KURSHEFTE I MIKROBIOLOGI

Transkript

1 Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet Institutt for bioteknologi KURSHEFTE I MIKROBIOLOGI Emne: TBT Per Bruheim, Olav Vadstein, Marte Dragset Revidert - -

2 Noen ord/begreper vi kommer til å bruke, slå opp i læreboka hvis du ikke kan disse! Anaerob Aseptisk teknikk Autoklavere Cellemorfologi (staver/kokker) Homogenisat Inkubere Inokulere Inokulum Koloni Kultur Pode Preparat (mikroskopi) Resistens Resuspendere Stamme Steril Supernatant Turbiditet - -

3 GENERELL ORDEN En del utstyr til forsøkene er samlet i en skuff i benken. Denne skuffen skal inneholde: Fast utstyr (Skal ikke kastes) En podenål En smukk til pasteur-pipetter Forbruksvarer (be om mer når det er tomt) En eske objektglass En eske dekkglass Når kurset er over ryddes eskene på plass i skuffen. Kasting av brukt engangsutstyr. Glass kastes i pappboks med svart plastpose, merket glassavfall. KUN glass og ikke noe annet kastes i denne! (NB! Knust glass skal kostes opp tvert (særlig ubehagelig er dekkglass som mistes, de er svært vanskelig å oppdage av andre enn de som mister dem, før man skjærer seg på dem). Brannfarlig avfall skal kastes i røde dunker (lite aktuelt på dette kurset). Alt annet (papir, engangshansker, plastpipetter, petriskåler osv.) kastes i svarte sekker eller i papirkurver. Rydding Før dere forlater kursalen, skal dere sørge for følgende: Væsker/gamle bakteriekulturer skal helles ut i vasken, utstyret skylles, tusj fjernes med stålull. Skylt utstyr settes på rullebord. Kulturer som skal til inkubering settes på anvist plass, vanligvis rullebord ved tavlen. Alt som skal til inkubering må MERKES godt, med benknummer, initialer, forsøksnummer og dato. Hilsen laboratoriepersonalet - 3 -

4 TIMEPLAN Dag Tidspunkt Gruppe Normalt Store oppgaver Tirsdag I - - II - -6 Fredag I - II - OVERSIKT OVER ØVELSENE.. Mikroskopering.. Utstrykning av E. coli på agarskål. 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen.. Gram-farging.. Lysozym i tårer. 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. 7. Karakterisering av pseudomonader. 8. Mikroskopering av utvalgte mikroorganismer. 9. Aerobe nitrogenfikserende bakterier - Azotobacter.. Isolering av streptomyceter.. Isolering av endosporedannende bakterier -Bacillus.. Isolering av melkesyrebakterier - Lactococcus-type. 3. Virkning av antibiotika vist på agarskål.. Kimtall i næringsmidler.. Totaltall og spektrofotometrisk måling av bakterietetthet. 6. Vekstkurve. 7. Bakteriofag. 8. Mikrobiologisk vannanalyse. 9. Winogradsky-søyle (demonstrasjonsoppgave). LABORATORIEKURSET. KURSDAG. Fredag /. Øvelse. Mikroskopering. Øvelse. Utstrykning av E. coli på agarskål,. dag. Utstyr og medier: Plate med kolonier av E. coli. kolbe med steril,9 % NaCl Pasteurpipetter, sterile plate med LA medium KURSDAG. Tirsdag 6/. Øvelse. Utstrykning av E. coli på agarskål,. dag. Øvelse B. Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium,. dag. Øvelse 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen,. dag. Utstyr og medier: plater med LA-medium EM kolbe med minimalmedium - -

5 KURSDAG 3. Fredag 9/. Øvelse B. Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium,. dag. Øvelse 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen,. dag. Øvelse A. Gram-farging. Utstyr, reagenser og bakterier: Agarplater med E. coli og Micrococcus sp. (en av hver pr. benk) Krystallfiolett (løsning ) Grams jodløsning (løsning ) Safranin (løsning 3) Etanol Pasteur- eller dråpepipetter (usterile) begerglass og petriskål Filterpapir KURSDAG. Tirsdag /. Øvelse B. Gram-test etter KOH-metoden. Øvelse. Lysozym i tårer,. dag Øvelse 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. Utstyr, medier og bakterier: Plater med E. coli og Micrococcus luteus (en av hver pr. benk) Dråpeflasker med Micrococcus- og E. coli-kultur (en av hver pr. benk). stykke løk Sterilt Eppendorf-rør dråpepipette (plast, engangs) Pasteurpipetter plater med LA-medium 3% KOH plate med YES-agar Grovt sjøsalt Skål med etanol + glasstav KURSDAG. Fredag /. Øvelse. Lysozym i tårer,. dag (Avsluttes). Øvelse 7A. Pseudomonader, mikroskopering og oppbevaring. Øvelse 8. Mikroskopering av utvalgte mikroorganismer. Utstyr, medier og bakterier: Pasteurpipetter plate med succinat-medium skråagar med succinatmedium Pseudomonas på agarskåler ( per benk, ordnes av kursansvarlig) Utvalgte mikroorganismer KURSDAG 6. Tirsdag 9/. Øvelse 7B. Pseudomonader, anaerob respirasjon, dag. Øvelse 7C. Pseudomonader, karakterisering, dag. Øvelse 9. Azotobacter,. dag. Øvelse. Streptomyceter,. dag. Øvelse. Anrikning av aerobe endosporedannende bakterier: Bacillus.dag Medier og utstyr: Matjord for inokulum - -

6 Sterilt vann anaeroberør med hette og propp ml EM kolbe med succinat/nitrat medium ml EM-kolbe med ml mannitol- N-fritt -medium plate med GA plate med GAUrea plate Kusteragar rør med Hugh og Leifsons stikkagar (Sjekk ph, skal være svakt grønn) Steril parafin Treklype Glasstav + skål med etanol Pasteurpipetter, sterile Sterilt reagensrør med plast-propp/hette Vannbad på 8 ºC E.coli utlevert på agarskål ( per benk) KURSDAG 7. Fredag /. Øvelse 7B. Pseudomonader, anaerob respirasjon, dag (avsluttes). Øvelse 7C Karakterisering av pseudomonader, dag (avsluttes). Øvelse 9. Azotobacter,. dag. Øvelse. Streptomyceter,. dag. Øvelse. Bacillus,. dag. Medier og utstyr: anaerobrør med hette og propp plater med GA plater med Kusteragar ml EM-kolbe med ml mannitol- N-fritt -medium Kovaks oksidase reagens (ferskt) Filterpapir E. coli utlevert på agarskål ( per benk, helst ferske) 3 % KOH KURSDAG 8. Tirsdag 6/. Øvelse 9. Azotobacter, 3. dag (avsluttes). Øvelse. Streptomyceter, 3. dag. Øvelse. Bacillus, 3. dag. Øvelse. Melkesyrebakterier,. dag. Utstyr og medier: skråagar med GA-medium plate med næringsagar-la Upasteurisert melk anaerobrør med hette og propp KURSDAG 9. Fredag 9/. Øvelse 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier, dag (avsluttes) Øvelse. Melkesyrebakterier,. dag. Øvelse 9. Winogradsky-søyle (Start på demonstrasjonsoppgave) - 6 -

