BIO 101 Organismebiologi 1 Laboratorieøvelser Mikrobiologi & protister Ver red Gunnar Bratbak Institutt for Biologi Universitetet i Bergen

Transkript

1 BIO 101 Organismebiologi 1 Laboratorieøvelser Mikrobiologi & protister Ver red Gunnar Bratbak Institutt for Biologi Universitetet i Bergen

2 Forord Dette kursheftet er skrevet for bruk på første del av laboratoriekurset i emnet Organismebiologi 1 (BIO101) som omhandler mikrobiologi og protister. Teksten bygger på heftet Laboratorieøvelser i mikrobiologi (2010) av Gunnar Bratbak. Øvelsene med makroalger er skrevet av Kjersti Sjøtun. Kommentarer, rettinger og forslag til endringer / alternative øvelser mottas med takk. GB I årets utgave er det rettet en del feil og gjort en del endringer i noen øvelser for å gjøre arbeidsoppgavene klarere. Det er også gjort en del presiseringer i hvordan journalen skal skrives. Kurset er gjort mindre omfangsrikt ved at øvelsene med makroalger er tatt ut. GB Bildene på forsiden er Mikroskop fra Carl Zeiss (ca 1931) Bakterier med sporer: Bacillus Rødalge: rødlo, Bonnemaisonia hamifera Grønnalge: Tetraselmis cordiformis (Prasinophyte) Cilitat: Tetrahymena Bildene er hentet fra

3 BIO 101 Mikrobiologi og protister 1 ver 07/01/2013 Innledning Om kurset og kursheftet 2 Sikkerhet på laboratoriet 3 Mikrobiologisk arbeid 5 Diverse basisutstyr 6 Noen faguttrykk og definisjoner 7 Laboratorieøvelser Mikroskopering : Justering av lysmikroskop : Lysfelt, mørkefelt og fasekontrast : Synsfeltets størrelse og kalibrering av måleokular : Mikroskopering av mikroorganismer 15 Mikroorganismer i vårt nærmiljø : Mikrofloraen på fingrer, hår, etc. 18 3: Mikrofloraen i luft 19 4: Antibiotikaresistens 20 Anrikning av bakterier : Anrikning av melkesyrebakterier 23 Kvantifisering av mikroorganismer : Telling av gjær i tellekammer 24 7: Kimtall 25 8: Vekstforsøk med Vibrio natriegens 26 Appendiks A1: Lysmikroskopet 36 A2: Kvantifisering av mikroorganismer 44 A3: Bruk av tellekammer 47 A4: Vekst av mikroorganismer i satskultur 49 A5: Presentasjon av resultater 51 A6: Steriliseringsmetoder 53 A7: Dyrking av mikroorganismer 54 A8: Medier 58 A9: Cleaning of Microscope Optics (Leica) 60 A10: Bruksanvisning 3M Petrifilm Aerobic Count Plate 62 A11: Bruksanvisning 3M Petrifilm Coliform Count Plate 69

4 BIO 101 Mikrobiologi og protister 2 ver 07/01/2013 Innledning Om kurset og kursheftet Dette kursheftet inneholder en beskrivelse av de øvelsene vi skal gjennom på kurset. Øvelsene utføres nødvendigvis ikke i den rekkefølge de er beskrevet. Timeplan for kurset utarbeides separat. I Appendiks beskrives en del sentrale teknikker og metoder samt noe teori for en del av øvelsene. Forberedelse: For å gjennomføre kurset på en skikkelig måte forutsettes det at en har lest og tenkt gjennom oppgavene på forhånd. Du vil forhåpentligvis få større utbytte og forståelse av øvelsene ved å lese appendiks når det henvises til dette. I noen av oppgavene er det spørsmål og oppgaver som skal besvares før øvelsen gjennomføres. Les også gjennom avsnittene Sikkerhet på laboratoriet (side 3-4) og Mikrobiologisk arbeid (side 5) før kurset begynner. Utførelse av øvelsene: Øvelsene gjennomføres av to og to studenter i samarbeid hvis annet ikke er nevnt. Journalføring: Det skal føres laboratoriejournal. Dårlig og mangelfull journalføring er årsak til at ellers fine resultater blir ubrukelige (for forskere vil det si umulig å publisere). Enkle ting som å notere når noe ble gjort, når og hvor en prøve ble tatt (datoen), hvordan den ble behandlet, hva temperaturen var, osv. blir altfor ofte ikke notert ned selv om de er helt avgjørende for tolkningen av resultatene. Stol ALDRI på hukommelsen når det gjelder journalføring. (Jeg skal vedde på at hver og en av dere i løpet av studiet kommer til å erfare at en journal aldri kan bli detaljert nok når resultatene skal oppsummeres og rapporteres.) Laboratoriejournal føres i eget hefte eller perm. Alle spørsmål og oppgaver skal besvares. Presentasjon av data og figurer skal følge anvisningene i Appendiks A5. Journal med resultater skal leveres inn for godkjenning. Det er lov å samarbeide, men husk å oppgi hvem dine medforfattere er. På kurset jobber 2 eller 4 studenter sammen på de enkelte øvelsene og da er det også greit å samarbeide om å skrive teksten og lage figurer til journalen, men skal du tegne noe du har sett i mikroskop så skal du tegne det DU har sett og ikke noe andre har sett. Der ER forskjell på å samarbeide og å kopiere andres arbeid - DU lærer ingenting av å skrive og tegne av det andre har gjort. Pensum: Laboratoriekurset er en viktig del av pensum og det blir som regel alltid gitt minst en eksamensoppgave som relaterer til kurset. Det har vist seg at ikke alle tenker på det når de leser til eksamen

5 BIO 101 Mikrobiologi og protister 3 ver 07/01/2013 Sikkerhet på laboratoriet HMS-avdelingens www side om Verne- og sikkerhetstiltak på laboratoriet finner her: Institutt for biologi sin HMS side finner du her: Brann og rømningsveier Brannvarsling er kombinert talemelding/klokkevarsling. Legg merke til hvor brannslukningsutstyr og rømningsveier er. Samlingsplassen ved brann er foran hovedinngangen til A&B-blokken Kjemikalier: Forsøkene som gjøres på kurset representerer normalt ikke noen risiko. Det forutsettes imidlertid et minimum av omtanke og sunn fornuft. De vanligste laboratorieuhellene er sprut av kjemikalier på hud og i øynene, kuttskader på knust glass og brann. På laboratoriet finnes øyespylere på vaskene, forbindingssaker i medisinskap og brannslukningsutstyr, nøddusjen er i korridoren. De fleste kjemikaliene vi bruker er ufarlige og lite / ikke giftige uten at det betyr at vi skal søle unødvendig. Skal du bruke et stoff på laboratoriet som du ikke kjenner virkningen av SKAL du, ikke bare for din egen del, men også for de du deler arbeidsplass og laboratorium med, sjekke databladet for vedkommende stoff. Databladet skal ifølge reglene forefinnes på laboratoriet der du bruker stoffet. Databladene kan du også få hos leverandøren av stoffet eller ved å søke på internett: HMS-datablad for kjemikalier og informasjon om giftighet kan du finne på EcoOnline Verneutstyr: Verneutstyr bruker vi for å beskytte oss selv mot det som måtte være helseskadelig på laboratoriet. Vit hva du gjør, kjenn risikoen, og bruk verneutstyr når det er nødvendig. Verneutstyr misbrukes dessverre ofte. Med verneutstyr kan vi søle og spre kjemikalier rundt omkring på laboratoriet mens vi selv er beskyttet. De vi deler laboratorium med og de som vasker og rydder etter oss er imidlertid ikke beskyttet. De to kanskje vanligste eksemplene på misbruk av verneutstyr er hansker og laboratoriefrakk. Forurensede hansker tas ofte ikke av når en gjør notater på labben (din blyant!), når en åpner kjøleskapdøren eller tar telefonen (hva med nestemann uten hansker?). Noen tar ikke av laboratoriefrakken når de spiser lunch! Bruk av verneutstyr fritar ikke for bruk av hode! Laboratoriefrakk: Beskytter deg og klærne dine mot kjemikalier. Laboratoriefrakken skal taes av når du forlater laboratoriet slik at du ikke tar sølet med deg. Frakkens andre funksjon er å beskytte det du jobber med mot de skitne klærne dine.

