CMV STRATEGIMØTE. Diagnostikk ved cytomegalovirus-infeksjoner 12. november Oppsummering, anbefalinger og forelesningsmanuskripter.

Transkript

1 CMV STRATEGIMØTE Diagnostikk ved cytomegalovirus-infeksjoner 12. november 1998 Oppsummering, anbefalinger og forelesningsmanuskripter Redaktører: Halvor Rollag, Miklos Degré, Tore Jarl Gutteberg, Gunnar Hoddevik. REFERANSEGRUPPE FOR EKSTERN KVALITETSSIKRING I VIROLOGI OG SEROLOGI Statens institutt for folkehelse, 1999 ISBN:

2 INNHOLDSFORTEGNELSE Forord... 2 Deltagerliste... 3 Program... 4 Sammendrag og anbefalinger Innlegg i følge programmet CMV, en oversikt: Epidemiologi Sykdomsmanifestasjoner Patogenese Diagnostikk CMV-diagnostikk: Serologi Påvisning av virus Resistens ved behandling Patologisk/histologisk undersøkelse CMV, klinikk og diagnostikk sett i sammenheng: Intrauterin og perinatal infeksjon Infeksjon hos immunkompetente Infeksjon hos organ- og benmargstransplanterte Infeksjon hos AIDS-pasienter

3 Forord I regi av Referansegruppe for ekstern kvalitetssikring i virologi og serologi ble det holdt strategimøte om CMV på Folkehelsa den 12. november Programmet var satt sammen av en programkomité bestående av: Halvor Rollag (leder), Miklos Degré, Tore Jarl Gutteberg og Gunnar Hoddevik. Programkomiteens medlemmer er også redaktører av rapporten. Rapporten inneholder sammendrag og anbefalinger samt foredragene (manuskriptene) som er gjengitt i sin helhet. Oslo, februar 1999 Halvor Rollag, Miklos Degré, Tore Jarl Gutteberg, Gunnar Hoddevik

4 DELTAGERE Aandahl, Einar, Lillehammer mikrobiologiske lab., Fylkessykehuset, Lillehammer Alexandersen, Erja, Bakteriologisk lab., Aker sykehus, Oslo Berdal, Bjørn Peter, Volvat medisinske senter, Oslo Bjørneklett, Arvid, Medisinsk avdeling A, Rikshospitalet, Oslo Bjøro, Kristian, Medisinsk avdeling A, Rikshospitalet, Oslo Bruu, Anne-Lise, Avdeling for virologi, Statens institutt for folkehelse, Oslo Degré, Miklos, Mikrobiologisk institutt, Rikshospitalet, Oslo Flø, Reinhardt, Medisinsk avdeling, Horten sykehus, Horten Gutteberg, Tore J., Mikrobiologisk avdeling, Regionsykehuset i Tromsø Haukland, Hanne H., Mikrobiologisk avdeling, Regionsykehuset i Tromsø Hjetland, Reidar, Mikrobiologisk avdeling, Sentralsykehuset i Sogn & Fjordane, Førde Holten, Eirik, Mikrobiologisk avdeling, Sentralsykehuset i Akershus, Nordbyhagen Hoddevik, Gunnar M., Avdeling for virologi, Statens institutt for folkehelse, Oslo Holter, Ellen, Mikrobiologisk institutt, Rikshospitalet, Oslo Iveland, Hjørdis, Mikrobiologisk avdeling, Buskerud sentralsykehus, Drammen Jenum, Pål, Avdeling for bakteriologi, Statens institutt for folkehelse, Oslo Kalland, Karl-Henning, Mikrobiologisk avdeling, Haukeland sykehus, Bergen Lindemann, Rolf, Barneavdelingen, Ullevål sykehus,oslo Littauer, Pia, Mikrobiologisk avdeling, Regionsykehuset i Tromsø Mortensen, Lisa, Mikrobiologisk laboratorium, Nordland Sentralsykehus, Bodø Myrmel, Helge, Blodbanken, Haukeland sykehus, Bergen Natås, Olav B., Mikrobiologisk avdeling, Rogaland sentralsykehus, Stavanger Nordbø, Svein Arne, Avdeling for mikrobiologi, Regionsykehuset i Trondheim Noraas, Sølvi, Mikrobiologisk avdeling, Vest-Agder sentralsykehus, Kristiansand Opsjøn, Sissel Linda, Avdeling for mikrobiologi, Regionsykehuset i Trondheim Roald, Borghild, Avdeling for patologi, Ullevål sykehus, Oslo Rollag, Halvor, Mikrobiologisk institutt, Rikshospitalet, Oslo Schøyen, Rolf, Mikrobiologisk laboratorium, Vestfold Sentralsykehus, Tønsberg Skar, Anne Grete, Mikrobiologisk avdeling, Ullevål sykehus, Oslo Størvold, Gunnar, Mikrobiologisk avdeling, Ullevål sykehus, Oslo Tveten, Yngvar, Telelab a/s, Laboratorium for medisinsk mikrobiologi, Gulset, Skien Vik, Inger Sofie Samdal, Mikrobiologisk laboratorium, Fylkessjukehuset, Molde Ørstavik, Ivar, Avdeling for virologi, Statens institutt for folkehelse, Oslo

5 PROGRAM Inger Sofie Samdal Vik, referansegruppens leder, ønsker velkommen Innledning om CMV-diagnostikk. Epidemiologi, sykdomspanorama, Halvor Rollag virusets oppbygning, smittemåter, patogenese inkludert immunrespons. Hvilke aspekter som skal belyses ved dette møtet. DEL I. LABORATORIEDIAGNOSTIKK. Møteleder: Tore Jarl Gutteberg Introduksjon ved møteleder (30 + 5') Serologisk diagnostikk: Anne Lise Bruu IgG, IgM, IgA, aviditetsundersøkelse Kvantitering av spesifikke immunglobuliner Serologiske tester for immunstatus og CMV-sykdom Måling av celleformidlet immunitet (25 + 5') Påvisning av CMV. Miklos Degré Ulike metoder (Dyrkning inklusive shell vial, PCR; kvalitativ og kvantitativ, pp67-rna, RNA-DNA-hybridisering): Fortrinn, ulemper, ressursbruk Valg av prøvemateriale i forhold til klinikk Hvilke prøvematerialer metodene egner seg for Pause (10 + 5') Mulighet for mikrobiologisk terapiovervåkning ved påvisning Gunnar Størvold av resistente CMV-stammer (10 + 5') Hva kan patologisk/histologisk undersøkelse bidra med ved Borghild Roald diagnostikk av CMV-infeksjon: Affeksjon av ulike organer Diagnostiske muligheter og begrensninger (40') Oppsummering og diskusjon om anbefalinger ved møteleder Lunsj i kantina på Folkehelsa DEL II. KLINIKK Møteleder: Miklos Degré (5') Introduksjon ved møteleder (20 + 5') Intrauterin og perinatal CMV-infeksjon Maria Hallerud og Klinikk Rolf Lindemann Hva føler klinikeren er det største diagnostiske behov (20 +5') CMV-infeksjon hos immunkompetente personer Reinhardt Flø Klinikk Hva føler klinikeren er det største diagnostiske behov (25 + 5') CMV-infeksjon hos organ- og benmargstransplanterte pasienter Kristian Bjøro Pause (15 + 5') CMV-infeksjon hos AIDS-pasienter: a) Klinikk b) klinisk betydning av CMV- Arvid Bjørneklett infeksjon c) Hva føler klinikeren er det største diagnostiske behov (40') Oppsummering og diskusjon om anbefalinger ved møteleder

