Tradisjonelle virologiske metoder. Halvor Rollag Avdeling for mikrobiologi Oslo Universitetssykehus Rikshospitalet

Transkript

1 Tradisjonelle virologiske metoder Halvor Rollag Avdeling for mikrobiologi Oslo Universitetssykehus Rikshospitalet 1

2 Organisering Påvisning av virus Historisk utvikling Cellekultur Direktepåvisning i prøvematerialer Serologiske metoder KBR HAI Nøytralisasjonstest 2

3 Diagnostikk av virusinfeksjon ved Påvisning av virus og av spesifikke antistoffer Agens 3

4 Mosaikksykdom på tobakksplanten Aldolf Mayer overførte sykdommen med plantesaft. Ingen bakterier 1898 M.W.Beijerinck. Saften beholdt sin sykdomfremkallende også etter filtrering gjennom porselensfiltre. 4

5 Virus og dyresykdommer Løffler og Frosch 1898 Filtrerbart materiale fra blemmer i munnslimhinnen hos syke dyr kan overføre sykdommen. 5

6 Tumorfremkallende filtrerbare agens Wilhelm Ellemann og Olaf Bang, 1908 kyllingleukemi Francis Peyton Rous 1910 nobelpris 1967 Filtrat fra blod og og tumor hos høns med sarkom overfører sykdommen til friske høns. 6

7 Bakterievirus F.W.Twort 1915 F. D herelle 1917 Enzym eller levende vesen 7

8 Filtrering med ulik porestørrelse 8

9 Svedbergs ultrasentrifuge 9

10 Påvirsning av virus ved mikroskopi Lysmikroskopi Florescensmikrospi med UV lys ned mot 0,2µ Elektronmikroskopi fra ca

11 Elektronmikroskopi 10 6 partikler/ml ca x forst. Adenovirus Rotavirus (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) Anvendelse: virus i avføring, hurtigpåvisning av koppevirus 11

12 Dyrking av virus I levende dyr I embryonerte egg I vevskultur I cellekultur 12

13 Inokulasjon av enterovirus på pattende mus 13

14 Dyrking av virus på embryonerte egg 14

15 Vevskultur Oppdaget 1906/7 R.G. Harrison Satt i system 1924/25 av Alexis Carrel viste at Roussarkomavirus kunne dyrkes i det uendelige. 1mm 3 vevsbiter i en dråpe serum, hengende, På objektglass I kolber 15

16 Dyrkning av virus i cellekultur Første dyrking av virus i cellekultur: 1949 dyrking av poliovirus i humane embryonale celler. Nobelpris i 1954 til Fredrick C. Robbins John F. Enders Thomas H. Welles 16

17 Cellekultur monolayer 17

18 Cellekultur Primærceller. Fra vev hos dyr eller mennesker passasjer. Eks. HE.celler, monocytter, lymfocytter Apenyrer Cellelinjer Fra cancer celler (Vero, HeLa, A549) Immortaliserte primærceller Eks Raji (EBV) 18

19 Vekstmedier Vanlige medier: Salter,(BSS, Eagle,Hank) Energi Glukose Essensielle aminosyrer (obs glutamin) Vitaminer Hypoxantin for nukleinsyreprod. Serum (vekstfaktorer) Rensede eller syntetiske vekstfaktorer EGF, IL3, G CSF, Insulin etc avhengig av celletype. Antibiotika Penicillin G, Streptomycin, ev amfoterecin B 19

20 Vanlig brukte cellekulturer HE celler: Humane embryonale fibroblaster MRC5. Fibroblaster Hep 2 cells Oral cancercellelinje Vero celler: apenyrecellelinje HeLa celler: Cervixcarcinomcellelinje A 549: Lungecancer (pleura?) THP1 celler: Makrofaglignende 20

21 Virusisolasjon Prøvemateriale i transportmedium. Vevsbiter må homogeniseres. Tilsettes celler som er i deling dvs ikke helt konfluente Inkuberes et visst antall dager avh av virus HSV:3 d CMV: 3 uker 21

22 Virusisolasjon Mikroskopere 1 3x ukentlig for åse etter cytopatogen effekt. Cytopatogen effekt (CPE) er endringer i cellkulturens morfologi som kan være virusbetinget. Noen virus gir liten eller ingen CPE Ved mistanke om virusinfeksjon passereres celler/medium til ny cellekultur 22

23 Virus i cellkultur II De fleste cellkulturer er permissive for noen virus. HE: CMV, herpes, adenovirus Vero: Herpes, influensa, enterovirus A 549. Adenovirus Noen virus lar seg ikke dyrke I cellekultur Eks. HBV, HCV 23