6 BIO 101 Mikrobiologi og protister 4 ver 07/01/2013 Hansker: Det er to grunner til å bruke hansker: Når vi må beskytte hendene mot skadelige kjemikalier, varme, kulde, stikk etc., og når vi må beskytte det vi jobber med mot kontakt med hendene. Er det materialet vi jobber med som skal beskyttes bruker vi medisinske undersøkelsesshanskar (engangshanskar), vanligvis av nitrill. Disse gir det materialet du jobber med en god beskyttelse mot forurensninger som du har på fingrene dine (bakterier, fett, DNA, RNase etc). Men hanskene blir lett forurenset av ting vi tar på (blyanten, kjøleskapdøren, telefonen) og da blir beskyttelsen fort illusorisk. Du skal derfor ikke gå rundt på laboratoriet med hansker på uansett om det er deg selv eller det du jobber med du vil beskytte. Det finnes ingen universalhanske beskytter hendene mot alt. Behovet for beskyttelse avhenger av hva vi jobber med, kjemikaliets egenskaper og hvordan kontakten med kjemikaliet skjer. På UiBs HMS side finnes en veiledning for bruk og valg av hansker: Det finnes også en hanskeguide som viser hva hansker av ulik materiale tåles av kjemikaler: Briller: Beskytter mot kjemikaliesprut og glassplinter. Maske / munnbind: Kan benyttes som beskyttelse mot kjemikaliestøv når vi lager løsninger Peleusballong / pipettepumpe: Skal benyttes når du pipetterer med glass pipette, IKKE bruk munnen. Avtrekksskap: Løsemidler og flyktige forbindelser håndteres i avtrekksskap. Avfallshåndtering: Alt avfall på laboratoriet skal sorteres og behandles etter type. Husk at det er ditt ansvar at de som skal ta seg av avfallet etter at du har kastet det ikke kommer til skade, se Glass (stikkende, skjærende): Glass kastes i egen beholder for glassavfall - IKKE i papirbosset. Kanyler: Kastes i egen beholder. Kjemikalier: Vannløselige kjemikalier (i små mengder) kan stort sett skyldes ned i vasken. Løsemidler behandles som spesialavfall. Agarskåler / bakterier: Kastes i autoklavposer og destrueres ved autoklavering Følgende generelle leveregler gjelder på laboratoriet: Spising, drikking og røyking på laboratorier er forbudt. Laboratoriefrakk skal brukes på laboratoriet Pipettering med munnen er forbudt, bruk automatpipetter eller glasspipetter med peleusballong / pipettepumpe. Tørk opp søl selv - bare du vet hva som er sølt. Skyll alt brukt glassutstyr og vask vekk tusjmerker før du sender det til vask. Kast avfall og brukte kjemikalier på riktig plass. Bruk vernebriller og hansker ved håndtering av sterke syrer og baser. Løsningsmidler brukes og håndteres i avtrekksskap.

7 BIO 101 Mikrobiologi og protister 5 ver 07/01/2013 Mikrobiologisk arbeid Aseptisk arbeidsteknikk og regler for mikrobiologisk laboratoriearbeid. Vi er omgitt av en naturlig mikroflora av bakterier. De fleste av disse er harmløse, noen er bra for oss, men noen er eller kan også være sykdomsfremkallende (patogene). På laboratoriekurset skal vi anrike og dyrke mikroorganismer slik at konsentrasjonen og mengden av bakterier vi håndterer kan være mye høyere enn det vi møter i dagliglivet. Fordi antallet og konsentrasjonen er stor og fordi bakterier som anrikes, isoleres og dyrkes fra omgivelsene våre er ukjente og kan være patogene så skal alt arbeid med mikroorganismer utføres som om de var patogene. Renslighet og bruk av aseptisk arbeidsteknikk er derfor en dyd av nødvendighet. Aseptisk arbeidsteknikk skal sikre at: Forsøksmaterialet ikke blir forurenset av mikroorganismer fra omgivelsen. Mikroorganismene fra forsøksmaterialet ikke blir spredt til omgivelsen. Derfor må alt utstyr som brukes og som kommer i kontakt med forsøksmaterialet, være sterilt. Etter bruk må dette utstyret tas hånd om på en forsvarlig måte og søl må unngås. Vanligvis er alt utstyr sterilisert på forhånd. Men en del brukerutstyr som f.eks. podenåler, glass-staver og pinsetter må steriliseres på stedet. En beskrivelse av de vanligste steriliseringsmetodene finner du i Appendiks A6. Husk følgende regler for mikrobiologisk laboratoriearbeid: Bruk en ren laboratoriefrakk. Ingen røking eller spising på laboratoriet. Vask hendene før og etter lab-arbeid. Benkeplassen skal vaskes før og etter bruk med 70% etanol (desinfeksjonsvæske). Hold arbeidsplassen din ren og ryddig til enhver tid. Oppbevar ikke unødig utstyr verken på benken eller i inkubatorskapene. Bland ikke sammen rent og skittent utstyr. Etter bruk må utstyr tas hånd om på en forsvarlig måte: Brukt engangsutstyr som plastagarskåler, tørkepapir og pipettespisser legges i en plastbøtte til dette formål. Brukte glasspipetter (1mL,5mL,10mL) settes i en plastbøtte med desinfeksjonsvæske (klorin). Ta ut bomullspluggen fra pipettene før de samles inn for vasking. Annet skittent glassutstyr og brukte kulturrør skal straks etter bruk skylles og legges i det fremsatte samlekar. Tusjmerking fjernes med skrubb eller aceton. Sett tydelig merke på alt som skal brukes i et eksperiment. Kurs- og lag nr. Umerkede prøverør og petriskåler blir kastet. Mikroskopene skal alltid rengjøres etter bruk og tildekkes med støvhetten. Enhver ødeleggelse eller feil på mikroskopet må straks rapporteres til kursleder. Uhell som søl av sterke syrer og baser, kutt, forbrenninger, svelgning eller søl med kulturene, må straks meldes til kursleder. NB! Steng gasskranen før du forlater arbeidsplassen for dagen.

