved romtemperatur (15 25 C). 8. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 9. Sett inn QIAamp MinElute-kolonnen i VacConnector (VC) på vakuumsystemet (se figur 3, side 21). Sett inn en kolonneforlenger (EXT) i den åpne QIAamp MinElute-kolonnen. i Behold vaskerøret (WT) for tørt spinn i trinn Skift hansker, og åpne kun ett rør om gangen. 11. Påfør forsiktig hele lysatet fra trinn 7 til kolonneforlengeren (EXT) på QIAamp MinElute-kolonnen uten at kanten blir våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp MinElute kolonnemembranen med pipettespissen. 12. Slå på vakuumpumpen. Etter at lysatet er trukket inn gjennom QIAamp MinElute-kolonnen, åpne ventilen på vakuumsystemet, og slipp ut vakuum. Ved prosessering av flere QIAamp MinElute-kolonner samtidig, anbefaler vi å lukke VacValve på hver kolonne etter at lysatet har kommet gjennom for å redusere varigheten på dette vakuumtrinnet. i Hvis lysatet ikke har kommet helt igjennom membranen etter 15 min., kast QIAamp MinElute-kolonnen og gjenta prosedyren med en ny prøve. i Vakuumsystemventilen skal brukes for hurtig frigjøring av vakuumtrykket. 13. Påfør 600 μl vaskebuffer 1 (AW1) til QIAamp MinElute-kolonnen. Fjern forsiktig og kast kolonneforlengeren (EXT), og lukk ventilen på vakuumsystemet. Etter at vaskebufferen 1 (AW1) er trukket inn gjennom QIAamp MinElute-kolonnen, åpne ventilen, og slipp ut vakuum. i For å unngå krysskontaminering, se til at fjernede kolonneforlengere (EXT) ikke passerer over nærliggende QIAamp MinElute-kolonner. 24 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

25 14. Påfør 750 μl vaskebuffer 2 (AW2) til QIAamp MinElute-kolonnen uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp MinElute kolonnemembranen med pipettespissen. La lokket på kolonnen være åpent, og lukk ventilen på vakuumsystemet. Etter at vaskebufferen 2 (AW2) er trukket inn gjennom QIAamp MinElute-kolonnen, åpne ventilen, og slipp ut vakuum. 15. Påfør 750 μl etanol ( %) til QIAamp MinElute-kolonnen uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp MinElute kolonnemembranen med pipettespissen. La lokket på kolonnen være åpent, og lukk ventilen på vakuumsystemet. Etter at etanol er trukket inn gjennom QIAamp MinElute-kolonnen, åpne ventilen, og slipp ut vakuum. i Bruk pipettespisser med aerosolbarriere for å påføre etanol til QIAamp MinElute-kolonnen. 16. Lukk lokket på QIAamp MinElute-kolonnen, fjern det fra vakuumsystemet, og kast VacConnector (VC). Plasser QIAamp MinElute-kolonnen i vaskerøret (WT) som ble lagret fra trinn 9, og sentrifuger ved full hastighet (omtrent x g, eller o/min.) i 1 min. for å tørke membranen helt. Kast vaskerøret (WT) som inneholder filtratet. i Utelatelse av tørrsentrifugeringen kan føre til hemming av downstreamanalysen. 17. Plasser QIAamp MinElute-kolonne i et nytt vaskerør (WT), og inkuber med lokket åpent ved 56 C i 3 min. for å fordampe resterende væske. 18. Plasser QIAamp MinElute-kolonnen i et rent elusjonsrør (ET), og kast vaskerøret (WT). Åpne forsiktig lokket på QIAamp MinElute-kolonnen, og påfør 20 μl eller 60 μl elusjonsbuffer (AVE) (avhengig av downstream-analysen) på midten av membranen. Lukk lokket, og inkluber ved romtemperatur (15 25 C) i 3 min. Sentrifuger ved full hastighet (omtrent x g, eller o/min.) i 1 min. for å eluere virusnukleinsyrene. i Følg vedlikeholdsprosedyrene for vakuumsystemet etter utføring av denne protokollen (se håndboken som medfulgte vakuumsystemet for flere opplysninger). Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

26 Denne siden skal være tom 26 Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/2007

27 Denne siden skal være tom Håndbok for QIAamp DSP virussett 11/

28 Australia Bestillinger Faks Teknisk Østerrike Bestillinger 0800/ Faks 0800/ Teknisk 0800/ Belgia Bestillinger Faks Teknisk Canada Bestillinger Faks Teknisk 800-DNA-PREP ( ) Kina Bestillinger Faks Teknisk Danmark Bestillinger Faks Teknisk Finland Bestillinger Faks Teknisk Frankrike Bestillinger Faks Teknisk Tilbud Tyskland Bestillinger Faks Teknisk Hong Kong Bestillinger Faks Teknisk Irland Bestillinger Faks Teknisk Italia Bestillinger Faks Teknisk Japan Telefon Faks Teknisk Korea (Sør) Bestillinger Faks Teknisk Luxembourg Bestillinger Faks Teknisk Nederland Bestillinger Faks Teknisk Norge Bestillinger Faks Teknisk Singapore Bestillinger Faks Teknisk Sverige Bestillinger Faks Teknisk Sveits Bestillinger Faks Teknisk Storbritannia Bestillinger Faks Teknisk USA Bestillinger Faks Teknisk 800-DNA-PREP ( ) NO 11/2007 Sample & Assay Technologies