7 Utstyr og medier: % sterilt saltvann stk. 3 ml plastrør Automatpipetter (- μl) og spisser plate med KPGAL-CaCO3 E-M kolbe med dest. vann. Til Winogradski søylen: Marint mudder for inokulum, skjeer og spatler (felles) kolbe med sterilt % NaCl. ml målekolbe Cellulosepulver Sjøvann CaSO Gjærekstrakt store og liten spatel begerglass à ml og begerglass à ml Al-folie KURSDAG. Tirsdag 3/. Øvelse. Streptomyceter,. dag Øvelse. Bacillus,. dag (Avsluttes). Øvelse. Melkesyrebakterier, 3.dag (Katalase- og gram-test; avsluttes) Øvelse 3. Virkning av antibiotika vist på agarskål. Medier og utstyr: Antibiotika Pinsetter 3% KOH 3 % hydrogenperoksid Flytende kultur av en gram positiv bakterie Flytende kultur av en gram negativ bakterie Pipetter Sterile pipettespisser Glasstav + skål med etanol E.coli på agarskål ( per benk) Skråagar med Pseudomonas og Bacillus laget tidligere GA el. LA-plater KURSDAG. Fredag 6/ Del av labjournal leveres! Øvelse. Streptomyceter,. dag (avsluttes). Øvelse 3. Virkning av antibiotika vist på agarskål, dag, avsluttes. Øvelse. Kvantitativ mikrobiologi,. dag. A. Kimtall i næringsmiddel. Medier, utstyr og bakterier. pakke kjøttdeig el lignende fra ferskvare (ikke vakuumpakket, saltet, røykt etc.) Fortynningsløsning,.9% NaCl LA-medium til fortynning Steril homogenisator + en steril pinsett 6 sterile 3 ml plastrør for fortynningsserie Sterile pipetter ( ml) Pelleusballonger Whirlmixere 6 skåler med LA-medium Automatpipetter (, ml) Sterile pipettespisser Glasstav + skål med etanol - 7 -

8 KURSDAG. Tirsdag /3. Øvelse. Kvantitativ mikrobiologi,. dag. A. Kimtall (Avsluttes) Øvelse. Totaltall og måling av optisk tetthet Medier, utstyr og bakterier: Kultur av Vibrio natriegens Formalin Tellekammer BHI-medium til fortynning Kyvetter Automatpipetter + spisser 3 ml rør til fortynning KURSDAG 3. Fredag /3. Øvelse 6. Vekstkurve for bakterie,. dag. NB; FORSØKET TAR TIMER. Medier, utstyr og bakterier: Det samme som kursdag i tilpasset antall og mengde plater BHI-medium Semilogaritmisk millimeterpapir Vannbad 37 o C Whirlmixere KURSDAG. Tirsdag 9/3. Øvelse 6. Vekstkurve,. dag (Avsluttes) Øvelse 7. Bakteriofag ( pfu ),. dag. Medier, utstyr, fag og bakterier: Dråpeflaske med kultur av E. coli B Suspensjon av T-fag 9 plater med Hersheys agar x 9,9 ml,9% NaCl til fortynning x 9, ml,9% NaCl til fortynning 9 x 3, ml Hershey s sloppy agar (toppagar) Automatpipetter Sterile pipetter og spisser til automatpipetter Varmeblokk Whirlmixere - 8 -

9 KURSDAG. Fredag /3. Øvelse 7. Bakteriofag,. dag. Ettrinns vekst ("burst size") for bakteriofag. NB; FORSØKET TAR TIMER. Medier, utstyr, fag og bakterier: Aktivt voksende kultur av E. coli B i Hershey s broth, ml, M KCN x 9,9 ml Hershey s broth Suspensjon av T-fag rør med Herseys broth til fortynning (9 ml i hvert) plater med Hershey s agar x 3, ml Hershey s sloppy agar (toppagar) Automatpipetter og sterile spisser Varmeblokk, vannbad, stoppeklokke Whirlmixere KURSDAG 6. Tirsdag 6/3. Øvelse 7. Bakteriofag, 3. dag. Ettrinns vekstkurve for bakteriofag (avsluttes). Øvelse 8. Mikrobiologisk vannanalyse,. dag. Medier og prøver: Vannprøver durhamrør med ml laktose-pepton medium (3 x styrke) durhamrør med ml laktose-pepton medium (enkel styrke) stk. ml pipette 3 stk. ml pipette KURSDAG 7. Onsdag 7/3. Øvelse 8. Mikrobiologisk vannanalyse,. dag. Medier og prøver: stk. ml pipette 3 stk. ml pipette durhamrør med laktose-briljantgrønt-gallesalter for hver positive (. dag) durhamrør med laktose-gallesalter for hver positive (. dag.) rør med indol-medium for hver positive (. dag). KURSDAG 8. Fredag 9/3. Øvelse 8. Mikrobiologisk vannanalyse, 3. dag. Øvelse 9. Winogradski-søyle (avsluttes). Oppsummering. Reagenser: Kovacs indolreagens Fredag 6/3. Siste frist for innlevering av journal! - 9 -

10 Øvelse. Mikroskopering Mikroorganismer er for små til å kunne ses med det blotte øye og må derfor observeres i et mikroskop (mikro betyr liten, skopein betyr å se). Et moderne lysmikroskop består av følgende hovedkomponenter; lyskilden som sitter nede på foten og sender lys gjennom kondensoren som fokuserer lyset i et lite område i objektet planet. Objektet som skal undersøkes er plassert på objektbordet og over det sitter objektiv-linsene som forstørrer objektet. Nærmest øyet er okularlinsene som gir en ytterligere forstørrelse av bildet i objektivet. Fig.. Skisse av mikroskop med fasekontrast kondensor - -

11 - -

12 Dybdeskarpheten i bildet avtar eksponensielt med økende numerisk appretur. Den vanlige lysmikroskopi metoden kalles lysfeltmikroskopiering. Preparatet er da mørkt på lys bakgrunn, fordi en del av lyset som treffer preparatet blir absorbert eller reflektert. Ved mørkefeltsmikroskopi benyttes en kondensator som bryter lyset slik at bare det lyset som spres fra preparatet kommer inn i objektet. Preparatet blir lyst på mørk bakgrunn. Mørkefelttsmikroskopi gir bedre kontrast og oppløsningsevne enn vanlig lysfeltsmikroskopi, men gir bare omrisset av cellens som skal studeres. De fleste mikroorganismer er store nok til å kunne bli sett i et lysfeltsmikroskop, men det er ofte vanskelig å se i ufargede preparater fordi cellene absorberer lite lys, og det blir dermed liten kontrast mellom dem og omgivelsene. Det samme problemet gjelder også for organeller og andre tette komponenter inne i en enkelt (eukaryot) celle. Fasekontrastmikroskop benyttes for å øke kontrasten mellom cellene, bakgrunnen og strukturere inne i cellen og cytoplasma. Fasekontrastmikroskopet nyttegjør seg av at objekter med forskjellig tetthet (og dermed forskjellig refraksjonsindeks) sprer lys forskjellig. Fase-endrede elementer i objektivlinsen endrer lyset slik at det blir en faseforskjell mellom det spredte (diffrakterte) og ikke spredte lystet. Når det spredte og ikke spredte lyset bringes sammen, gir det en lavere lysintensitet p.g.a. faseforskjellen (destruktiv interferens). Jo mindre gjennomskinnelige objekter er, jo større er diffraksjonen (spredningen) og jo mørkere vil objektet fremstå. Anmerkninger om mikroskopene Forstørrelsen er inngravert på objektiver og okularer. Avstanden mellom okularene må tilpasses avstanden mellom øynene. Når bildet fra begge øynene faller sammen til et sirkelrundt bilde, er avstanden riktig (som en kontroll kan du spørre din optiker neste gang du tar en synstest). Den vanligste objektivforstørrelsen vi bruker er x. Alle mikroskopene har også et x objektiv, merk at dette kun kan brukes sammen med immersjonsolje. - -