8 BIO 101 Mikrobiologi og protister 6 ver 07/01/2013 Diverse basisutstyr. Petriskåler: Disse består av en bunndel og et lokk. De er laget av plast eller glass og brukes til dyrking på faste medier(agar). Plastskålene leveres i sterile pakninger. Ta ikke ut flere skåler enn du har bruk for. Plastskålene tåler ikke langvarig oppvarming over 50 0 C. Ved dyrking over 50 0 C brukes skåler av glass. Merk alltid skålene(bunndelen) med navn, dato og organisme/kultur før du plasserer dem i inkubatoren. Kulturrør: Dette er tykkveggete reagensrør uten krave. De brukes til å dyrke mikroorganismer på faste og flytende medier. Rørene kan lukkes med bomullspropp eller med en hylse av plast eller metall. Erlenmyerkolber (EM-kolber): De brukes til dyrking av mikroorganismer i flytende medier. De er godt egnet for aerobe organismer. Kolbene kan lukkes med Al-folie eller bomullspropp. Podenål: Denne brukes til overføring av mikroorganismer fra f.eks. en kultur til et nytt medium (poding eller inokulering), fra en anrikingskultur til petriskåler med agarmedium for å isolere mikroorganismer og anlegge renkulturer eller fra en kultur til et objektglass for mikroskopering. Pipetter: Vi skal bruke automatpipette (100 og ul) og graderte glasspipetter på 1mL, 5mL og 10mL. Aluminiumsbeholdere med sterile pipetter er plassert på hver arbeidsbenk. Ta alltid i den øvre enden av pipetten. For å hindre at spytt eller støv skal trenge ned i pipetten er det plassert en bomullsplugg i den øvre enden. Bruk peleusballong / pipettepumpe til pipettering med glasspipetter - ikke munnen. Pasteurpipetter: De brukes til å ta ut små volumer fra flytende kulturer. Fire dråper tilsvarer ca. 0,1 ml. Sterile pasteurpipetter skal finnes i beholdere på laboratoriet. Bunsenbrenner: Gassbluss for sterilisering (gløding) av podenåler etc. En bunsenbrenner skal stå på hver arbeidsplass. Inkubator: Dette er et termostatert skap eller rom hvor en plasserer kulturer av mikroorganismer (inkuberes) for å dyrke dem ved en bestemt temperatur. Alt som settes i inkubatoren må merkes med navn og/eller lagnummer. Agarskåler legges i plastposer og inkuberes med bunnen opp.

9 BIO 101 Mikrobiologi og protister 7 ver 07/01/2013 Noen faguttrykk og definisjoner. Steril: Fri for alle former for liv. Sterilisering: Total inaktivering (dreping) eller fjerning av alle former for liv med hensyn til deres evne til å reprodusere seg selv. Desinfeksjon: Dreping eller reduksjon i tallet på visse typer mikroorganismer. Materialet blir ikke nødvendigvis sterilt. Opprinnelig ble uttrykket desinfeksjon brukt om metoder til å uskadeliggjøre patogene(sykdomsframkallende) mikroorganismer. Desinfeksjonsmiddel: Stoff som dreper mikroorganismer (men ikke nødvendigvis deres sporer) og skal anvendes på ikke-levende materiale som f.eks. redskaper og arbeidsbenker. Aseptiske midler: Dreper også mikroorganismer, men et antiseptikum er et så lite farlig stoff at det kan brukes på levende vev som f.eks. hud og slimhinner. Poding og inokulering: Med poding eller inokulering menes å introdusere (mikro)organismer. I mikrobiologi betyr dette å overføre eller tilsette mikroorganismer (bakterier, virus alger osv.) til et medium eller sted der de kan vokse. Materialet med mikroorganismer som overføres kalles inokulum. Vanlig utstyr til poding er podenål eller pipette. Podenål brukes ved overføring av små mengder podemateriale. Pipetter brukes til overføring av et bestemt volum flytende podemateriale. Medium/substrat: Med det mener en vekstmidlet eller blandingen av næringsstoffer som mikroorganismene dyrkes på eller i.

10 BIO 101 Mikrobiologi og protister 8 ver 07/01/2013 Mikroskopering Formålet med denne delen av kurset er å lære grunnleggende bruk av lysmikroskop. De mikroskopene vi bruker på kurset er i tillegg til vanlig lysfelt også utstyrt med mørkefelt og fasekontrast. Mikroskopene har objektiver som forstørrer fra 4x til 100x. Vi går gjennom vedlikehold og justering av mikroskopet, bruk av ulike mikroskoperingsteknikker og valg av forstørrelse. Mikroskopteori finner du i Appendiks A1. Mikroskopets oppbygging Mikroskoptubus med okularer Okular med dioptri-innstilling Skala som viser avstanden mellom okularene (= pupilleavstand) Objektbord med klemmer som holder preparatet på plass Skrue for høydejustering og fokusering av kondensor (sitter på venstre side og Kondensor er ikke synlig med på faseringer bildet) og aperturblender (se nærbilder nedenfor) Lampehus med feltblender Håndtak for å bære mikroskopet Håndtak for å bære mikroskopet Objektivrevolver med objektiver som forstørrer fra 4x til 100x Skruer for X- og Y- justering av preparater på objektbord Fokuseringsskruer for grov og finjustering (en på hver side av mikroskopet) Av/på bryter for lys. Hjul for justering av lysintensitet sitter på motsatt side Figur 1.1 LEICA DM750 mikroskop med fasekontrast

11 BIO 101 Mikrobiologi og protister 9 ver 07/01/2013 Objektiv med angivelse av forstørrelse / numerisk apertur og fasering nummer Aperturblender Kondensor med faseringer (PH1, PH2, PH3) lysfelt (BF) og mørkefelt (DF) To skruer for å sentrere kondensoren Lampehus med feltblender Fokuseringsskruer for grov og finjustering (en på hver side av mikroskopet) Figur 1.2 Nærbilde av fasekontrast kondensoren på LEICA DM750 Kort om bruk / vedlikehold / renhold av mikroskopene Bruk håndtakene (se Fig 1.1) og hold mikroskopet med begge hender hvis det skal løftes / flyttes. Hold alle optiske overflater (okularer, objektiver, kondensor, lampe) rene. Bruk KUN lisepapir og rensevæske til å rengjøring. (se Appendiks A9 "Cleaning of Microscope Optics"). Ikke bruk maskara / øyensverte de dagene du skal mikroskopere det griser bare til okularene. Bruk alltid dekkglass på preparatet Ikke skru objektivene så langt ned at de berører preparatet (100X objektivet skal berøre oljen ikke preparatet) Hvis du har bruk 100X objektivet / olje må du IKKE bruke 40X objektivet etterpå da søler du det til med olje. Når du er ferdig for dagen: o Fjern preparater o Vask av olje fra 100x objektivet hvis du har brukt det o Tørk av mikroskopet o Legg over støvhette