6 SAMMENDRAG OG ANBEFALINGER Cytomegalovirus Rundt år 1900 begynte man å bli klar over at intrauterin fosterdød kunne skyldes en sykdom karakterisert ved store celler (cytomegali) i mange organer. Man trodde først at dette var en protozo-sykdom. Fra 1920 årene ble det hevdet av flere at dette måtte være en virussykdom. Viruset ble isolert på flere laboratorier rundt 1955 og fikk navnet cytomegalovirus (CMV). Det viste seg at viruset tilhørte herpesvirusgruppen, at det gikk inn i en latensfase etter primærinfeksjon og kunne reaktiveres. Ved hjelp av serologiske tester kunne en vise at % av den voksne befolkning var infisert med CMV. CMV kan overføres fra mor til foster og fra mor til barn med morsmelk. Viruset overføres ved direkte og indirekte kontaktsmitte og som inokulasjonssmitte ved blodtransfusjoner og transplantasjoner. Sykdomsmanifestasjonene: Disse bestemmes i stor grad av vertens T-celleimmunitet. Hos ellers friske personer forløper CMV-infeksjonen asymptomatisk, men av og til ses mononukleoselignende sykdomsbilder og hepatitt. Ved redusert T-celleimmunitet kan CMV-infeksjonen ha manifestasjoner fra ulike organer. Vanligst er benmarg- og lever-affeksjon. Hos AIDS-pasienter er CMV-retinitt mest fryktet. Både hos immunkompetente og immunsupprimerte pasienter er sykdomsforløpet mildere ved reaktivering enn ved primærinfeksjoner. Men både primærinfeksjon og reaktivering forløper mer alvorlig hos immunsupprimerte. CMV kan infisere de fleste celletyper, men virusreplikasjon finner sted bare i noen av dem. De viktigste er endotelceller og parenchymceller i ulike organer. Organmanifestasjonene er først og fremst knyttet til en oblitererende vaskulitt som er indusert av CMV-infeksjon av endotelceller. CMV-infeksjonen: Hovedproblemet er å skille mellom en asymptomatisk CMV-infeksjon og en symptomgivende CMV-infeksjon som eventuelt skal behandles. Sannsynligheten for symptomgivende infeksjon øker med virusreplikasjonsraten. Overvåkning av CMVreplikasjonsraten skjer ved kvantitativ måling av CMV (viral load) i blod. Hos personer med høy risiko for utvikling av CMV-sykdom kan økt rate være indikasjon på at en bør starte terapi. Immunhistokjemisk påvisning av CMV i biopsier er den beste måte for påvisning av organmanifestasjoner. Serologiske undersøkelser synes å ha liten verdi utover immunstatusundersøkelse og påvisning av primærinfeksjon. Antivirale midler: Ganiciclovir, cidofovir og foscarnet er effektive hemmere av CMV-replikasjon. Ved langvarig terapi eller profylaktisk bruk vil resistente mutanter bli selektert. Det er relativt liten grad av kryssresistens mellom disse midlene.

7 Laboratoriediagnostikk Påvisning av antistoff: CMV-IgG Brukes for påvisning av gjennomgått primærinfeksjon. Påvisning av CMV-IgG er ensbetydende med at personen har en latent CMV-infeksjon. Metoder som vanligvis brukes er EIA/MEIA. Latexagglutinasjon kan brukes for rask påvisning av CMV-total-antistoff. Sensitiviteten er lavere enn for EIA/MEIA baserte tester. Aviditetstestene vil når de blir kommersielt tilgjengelige, kunne brukes til å skille mellom primærinfeksjon og reaktivering. En stor andel av de antistoffer som dannes ved primærinfeksjon er lavavide. CMV-IgM Brukes for påvisning av aktuell infeksjon, da CMV-IgM kan påvises hos alle med primærinfeksjon og 25-50% av dem med reaktivert infeksjon. CMV-IgM antistoffrespons kan utebli hos barn som er smittet intrauterint. Metoder som vanligvis brukes er EIA/MEIA Spesifisiteten og sensitiviteten av testen varierer fra fabrikant til fabrikant. Det arbeides med å bedre sensitivitet og spesifisitet ved bruk av rekombinant fremstilte CMVantigener, slik som: Major DNA-binding protein (pul57) og fusjonsproteinet CM2 (pul57 og pul44). CMV-IgA CMV-IgA analyse kan brukes for tidlig påvisning av aktuell infeksjon hos immunkompetente (som støtte til CMV-IgM). CMV-IgA aktiviteten er mest uttalt ved primærinfeksjon. Nyfødte har som regel dårlig IgArespons Vanligste metoder er EIA. Ved bruk av rekombinant fremstilte antigener kan sensitivitet og spesifisitet økes. Materiale for antistoffpåvisning: Serum, eventuelt fullblod uten tilsetning. Agenspåvisning: Dyrkning av virus i cellekultur. Biopsi og autopsimateriale må sendes på virustransportmedium. Urin, bronkialskyllevæske og sekreter bør blandes 1:1 med transportmedium. Virus lar seg sjelden påvise i spinalvæske ved dyrkning. Viruset vil replikere i primære fibroblaster (HE-celler) eller i en fibroblastcellelinje som MRC-5. Karakteristisk CPE opptrer etter 1 til 4 uker. Endelig identifikasjon av virus skjer ved immuncytokjemisk eller PCR-metode. Sensitiviteten av virusdyrkningen kan økes ved å bruke rollerkultur. Tiden for påvisning av virus i cellekultur kan reduseres betraktelig ved bruk av den såkalte "shell vial" metode. Prøvematerialet sentrifugeres ned på en fibroblastkultur på en "cover

8 slip". CMV-IE og E antigener kan påvises ved immuncytokjemi etter 1-2 døgn. Egner seg best for påvisning av CMV i urin og bronkialskyllevæske. Denne metoden er supplement til, men ikke en erstatning for vanlig dyrkning. Påvisning av CMV ved immunologiske metoder. CMV-pp65 antigen i granulocytter kan påvises ved immuncytokjemisk metode. Mengden CMV-pp65 positive granulocytter (antall pp65 positive celler pr celler) vil gjenspeile CMV-replikasjonsaktiviteten i endotelcellene. Metoden egner seg best for overvåkning av CMV-replikasjonsaktiviteten hos immunsupprimerte pasienter. Økt CMV-replikasjonsaktivitet er korrelert med sykdomsutvikling. Prøvematerialet: 3 ml EDTA-blod (fiolett kork). Påvisning av CMV-infiserte celler i biopsi og autopsimateriale. Immunhistokjemisk påvisning av CMV i histologisk snitt er uovertruffen metode for påvisning av CMVorganmanifestasjoner. Genteknologiske metoder. Kvalitativ påvisning av CMV- nukleinsyrer Kvalitativ påvisning av CMV ved PCR i ulike prøvematerialer som: plasma, leukocytter, spinalvæske, øye-kammervæsker, urin og biopsier. CMV-pp67 mrna ("late gene") kan påvises i leukocytter ved "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA) teknikk. Prøvematerialet er EDTA-blod. Kvalitativ CMV-PCR er egnet til påvisning av infeksjonsstatus, men lite egnet til å følge sykdomsutvikling. Kvantitativ påvisning av CMV-DNA Kvantitative metoder brukes først og fremst for påvisning av mengde CMV-DNA i leukocytter og plasma. PCR er den mest utbredte metode for kvantitativ påvisning av CMV- DNA i leukocytter, plasma eventuelt urin og spinalvæske. Prøvematerialet er EDTA-blod eller annet prøvemateriale uten tilsetning. Det finnes også en metode for kvantitativ påvisning av CMV-DNA i leukocytter ved DNA-RNA hybridisering. Prøvematerialet er EDTA-blod. De kvantitative metoder for påvisning av CMV samt påvisning av pp67 mrna ved NASBA er spesielt egnet for overvåkning av infeksjon og sykdomsutvikling hos immunsupprimerte pasienter samt respons på antiviral behandling. Resistensovervåkning CMV-infeksjoner kan behandles med nukleosidanalogene ganciclovir, cidofovir og DNApolymerasehemmeren fosfonomaursyre. Mutasjoner i virus fosfotransferasegen UL97 og DNA-polymerasegen UL54 gir resistens mot ganciclovir. Endringer i UL54 genet kan gi kryssresistens mellom ganciclovir og cidofovir. Foscarnet-resistens er assossiert med en mutasjon i UL54 genet som fører til utskiftning av aminosyren alanin med valin i posisjon 809 i den konserverte region III i DNApolymerasegenet.