13 Ringblenderne i kondensorene er tilpasset objektivene. Følgende innstillinger brukes: Objektiv Lysfelt Mørkefelt Fasekontrast,x H () - - x H () (D) x H () (D) x H () (NB olje!) - 3 (NB olje!) Vi bruker oftest fasekontrast, lysfelt bukes til fargede prepareter (Øvelse, Gram-farging) Et sett mikroskoper (benk nr til 8) har felles fasering for alle forstørrelsene. Behandling av mikroskopet. Mikroskopet er et kostbart presisjonsinstrument, og følgende punkter må overholdes nøye: ) Støvhetten skal alltid være på mikroskopet når det ikke er i bruk. ) Søl av kjemikalier må fjernes straks. 3) Rengjøring av optikken foretaes enklest ved å puste dugg på linsene, og tørke med linsepapir. Bruk aldri tørt papir på optikk. ) Immersjonsolje og fett på linsene fjernes omhyggelig med linsepapir fuktet med xylen eller Lens Cleaner (Kodak e. l.). Bruk hansker. ) Bruk begge hender når du flytter mikroskopet, unngå støt. ØVELSE. Mikroskopering Det er utlevert en petriskål med kultur av Escherichia coli,,9% NaCl og pasteurpipetter. I skuffen finnes objektglass, dekkglass og en podenål. ) Koble til strøm for å få lys. Still alltid lysjusteringen lavt til å begynne med, og skru opp til behagelig lys. Høye spenninger forkorter lampens levetid betydelig. ) Juster avstanden mellom okularene slik at de passer til øynene. Blikket skal brukes som om du ser på noe som er langt borte, okularbredden er riktig når du ser bildet som en enkelt sirkel. 3) Sjekk at alle blendere (lampe og kondensor er åpne) ) Plasser objektglass med preparatet på kryssbordet med den fjærbelastede armen. ) Skru opp kryssbordet til avstand mellom objektiv og preparatet er ca mm. 6) Se i mikroskopet samtidig som du a) beveger kryssbordet horisontalt b) hever kryssbordet inntil preparatet kommer i fokus. Hensikten med å bevege kryssbordet er at en da kan skille mellom preparatet (som da beveger seg), og artefakter som kan oppstå fra støv og lignende i selve optikken. Sjekk fra tid til annen om linsen berører preparatet, da har du skrudd for langt, gå i så fall tilbake til punkt. Preparater: Lag en suspensjon av bakterien på objektglasset (ved å løse opp litt av én koloni i en liten dråpe saltvann) med en steril podenål. Suspensjonen skal være lett turbid, ikke helt grå, da er den for tett. Sett på dekkglass og prøv så å finne bakteriene i mikroskopet ved å bruke objektivet med x. Bruk deretter x og tilslutt x. Ved x må det brukes olje mellom objektivet og dekkglasset for at man skal kunne se noe. Drypp derfor en dråpe olje oppå dekkglasset. Obs. Det skal ikke være olje mellom objektglass og dekkglass. Fyll inn info om mikroskopet i tabellen i laboratoriejournalen og tegn en liten figur av hva du ser i mikroskopet

14 ØVELSE. Dyrkning av E. coli på agarskål og i flytende vekstmedium Som dere vil erfare i dette laboratoriekurset, vokser bakterier (og andre mikroorganismer) nær sagt overalt i naturen. Når bakteriene finner de rette vekstbetingelsene vil de vokse og formere seg. Mikrobiologer ønsker vanligvis å studere renkulturer av bakterier. Det vil si at mikrobiologer må kunne isolere de ønskede bakteriene og holde dem i kultur i laboratoriet uten at kulturene blir forurenset (kontaminert) av andre mikroorganismer. Mikrobiologer må med andre ord beherske det vi kaller sterilteknikker. Hensikten med denne oppgaven er derfor å innøve noen vanlige teknikker for isolering og dyrkning av bakterier. Escherichia coli benyttes som eksempel. Agar er et polysakkarid fremstilt fra rødalger, og det benyttes til å omdanne vekstmedier til en fast gel. Vanligvis inneholder vekstmedier, til,% agar. Dersom agarmedier inneholder de nødvendige næringsemnene, og de fysikalske betingelsene (temperatur, ph, aerobt/anaerobt etc.) ved inkuberingen er de rette, kan bakterier, gjær og sopp vokse på agaroverflaten. For rasktvoksende bakterier (f. eks. E. coli) kan en celle formere seg og gi en synlig koloni på agarmediets overflate i løpet av et halvt døgn. Dyrkning av bakterier på agarmedier skjer vanligvis i petriskåler, og petriskåler med agarmedium betegnes agarskåler eller -plater. Agarskåler er hensiktsmessige å benytte for å oppnå renkulturer av bakterier, kontrollere renheten av kulturer og oppbevare kulturer over kortere tidsrom. Kolonienes utseende (morfologi) varier hos ulike typer bakterier, sopp og gjær. Selv om koloni-morfologi ikke i seg selv er et tilstrekkelig grunnlag til å klassifisere bakterier eller andre mikroorganismer, vil utseendet av koloniene på agarskålen gi oss en indikasjon på om vi har en renkultur eller om kulturen inneholder flere typer bakterier/mikroorganismer. En annen vanlig dyrkingsmåte for å oppformere eller studere bakterier er å benytte flytende næringsmedier. For aerob dyrkning (med tilgang på luft) has vekstmediet i en kolbe med plasthette eller bomullspropp som virker som luftfilter. Bakterier som på forhånd er isolert i renkultur på agarmedium, overføres til mediet og kolben settes vanligvis på en rystemaskin for å bedre lufttilførslen under inkubasjonen. I denne oppgaven skal vi øve oss på å stryke ut bakterien E. coli på agarskål. Hensikten med utstrykningen er å lage en gradient av bakterier på agaroverflaten, slik at man oppnår at de enkelte bakteriecellene blir skilt fra hverandre og kan gi opphav til adskilte kolonier. For denne dyrkningen brukes et rikt LA-medium (inneholdende gjærekstrakt og pepton). Koloniene som vokser opp på LA-mediet skal den neste kursdag brukes som inokulum for en flytende kultur. Her benyttes et minimal-medium som inneholder glukose som eneste karbon- og energikilde samt fosfat, NH +, SO -,Mg +, K + og spormineraler for å tilfredsstille E. coli bakteriens øvrige vekstkrav. Utførelse Øvelsens. dag (Kursdag ). Det er utlevert en agarskål med LA-medium pr. kursdeltaker og en agarskål med bakterien E. coli pr. benk. Podenålen (gjerne med en liten løkke på enden) flamberes først i en gassflamme (dvs. glødes) og avkjøles ved å stikke den ned i agaren. Når nålen er avkjølt, tas det opp litt materiale fra en koloni, og nålen strykes 3 - ganger nær kanten av den sterile agarskålen (se i Fig. s. 6). Nålen flamberes på nytt og avkjøles. Den strykes så 3 - ganger på agaroverflaten, slik at den berører strekene fra første utstrykning en gang (se i Fig. ). Nålen flamberes igjen, og utstrykningen gjentas for tredje og eventuelt fjerde gang som vist på figur side 6. Merk bunnen (ikke lokket) av skålene med GRUPPE-NR., BENK-NR. og øvelse nr. Skålene inkuberes opp/ned (for å hindre rask uttørking) ved 37 o C. Øvelsens. dag (Kursdag ). Overføring av E. coli fra agarskål til flytende medium Agarskålen inspiseres. Vurder om utstrykningen har gitt områder med godt adskilte kolonier og om koloniene ser ensartet ut. Fra en godt adskilt koloni overføres cellemateriale med podenålen til det flytende vekstmediet i vekstkolben. Det er utlevert en kolbe til hver student. Agarskålen kastes etter bruk. - -