12 BIO 101 Mikrobiologi og protister 10 ver 07/01/2013 Lysfelt, mørkefelt og fasekontrast. Hvilken mikroskoperingsteknikk vi bruker bestemmes av hvordan vi kombinerer objektiv og innstilling på kondensor. Tabellen gir en oversikt over mulige kombinasjoner. I Appendiks A1 finner du en kort innføring i mikroskopteori og en forklaring på hvordan de ulike teknikkene fungerer. Teknikk Objektiv Kondensor Bruk Lysfelt Alle BF Fargete eller store objekter, >10 m (dvs >0,01mm). Mørkefelt 4x-40x DF Alt som er "smått" dvs m (0,0001-0,1mm). Med denne teknikken ser vi ingen detaljer og mye rusk. Lett å se bevegelige mikroorganismer på lav forstørrelse. 10x PH1 Små objekter uten farge 0,1-10 m (0,0001- Fasekontrast 40x PH2 0,01mm). Dette er den metoden vi bruker mest 100x PH3 i mikrobiologi. Aperturblenderen skal alltid være helt åpen når du bruker mørkefelt og fasekontrast. Når du bruker lysfelt kan du variere blenderen for å få mindre lys og større dybdeskarphet. 100x objektivet er et oljeimmersjonsobjektiv og da må det være olje mellom objektivet og dekkglasset (se Appendiks A1). Alle oljeimmersjonsobjektiver er merket med en sort ring. Problemer? Sjekk de vanligste feilene: Preparatet er ute av fokus. Kondensoren er skrudd ned. Blenderen er lukket. Feil fase. Vann eller oljesøl på objektivet. Skitne okkularer (kommer fra øyenvippene). Glemt olje på 100x. Figur 1.3 Fasekontrast bilde av bakterier. Bilde til høyre viser bakterier som har samlet seg rundt en luftblære. (Kilde:

13 BIO 101 Mikrobiologi og protister 11 ver 07/01/2013 Øvelse 1.1: Justering av lysmikroskop For at mikroskopet skal gi et optimalt bilde av objektet er det viktig at det justeres korrekt. I praksis vil dette si at okularene stilles slik at du ser skarp på begge øynene og at lysveien sentreres slik at lampe, linser og blendere etc. er sentrert langs mikroskopets optiske akse. Lær deg å kjenne igjen et dårlig innstilt mikroskop slik at du kan rette feil og få sett det du skal se. Ved å følge / sjekke de tre punktene i følgende beskrivelse skulle resultatet bli bra. Utstyr: Mikroskop Beskrivelse av mikroskopet (se f.eks Figur 1.1 og 1.2) Preparat (hva som helst kan brukes, for eksempel objektglass med en tusjstrek) Prosedyre (hver student justerer sitt eget mikroskop): 1. Mikroskoptubus Slå på lyset og juster til passende intensitet. Sving inn 10x objektivet Juster avstanden mellom okularene (= pupilleavstand) slik at du kan se i mikroskopet med begge øynene. 2. Justering av okularene Still måleokularets dioptriinnstilling (dioptri er enhet for linsestyrke) slik at du ser måleskalaen skarpt. Hvis du er like langsynt/nærsynt på begge øynene, bruker linser eller mikroskoperer med briller på så stilles det andre okularet til samme verdi og går videre til punkt 3. Legg et preparat på objektbordet. Sving inn 10x objektivet, still kondensoren på BF Se gjennom måleokularet og fokuser preparatet (se med bare ett øye). Juster det andre okularets dioptriinnstilling til du ser skarp med det andre øyet. Sving inn 40x objektivet, fokuser og kontroller at du ser skarp på begge øynene. 3. Köhler innstilling (for å oppnå jevn belysning og optimal kontrast) Legg inn et preparat (for eks et objektglass med en tusjstrek på), sving inn 4x objektivet, still kondensoren på BF, og fokuser. Lukk feltblenderen så mye at du ser den - den skal være skarp, hvis ikke må du skru kondensoren opp eller ned. Sentrer blenderen (og dermed kondensoren) med de to sentreringsskruene - lettest å se hvis du åpner blenderen så mye at kantene nesten berører kanten av synsfeltet. Åpne feltblenderen så mye at den akkurat forsvinner ut av synsfeltet. Justering av faseringer kan av og til også være nødvendig, men dette skal vi ikke gå gjennom her. Journalføring Ingen

14 BIO 101 Mikrobiologi og protister 12 ver 07/01/2013 Øvelse 1.2: Lysfelt, mørkefelt og fasekontrast. I denne øvelsen skal vi demonstrere forskjellene på de ulike mikroskopiteknikkene. Før du begynner bør du lese gjennom avsnittet Lysfelt, mørkefelt og fasekontrast og Appendiks A1. Utstyr: Mikroskop Objektglass og dekkglass Kultur med en blanding av protozoer, alger og bakterier Prosedyre: Lag et våtpreparat med en dråpe kultur Legg preparatet i mikroskopet og se på det med de ulike innstillingene som angitt i tabellen nedenfor. Sammenlign det du ser med beskrivelsen i avsnittet Lysfelt, mørkefelt og fasekontrast. Lag en enkel skisse som illustrerer hvordan organismene ser ut med de ulike teknikkene. Merk deg følgende: Farge, størrelse på de ulike organismene i forhold til hverandre, og om detaljer som for eks. kloroplast og flagell synlige. Teknikk Objektiv Kondensor Kommentar Lysfelt 10-40x BF Du skal kunne se alger og protozoer som svømmer. Kan du se flageller (når cellene ligger i ro)? Bakterier synes ikke (i beste fall dårlig på 40x). Mørkefelt 10-40x DF Nå ser du hvor mye rusk det er i prøven og på glasset i tillegg til cellene. Kan du se bakterier? Fasekontrast 40x 100x (olje) PH2 PH3 Nå skal du kunne se flageller. Hvis ikke må du pusse og justere mikroskopet (se side 3-5). Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Skisser som viser hvordan organismene ser ut ved de ulike teknikkene. Kommentarer til organismenes utseende ved de ulike teknikkene (farge, synlige detaljer). Bruk pensumlitteratur eller internett og finn svar på følgende spørsmål: 1) Hva er (omtrentlig) størrelsen på organismene i preparatet. 2) Hva er diameteren på flagellene til eukaryote organismer og til bakterier?

15 BIO 101 Mikrobiologi og protister 13 ver 07/01/2013 Øvelse 1.3: Synsfeltets størrelse og kalibrering av måleokular I denne øvelsen skal du finne ut finne ut hvor mye du ser i mikroskopet, dvs diameteren på synsfeltet, og lære å kalibrere måleokular slik at du kan måle størrelsen på det du ser i mikroskopet. Utstyr: Mikroskop Objektmikrometer (objektglass med en 2mm lang målestokk delt i 200 streker) Måleokular (i ett av okularene på mikroskopet er det lagt inn en målestokk / strekplate) Prosedyre: Se gjennom måleokularet og fokuser målestokken i okularet ved å vri på dioptriinnstillingen. Fokuser på et preparat med dette okularet og juster dioptriinnstillingen på det andre okularet slik at du ser skarpt med begge øynene. Legg objektmikrometeret i mikroskopet, finn skalaen med 10x objektivet og fokuser (bruk BF og liten åpning på aperturblenderen slik at du får stor dybdeskarphet). Du skal nå kunne se begge skalaene skarpt. Vri okularet og flytt preparatet slik at skalaene blir parallelle og ligger over eller ved siden av hverandre (se Figur 1.4). Mål lengden på skalaen i okularet ved 4x, 10x, 40x og 100x forstørrelse og før resultatet inn i tabellen. Ved 4x forstørrelse er skalaen på objektmikrometeret for kort, så her må du flytte preparatet og legge sammen flere målinger. Måleokular skala / strekplate med 100 delstreker Objektmikrometer med lengde på 2 mm og 200 delstreker. (1 delstrek = 0.01mm = 10 m) Figur 1.4 Synsfelt i mikroskop med måleokular og objektmikrometer.