9 Mistanke om resistensutvikling vil en få ved manglende terapirespons og ved vedvarende høyt nivå av CMV-DNA i plasma eller CMV- pp65 og CMV-RNA i leukocytter. Mutasjoner kan påvises ved sekvensering av gener oppformert ved PCR direkte fra DNA isolert fra prøvematerialet eller ved sekvensering av tilsvarende gener i virus som er dyrket i cellekultur. Resistente CMV-isolater kan også påvises ved dyrkning i cellekultur der mediet er tilsatt ulike konsentrasjoner av aktuelle antivirale midler. Påvisning av CMV-resistens bør sentraliseres til laboratorier som har en betydelig CMVdiagnostikk, som for eksempel Rikshospitalet. Organdiagnostikk Påvisning av CMV ved immunhistokjemi, eventuelt typiske celler i snitt fra biopsi eller autopsimateriale er gullstandard. De fleste lesjoner som er CMV-indusert stammer fra virusinfeksjon av endotel i de små kar. Dette fører til oblitererende vaskulitt med nekrose av omliggende vev som følge. Påvisning av CMV i biopsier eller autopsimateriale ved dyrkning eller nukleinsyreamplifikasjon er indikativt på organmanifestasjon, men beheftet med en del usikkerhetsmomenter. Biopsien kan inneholde latent CMV eller CMV som replikerer i epitelceller og som derfor har liten betydning for utvikling av kliniske organmanifestasjoner.

10 Skjematisk oversikt over CMV-diagnostikk Påvisning/ Metoder CMV smitte og infeksjon hos mor og barn IgG +++. Diagnostikk /Utredning IgM +/- Kan være av verdi. Sensitivitet er usikker Dyrkning Nuleinsyrepåvisning +++ I urin fra barn de første 14 dager +++ I urin fra barn de første 14 dager CMV-infeksjon hos immunkompetente personer. +++ Diagnostikk/ Utredning +++ Ja, men kan være uspesifikk +/- I urin, muligens av noe verdi +/- I blod og i urin kan noen ganger være avklarende HIV/AIDS +++ For å bekrefte gjennomgått infeksjon +/- +/- +/- +/- +++ Kvantitativ metode Måling av virusmengde eller aktivitet Transplanterte, andre med nedsatt T-celleimmunitet. +++ For å bekrefte gjennomgått infeksjon +++ Kvantitativ metode Måling av virusmengde eller aktivitet CMV-pp65 i granulocytter Resistens Histologisk diagnostikk Kvantitativ metode Måling av virusmengde eller aktivitet Når antivirale midler ikke virker Ved organmanifestasjoner +++ Kvantitativ metode Måling av virusmengde eller aktivitet +++ Når antivirale midler ikke virker +++ Ved organmanifestasjoner +++ anbefales +/- usikker verdi på grunn av metode eller biologiske begrensninger - bør ikke utføres alle laboratorier bør utføre dette regner med at de fleste laboratorier vil utføre dette oppgave for referanse-/regions-laboratorium nasjonal oppgave (Rikshospitalet)

11 Anbefalinger for undersøkelser ved ulike kliniske situasjoner Immunkompetente pasienter: Smitte under svangerskap: Mistanke om smitte av mor i svangerskapet: Sjelden aktuelt å foreta undersøkelser da infeksjonen gir lite karakteristiske symptomer. Påvisning av CMV i urin ved dyrkning eller PCR kan forsøkes ved spesifikk mistanke. Materiale: Dyrkning: Urin med tilsetning av transportmedium (50:50) hvis transporttiden overskrider noen få timer. PCR: Urin uten tilsetning. Serologi gir lite, med mulig unntak av serokonversjon hos tidligere CMV-IgG negative. CMV- IgG aviditetstest kan overveies (primærinfeksjon ledsages gjerne av lav-avide antistoffer). Metoden trenger imidlertid videre utredning. CMV-IgM hos barnet kan brukes som en supplerende test til urindyrkning. Materiale: Serum eller fullblod uten tilsetning. Påvisning av viruri hos det nyfødte barnet ved virusisolasjon, eller DNA amplifikasjon. Prøven må være tatt innen to uker etter fødsel for å utelukke smitte etter fødsel. Materiale: Urin uten tilsetning for PCR, og med transportmedium for virusdyrkning. Smitte etter fødsel Hos immunkompetente personer ser en symptomgivende CMV-infeksjon nesten utelukkende ved primærinfeksjon. Ved noen infeksjonssykdommer, autoimmunsykdommer og andre tilstander der den celleformidlede immunitet er forbigående eller langvarig nedsatt vil CMV kunne reaktiveres og bli utskilt i urin, spytt og andre sekreter. Ofte vil pasientene også danne CMV-IgM antistoffer ved reaktivert CMV-infeksjon. Hvis det ikke kan påvises en serokonversjon, vil diagnosen CMV-sykdom bli en eksklusjonsdiagnose. Når CMV-IgG aviditetstester og CMV- IgM tester der en påviser antistoff mot spesielle antigener blir tilgjengelige, vil en lettere kunne skille mellom CMV-primærinfeksjon og reaktivering Med de tester som i dag er tilgjengelige, vil et høyt CMV-IgM titer og et lavt CMV-IgG titer indikere en primær CMVinfeksjon hvis prøven tas tidlig sykdomsforløpet. Analyse av en ny serumprøve tatt noen uker senere vil kunne gi ytterligere informasjon. CMV er årsak til ca 5% av mononukleosetilfellene og ses bare i forbindelse med primærinfeksjon. I tillegg til påvisning av CMV-IgM, eventuelt påvisning av CMV i urin eller spytt, må en ekskludere EBV som årsak til mononukleosen. CMV kan også forårsake akutt hepatitt. For å stille denne diagnosen må en utelukke infeksjon med andre virus som kan gi hepatitt. Immunkompromitterte pasienter: Dette omhandler pasienter med langvarig og betydelig nedsatt celleformidlet immunitet.