15 Merk kolben med GRUPPE-NR., BENK-NR. og øvelse nr. Kolben inkuberes med rysting ved 37 o C. Øvelsens 3. dag (Kursdag 3). Se om det er vekst i kolben og kontroller ved mikroskopering at cellene ser ensartet ut. (Øvelsen avsluttes). * * * ØVELSE 3. Mikroorganismer i luft og på kroppen. Mikroorganismer finnes praktisk talt overalt. Dette kan påvises ved å berøre overflaten av et generelt agarmedium med f. eks. fingrene eller leppene eller la agarskålen stå udekket mot luft i ca. til 3 min. Etter inkubering ved 3 o C, vil celler av bakterier, gjær eller muggsopp som har havnet på skålen, vokse fram til kolonier. Utførelse Det er utlevert agarskåler med LA pr. gruppe. Øvelsens. dag. (Kursdag ). Bakterier i luft. Agaroverflaten eksponeres en viss tid mot luft ved å ta av lokket. grupper går sammen om ansvaret for å måle bakterietetthet i hver sin lokalitet. Laboratoriets labbenk, vinduskarm, gang etc. Bruk skåler med forskjellig eksponeringstid (f. eks. - 3min- time; noter tiden på skålene). Bakterier på fingre. Sett to streker i kryss på bunnen av en skål slik at den deles i fire deler. Hver deltaker setter et fingeravtrykk på agaroverflaten i ett av feltene. Merk disse to feltene med uvasket og med initialer. Vask så hendene med såpe, skyll og tørk. Sett deretter av fingeravtrykk på de to gjenværende feltene og merk disse. Bakterier på lepper. En i gruppen presser leppene mot agaroverflaten på den fjerde skålen. Agarskålene merkes og inkuberes ved 3 o C til neste kursdag. Øvelsens. dag. (Kursdag 3 eller ). Inspiser skålene og tell antall kolonier. Resultatet fra luftskålene noteres på tavlen så raskt som mulig slik at hele klassen kan få alle resultatene. Husk å notere ned resultatene i labjournalen. Mikroskoper noen av koloniene fra luft platene, og noen fra leppe platen, ved å overføre en liten del av koloniene vha. podenåla til en dråpe vann på et objektglass. Undersøk spesielt om luft-platene er kontaminert med kolonier av Micrococcus luteus som er vanlig forekommende i luft. Dette er den bakterietypen som vi benytter i lysozym-øvelsen (Øvelse ) og til gramfarging (Øvelse ). De danner gule kolonier og forekommer gjerne i kuber med åtte celler (sarcina-type cellemorfologi). (Skålene kastes etter bruk). Noter alle resultater i labjournalen. * * * ØVELSE. Gramfarging. Ved gramfarging kan vi skille mellom to typer cellevegg hos bakterier. Hos grampositive (G+) bakterier består celleveggen nesten bare av peptidoglykan. Hos gramnegative (G-) bakterier utgjør peptidoglykanet bare -% av celleveggen, mens resten utgjøres av en yttermembran bestående av lipopolysakkarid (LPS), fosfolipid og protein. Hos begge typer bakterier er det peptidoglykanet som gir celleveggen mekanisk styrke. Gramfarging utføres ved at bakterier som er fiksert til et objektglass, tilsettes løsninger med henholdsvis krystallfiolett og KI-jod. Ved blanding av jod og krystallfiolett dannes det et fargekompleks. Ved rask skylling med etanol avfarges G- bakterier, mens G+ bakterier beholder dette fargekomplekset inne i cella (slå opp i - -

16 læreboka for å finne ut hvorfor! Hint: s 8 9 edition). For lettere å skille mellom G+ og G- bakterier i mikroskop kontrastfarges vanligvis bakteriene med det røde fargestoffet safranin. Ved mikroskopering (uten bruk av fasekontrast) vil G+ bakterier være blåfiolette og G- bakterier være lyserøde (fargeløse eller lyseblå dersom kontrastfarging ikke brukes). (Se Fig. 3). Utførelse A. Prosedyre for gram-farging. (Kursdag 3). Det blir utlevert skål med E.coli og en skål med M.luteus. ). Et rent objektglass flamberes på begge sider for å fjerne fett. Obs. Dette gjøres med en treklype da glasset blir svært varmt. Sett glasset til avkjøling etterpå. ) En liten dråpe vann settes på objektglasset når det er avkjølt til romtemperatur (bruk lite vann slik at det tørker fort igjen). Med podenålen overføres en liten mengde bakterier fra en bakteriekoloni til vanndråpen. (Dråpen skal bare bli svakt blakket så pass på at du ikke tar for mye av bakteriekolonien). Dråpen strykes utover i et tynt lag på objektglasset og tørkes i luft. 3) Fikser bakteriene til glasset ved å stryke objektglasset forsiktig gjennom flammen på gassbrenneren. Avkjøl til romtemperatur. ) Legg et papirhåndkle på benken og legg en petriskål opp på dette. Objektglasset legges i skålen med preparatsiden opp og overhelles med krystallfiolett (reagens ) slik at bakteriene er dekket. La stå i - min. ) Skyll forsiktig med rennende vann ned i et begerglass, ryst av vannet og tilsett jodløsning (reagens ). La stå i - min. 6) Objektglasset holdes på skrå og 96 % etanol dryppes på slik at det renner over preparatet til det ikke frigjøres mer fargestoff (-3 sek. bør være nok). 7) Skyll raskt med rennende vann, rist av vannet og tilsett safranin (reagens 3). La stå / min. 8) Skyll raskt med vann og tørk ved å presse et filterpapir opp på preparatet. 9) Etter lufttørking kan preparatet mikroskoperes. Uten å dekke til med dekkglass lokaliseres de fargede cellene med X objektivet. Mikroskoper så med X objektivet eller tilsett immersjonsolje og mikroskoper med X objektivet (uten bruk av dekkglass). Noter resultatet i labjournalen. (Dersom du ønsker å studere de fargede preparatene ytterligere i mikroskop, så ta vare på disse til neste kursdag). B. Gram-test etter KOH-metoden. (Kursdag ; avsluttes). En dråpe 3% KOH has på et objektglass. Materiale fra en bakteriekoloni slemmes opp i dråpen og blandes godt. Erfaring viser at dersom suspensjonen blir viskøs innen ca. ett min, er bakterien G-. Dersom suspensjonen ikke blir viskøs, er bakterien G+. En eventuell viskositetsøkning skyldes at DNA har lekket ut av cellen, og dette kan påvises ved å stikke løkken på podenåla ned i suspensjonen og observere om det kan trekkes ut seige tråder av DNA. Trådene er svært tynne og blir ikke så lange, så man må se nøye etter for å få øye på dem. Rør litt rundt i suspensjonen og prøv å dra opp tråder flere ganger hvis det ikke lykkes på første forsøk. Noter resultatet i labjournalen