16 BIO 101 Mikrobiologi og protister 14 ver 07/01/2013 Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Resultater i tabell Svar på spørsmålet: Hva er sammenhengen mellom mikroskopets forstørrelse og lengden på skalaen i okularet? Tabell øvelse 1.4 Objektivets forstørrelse Mikroskopets forstørrelse 4x 40x 10x 100x 40x 400x 100x 1000x Synsfeltets diameter (mm) Lengden på skalaen i måleokularet (mm)

17 BIO 101 Mikrobiologi og protister 15 ver 07/01/2013 Øvelse 1.4: Mikroskopering av mikroorganismer Vi skal i denne oppgaven lage preparater, tegne og måle størrelsen på ulike mikroorganismer som vi omgir oss med Utstyr Mikroskop Vann i dråpeflaske Objektglass og dekkglass Podenål Pasteurpipette Ulike kulturer og vannprøver o Bakterier i yoghurt (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus og Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) o Sopp i ost eller mugg (Rhizopus (brødmugg), Mucor (gammelost), Penicillium (blåmuggost) o Bakegjær (Saccharomyces cerevisiae) o Mikroalger - Diatomeer: Chaetoceros curvisitus (sentrisk), Thalassionema nitzschioides - Dinoflagellater: Heterocapsa triquetra - Flagellater: Prymnesium parvum, Pyramimonas sp Prosedyrer: Tillaging av mikroskopiske preparater: Materialet vi skal se på i mikroskop må alltid ligge i en væskefase og det må alltid være et dekkglass oppå. Væsken er vanligvis vann, men kan også være et fargestoff eller et annet egnet innleiringsmedium. Bruk lite materiale og lite væske, med litt erfaring finner du ut hva som er passe. Når dekkglasset legges på skal det ikke svømme og det skal ligge flatt (kan være vanskelig hvis det er brukt for mye materiale). Hvis du har for mye væske kan overskuddet tas vekk ved hjelp av tørkepapir. Mikroorganismer fra kultur i flytende medium: 1. Bruk podenål eller pasteurpipette og overfør en dråpe av kulturen til et objektglass 2. Legg på dekkglass. Vanlig feil: For stor dråpe(prøve) på objektglasset. Mikroorganismer på fast medium: 1. Legg en liten dråpe vann på objektglasset. 2. Bruk sterilteknikk og ta ut litt av kulturen med podenålen. Skal du lage preparat av en sopp så ta materiale fra ytterkanten av kolonien. Suspenderer cellene i vanndråpen og spre denne suspensjonen litt utover objektglasset med podenålen. 3. Legg på dekkglass. Vanlige feil: For mye vann på objektglasset. For mye cellematerialet og for tett cellesuspensjon.

18 BIO 101 Mikrobiologi og protister 16 ver 07/01/2013 Mikroskopere Legg preparatet i mikroskopet og still inn mikroskopet (forstørrelse, fase/lysfelt osv). Begynn alltid på lav forstørrelse (10x) og finn et objekt du kan fokusere på før du går høyere forstørrelse. Observer følgende egenskaper ved organismene: a) Form (tegn det du ser) b) Størrelse (bruk måleokular) c) Bevegelighet (observere "levende preparat") d) Særtrekk (for eks sporer, flageller, etc) Apropos bevegelse: At celler rører på seg i mikroskopet betyr ikke at de har egenbevegelse eller svømmer. Preparatet kan «renne» som en elv og da flytter alle cellene seg i samme retning. Brownske bevegelser er tilfeldige partikkelbevegelser i væske eller gass og får cellene til å dirre eller virre frem og tilbake. Hvis organismene har egenbevegelse (vanligvis flagell eller cilier, noen diatomeer og trådformete cyanobakterier har glidende bevegelser) så vil de forflytte seg uavhengig av hverandre i preparatet. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Tegninger av det DU har observert. Angi størrelse på organismene. Sammenlign dine målinger med det du kan finne om størrelsen på organismene i pensum litteraturen eller på internett.

19 BIO 101 Mikrobiologi og protister 17 ver 07/01/2013 Mikroorganismer i vårt nærmiljø I innledningen ble det nevnt at vi er omgitt av en naturlig mikroflora. Vi skal utføre noen enkle øvelser som demonstrerer tilstedeværelse av bakterier på og omkring oss. Alle medier og vekstforhold er selektive og hvert av dem gir grobunn for vekst av bare noen få av de mikroorganismene som er tilstede i et naturlige miljø. Appendiks A7 beskriver dyrking av ulike mikroorganismer og i Appendiks A8 finner du oppskriften på noen vanlig brukte medier. På KPGA-skålene (Kjøtt-Pepton- Gjærekstrakt-Agar) vokser et bredt spektrum av mikroorganismer (bakterier). På Mex-skålene (Maltekstrakt-agar) vil først og fremst gjærsopp kunne vokse. Vekstforholdene i denne øvelsen vil f.eks. ikke tillate vekst av strengt anaerobe bakterier da kulturene inkuberes aerobt. Øvelse 2: Mikrofloraen på fingrer, hår, etc. I denne øvelsen skal vi påvise forekomst av bakterier og sopp på og omkring oss. Utstyr: Agarskåler med KPGA og Mex. Sterilt vann på dråpeflaske Steril bomullspinne Prosedyre: 1) Marker fire sektorer med tusj på bunndelen (utsiden) av hver skål og merk disse med hva som testes (for eks «fingeravtrykk», «hår», «dørhåndtak», «jord» etc) 2) Fukt fingeren med sterilt vann og sett den ned på agaren eller fukt en steril bomullspinne, vask det du vil teste og stryk deretter ut på agaren. Skal du teste noe fuktig (snørr, spytt, vann fra do etc) trenger du ikke fukte bomullspinnen med sterilt vann. 3) Merk skålene med navn, dato og plass/mikroskop nr (så vet vi hvor du sitter). Legg KPGA skålene en plastpose og inkuber ved 30 o C. Mex skålene legges i egen plastpose og inkuberes ved romtemperatur i skuffen i labbenken. Alle skålene inkuberes med bunnen opp. 4) Neste kursdag observeres skålene for vekst av mikroorganismer som vil vise seg som kolonier med ulik form og farge på agarflaten nær testobjektet eller berøringsstedet. Mex skålene må kanskje inkuberes til neste uke. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Tegn en skisse eller ta bilde av hver skål med vekst. Kommenter likheter og forskjeller i forhold til hvilket objekt som ble testet. Gav de forskjellige mediene forskjellig resultat? Beskriv eventuelt forskjellene. Kommentarer til resultatene og konklusjon.