12 Diagnostikken vil variere noe med hvilke organer eller organsystemer som er angrepet og med grunnsykdommen. AIDS pasienter: Serologiske undersøkelser er av liten verdi. Chorioretinitter: Dette er den hyppigste komplikasjon forårsaket av CMV. Diagnosen stilles i hovedsak på grunnlag av oftalmologiske funn. Aspirasjon av kammervæske fra øye er lite aktuelt. Hvis det foretas, kan CMV påvises ved PCR. Påvisning av antigenemi (CMV-pp65-antigen i granulocytter) kan forsøkes, men korrelasjonen er usikker. Gastrointestinale infeksjoner: Viktigst er histologisk og immunhistokjemisk undersøkelse av biopsier. Påvisning av CMV ved virusdyrking eller PCR av tarmbiopsier vil kunne understøtte diagnosen. Antigenemi støtter også diagnosen, men kan ikke tillegges avgjørende betydning. Nervesystem-infeksjoner: Disse diagnostiseres i hovedsak klinisk og ved hjelp av MRI. Påvisning av PCR i spinalvæsken støtter diagnosen men den bør være kvantitativ fordi lave titre kan forekomme uten klinisk signifikans. Antigenemi har ingen avgjørende diagnostisk verdi. Pneumoni: Diagnostiseres helst ved hjelp av histologisk og immunohistokjemisk undersøkelse av biopsi. Påvisning av CMV ved dyrkning eller PCR i bronkialskyllevæske har ingen sikker diagnostisk verdi da disse pasientene skiller ut CMV i luftveissekret uten at det gir opphav til sykdom. CMV-antigenemi viser heller ikke noen god korrelasjon med utvikling av pneumoni. Organ- og benmargstransplanterte pasienter: Serologisk screening av donor og resipient skal foretas før transplantasjon for å klarlegge eventuell CMV-latenstilstand og infeksjonsfare fra donor. Pasienter som har fått et allotransplantat bør overvåkes ukentlig for CMV-infeksjon og sykdom de første 3 måneder etter transplantasjonen. Påvisning av CMV i blod med metoder som tillater kvantitering av virus er mest egnet. Blodårenes endotelceller vil være hovedstedet for virusreplikasjon hos denne pasientguppen. Virus utskilles i blodbanen og vil også bli "plukket opp" direkte fra endotelcellene av granulocytter, muligens monocytter. Mengde CMV i blod er derfor et mål på størrelsen av virusreplikasjon i endotelcellene. Stor mengde eller jevnt stigende mengde CMV i blod korrelerer godt med utvikling av klinisk sykdom med organmanifestasjoner. Et fall i mengde CMV i blod vil være en god indikator på effekt av antiviral behandling. Metoder for kvantitativ CMV påvisning i blod er CMV-pp65 antigen i leukocytter, PCR for påvisning av CMV-DNA i leukocytter og plasma, RNA-DNA hybridisering for påvisning av CMV leukocytter og påvisning av CMV-late-RNA ved NASBA. Et glass med 3 ml EDTAblod kan brukes for påvisning av CMV med alle disse undersøkelsene. Transporttiden må ikke overskride ett døgn. Det er ikke nødvendig med nedkjøling av prøven.

13 Dyrkning av CMV fra blod er en lite egnet undersøkelse hos denne pasientgruppen da metoden ikke er kvantitativ og resultatet først foreligger etter flere uker. Serologisk oppfølging av seropositive resipienter er av liten verdi, fordi den gir liten hjelp til påvisning av reaktivering eller reinfeksjon. Serologisk oppfølgning av seronegative resipienter gir god støtte, men serokonversjon og IgM kommer relativt sent i relasjon til klinisk utvikling. Materiale: Serum, alternativt fullblod uten tilsetning. Biopsi tatt ved spesifikke organrelaterte symptomer (gastro-intestinale sår, hepatitt, pneumoni) bør undersøkes histologisk og immunhistokjemisk. Påvisning av CMV i biopsier ved dyrkning eller DNA-amplifikasjonsteknikk vil kunne understøtte diagnosen. Biopsi til histologisk undersøkelse sendes på formalin, mens biopsier til virusdyrkning eller DNA-amplifikasjon sendes på virus-transportmedium.

14 CMV-INFEKSJONER: EPIDEMIOLOGI, SYKDOMSMANIFESTASJONER, PATOGENESE OG DIAGNOSTIKK Halvor Rollag, Mikrobiologisk institutt, Rikshospitalet, I etterhånd kan en si at forstillingen om en egen infeksjonssykdomstype karakterisert ved store celler, µm dukket opp like før århundreskiftet. Disse store celler som ble funnet i ulike organer til noen dødfødte barn, trodde man var protozoer (amøber) Utover i årene dukket virusteorien opp. Man kunne se tilsvarende celler i herpes og vannkoppevirus infisert vev. Infeksjonens egentlige virusperiode opprant ikke før på midten av 50 tallet da det lyktes å isolere CMV i cellekultur. Etter å ha fått mulighet til virusdyrkning og senere antistoffpåvisning, gikk det opp for den medisinske allmennhet at CMV-infeksjoner var vidt utbredt i befolkningen. Eksplosjonen i kunnskap om immunsviktsykdommer som følge av transplantasjonsvirksomhet og HIV-infeksjoner, viste at CMV er en ekstrem opportunist. Som sådan får dette viruset skylden for så mangt. I den kliniske hverdag reises derfor ofte spørsmålet om en tilstand er forårsaket av CMV eller ikke. Et av siktemålene ved dette seminaret er nettopp at vi diskutere oss frem til hvordan vi ved valg av tidspunkt for prøvetaking, prøvemateriale og undersøkelsesmetoder kan sannsynliggjøre at CMV er årsak til en aktuell sykdomstilstand. Som basis for en slik diskusjon må vi vite litt mer om epidemiologi, sykdomsbilder og virusets samspill med verten. Smittemåter CMVs smitteveier er mange og nærmest uransakelige. Smitte fra mor til foster fører til at 0,5%-1% av alle nyfødte skiller ut CMV i urin. Perinatal smitte kan stamme fra mor eller personale. De fleste av oss ble smittet i barneårene ved at virusinfisert spytt går fra munn til munn. Små barn som infiseres med CMV kan skille ut virus i månedsvis. Ved seksuelt overført smitte kan viruset tydeligvis overføres i alle kanaler. Infiserte personer kan skille ut viruset i spytt, sæd og cervicalsekret over lengre tid. Smitte via blod og transplanterte organer er en av vår tids velsignelser. I sum fører dette til at 60-80% av norske blodgivere, 75% av pasienter som skal nyretransplanteres, 70% av bløderne, og bortimot 100% i noen selekterte grupper av menn som har sex med menn har antistoffer mot CMV Sykdomsbilder Sykdomsbildene er til en stor grad avhengig av vertens immunstatus Ved intrauterin smitte varierer sykdomspanoramet fra dødfødsel via ikterus, hepatosplenomegali, petechier til ingen påfallende symptomer i det hele tatt. Allikevel kan barnet ha skader på sentralnervesystemet. Flere undersøkelser har vist at ca 15%av disse asymptomatisk infiserte barna har hørselsskader. Ved perinatal smitte forløper de fleste CMV-infeksjoner asymptomatisk. Ved lav fødselsvekt (<1500g) vil en se symptomatiske infeksjoner, oftest i form av pneumoni. Senere i livet vil immunstatus være viktigste bestemmende faktor for sykdomsbildet. Hos immunkompetente personer vil CMV-infeksjoner som regel forløpe asymptomatisk. Men ca 5% av tilfellene av mononukleosesyndromet vil være forårsaket av CMV. Dette sykdomsbildet kan være ledsaget av organmanifestasjoner hvorav hepatitt er det vanligste. Men andre organmanifestasjoner slik en kjenner dem fra immunsupprimerte pasienter er også beskrevet ved CMV-infeksjoner med og uten mononukleosesyndrom. En vet at CMV reaktiveres fra tid til annen også hos immunkompetente personer. Om slik reaktivert CMVinfeksjon kan gi sykdomsmanifestasjoner er lite kartlagt.