17 Fig.. Gram-farging * * * ØVELSE. Lysozym i tårer. Alexander Flemming, som oppdaget penicillin, oppdaget også et bakteriedrepende enzym som kalles lysozym. Lysozym forekommer i forskjellige kroppsvæsker og biologisk materiale som tårer og eggehvite og fungerer som et forsvar mot bakterier. Lysozym hydrolyserer peptidoglykan som finnes i cellevegg hos bakterier. Ved lysozymbehandling mister cellen sin form og cellemembranen sprekker på grunn av osmotisk påvirkning. Grampositive bakterier er spesielt følsomme for lysozym, mens peptidoglykanet hos gram negative bakterier er beskyttet mot lysozym av yttermembranen. Vi skal her undersøke innflytelsen av lysozym i tårer på vekst av en gram positiv bakterie (Micrococcus luteus) og en gram negativ bakterie (E. coli)

18 Utførelse Lysozym,. dag. (Kursdag ). Hver gruppe får utlevert to agarskåler med LA-medium. Hver benk får utlevert en dråpeflaske med kulturer av henholdsvis E. coli og M. luteus. Drypp et par dråper av hver av kulturene på hver sin plate med næringsagar og fordel bakteriene jevnt utover vha. en bøyd glasstav. Glasstaven dyppes i etanol, brennes av vha. gassflammen og avkjøles i luft før bruk. (Glasstaven skal ikke holdes i flammen). La gjerne skålene tørke noen minutter etter utstrykning. Merk bunnen av skålene med hhv. Micrococcus og E. coli, samt gruppens nr., benk nr og øvelsens nr. Dere skal nå samle tårer. Hold derfor et lite stykke ferskt overskåret løk under øyet på din medarbeider. Vedkommende bør stå med hodet bøyd til samme side som det øyet det skal samles tårer fra. Fang opp tårene med en steril dråpepipette, og overfør dem til et sterilt Eppendorf-rør. Dere trenger -3 dråper. Drypp en dråpe tåre på midten av hver agarskål. Skålene blir deretter inkubert ved 37 o C. Lysozym,. dag. (Kursdag ). Inspiser agarskålene. Noter og diskuter resultatene i laboratorie-journalen. (Skålene kastes etter bruk). * * * ØVELSE 6. Isolering av ekstremt halofile arkebakterier. Det finnes tre hovedtyper arkebakterier (Archaebacteria) som kan dyrkes i laboratoriet: ekstremt halofile, metanproduserende og hyper-termofile S-avhengige. (Det finnes i tillegg andre typer arkebakterier som man hittil ikke har greid å dyrke i laboratoriet). Vi skal forsøke å isolere den ekstremt halofile typen. Disse arkebakteriene finnes i naturlig saltsjøer (f. eks. Dødehavet) og i laguner hvor det produseres havsalt ved sol-inndamping av sjøvann. Fra lagunene overføres de halofile arkebakteriene til havsaltet vi kjøper i butikken. Utførelse Øvelsens. dag. (Kursdag ). Noen krystaller kommersielt havsalt strøs på overflaten av YES-agar, som inneholder gjærekstrakt og % havsalt. Agarskålen pakkes i plastposer (for å hindre uttørking) og inkuberes ved 3 o C. Obs: Ikke snu skålen for da faller saltkrystallene av. Det vil ta noen uker før det vokser opp kolonier som er store nok til å arbeide videre med. Øvelsens avslutning. (Kursdag 9 eller avtales senere) Lag en suspensjon av de halofile arkebakteriene i en dråpe % havsaltvann på et objektglass. Inspiser bakteriene i mikroskopet og beskriv cellene. Bakterieceller som er tilpasset sterk saltholdighet i mediet vil sprekke dersom saltholdigheten synker drastisk. Når bakteriecellene sprekker forsvinner turbiditeten i bakteriesuspensjonen, og dette skal vi vise ved et enkelt forsøk. Det er utlevert to reagensrør, lag en suspensjon av bakteriemasse i ml saltvann i det ene røret, og pipetter halvparten over til det andre røret. Suspensjon bør være sterkt turbid, dvs. ganske grumsete (og rosa). Tilsett ml % saltvann til rør, deretter omtrent like mye destillert vann til det andre, vortex rørene og se om det skjer farge/gjennomsiktighets-endringer. Beskriv forskjellen i labjournalen. * * * - 8 -

19 ØVELSE 7 A-C. Karakterisering av pseudomonader. Bakterier som tilhører gruppen Pseudomonas er stavformede og bevegelige (polart flagellerte) De får alltid energi (ATP) til vekst ved respirasjon. Oksygen er den foretrukne elektron-akseptoren, men de fleste kan utføre anaerob respirasjon med nitrat som elektron-akseptor (såkalt denitrifisering). Bakteriene inneholder cytokrom c- oksidase som kan påvises med Kovacs oksidasetest. De kan ikke gro fermentativt. Nyere taksonomi basert på 6S RNA-homologi har vist at Pseudomonas er en heterogen gruppe bakterier. Det finnes dessuten mange bakterier som likner på Pseudomonas, og man bruker derfor ofte ordet pseudomonader (engelsk: pseudomonads) som en løsere betegnelse på disse bakteriene. En typisk egenskap hos pseudomonader er at de kan bruke en mengde forskjellige lavmolekylære organiske forbindelser som eneste energi- og karbonkilde. I denne øvelsen får dere utlevert en ukjent stamme av Pseudomonas. Vi skal utføre noen enkle taksonomiske tester med denne stammen og deretter sammenlikne med skjema for identifisering av Gram-negative bakterier på side 7 i labjournalen. Øvelse 7, del A, mikroskopering. Utførelse Øvelsens. dag (Kursdag ). En kultur av en ukjent Pseudomonas stamme utleveres på en agarskål ( skål per benk). Mikroskoper og sjekk cellemorfologi og bevegelighet. Noter i tabell i labjournalen. Overfør bakterien til en skråagar med succinatmedium. Stryk også bakterien på en ny agarskål med succinatmedium slik at hver gruppe får sin egen skål. Skråagar er et reagensrør med agarmedium, hvor agaren lager en skrå overflate langs rørveggen. En skråagar tørker ikke så fort ut som agarplater og er derfor hensiktsmessig å bruke ved oppbevaring av bakterier. Øvelse 7, del B, anaerob respirasjon (denitrifisering). Utførelse. dag (Kursdag 6) Fra agarskålen med succinat-medium, ta en koloni av Pseudomonas og bruk denne som inokulum i et anaerobt rør med succinat-nitrat-medium. Fyll helt opp med medium og sett så på proppen (gjøres over vasken). Merk røret og inkuber kulturen. Vekst under disse betingelser vil bety at isolatet kan respirere med nitrat som elektronakseptor.. dag (kursdag 7) Inspiser den anaerobe kulturen med succinat-nitrat-medium for bakterievekst og gassdannelse. Pseudomonas er denitrifiserende bakterier og forventes å produsere N og CO under anaerob vekst i dette mediet. (Kulturene kastes etter bruk). Noter resultatet i tabellen i labjournalen. Øvelse 7, del C, karakterisering av pseudomonader. Bakterien skal testes for dens evne til ) å fermentere eller oksidere glukose til syrer, og ) for tilstedeværelse av cytokrom c-oksidase i cellene. E. coli er fermentativ og mangler cytokrom c-oksidase, og brukes som kontroll. Utførelse. dag (kursdag 6) Fermenteringstest (OF-test eller Hugh-Leifson-test). Det lages to stikkagarer med Hugh-Leifson-medium for - 9 -