20 BIO 101 Mikrobiologi og protister 18 ver 07/01/2013 Øvelse 3: Mikrofloraen i luft I den øvelsen skal vi påvise forekomst av bakterier og sopp i luft og sammenligne forekomsten ulike steder (laboratorium, kontor, lesesal, hjemme, ute). Utstyr: 3 stk.kpga- og 3 stk. Mex-skåler. Prosedyre: 1) Ta 3 stk. KPGA- og 3 stk. Mex-skåler til der du skal undersøke mikrofloraen i lufta. 2) Eksponer skålene ved å ta av lokket. Eksponeringstida skal være 1 time. 3) Etter at skålene er eksponert, pakkes de inn på nytt, merkes med navn, dato og eksponeringssted. KPGA skålene inkuberes ved 30 o C og Mex-skålene ved romtemperatur. 4) Neste kursdag: Tell antall kolonier på skålene og før resultatene inn i tabell på tavla. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Tabell som viser dine og hele klassens resultat (minimum, maksimum og gjennomsnitt) for hvert eksponeringssted. Kommentarer til resultatene og konklusjon. Tabell øvelse 3 Antall bakterier (kim) pr skål pr time Klassens resultat Sted Mine resultat Min - Max Gjennomsnitt Lab - Kontor - Lesesal - Hjemme - Ute -

21 BIO 101 Mikrobiologi og protister 19 ver 07/01/2013 Øvelse 4: Antibiotikaresistens Antibiotikaresistens er et alvorlig og økende medisinsk problem. I denne øvelsen skal vi demonstrere hvordan vi kan teste hvor godt eller dårlig ulike antibiotika virker mot en bakterie. Testen vi skal bruke går ut på å måle hemmingssoner rundt papirtabletter med ulike typer og konsentrasjoner av antibiotika når disse legges på agarskåler der det vokser bakterier. Dette er en standardtest (se også Oxoid Antimicrobial Susceptibility Test (AST)), men vi følger en forenklet protokoll fordi vi ikke er avhengige av konstante testbetingelser. Bakteriene vi skal teste plukker vi fra en av agarskålene i øvelse 3.1. eller 3.2. Vi vet ikke hvilken bakterie dette er så her skal det jobbes sterilt og uten søl. Tenk deg at du er blitt infisert og syk av denne bakterien, spørsmålet er nå hvilket antibiotikum du skal velge for å bli frisk. Utstyr: Bakterieprøve (fra øvelse 2 eller 3) 2 Agarskåler med KPGA Sterilt vann Sterile Eppendorfrør Steril bomullspinne Antibiotika disc dispenser (se tabell) Antibiotika i disc dispenseren. Antibiotikum Mekanisme Eksempler på medisinsk bruk Penicillin Hemmer G+: Staphylococcer og Streptococcer, men celleveggsyntese mange resistente Ampicillin Bredspektret penicillin Hemmer G+: Staphylococci, Streptococci celleveggsyntese G-: H. influenzae, coliforme og Proteus spp. Vancomycin Hemmer celleveggsyntese G+, smalspektret, men effektiv. Erythromycin 50S inhibitor Som penicillin, men bedre mot mykoplasma og legionella. Luftveisinfeksjoner Streptomycin 30S inhibitor Bredspektret. Brukes ved alvorlige infeksjoner som tuberkulose og pest Tetracycline 30S inhibitor Bredspektret. Brukes ved infeksjoner forårsaket av G+ og G- chlamydier, mycoplasmer, spiroketer, rickettsier og actinomyceter. Chloramphenicol 50S inhibitor Bredspektret, G+ og G-. Øyeinfeksjoner Trimethoprim Folsyre metabolisme Urinveisinfeksjoner Prosedyre (sjekk standardprosedyre): 1) Bruk en steril bomullspinne til å plukke en (eller flere like) koloni(er) fra en agarskål og suspender bakteriene den i 0.5 ml sterilt vann i ett eppendorfrør. 2) Bruk den samme fuktige bomullspinnen og stryk ut suspensjonen på en agarskål slik at hele skålen dekkes. 3) Legg på antibiotika antibiotikatabletter med dispenseren 4) Inkuber i 24h ved 32 C. 5) Mål diameteren hemmingsonene (mål på undersiden utan å ta av lokket)

22 BIO 101 Mikrobiologi og protister 20 ver 07/01/2013 Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Resultat (diameteren på hemmingssonene) i tabell Tegning eller fotografi av skålene. Kommentarer til resultatene og konklusjon. Tabell øvelse 4 Antibiotikum Konsentrasjon Kode Hemmingssone (mm) Penicillin G 10 units P 10 Ampicillin 10 µg AMP 10 Vancomycin 5 µg VA 5 Erythromycin 10 µg E 10 Streptomycin 10 µg S 10 Tetracycline 10 µg TE 10 Chloramphenicol 10 µg C 10 Trimethoprim 2,5 µg W 2.5

23 BIO 101 Mikrobiologi og protister 21 ver 07/01/2013 Anrikning av bakterier Dersom den organismen en ønsker å isolere og rendyrke, finnes i stort antall i miljøet, kan en anlegge renkultur direkte fra det. En kan da nytte en eller flere av metodene eller teknikkene som fortynning, utstrekning, utplating eller innstøpning. Men vanligvis er en bestemt mikroorganisme tilstede i et lite antall og/eller finnes sammen med mange uønskete organismer. Da vil det lønne seg å anlegge en anrikningskultur først. Dette er en kultur der en velger vekstmediet og dyrkingsvilkårene slik at en gir "den ønskede mikroorganisme" en selektiv fordel mht. veksthastighet (se Appendiks A7 og A8). Det vil si den vokser hurtigere enn de andre organismene i kulturen, men ikke nødvendigvis optimalt. Derved vil den øke sin relative andel av kulturens biomasse. Til anrikningskulturer benytter en svært ofte selektive vekstmedier og/eller dyrker under selektive vekstforhold. Inokulumet må selvsagt inneholde den ønskede organisme i størst mulig tetthet. Forbehandling av inokulumet/anrikningskilden kan også være aktuelt f. eks. koking for anrikning av endospore-dannende bakterier. Kort sagt gjelder det å utnytte den ønskede organismens mer eller mindre spesifikke egenskaper slik at denne favoriseres mht. vekst framfor alle andre tilstedeværende organismer. Men det vil ofte ikke være det samme som å tilrettelegge optimale vekstbetingelser for en renkultur av vedkommende organisme. I en blandet mikroorganisme kultur er det den relative veksthastigheten som er avgjørende for hvilken organisme som tallmessig vil komme til å dominere i kulturen til slutt. Det betyr at planlegging og gjennomføring av en vellykket anrikning generelt vil kreve en omfattende kunnskap om den ønskede organismen, og ofte også til de uønskede organismene. Likevel, selv med besittelse av denne viten er man ikke garantert et vellykket resultat. Glem heller ikke at en "vellykket anrikningskultur" sjelden er det samme som en renkultur. En anrikningskultur er vellykket når en har oppnådd et forbedret og godt utgangspunkt for påfølgende isolering og anlegging av renkultur vha. fortynning, utplating og/eller utstrekning.