15 Hos immunsupprimerte pasienter der T-celle-tilknyttet immunitet er redusert, vil CMV kunne forårsake symptomgivende infeksjon både ved primærinfeksjon og ved reaktivering. Hos våre nyre-tx pasienter vil ca 75% av dem med primærinfeksjon og 25% av dem med reaktivert CMV-infeksjon få klinisk sykdom. Vanligste organmanifestasjoner er affeksjon av benmarg, lever og GI-traktus. Etter benmargtransplantasjon vil CMV-pneumoni ofte ha dødelig utgang. Hos AIDS-pasienter har CMV-retinitt vært en fryktet sekundærinfeksjon. Siden CMV hyppig reaktiveres ved immunsuppresjon, er det en stor utfordring å klarlegge om CMV er årsak til sykdom eller bare en harmløs medpassasjer. F.eks. selvom CMV kan påvises i bronkialskyllevæske fra svært mange AIDS- og andre immunsupprimerte pasienter, er den sjelden årsak til pneumoni. Cytomegalovirus Som vi alle er kjent med, er det til nå identifisert 8 ulike humane herpesvirus. CMV har fått nummer 4. Ulike dyrearter har sine herpesvirus. De fleste herpesvirus, CMV inkludert, krysser ikke speciesgrensene. Rotte, mus, ape har sine egne CMV-varianter, men ulikheter i biologi mellom non-human CMV og deres verter er såpass stor at det er vanskelig å trekke slutninger om humant CMVs patogenese på basis av dyreforsøk. CMV, er som nevnt, et ekte herpesvirus. Genomet er derfor et dobbelttrådet DNA som videre er omsluttet av et kapsid. Ytterst har viruset en lipidmembran. Mellom membran og kapsid finnes en amorf masse som kalles tegument eller matriks og som består av minst 8 virusproteiner. Det mest omtalte er fosfoprotein 65 - pp65. Når CMV infiserer en celle, bindes viruset først uspesifikt til heparansulfat på cellens overflate og deretter skjer binding til den spesifikke reseptor. Etter sammensmelting av virus og cellemembran tømmes tegumentproteiner og kapsid i cellens cytoplasma. Noen av tegument proteinene har en signalsekvens som gjør at de blir transportert til cellekjernen. Der virker matriksproteinene som regulatoriske proteiner. Etter at virus DNA er frigjort fra sitt kapsid blir også det fraktet til kjernen der virusreplikasjonen foregår. Ved CMV-infeksjon av en celle kan utfallet bli ett av tre. 1. Non-permissiv. Virus blir tatt opp i cellen og matrix-proteinene vandrer til kjernen. Ingen virusgener blir transkribert. De fleste av kroppens celler er non-permissive for CMV. 2. Semipermissiv. Som non-permissiv infeksjon, men de tidlige regulatoriske proteiner (CMV-IE proteiner) blir dannet. Disse IE-proteinene virker først og fremst som genregulatoriske proteiner. Monocytter, lymfocytter, en del epitelceller er semipermissiv for CMV. 3. Permissive. Det skjer en full virusreplikasjon, Der alle faser, IE, E og L gjennomgås. Endotelceller, differensierte makrofager, epitel i ulike organer (Nyre, lever, spyttkjertel, tarm, bronkial, etc) og fibroblaster. 4. Latent infeksjon: Først og fremst benmarg stamceller og endotelceller. Når et organ blir infisert med CMV, en se at selvom et en celletype i prinsippet er permissiv for CMV vil en i praksis se non-semi og permissive celler ved siden av hverandre. CMV viser også store stamme til stammevariasjoner med hensyn til permissivitet i en bestemt celletype.

16 Konsekvenser av CMV-infeksjon av en celle. En celle som blir infisert med CMV vil få endret sin funksjon enten infeksjonen er non- semieller permissiv. En svært viktig respons er at alle celler som blir infisert vil endre sin produksjon og utskillelse av cytokiner. I mange sammenhenger vil det at en celle radikalt legger om sin cytokinutskillelse være vel så viktig som at den produserer infeksiøst virus. Hvilke cytokiner det dreier seg om vil avhenge av hvilke celler som er infisert og cellens permissivitet for CMV. I mus er det vist at det vesentlige av levercellepatologien ved MCMV-infeksjon kan tilbakeføres til MCMV-indusert produksjon av TNF-α Opptak av CMV i en celle kan endre cellens cellesyklus og eventuelt lede til cellens død ved apoptose uten at et eneste virusprotein er produsert. CMV-infeksjon av hematopoietiske stamceller er eksempler på det. Nedregulering av produksjon av von Willebrand-faktor i CMV-infiserte endotelceller skyldes CMV-IE-proteiner. Reaktivering Detaljene omkring reaktivering av latent CMV er ikke fullstendig kartlagt. Det er kanskje flere veier som fører frem. Redusert aktivitet av cytotoksiske T-celler er i seg selv ikke nok. Men mer eller mindre bortfall av cytotoksisk T-celleaktivitet vil føre til at reaktivert virus uforstyrret kan replikere og pumpes ut av cellene i store mengder. Selve reaktivering kan skyldes cytokinpåvirkning av cellen. En rekke av de proinflammatoriske cytokiner som IL-1 og IL-6 er kandidater. I en nylig publisert studie av reaktivert CMV-infeksjon i kjølvannet av sepsis ble reaktiveringen forutgått av økende IL-1 og IL-6 nivåer i blod, mens TNF-α kom etter reaktiveringen. Spredning av virus Produksjonhastighet av virus og spredningshastighet av virus er sentrale faktorer i patogenesen. Både ved primærinfeksjon og ved reaktivering vil blodårenes endotelceller være sted stor virus multiplikasjon. Infeksjon av andre endotelceller kan skje ved frigjøring av virus til blod eller hjelp av granulocytter og monocytter/makrofager. Monocytter og granulocytter utveksler CMV med endotelceller på en veldig spesiell måte. Endotelceller infisert med CMV har økt ekspresjon av integriner på sin overflate. Dette letter bindingen av monocytter og makrofager Etter binding kan virus vandre transmembrant fra endotel til fagocytt. I granulocytter vil det ikke skje noen transkripsjon av virale gener. Oftest vil CMV forbli intakt i granulocyttens cytoplasma og granulocytten kan på samme vis overføre dette virus til en annen endotelcelle eller til celler ute i vevet hvis granulocytten vandrer dit. På samme måte kan monocytter plukke opp av avgi virus. Hvis en monocytt vandrer ut i vev og utvikler seg til makrofag vil den kunne bli permissive for CMV. En alternativ vei for spredning av CMV går fra CMV-infiserte benmarg stamceller. I stamcellene vil CMV-DNA bli liggende i kjernen som et plasmid. Ved celledeling og differensiering replikerer også CMV-DNA. CMV-DNA følger først og fremst monocyttcellerekken. Når monocytter kommer ut i perifert vev og modner til makrofager vil CMV aktiveres og infeksiøst virus produseres. Hva er mekanismen for de ulike organmanifestasjoner? Det vil variere fra organ til organ.