20 hver bakterie som skal undersøkes. Mediet inneholder glukose, pepton, ph-indikatoren bromtymolblått og lav konsentrasjon av agar (ca.,%). Agarmediet er fylt i reagensrør. Litt bakteriemasse tas ut med steril podenål, som stikkes rett ned i agaren. Det ene røret forsegles med steril smeltet parafinvoks. Voksen smeltes på benken over gassbrenner (dette blir det anaerobe røret; røret uten vokspropp er aerobt). Inokuler i tillegg et aerobt og et anaerobt rør med utlevert E. coli. Rørene inkuberes ved romtemperatur.. dag (kursdag 7) Inspiser stikkagarene med Hugh-Leifson-medium og noter resultatet. Syreproduksjon registreres ved fargeomslag av indikator fra grønt til gult. Gassproduksjon registreres ved dannelse av gasslommer i agaren som er forseglet med parafinvoks. Konsulter figur med skjema for identifisering av Gram-negative bakterier. Merk følgende: Pseudomonas er ikke-fermentative bakterier og skal derfor ikke produsere syre eller gass i de anaerobe rørene. Noen pseudomonader produserer imidlertid syre ved oksidasjon av glukose under aerob vekst. Det er også mulig med fargeomslag til blått (basisk reaksjon) i de aerobe rørene pga. ammoniakk-produksjon fra pepton i mediet. E. coli forventes å produsere syre og gass, særlig i det anaerobe røret. Tilleggsopplysninger til skjema OF-test Fermentative: Vekst og fargeomslag i det forseglede (anaerobe røret), eller begge. Vekst og fargeomslag i bare det aerobe: Pseudomonas gruppe I og II, samt Agrobacterium (da er de ikke fermentative, men produserer syre ved aerob respirasjon). Da pseudomonader er respiratoriske, vokser de ikke i det anaerobe røret (fordi her er ikke oksygen og ikke nitrat). Dersom avlesningen går greit vaskes rørene, hvis ikke inkuberes de videre til neste kursdag. Kovacs oksydasetest. Bakterier tilhørende gruppen Pseudononas inneholder alltid cytokrom c-oksidase, som kan påvises ved Kovacs oksydasetest. Drypp noen dråper oksydasereagens (% N-tetrametyl-p-fenylendiamin i vann) på et filtrerpapir. Overfør materiale fra en koloni med pseudomonader til det våte området på papiret. Ved positiv reaksjon blir bakteriemassen dyp blå innen ett min. Bruk utlevert E. coli som en negativ kontroll. Utfør også Gram-test med KOH-metoden. (NB. Skråagaren av Pseudomonas skal brukes på nytt på kursdag i Øvelse ). Avslutning. Et skjema for klassifisering av noen gram-negative, heterotrofe bakterier er angitt på s. 9 i labjournalen. Undersøk om dine resultater samsvarer med det som gjelder for Pseudomonas-gruppene. 3. dag (kursdag 8) Eventuelt: Inspiser stikkagarene med Hugh-Leifson-medium og noter resultatene. * * * ØVELSE 8. Mikroskopering. Utføres kursdag. Vi skal i denne øvelsen ta oss tid til å mikroskopere forskjellige mikroorganismer som holdes i kultur ved instituttet. Arter eller typer bestemmes av hva som er tilgjengelig. Husk å notere hva dere så i mikroskopet i labjournalen. * * * - -

21 ØVELSE 9-. Isolering av forskjellige typer bakterier fra jord. (Forord). Det er anslått at g god matjord inneholder. forskjellige typer bakterier, men bare et fåtall av disse har hittil latt seg dyrke på laboratoriemedier. I dette eksperimentet skal vi isolere tre forskjellige typer av bakterier fra den samme jordprøven ved å variere behandlingen av jordprøven og anriknings- og vekstbetingelsene for bakteriene. Anrikningskulturer brukes når vi vil isolere bestemte typer bakterier (eller andre mikroorganismer) fra prøver som inneholder mange ulike mikroorganismer. Stryker vi ut fra en prøve direkte på en agarskål med et ikkeselektivt medium, vil vi bare få kolonier av de artene som det er mest av i prøven, og som kan vokse på det valgte vekstmediet. Når vi vil isolere bestemte typer bakterier, benytter vi vanligvis flytende anrikningskulturer med selektive medier hvor bestemte organismer favoriseres. Anrikningskulturene inokuleres med et inokulum som forventes å inneholde den eller de bakteriene som vi ønsker å isolere. Etter inkubering vil kulturene bli dominert av de bakteriene som vokser fortest og til høyest antall under de valgte betingelsene. Fra anrikningskulturene kan så de dominerende bakteriene eventuelt isoleres ved utstrykning på agarskåler. Vanlige parametere som kan varieres i anrikningskulturer er: - Karbonkilde (sukkerart, organisk syre, alkohol, alkaner etc.) - Nitrogenkilde (f. eks. NH +, NO3 -, N ) - Energikilde (organiske eller uorganiske forbindelser, lys) - Aerobe forhold - Anaerobe forhold med eller uten ekstern elektronakseptor ( f. eks.. NO - 3, SO - ) - Temperatur Suspensjon av jord lages ved å riste ½ spiseskje jord med ml sterilt vann, hvoretter suspensjon får stå i ca. - min. Én del av suspensjonen brukes som inokulum i en anrikningskultur for isolering av Azotobacter sp. (Øvelse 9), en annen strykes på skåler for vekst av streptomyceter (Øvelse ). En tredje del pasteuriseres for bruk som inokulum ved isolering av Bacillus sp. (Øvelse ). * * * ØVELSE 9. Aerobe nitrogenfikserende bakterier - Azotobacter. De fleste heterotrofe bakterier som fikserer N, er obligat eller fakultativt anaerobe, og N -fikseringen foregår dermed bare under anaerobe vekstbetingelser. Bakterier tilhørende slekten Azotobacter er eksempel på bakterier som kan fiksere N under aerob vekst, og denne egenskapen skal vi benytte til å anrike på denne typen bakterier. Erfaringsmessig gror disse bakteriene bra med mannitol som karbon og energikilde i medium uten bundet nitrogen ( N-fritt medium). Mange bakterier kan ikke benytte mannitol, og bruk av mannitol som karbon- og energikilde er derfor med på å gjøre mediet enda mer selektivt. Utførelse Azotobacter,. dag. (Kursdag 6). Inokuler ca. ml fra supernatanten av jordsuspensjonen til EM-kolbe med ml mannitol- N-fritt -medium. Bruk pasteurpipette som tar ca. ml. Kolben merkes og inkuberes stillestående og mørkt ved 3 o C til neste kursdag. Azotobacter,. dag. (Kursdag. 7). Undersøk om det er dannet en tydelig hinne på overflaten av mediet. Obs: Ikke rist eller rør for mye på kolben for da vil hinna gå i stykker. Azotobacter er aerobe og har et stort oksygenforbruk, de kan leve i denne hinnen. Inspiser en prøve fra hinnen i mikroskop. Azotobacter er vanligvis bevegelige, cellene opptrer parvis, og de er - -