24 BIO 101 Mikrobiologi og protister 22 ver 07/01/2013 Øvelse 5: Anrikning av melkesyrebakterier I denne øvelsen skal vi demonstrere hvordan vi kan anrike for melkesyrebakterier. Utstyr: 2 stk. 200 ml Erlenmeyer-kolber 50 ml skummet melk ph-meter Prosedyre: 1) Til hver av to stk. 200 ml E-kolber tilsettes ca. 50 ml skummet melk. Mål ph. 2) Den ene kolben merkes "K" (kontroll) og lukkes med Al-folie. 3) Den andre kolben inokuleres med spytt og merkes tilsvarende. 4) Inkuber kolbene ved 30 o C i 1-2 dager. 5) Beskriv forskjellene i lukt og konsistens på kolbenes innhold. Mål ph. 6) Mikroskoper prøver av innholdet, og beskriv det du ser. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Beskriv hva som ble observert ved mikroskopering, tegn. Hvilke endringer i ph ble observert? Svar på spørsmål 1) Hvordan ville du gått videre for å isolere organismer fra anrikningene? Kommentarer til resultatene og konklusjon.

25 BIO 101 Mikrobiologi og protister 23 ver 07/01/2013 Kvantifisering av mikroorganismer Det er tre prinsipielt forskjellige måter å telle mikroorganismer på. Det er de metodene som baserer seg på 1) Observasjon av enkeltceller (mikroskopi, elektronisk partikkelteller, flowcytometri) 2) Vekst (kimtall, most-probable-number (MPN) 3) Cellenes / kulturens optiske egenskaper (lysabsorbsjon, lysspredning). Det viktige er at metodene som baserer seg på vekst bare tar med de levende organismene som kan vokse ved de betingelsene vi gir dem. De metodene som baserer seg på observasjon og optiske egenskaper tar med både levende og døde celler, og eventuelt andre partikler som ligner på de cellene. Noen ulike metoder er kort beskrevet i Appendiks A2. Øvelse 6: Telling av gjær i tellekammer I denne øvelsen skal du lære å bruke tellekammer og bruke det til å finne ut hvor mange gjærceller det er i en pakke gjær. Før du begynner må du lese Appendiks A3 om bruk av tellekammer. Utstyr Mikroskop Vekt Tellekammer Fortynningsvann Falconrør 2 Eppendorfrør og stativ Pipette (10mL) og pipettefyller Automatpipetter 100µL og µL Bakegjær (Saccharomyces cerevisiae) Prosedyrer: 1) Vei inn ca 0,1 gjær og løs den opp i 10mL vann i et Falconrør. 2) Fortynn gjærløsningen 100 ganger i eppendorfrør (dvs. 2 ganger 1:10 fortynning, (100µL gjærløsning + 900µL vann)). 3) Legg en liten dråpe fra 100x fortynningen på rutenettet i tellekammeret (se Appendiks A3) og tell gjærcellene. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Utregning av antall gjærceller i en pakke (50g) gjær) Regn volumet av alle cellene til sammen (antall celler x volum av enkeltcelle). Volumet av en enkelt celle kan beregnes fra dine egne størrelsesmålinger i øvelse 1.5 når du antar at gjærcellene er kuleformet (volum = 4/3πr 3 ). Hvordan stemmer volumet av cellene med volumet gjærpakken (En gjærpakke veier 50g og måler ca 3x3x4cm = 36cm 3 ). Kommentarer til resultatene og konklusjon.

26 BIO 101 Mikrobiologi og protister 24 ver 07/01/2013 Øvelse 7: Kimtall I denne øvelsen skal du finne kimtallet og antall koliforme bakterier i en vannprøve. Vi skal bruke en kommersiell test som heter Petrifilm og produseres av 3M. Disse baserer seg på bruk av bare 1mL vannprøve og er dermed ikke veldig følsomme. Skal drikkevann testes og godkjennes bruker man 100 ml vannprøve for koliforme bakterier. Les bruksanvisningene i Appendiks A10 og A11 før du begynner der får du en detaljert beskrivelse av hvordan platene inokuleres og hvordan resultatet tolkes og telles. Utstyr 3M Petrifilm Aerobic Count Plate (Gul) 3M Petrifilm Coliform Count Plate (Rød) Plast spreder (fra 3M) Automatpipette 1 ml Pipettespisser 1 ml Vannprøve Prosedyrer (for detaljer se Appendiks A10 og A11): Totalkim (3M Petrifilm Aerobic Count Plate) (Gul) 1) Legg Petrifilmen på bordet og løft opp toppfilmen. 2) Hold pipetten loddrett og legg 1mL vannprøve på midten av filmen. 3) Slipp toppfilmen og la den falle på plass. 4) Legg sprederen med den «hule» siden ned på filmen og press forsiktig (ikke vri eller gni) slik at vannprøven fordeler seg ut over hele sirkelen. 5) Ta vekk sprederen, og la filmen ligge i ro på bordet i ett minutt mens gelen dannes. 6) Merk platen med navn og prøve. 7) Inkuber i 48±3h ved 32±1 C. 8) Tell antall kolonier på skålene og før resultatene inn i tabell på tavla. Koliforme (3M Petrifilm Coliform Count Plate) (Rød) 1) Legg Petrifilmen på bordet og løft opp toppfilmen. 2) Hold pipetten loddrett og legg 1mL vannprøve på midten av filmen. 3) Rull ned toppfilmen forsiktig slik at de dannes luftblærer under - ikke la den falle på plass. 4) Legg sprederen med den flate siden ned på filmen og press forsiktig (ikke vri eller gni) slik at vannprøven fordeler seg ut over hele sirkelen. 5) Ta vekk sprederen, og la filmen ligge i ro på bordet i ett minutt mens gelen dannes. 6) Merk platen med navn og prøve. 7) Inkuber i 24±2h ved 32±1 C. 8) Tell antall kolonier på skålene og før resultatene inn i tabell på tavla.

27 BIO 101 Mikrobiologi og protister 25 ver 07/01/2013 Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Tegning eller fotografi av Petrifilmene dine. Tabell som viser dine og hele klassens resultat (minimum, maksimum og gjennomsnitt) for hver vannprøve. Kommentarer til resultatene og konklusjon. Tabell øvelse 7 Antall totalkim pr ml Klassens resultat Vannprøve Mine resultat Min - Max Gjennomsnitt Dam i parken - Drikkeflaske - Springvann - Tabell øvelse 7 Antall koliforme pr ml Klassens resultat Vannprøve Mine resultat Min - Max Gjennomsnitt Dam i parken - Drikkeflaske - Springvann -