17 Som nevnt vil endotelceller, fibroblaster, parenchymceller være blant de viktigste celler CMV kan angripe. Ved CMV-replikasjon i de små blodårers endotel kan det induseres en oblitererende vaskulitt. Den følgende nekrose kan være årsak til organmanifestasjoner som CMV-induserte gastrointestinale ulcera og skader i CNS. Betydningen av infeksjon av parenchymceller varierer fra organ til organ. F.eks. kan CMV replikere i nyrenes tubulusceller og bli skilt ut årevis uten at nyrefunksjon reduseres. I benmarg vil infeksjon av de hematopoietiske stamceller hemme deres evne til celledeling og differensiering. Samtidig vil infeksjon av benmargens stromaceller og endotelceller nedsette deres evne til produksjon av hematopoietiske vekstfaktorer. Summen blir som vi vet en betydelig leukopeni. I lever: Starter infeksjonen blodårenes endotel, men også leverparenchymceller infiseres. I retina er muligens endotelcelleinfeksjonen av mindre betydning, mens CMV kan replikere i celler i alle retinas lag og ødelegge disse cellene I lunger sees CMV-infiserte epitelceller i bronkier og alveoler. I tillegg vil en kunne finne betydelige mengder virus i interalveolære celler. Det har vært postulert at immunpatogenesen er av betydning ved interstitiell CMV-pneumoni, spesielt hos benmargtransplanterte pasienter. I de ulike organ vil infeksjon av endotelceller og parenchymceller eventuelt andre celler ha ulik betydning for organmanifestasjonene. Det vil selvsagt også ha betydning om den infiserte celle er non, semi eller fult permissiv for CMV. Vi vet for eksempel at endotelcelceller i ulike organer, til og med innen samme organ er ulikt mottakelige for en CMV-infeksjon. Endotelceller av ulik lokalisasjon varierer også med hensyn til CMV-induserte cellefunksjendringer. Immunpatogenese Immunpatogenesen ved CMV-infeksjoner er på langt nær klarlagt. CMV er et virus med betydelig potensiale for å unnvike immunsystemet. Det er lite som tyder på at spesifikk T- cellecytotoksistet er årsak til utbredt organskade. Feber og sykdomsfølelse skyldes her som ved andre infeksjonssykdommer indusert produksjon av ulike cytokiner. Som tidligere nevnt viser museforsøk av levercelleskade kan skyldes økt produksjon av TNF-α Konsekvenser for diagnostikk Påvisning av CMV i urin, i spytt i bronkialsekret er tegn på infeksjon av organspesifikke celler. Dette kan foregå uten tegn på organskade eller sykdom. Ved påvisning av CMV i blod enten som fritt CMV i serum/plasma eller som CMV tatt opp i granulocytter og makrofager vil vi kunne få et speilbilde av virusreplikasjon i endotelceller. Som så mange ganger ellers er det patologene som kan gi oss fasitsvaret ved deres immunhistokjemiske undersøkelse av biopsier.

18 SEROLOGISK DIAGNOSTIKK VED CMV-INFEKSJONER Anne-Lise Bruu, Avdeling for virologi, Folkehelsa Indikasjon for CMV-antistoffundersøkelser er: - Mistanke om aktuell primærinfeksjon, spesielt hos gravide. - Påvisning av gjennomgått infeksjon/bærertilstand (gjelder særlig donores og recipienter). - Som ledd i overvåkingen av transplantasjonspasienter. Fordeler med CMV-serologi: Rimelig, rask og sikker å utføre, muligheter for automatisering. Ulemper: Gir bare indirekte informasjon om tilstedeværelsen av virus, kan være vanskelig å vurdere på grunn av varierende sensitivitet og spesifisitet for de fleste kommersielle tester, samt kryssreaksjoner med andre herpesvirus. Dette kan føre til både falsk negative og falsk positive resultater, spesielt for CMV-IgM. Påvisning av IgM-antistoffer utføres ved mistanke om CMV-primærinfeksjon (CMVmononukleose), når påvisning av virus/virusantigen/virusnukleinsyre ikke er aktuelt, dvs. hos immunkompetente personer. IgM-analyse utføres også som støtte til andre analyser ved overvåking av transplanterte, samt ofte ved mistanke om kongenital CMV-infeksjon, selv om bare 33-60% av de nyfødte med slik infeksjon har IgM-antistoffer ved fødselen. Hos immunkompetente kan CMV-IgM påvises i 2-3 måneder etter aktuell infeksjon, hos enkelte noe lenger, men IgM forsvinner som regel innen 12 måneder. Hos immunsupprimerte kan IgM-antistoffene persistere i over et år. Ved CMV-reaktivering er det ikke alltid IgMrespons. Analyse med henlikk på IgG-antistoffer utføres for å påvise gjennomgått infeksjon/bærertilstand i visse populasjoner: Kvinner i fertil alder som kan være smitteutsatt, donores (inkludert blodgivere), screening av pasienter som skal gjennomgå transplantasjon, samt i forbindelse med epidemiologiske studier. Analysen brukes også for å påvise ev. serokonversjon ved primærinfeksjon. IgG aviditetsundersøkelse brukes til å skille mellom primærinfeksjon og reaktivering. IgA-analyse kan brukes for tidlig påvisning av aktuell infeksjon hos immunkompetente (som støtte til IgM), men det foreligger ingen pålitelige data angående evaluering av kommersielle tester. IgA-aktiviteten er mest uttalt ved primærinfeksjon. Nyfødte har som regel dårlig IgArespons. ELISA-tester med rekombinant antigen bør benyttes. Kommersielle tester testprinsipp. Det finnes en rekke tester for påvisning av CMV-antistoffer, basert på følgende prinsipper: - Komplementbindingsreaksjonen (KBR) - Passiv hemagglutinasjon - Latexagglutinasjon - Nøytralisasjon - (Radio)immunprecipitasjon - RIA - Counterimmunelektroforese - EIA/MEIA

19 - Immunfluorescens (IF) - (Dot)immunblotting Testene har forskjellig grad av sensitivitet. Den er høyest for RIA-baserte tester, varierende for IgM-ELISA og lav for KBR. Da signifikant stigning av antistofftiter og såkalt høyt titer i KBR kan forekomme både ved primærinfeksjon og reaktivering, brukes denne metoden i dag fortrinnsvis til å bekrefte serokonversjon. Latexagglutinasjon påviser totalantistoffer og brukes mest ved screening av blodgivere. Ulempen ved IF-tester er den subjektive avlesningen. ELISA/MEIA-tester brukes derfor mest for antistoffpåvisning, men det er en stor ulempe at antigener som benyttes i kommersielle tester ikke er standardisert. Dette fører til varierende overensstemmelse, spesielt for IgM-tester. Som regel brukes cellekulturdyrket antigen som er dårlig renset eller ikke renset i det hele tatt, og svært ofte finnes ingen opplysninger om antigenet i produsentens veiledning. Man må også være klar over at CMVantistoffer har høy kryssreaktivitet med andre herpesvirusantigener. Men serologisk respons mot andre herpesvirus kan også skyldes generell B-cellestimulering eller reaktivering av det heterologe virus. Man savner også skikkelige standard-referansesera både for CMV-IgM og CMV-IgG. Bare noen få CMV-antigener som finnes i cellekultur er essensielle for serodiagnose av CMV-infeksjon. Rekombinant framstilte antigener er nå tilgjengelige, og tester med slike antigener har høyere sensitivitet og spesifisitet enn de vanlige ELISA-testene. Hittil er DNAfragmenter fra 8 forskjellige leserammer av CMV amplifisert med PCR og klonet i E. coli: - ppul32 - ppul44 - p52 - pul57 - pp150, 150/1 og 150/7 - gpul55 - ppul83 (pp65) - ppul80a (pp38) ppul32 er meget immunogent og kan påvises hos 100% av alle CMV-bærere og i 80% av alle CMV-IgM positive sera. pul57 er hoved-dna-bindende protein og meget viktig for IgM-responsen. gpul55 (= glykoprotein B) er viktigste glykoprotein. Undersøkelser har vist at bare antistoffer mot glykoproteinene (og spesielt mot glykoprotein B) er i stand til å nøytralisere virus. Disse antistoffene spiller derfor en viktig rolle ved vertens forsvar mot invasjon av virus, og kan mildne forløpet ved kongenital infeksjon. gpul55-responsen kommer først etter dager ved primærinfeksjon, men straks ved reaktivering, og kan derfor brukes til å skille mellom disse to typene av aktuell infeksjon. IgM-antistoffer mot p52 kan påvises meget tidlig, og gir høyere titer ved symptomatisk primærinfeksjon enn ved reaktivering. IgM-ELISA med rekombinant antigen ga bedre resultater hos nyfødte enn de vanlige ELISA-testene og var positiv hos 83% av transplantasjonspasientene som var antigenemi-positive.