22 ofte fylt med korn av poly-β-hydroksybutyrat. Overfør noen dråper fra overflaten til nytt medium og inkuber med rysting til neste kursdag. De gamle kulturene kan også inkuberes på nytt (uten risting) dersom veksten av Azotobacter var utilfredsstillende. Azotobacter, 3. dag. (Kursdag 8; avsluttes). Inspiser og mikroskoper kulturene. Lag en tegning av bakteriene i labjournalen og sammenlign med bilder av Azotobacter i læreboka. (Kulturene kastes etter bruk). * * * ØVELSE. Isolering av streptomyceter. Streptomyces er den største gruppen av aktinomycetene. De ligner sopp ved at de danner et såkalt mycel som er et nettverk av lange, trådformede, ofte forgrenede hyfer. I motsetning til sopp som er eukaryote, er aktinomycetene prokaryote, grampositive bakterier. Det er stor forskjell på tykkelsen på mycelet som er. til. μm hos aktinomycetene og ca. μm hos sopp. På agarplater danner aktinomycetene et substratmycel ned i substratet og deretter et luftmycel. Hos mange aktinomyceter fragmenterer mycelet raskt til uregelmessige kokker og staver. Streptomycetene er karakterisert ved at de danner et mer stabilt mycel som ikke fragmenterer, og ved at de danner konidiesporer i lange kjeder på luftmycelet. Kolonier av streptomyceter er forholdsvis lett gjenkjennelige ved at de har sopplignende ( melaktig ) utseende. Dessuten kan vekst av streptomyceter ofte gjenkjennes ved at det dannes en karakteristisk jordlukt som forårsakes av produksjon av geosminer. Til isolering av streptomyceter benyttes Kusteragar. Mediet er til en viss grad selektivt fordi mange bakterier ikke kan bruke stivelse som karbonkilde og nitrat som nitrogenkilde. Mediet er dessuten tilsatt et soppdrepende middel, cycloheximid ( μg/ml), for å hindre at agarskålene overgros med sopp. Mange (% av alle isolerte til dags dato) streptomyceter produserer antibiotika, et av disse er Streptomycin. Antibiotika er lavmolekylære forbindelser som er giftige for andre mikroorganismer. Vi skal til slutt teste om våre isolater har påvisbar produksjon av antibiotika. Utførelse Streptomyceter,. dag. (Kursdag 6). Fra jordsuspensjonens supernatant overføres - dråper med pasteurpipette til en Kusterplate. Fordel dette ut over agarskålen med. en bøyd glasstav. (Glasstaven flamberes med etanol og avkjøles ved å berøre agarflaten ved siden av inokulumet). Platene inkuberes ved o C. Streptomyceter,. dag. (Kursdag 7). Undersøk om platene har en karakteristisk jordlukt. Se etter små melaktige kolonier. Undersøk disse koloniene i mikroskop ved å berøre dem med podenåla og overføre materiale direkte til en dråpe vann på et objektglass. Se etter konidiesporer. (Lever inn platene for videre inkubering dersom veksten er dårlig). Isoler to lovende streptomyceter fra plata ved å stryke ut på to nye skåler med Kusteragar. Lever inn de gamle skålene for videre inkubering dersom veksten var dårlig. Streptomyceter, 3. dag. (Kursdag 8). Inspiser skålene for steptomyceter. For testing av antibiotikaproduksjon strykes to kolonier (fortrinnsvis renisolerte fra hver sin plate) som parallelle striper på en næringsagar (se Fig. 3. på s. ). Skålene inkuberes ved o C til kursdag. Streptomyceter,. dag (Kursdag ). Dine isolater av streptomyceter skal nå ha vokst opp langs strekene på agarskålen. Eventuell - -

23 antibiotikaproduksjon testes ved at du stryker Pseudomonas (fra Øvelse 7) og Bacillus (fra Øvelse ) sammen med en utlevert E. coli (som er en streptomycin-resistent stamme) på tvers mellom streptomycet-strekene slik at utstryket med testorganismene nesten berører de første strekene (se Fig. 3. på s. ). Platene inkuberes til neste kursdag. Streptomyceter,. dag. (Kursdag ; avsluttes). Inspiser platene og noter resultatet. Eventuell antibiotikaproduksjon vil gi hemming av en eller flere av testorganismene nær streptomycet-strekene. Lever inn skålene etter bruk, siden det er antibiotika-resistente bakterier på dem skal de i autoklaven for destruksjon. * * * ØVELSE. Isolering av endosporedannende bakterier - type Bacillus. Bakterier tilhørende slekten Bacillus danner sporer inne i cellen. I mikroskop ser endosporer ut som en intens lysende kule inne i bakterien, eller som kuler som svever fritt i medie hvis bakterien har gått i oppløsning rundt sporen. Sporene kan ha forskjellig plassering i bakteriecellen og ha større eller mindre diameter enn denne. Endosporer tåler ofte lengre tids koking, men de drepes ved autoklavering ved o C. Bacillus arter er vanlig forekommende i jord. For anrikning og isolering av disse bakteriene er det vanlig å utnytte endosporenes varmeresistens. Oppvarming av jordsuspensjon til 8 o C i ca. min, såkalt pasteurisering, dreper de fleste vegetative (dvs aktivt voksende) celler, men ikke endosporer. Ved anrikning tar vi også hensyn til disse bakterienes relasjon til oksygen. Bacillus-arter er obligat aerobe eller i noen tilfelle fakultativt anaerobe. I dette forsøket stryker vi pasteurisert jordsuspensjon direkte på agarskåler med gjærekstraktmedium (GA) som inkuberes aerobt. GA er et generelt medium som tillater vekst av mange typer bakterier, så seleksjonen skjer her hovedsakelig ved den måten vi har behandlet (pasteurisert) vårt inokulum. Vi skal dessuten benytte et mer selektivt agarmedium (GAUrea) som inneholder % urea og indikatoren fenolrødt. Mange Bacillus-arter produserer enzymet urease som spalter urea til ammoniakk og CO. (NH ) C + H -> CO + NH 3 Mens høye konsentrasjoner av ammoniakk er giftig for de fleste organismer, gror de ureaspaltende Bacillusartene best i nærvær av ammoniakk og forholdsvis høy ph. Indikatoren fenolrødt skifter farge fra rød (sur) til gul (basisk) ved ph 7,8. Fargeskifte indikerer dermed dannelse av ammoniakk (basisk). Ammoniakk lukter dessuten ganske sterkt og kan påvises ved å lukte forsiktig på platen. Utførelse Bacillus,. dag (Kursdag 6). Pasteuriser en del av jordsuspensjonen ved å varme den i vannbad ved 8 o C i min. Omtrent like mengder pasteurisert jordsuspensjon (f. eks. -3 dråper) overføres til GA- og GAUrea-skåler og fordeles jevnt utover med en steril glasstav. Skålene merkes og inkuberes ved 3 o C. Bacillus,. dag (Kursdag 7). Inspiser agarskålene for vekst av bakteriekolonier. Er det noen forskjeller i kolonitall på agarskåler med GA og GAUrea? Er det noen fargeforandring i urea-mediet? Lukt forsiktig på platene (vær spesielt forsiktig når du lukter på GAUrea). Se på utvalgte kolonier i mikroskop. Typiske kolonier av Bacillus sp. er flate med ujevne kanter og ru overflate. De er hvite eller svakt grå - eller brunfarget. Påvisning av endosporer ved mikroskopering er et sikkert tegn på Bacillus. Husk å notere resultat i labjournalen. Beskriv og tegn bakteriene. Stryk en koloni fra hver skål på hver sin nye agarskål med GA-medium (Kast de gamle skålene)