24 Cellekultur monolayer Uinfisert Infisert med adenovirus 24

25 Cytopatogen effect Influensavirus Herpes simplexvirus 25

26 Identifikasjon av virus Typisk CPE etter en bestemt tid (CMV) Virusnøytralisasjonstest. (Adeno, influensa etc) Påvisning av virus og type med IF teknikk (HSV) Hemadsorpsjon (orthomyxovirus og paraorthomyxovirus) Elektronmikroskopi PCR 26

27 Haemadsorption Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) 27

28 Virusnøytralisasjon Ukjent virus + Kjent antistoff + Cellekultur = Ingen CPE (match mellom virus og antistoff) CPE (ikke match mellom virus og antistoff) 28

29 Måling av mengde virus ved Plaque-titrering

30 Snøggdiagnostikk 30

31 Shell vial kultur Celle på et dekkglass I et flatbunnet rør. Legge prøvematerialet på cellelaget Centrifugerer 1500g i 30 min. Vasker Inkuberer I 1 2 døgn Påviser virus med IF teknikk 31

32 Direkte påvisning av virus i prøvematerialer Nasofarynkssekret Influensavirus A og B, Parainfluensavirus, adenovirus, RS virus Hudblemmer/sår HSV 1 og 2, VZV Blod Cytomegalovirus 32

33 Influensa virus i celler fra nesen Utstryk av virus på objektglass Fikseres Tilsetting av fluorescinmerket antistoff Ev umerket spesifikt a.s. Deretter merket antiantistoff. 33

34 Herpes simplexvirus i en hudlesjon 34

35 CMV pp65 in leukocytter 35

36 Immundiffusjon 36

37 Counter immunoelectrophoresis Hepatitt B test 37

38 Agglutinasjon Påvisning Av virus/virusproteiner Partikler + antistoff Virus Partikler med Spesifikt antistoff Virus Agglutinasjon F.eks hepatitt B virus diagnostikk 38

39 Pre EIA antistofftester Komplementbindingsreaksjon Haemagglutinasjonsreaksjon Virusnøytralisasjonsreaksjon Gelpresipitasjon Fluorescerende antistoffbestemmelse 39

40 Typical Serological Profile After Acute Infection Note that during reinfection, IgM may be absent or present at a low level transiently 40

41 Komplementbindingsreaksjon KBR Bordet og Gengou proisnippet 1901 Syfilistest Wassermann og Neisser

42 Komplementbindingsreaksjon Reaksjon 1 Pasientserum (antistoff?) varmeinaktivert Antigen (virus) Komplement (marsvinserum i forhåndsbestemt mengde) Reaksjon 2 Saueblodlegemer Hemolysin (anti saublod produsert i kanin) (inaktivert) 42

43 Komplementbindingsreaksjon Serum 56oC (ukjent)+ Virusantigen + Komplement Hemolysin + Erytrocytter Komplement Ingen hemolyse antistoff tilstede. dvs komplement brukt Hemolyse antistoff ikke tilstede komplement til overs Anvendelse: Luftveisvirus (infl.a+b), parainfluensavirus, RSV, adenovirus, HSV 43

44 Complement Fixation Test Complement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens, respectively. (2 fold serum dilutions were used) The observed 4 fold increase is significant and indicates recent infection. 44

45 Hemolyse i gel for påvisning av antistoffer mot rubella og influensa virus Brønn med serum (inakivert) Gel med saueblodl med antigen (virus) Komplement (marsvin) 45

46 Haemagglutinasjon Matte Knapp 46

47 Haemagglutinasjon inhibisjon Virus + serum (antistoff) + røde blodlegemer Ingen agglutinasjon (Knapp)= antistoff har bundet virus Agglutinasjon (matte) = ikke antistoff tilstede Anvendelse: Influensavirus A B og rubellavirus 47

48 48

49 Co agglutinering Virusantistoffpåvisning: Antistoffer mot røde hunder 49

50 Virusnøytralisasjonstest Høyere sensitivitet enn KBR og HAI. Egnet for immunstatus Kjent virus + ukjent serum + cellekultur Ingen CPE: spesifikt antistoff tilstede CPE: ikke antistoff tilstede eller i for lav konsentrasjon ved titrering 50

51 Påvisning av IgM antistoffer Skille IgG og IgM ved ultrasentrifugering Fraksjonere det sentrifugerte serum Bestemme hvilke fraksjoner som inneholdt IgG og eller IgM. Utføre serologisk test på hver enkelt fraksjon. 51

52 Immundiffusjon Anti IgG Eller IgM Serumfraksjoner 52

53 Oppsummering Identifikasjon av det filtrerbare agens som virus. Påvisning av virus ved isolasjon og direkte metoder Serologiske metoder for påvisning av virusantistoffer 53