20 Som regel kombineres to eller flere rekombinante antigener i ELISA-testene. Kombinasjon av ppul 32 og ppul44, ppul44 og pul57, pp65 (ppul83) og pp38 (ppul80a), samt ppul32, ppul44 og pul57 er godt egnet som antigen i IgM-tester. For kvantitering av antistoffer anbefales nøytralisasjonstesten. KBR og latexagglutinasjon (semikvantitativ analyse) kan også brukes, mens ELISA er dårlig egnet. IgG-antistoffene som dannes i rekonvalesensfasen av en CMV-primærinfeksjon er av en noe annen beskaffenhet enn de som dannes senere og har lav aviditet. Bindingen til antigenet spaltes lett ved behandling med urea, og IgG-aviditetsundersøkelse av enkeltserum tatt inntil 4 måneder etter debut av CMV-primærinfeksjon kan derfor brukes til å skille mellom primærinfeksjon og reaktivering. Det er for øvrig ofte svært vanskelig å skille mellom en primærinfeksjon og reaktivering, da spesifikt IgM og stigning av IgG/høyt antistofftiter i KBR kan forekomme ved begge tilstander. Følgende diagnostiske kriterier kan brukes: - Serokonversjon - IgG-aviditet - Antistoffer mot gpul55. Cellulær og humoral respons ved CMV-infeksjoner, samt antistoffer i slimhinner og sekreter er viktige faktorer for immunitet. Cellemediært immunrespons er bare dokumentert overfor matrixproteinet ppul83 (pp65), som er et av de mest immunogene ved CMV-infeksjon. Nedsatt respons mot dette antigenet kan være årsak til kraftig primærinfeksjon eller reinfeksjon. I tillegg har cellulære effektorfunksjoner, inklusive antistoffavhengig cytotoksisitet og uspesifikk mordercelleaktivitet blitt demonstrert hos pasienter med CMVinfeksjon. Nyfødte med kongenital infeksjon viser nedsatt proliferativ respons av T- lymfocytter de første leveårene, forenlig med kronisk virusutskillelse. Når virusutskillelsen opphører, normaliseres også T-celleresponsen. REFERANSER 1. Linde A, Fridell E, Dahl H, Anderson J, Biberfeld P, Wahren B. Effect of Primary Epstein-Barr Virus Infection on Human Herpesvirus 6, Cytomegalovirus, and Measles Virus Immunoglobulin G Titers. J Clin Microbiol 1990; 28: Britt WJ, Alford CA. I: Fields B. Virology (Volume II), Lippincott-Raven, Philadelphia 1995, s Landini MP, Mach M. Searching for Antibodies for Human Cytomegalovirus: Is It Diagnostically Useful? When and How? (Review Article). Scand J Infect Dis Suppl 1995; 99: Rothe M et al. Development of a gb-specific ELISA to differentiate primary and secondary HCMV infections. Progress in Clinical Virology IV. Abstract ved møtet i Hamburg Vornhagen et al. Early Serodiagnosis of Acute Human Cytomegalovirus Infection by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Recombinant Antigens. J Clin Microbiol 1994; 32:

21 6. Vornhagen R et al. The DNA-Binding Protein pul57 of Human Cytomegalovirus Is a Major Target Antigen for the Immunoglobulin M Antibody Response during Acute Infection. J Clin Microbiol 1995; 33: Vornhagen R et al. Immunoglobulin A-Specific serodiagnosis of Acute Human Cytomegalovirus Infection by Using Recombinant Viral Antigens. J Clin Microbiol 1996; 34:

22 PÅVISNING AV CMV Miklos Degré, Mikrobiologisk institutt, Rikshospitalet Påvisning av cytomegalovirus (CMV) bør regnes som hjørnesteinen i diagnostikk av CMV infeksjoner. Det er en rivende utvikling innen dette felt, og nye metoder og nye modifikasjoner blir introdusert med jevne mellomrom, både fra diagnostiske laboratorier og fra kommersielle produsenter. Bakgrunnen for disse undersøkelser er den erkjennelse at kliniske symptomer i stor grad ledsages, eller i stor grad forutgås, av viral replikasjon. Resultatet er påvisbart virus, enten lokalt eller i blodsirkulasjonen som utrykk for generell spredning, eventuelt i urinen, eller både lokalt og generalisert. Det er et problem, at CMVgenom er tilstede i organismen etter gjennomgått primærinfeksjon, mens virus ligger latent og vi må kunne differensiere mellom latent CMV-genom og genom som repliserer. Påvisning av CMV er basert på tre alternative prinsipper: 1. Påvisning av levende virus ved dyrkning 2. Påvisning av relevant virus antigen 3. Påvisning av viral nukleinsyre. DYRKNING Dyrkning i cellekultur betraktes av mange tradisjonelt som gullstandard for påvisning av CMV. Metoden har vært i bruk i flere årtier. Påvisning av virus i blod har relativt høy prediksjonsverdi for klinisk sykdom. Derimot påvisning i lokale sekreter, som nasofaryngeal sekret, bronkial skyllevæske, urin har mindre god korrelasjon med klinisk sykdom. Mengde virus, virus load er nyttig, men det er omstendelig og lite praktisk som rutineundersøkelse. Det er imidlertid flere argumenter som svekker dyrkningens plass i rutinediagnostikken. For det første er den svært tidkrevende. Resultatene foreligger ikke før tidligst dager etter utsæd, og ofte enda senere. En negativ dyrkning kan ikke besvares før tre uker etter utsæd. Dyrkningens effektivitet er avhengig av gode cellekulturer, og det er ikke alltid helt uten problemer at slike kulturer har en jevn og høy kvalitet. Moderne nukleinsyre - amplifikasjonsmetoder har i flere undersøkelser vist seg å være mere sensitive enn dyrkning. Det er imidlertid fortsatt en viktig undersøkelse, og uten tvil hører hjemme i CMV diagnostikkens armamentarium. Følgende materialer bør vurderes som egnet til dyrkning i cellekultur: halssekret og urin fra nyfødte barn ved mistanke på medfødt CMV infeksjon, fra voksne bronkialskyllevæske, halssekret, autopsi og biopsimateriale og eventuelt blod. Det er også beskrevet at CMV kan dyrkes fra cervix sekret, brystmelk og semen. Prøvene bør sendes i transportmedium, med unntak av urin som sendes uten tilsetning. Blodprøven tas med citrat- eller heparintilsetning. CMV er et relativt labilt virus, derfor bør transporttiden være kort og prøven bør ikke utsettes for temperatursvingninger. For å eliminere eventuell bakteriell forurensning behandles prøvene med transportmedium før utsæd i cellekultur. Dyrkningen foregår i diploide fibroblastceller, som regel embryonale lunge-fibroblaster. Det finnes kommersielt tilgjengelige fibroblast stammer f. eks. MRC-5. Fibroblastene må brukes før de blir for gamle og mister sensitiviteten, helst under 20 passasjer. Kulturene inokuleres med klinisk materiale, som adsorberes til cellene i minst en time før vedlikeholdsmediet tilsettes.