24 Bacillus, 3. dag (Kursdag 8). Inspiser koloniene fra andre utstryk på GA-plate. Overfør to Bacillus-kolonier til skråagar med GA-medium. Disse Bacillus-stammene skal benyttes igjen på kursdag. Bacillus,. dag (Kursdag ; avsluttes). Se Øvelse, Streptomyceter,. dag og Øvelse, Melkesyrebakterier, 3.dag. Bacillus-kulturene kastes etter bruk. * * * ØVELSE. Isolering av melkesyrebakterier Melkesyrebakterier forekommer i naturlig surnet melk. I dette forsøket skal vi forsøke å isolere bakterier av denne typen. Vi skal dessuten teste katalase-aktivitet og foreta en forenklet Gram-test etter KOH-metoden (se Øvelse B) på de isolerte organismene. Hydrogenperoksid dannes som et toksisk biprodukt ved aerob respirasjon og ved andre aerobe reaksjoner som involverer flavoenzymer. De fleste bakterier som kan gro aerobt, produserer derfor enzymet katalase som spalter hydrogenperoksyd: H O katalase H O + O Melkesyrebakterier kan gro aerobt, men er såkalt oksygen indifferente. Dvs. at de ikke kan utnytte oksygen til respirasjon, og de vokser derfor fermentativt under både aerobe og anaerobe betingelser. De er et unntak fra regelen om at bakterier som kan vokse aerobt, produserer katalase. Negativ katalasereaksjon er derfor et viktig taksonomisk kriterium for alle typer melkesyrebakterier. Testen på katalase utføres ved å overføre en dråpe 3% hydrogenperoksyd til et objektglass og slemme opp materiale fra en bakteriekoloni i denne dråpen. Bruk vernebriller! Positiv katalasereaksjon vil vises ved at suspensjonen bruser; dvs. at det dannes O. Ved lav katalase-aktivitet kan det være nødvendig å inspisere dråpen i mikroskop ved lav forstørrelse (X). Utførelse Melkesyrebakterier,. dag (Kursdag 8). Naturlig surnet melk lages ved å fylle opp et anaerobrør med upasteurisert melk og inkubere ved 3 o C. Melkesyrebakterier,. dag (Kursdag 9). Inspiser kulturen med naturlig surnet melk for eventuell gassdannelse. En type melkesyrebakterie, Streptococcus er homofermentativ og produserer ikke CO, så gå videre selv om det ikke er gass. Pga. fett og protein i melken er det nesten umulig å mikroskopere bakteriene uten bruk av spesielle fargeteknikker. Vi skal i stedet isolere bakteriene ved å stryke melken med en podenål på plater med KPGAL-CaCO 3 - medium. Som i tidligere eksperimenter er CaCO 3 tilsatt for å hindre at ph blir for lav under fermentering av sukker. Platene inkuberes ved 3 o C. Melkesyrebakterier, 3. dag (Kursdag ). Inspiser platene med melkesyrebakterier. Melkesyrebakterier danner lite energi (ATP) både ved aerob og anaerob vekst og har store krav til vekstfaktorer. De danner derfor små saktevoksende kolonier. Se på bakteriene i mikroskop, og foreta katalasetest (som beskrevet over) og Gram-test etter KOH-metoden (som beskrevet i øvelse ). Ta også med Pseudomonas fra øvelse 7 og Bacillus fra øvelse i disse testene. Husk å føre resultatene inn i labjournalen. - -

25 Fig 3.. Testing av antibiotikaproduksjon hos streptomyceter. (A) To renkulturer av streptomyceter strykes ut som parallelle striper på en agarskål. Skålene inkuberes. (B) Etter at streptomycetene har grodd fram på skålen, strykes 3- forskjellige bakterier mellom og på tvers av sterptomycetene. Disse utstrykningene skal gå helt inntil streptomycetene, men ikke berøre dem. Skålene innkuberes på nytt. * * * ØVELSE 3. Virkning av antibiotika vist på agarskål. Enkelte bakteriestammer kan ha forskjellig resistens mot forskjellige antibiotika. I denne øvelsen skal vi vise hvordan resistensmønsteret enkelt kan påvises på en agarskål. Utførelse.dag (Kursdag ) Det er utlevert to bakteriesuspensjoner, en gram positiv og en gram negativ. Med steril pipette settes μl av bakteriekultur midt på agarskålen. Steriliser glasstaven ved å dyppe den i 7% etanol, brenn av etanolen og stryk ut bakteriekulturen. Gjenta dette med den andre kulturen. Antibiotika leveres i standard piller, vi har fire forskjellige. Merk fire felt på undersiden av skålen, og legg en pille oppå agaren midt i hvert felt. Skålen inkuberes, denne gang med agaroverflaten opp..dag (Kursdag ) Obs: Ta med en linjal. Der hvor virksom antibiotika ikke har diffundert ut i skålen, vil bakterien vokse som et teppe. Rundt antibioika pillene vil det være en klar sone, med mindre bakterien er resistent mot den typen antibiotikum. Mål diameter på klaringssonen, og før dette resultatet inn i journalen. * * * - -

26 ØVELSE. Kimtall i næringsmiddel. Med kimtall forstås det antall bakterier som kan danne kolonier på et agarmedium. På engelsk brukes begrepene viable count eller mer vanlig; colony forming units (cfu). Kimtallsbestemmelse har visse begrensninger og vil alltid gi et lavere tall enn det virkelige antallet bakterier. Bare de bakteriene i prøven som kan vokse på det valgte agarmediet, blir registrert. Dessuten vil bakterier som er for nære hverandre, f. eks. ved at de henger sammen i kjeder eller er samlet på partikler, bare gi opphav til en koloni og derved bli registrert som ett kim. På tross av disse svakhetene er kimtallbestemmelse den mest brukte metoden til å bestemme antall bakterier i matvarer. Vanligvis lages et homogenisat av varen og det spres så ut,ml fortynnet prøve utover en agarplate. Antall kolonier som vokser opp på plata, bør være mellom 3 og 3. Når det er mindre enn 3 kolonier, blir bestemmelsen unøyaktig av statistiske årsaker. Dersom antallet er over 3, greier vi ikke å skille de enkelte koloniene fra hverandre. Siden en ikke vet på forhånd hvor mange bakterier som prøven inneholder, lages det vanligvis en fortynningserie i sterilt medium eller en annen egnet fortynningsløsning, og det plates ut fra flere fortynninger på hver sin plate. Når en har telt kolonier etter inkubering, kan en velge ut hvilken fortynning som er best egnet som grunnlag for utregning av kimtall i den opprinnelige kulturen. Kimtall angis vanligvis som antall pr. ml (husk at vi bare plater ut, ml på hver plate). Utførelse Dag (Kursdag ) I dette forsøket skal vi bestemme kimtallet i et næringsmiddel. Vi bruker fersk kjøttdeig som eksempel. Pålegget blir homogenisert med aseptisk teknikk av kursassistentene. Til dette brukes en såkalt stomacher. Vi bruker et kjent volum av sterilt.9% NaCl-løsning til å få bakteriene ut i suspensjon. Studentene henter så prøver fra dette homogenisatet. Lag først ferdig fortynningsrørene ved å overføre 9, ml LA-medium med en pipette til hver av de seks rørene. Fra homogenisatet overføres ml til rør nr. ( x fortynning) og blandes godt. Fra rør nr. overføres, ml til neste rør med 9, ml osv. Fra hvert rør overføres, ml med steril pipette til LA-medium, og prøven spres utover med glasstav på vanlig måte. NB: Ved utplating fra fortynningsrekka - HUSK å skifte pipettespiss mellom hver fortynning (hvis du ikke starter med røret som er mest fortynnet). Skålene inkuberes til neste kursdag (3 C). Kimtall,. dag (Avsluttes; Kursdag ) Skålene inspiseres og antall kolonier på skåler med passe antall kolonier telles. Beregn kimtallet i det opprinnelige homogenisatet. Beregn deretter kimtall per gram matvare. Før resultatet inn i labjournalen