28 BIO 101 Mikrobiologi og protister 26 ver 07/01/2013 Øvelse 8: Vekstforsøk med Vibrio natriegens I denne øvelsen skal vi lage en vekstkurve for Vibrio natriegens. Dette er en gramnegativ, aerob, heterotrof og polar flagellert bakterie som er halofil og krever NaCl (2%) i vekstmediet. I komplekst medium kan den vokse svært raskt med en generasjonstid på 9,8 min. Vi skal dyrke V. natriegens på flytende minimalmedium (MM) med glukose og 2% NaCl og vi skal følge veksten med turbiditet, celletall (mikroskoptelling) og kimtall. Vekst av mikroorganismer i satskultur er beskrevet i Appendiks A4. Teorien bak turbiditetsmåling er beskrevet i Appendiks A2. Utstyr: 250 ml flaske med 100 ml MM-medium m/glukose Luftpumpe Inokulum Vibrio natriegens Vannbad Pipetter 5mL og pipettefyller Spektrofotometer og kyvetter Prosedyre (4 studenter jobber sammen): 1) Oppstart og prøvetaking a) Flasken merkes med lag nr. og plasseres i vannbad ved 35 o C. Reguler lufttilførselen. Flasken skal stå i vannbadet under hele forsøket. b) Vekstforsøket startes ved å tilsette 5 ml kultur (inokulum). Inokulumet skal tas fra en utvokset kultur (i stasjonærfase) som står ved konstant risting i ristevannbadet på 35 o C. c) Noter tiden for start og ta ut 3-4 ml prøve til måling av turbiditet (A 620nm ) hvert 15 minutt til kulturen kommer i stasjonær fase, ca 3 timer. 2) Turbiditets måling (3-4 ml): a) Still inn spektrofotometeret på 620 nm og 0-still instrumentet med dyrkingsmediet som blank. b) Mål turbiditeten på kulturen A 620nm. Etter måling kastes prøven i vasken. c) Før resultatene straks inn i tabell og lag diagram (A 620nm mot tid) slik at en hele tiden kan følge med i vekstforløpet. Journal skal inneholde følgende: Tittel på øvelsen Navn på samarbeidspartnere og medforfattere Formålet med øvelsen Tabell over resultater (se side 27) Figurer som viser veksten på lineær skala og på log skala (se side 28) Beregn den spesifikke veksthastigheten µ (se Appendiks A4). Kommentarer til resultatene og konklusjon.

29 BIO 101 Mikrobiologi og protister 27 ver 07/01/2013 Tabell øvelse 8 Tid Absorpsjon min. (A 620 )

30 BIO 101 Mikrobiologi og protister 28 ver 07/01/2013 Figur 8.1: Vekstkurve for Vibrio natriegens. Lineært plott Absorbsjon, A620nm Tid, minutter Figur 8.2: Vekstkurve for Vibrio natriegens. Logaritmisk plott

31 BIO 101 Mikrobiologi og protister 29 ver 07/01/ Absorbsjon, A620nm Tid, minutter

32 Appendiks A 30 APPENDIKS A1: Lysmikroskopet 31 A2: Kvantifisering av mikroorganismer 39 A3: Bruk av tellekammer 42 A4: Vekst av mikroorganismer i satskultur 44 A5: Presentasjon av resultater 46 A6: Steriliseringsmetoder 48 A7: Dyrking av mikroorganismer 49 A8: Medier 53 A9: Cleaning of Microscope Optics (Leica) 55 A10: Bruksanvisning 3M Petrifilm Aerobic Count Plate 57 A11: Bruksanvisning 3M Petrifilm Coliform Count Plate 64

33 Appendiks A 31 Appendiks A1: Lysmikroskopet I optikken kan oppløsning defineres som den minst avstand mellom to punkter hvorved de fremdeles kan skilles fra hverandre. Øyets oppløsningen er bestemt av fysiologien og avstanden mellom de lysfølsome punktene i retina. Et normalt menneske øye kan skille mellom punkter som ligger ca 1 (0.017 ) fra hverandre. I praksis vil dette si at jo nærmere vi er et objekt jo finere detaljer kan vi se og ved en (minste) fokusavstand på 25 cm kan vi skille mellom to punkter som har en avstand på ca 0,07 mm. Hvis de ligger nærmere vil de delvis flyte sammen og vi sier derfor at øyets oppløsningsevne er 0.07 mm. For å observere det som er mindre må vi benytte hjelpemidler som lupe og mikroskop. A1.1: Mikroskopets forstørrelse En linses forstørrelse er gitt med formelen Ligning A1.1 M D f v hvor M er forstørrelse, D v øyets fokusavstand ( = 250 mm) og f linsens brennvidde. I mikroskopet har vi i prinsippet to linser, ett objektiv og ett okular og da blir den totale forstørrelsen: Ligning A1.2 M Mob Mok hvor M ob er objektivets forstørrelse og M ok okularets forstørrelse. Okularenes forstørrelse er nesten alltid 10x (av og til 8x). Objektivene fås med ulik forstørrelse som for eksempel 10x, 40x og 100x. Med de største objektivene på 100x vil mikroskopet ha en forstørrelse på 1000x. A1.2: Mikroskopets oppløsningsevne De fleste lysmikroskoper har en maksimal forstørrelse på 1000x. Grunnen til dette er at fysikken setter begrensing for oppløsningen slik at det ikke er mulig å se finere detaljer ved større forstørrelser. Det som begrenser mikroskopets oppløsningsevne er diffraksjonen (lysspredningen) som oppstår når lysbølgene passerer kanten på et objekt. Den teoretisk grensen for oppløsningen er bestemt av objektivets numeriske apertur (se neste avsnitt). Ligning A1.3 d NA hvor 0.61= en konstant, d = oppløsningsevnen, = lysets bølgelengde og NA = objektivets numeriske apertur.

34 Appendiks A 32 Når det gjelder lysmikroskopets oppløsningen må vi også ta hensyn til at objektet ikke belyses av parallelle lysbølger, men fra alle kanter fra kondensoren. Mikroskopets oppløsning blir bestemt både av objektivets og kondensorens numeriske aperture (disse er omtrent like) og er gitt ved formelen Ligning A1.4 d NAob NAko 2NA Hvis vi tenker oss at vi bruker et godt 100x oljeimmersjonsobjektiv med numerisk apertur på 1.4 og lys med en bølgelengde på 550 nm (= 0.55 m), så vil oppløsningsevnen bli Ligning A m d 0.2 m I et vanlig lysmikroskop er det med andre ord ikke mulig å se finere detaljer enn ca 0.2 m. For at et objekt på 0.2 m skal være synlig (dvs > 0.07 mm) må det forstørres minst 350x. Bruk av hvitt lys med bølgelengde ned til 400 nm, og høy lysintensitet gjør at oppløsningen i praksis er noe bedre enn det teorien her skulle tilsi. Den største forstørrelsen på vanlige lysmikroskoper er følgelig 1000x. Større forstørrelse gir ikke større oppløsning bare dårligere bilde bl.a. fordi belysningen i praksis blir for svak. I elektronmikroskopet benyttes en elektronstråle med mye kortere bølgelengde enn synlig lys. Disse mikroskopene har derfor en mye større oppløsningsevne og kan derfor kan derfor forstørre mer. A1.3: Numerisk apertur Vinkelen (alfa) er halve innfallsvinkelen til lys-kjeglen som kommer fra et punkt i objektet og som kan fanges opp av objektivet (Figur A1.1a). er med andre ord et mål for hvor mye lys som kommer inn i objektivet fra hvert punkt. Figur A1.1a viser at blir større når objektivets frontlinse blir større og når arbeidsavstanden blir mindre. Når vi bruker tørre objektiver (dvs objektiver med luft mellom objektiv og preparat) kan ikke bli større enn 39 fordi vi da får totalrefleksjon av lyset ved glass-luft interfasen. Hvis vi derimot bruker oljeimmersjonsobjektiv og olje med samme brytningsinndeks som glass mellom dekkglass og objektiv så vil lyset gå rett frem gjennom glass-olje interfasen og kan være større. Objektivets numeriske apertur NA er gitt som Ligning A1.6 NA n sin hvor n = brytningsindeksen til det mediet mellom dekkglass og objektiv som har minst brytningsindeks (n =1.0 for luft, n=1.515 for immersjonsolje) og = halve innfallsvinkelen til lyset (se Figur A1.1b). De beste olje immersjons objektivene har