23 De inokulerte kulturene inkuberes i 3 uker, med regelmessig skift av mediet. Mikroskopisk undersøkelse på cytopatogen effekt (CPE) uføres minst 2 ganger i uken. Typisk CPE kan ses som grupper av store, runde celler, som utvikler seg langsomt etter dagers inkubering, men av og til kan denne utviklingen ta lenger tid. Diagnosen kan bekreftes ved spesifikke antistoffer, enten som immunofluorscens eller som ELISA. Tidlig påvisning av CMV- early antigen (EA) kan utføres etter en eller to dagers inkubering av inokulerte fibroblastkulturer. For slike undersøkelser, som regel kalt shell vial undersøkelser, inokuleres fibroblaskulturer på dekkglass ved at materialet deponeres på cellene ved lav hastighets sentrifugering. Etter to dagers inkubering farges kulturene ved merkede antistoffer (enzym eller fluorescens) mot EA. Sensitiviteten for denne metoden er litt lavere enn for konvensjonell kultur, men hurtigheten er av stor betydning. Prøver fra spinalvæske, bronchialskyllevæske evt. urin fra nyfødte er aktuelle materialer til slik undersøkelse. ANTIGENPÅVISNING CMV antigen kan påvises i histologisk snitt ved immunohistokjemi. Denne undersøkelsen utføres ved enkelte patologisk avdelinger på biopsier og autopsier, gjerne kombinert ved vanlig histologi. Den egner seg til påvisning av lokale infeksjoner f. eks. i lunge og i gastrointestinal trakt. Fluorscens- eller enzymmerkede antistoffer mot strukturelle proteiner eller mot EA kan anvendes. Vanlig immunohistokjemisk undersøkelse har relativt lav sensitivitet. Påvisning av CMV antigen i hvite blodlegemer, antigenemi, er kanskje den viktigste undersøkelsen til diagnose og oppfølgning av CMV infeksjoner hos immunokompromitterte pasienter. Både primærinfeksjon og reaktivering av latent infeksjon med kliniske symptomer er ledsaget av sirkulerkulerende CMV antigen positive celler. Antigenet som påvises er matrix proteinet pp65 som etter all sannsynlighet produseres hovedsakelig av endotelceller eventuelt av makrofager, der virus multipliserer, og blir fagocyttert av nøytrofile granulocytter. CMV multipliserer ikke i granulocytter. Enkelte antigen-positive endotel celler og makrofager kan også påvises i slike preparater. Spesifikke monoklonale antistoffer rettet mot pp65 proteiner (C10 og C11) er kommersielt tilgjengelig. Antistoffene kan merkes ved fluorescerende molekyler (FITC) eller enzymer (peroxydase eller alkali fosfatase). Nøye standardisering av metoden er strengt påkrevet. Dette gjelder både preparering av cytospin preparater, antall celler, fikseringsmetode, fargemetode og det er nødvendig å inkludere standardiserte kontrolpreparater i hver undersøkelse. Semikvantitativ vurdering kan gjøres ved å telle antall positive celler. Det er vist i flere undersøkelser at opptreden av antigenemi med stigende antall positive celler er godt korrelert med kliniske symptomer. Fallende antall positive celler under behandling indikerer klart at behandlingen er effektiv. Antall positive celler varierer betydelig i ulike pasientgrupper og ved ulike sykdomstilstander. F. eks. er det vanligvis høyere antall celler en finner ved primærinfeksjon enn ved reaktivering, og høyere antall hos solid organtransplanterte pasienter enn hos benmargtransplanterte pasienter. Metodens store fordeler er at den kan utføres raskt, tar bare få timer etter prøvetaking, det er ikke behov for kostbar utstyr, og det er godt korrelert med klinisk utvikling. Det

24 er en ulempe at undersøkelsens kvalitet er avhengig av kort og korrekt transport og den er relativt arbeidskrevende. Det sendes 4-6 ml EDTA-blod til laboratoriet. Det er viktig at transporttiden holdes til minimum, ellers blir undersøkelsens kvalitet redusert. Prøven bør helst behandles i laboratoriet samme dag som det tas. I nødsfall kan prøven oppbevares ved romtemperatur høyst ett døgn. Hvite blodlegemer separeres ved dextran-sedimentering, og cytospinnpreparater lages med ca celler per objektglass. Preparatene fikseres vanligvis ved aceton. Ferdigfikserte preparater kan oppbevares i fryser til farging utføres (i hovedsak etter APAAP metoden). Mikroskopisk evaluering er relativt tidskrevende da de positive celler skal telles. NUKLEINSYREPÅVISNING Påvisning av HCMV nukleinsyre ved hybridisering har ikke tilstrekkelig sensitivitet til diagnostisk anvendelse. Det samme gjelder også in situ hybridisering. Nukleinsyre amplifisering er en viktig del av det diagnostiske apparatet. Polymerase kjede reaksjon (PCR) er den opprinnelige metoden som etterhvert fikk stor anvendelse. Denne metoden er nå også tilgjengelig kommersielt, sammen med flere andre varianter av amplifikasjonsmetoder (f. eks. NASBA og LCX). Det finnes flere alternativer når det gjelder valg av område av CMV-DNA for amplifikasjon. De fleste foretrekker områder innen major immediate early (IE) gen, fordi den er sterkt konservert, eventuelt kombinert med late antigen (LA) gen. Nested PCR synes ikke å ha sikre fordeler fremfor enkle PCR. Amplifikasjonsmetodenes hovedproblem er at de kan være alt for sensitive. Sensitiviteten i mange tilfeller er rapportert i størrelsesorden 10 genkopier, og det kan være sensitiv nok til å påvise latent virus i celler, f. eks. i ekstrakt fra hvite blodlegemer. I så tilfelle kan en kvalitativ PCR ikke brukes til å differensiere reaktivering fra latent virus. Det er beskrevet flere alternative måter å anvende nukleinsyreamplifikasjon til å påvise CMV genom relevant til klinisk sykdom. Valg av materiale kan være til betydelig hjelp. CMV-DNA påvist ved kvalitativ PCR i serum eller plasma synes å være av klinisk verdi, fordi det forekommer kun ved aktiv virusmultiplikasjon, da virus frigjøres fra celler, og ikke ved latens. DNA i leukocytter kan påvises tidligere enn i serum eller plasma, men en positiv test har lavere positiv prediktiv verdi. En alternativ metode er kvantitativ DNA amplifikasjon utført på leukocytt ekstrakter. Denne metoden kombinerer amplifikasjonens sensitivitet og kvantitering, selv om sensitiviteten synes å være noe lavere enn ved kvalitativ PCR. Mengde DNA i leukocytter er vanligvis godt korrelert med antigenpåvisning i leukocytter og med klinisk sykdom. Det finnes flere kommersielle metoder til kvantitativ DNA amplifikasjon. Kvantitering av DNA kan også utføres ved RNA-DNA hybridisasjon. Amplifikasjon av CMV-RNA er også en god alternativ og slik test finnes også kommersielt. CMV-RNA produseres selvfølgelig bare ved aktiv virus multiplikasjon. Det er en god korrelasjon mellom klinisk CMV sykdom og påvisning av CMV-RNA. Ingen av de beskrevne metoder er perfekte. Ingen av disse kan brukes alene som en sikker indikator for klinisk CMV sykdom. En kombinasjon av flere metoder gir en klar