Er det noe i utsagnet fra Zambia: Anbefaler nå geitemelk og vitaminer mot HIV. Christine M. Jonassen, Seniorforsker, Senter for laboratoriemedisin

Transkript

1 Er det noe i utsagnet fra Zambia: Anbefaler nå geitemelk og vitaminer mot HIV Christine M. Jonassen, Seniorforsker, Senter for laboratoriemedisin

2 Disposisjon Generelt om virus og antivirale egenskaper av geitemelk komponenter Geitemelk mot HIV? Geitemelk mot enteriske virus

3 Virus er obligatoriske celleparasitter. De er som regel verts- og vevsspesifikke, og bruker spesifikke reseptorer på overflate av målcellene hos verten Små genomer (ned til 1500 nt)- De bruker store deler av vertscellens maskineri for å formere seg Det er en utfordring å utvikle gode antivirale midler Virus har høye mutasjonsrater, og utvikler ofte resistens mot disse midler

4 Mulige antivirale av mekanismer melkekomponenter Ved direkte hemming av virus replikasjonen Ved binding til viruset Ved binding til reseptorer på virusets målcelle som hemmer virusbinding. Ved intracellulær lokalisering i målcelle, med effekt på apoptose, inflammatoriske prosesser, og hemming av virale enzymer Indirekte, ved påvirkning av vertens immunresponsen Berlutti et al

5 Kjente antivirale komponenter i melk Bovint laktoferrin har tidligere blitt vist til å utvise antivirale egenskaper (HIV, Herpesvirus, rotavirus, enterovirus), og effekten antas å skyldes binding til virus partikler/cellereseptorer, og dermed hindring av virus/reseptor binding, og dermed smitte. Antiviral effelt på ulike virus også funnet med andre melkeproteiner ( -lactoglobulin, mucin, Ig). Det er også funnet direkte enzymhemmende effekte av ulike melkeproteiner (hemende på revers transkriptase, virale polymeraser) Vist ulike antivirale aktiviter i melkeproteiner fra ulike dyrearter 5

6 HIV 35 Millioner mennesker lever med HIV smitte i verden, de fleste i fattige/middelsinntekts land. Kun en tredjedel av de smittede i disse landene har tilgang til antiviral terapi HIV er et retrovirus (genus lentivirus) som replikerer hovedsakelig i CD4+ T celler, makrofager og DC Engelman and Cherepanov 2012

7 HIV smitter ikke fekalt/oralt, men via blod, sex, eller vertikalt (fra mor til barn) Tarmdysfunksjon er en av hovedsymptomer hos AIDS patienter, og viruset replikerer da hovedsaklig i CD4+ T Healthy gastrointestinal tract HIV-infected gastrointestinal tract Brenchley and Douek 2008)

8 helsegevinst ved drikking av geitemelk mot HIV? Lactoferriner er kjent for å hemme HIV replikasjon, tilsetning av blf i diett hos barn på antiviralterapi senker virus-load, og hever CD4+ tall. Nativ blf er også blitt vist å være signifikant mer potent til å hindre HIV transmisjon fra DC til CD4+ T celler enn hlf. Likevel: Ikke direkte kontakt mellom selve geitemelken ved normalkonsum, og det blod/genitalielokaliserte HIV eller målcellene for hindring av nysmitte, men mulighet for gunstig effekt i tarmen på HIV smittede, samt mulighet for at bioaktive komponenter kommer over til blodbanen der viruset replikerer

9 Konsum av geitemelk kan likevel være gunstig av flere årsaker i bekjempelsen av HIV/AIDS I bekjempelsen av vertikalsmitte til spebarn via morsmelk hos kvinner som ikke har tilgang til antiviral behandling, er geitemelk en bedre erstatning til morsmelk enn kumelk (mer likhet med humant melk på viktige punkter) Geitemelk inneholder mye Selenium, som fremmer immunforsvaret, og Se status hos HIV smittede er positivt assosiert med utsetting av sykdomsprogresjon. Geitemelk er også vist til å ha en gunstig effekt på biotilgjengelighet av Zn, Se og Cu i rotter.

10 I tillegg Geiter er naturlig vert for et annet lentivirus, CAEV. Viruset kan gå over i melken Det er funnet kryssreaktivitet av antistoffer mot CAEVs overflate glykoprotein gp135, med HIVs gp120 I Mexico ble det nylig vist at over halvparten av barn som drikker jevnlig geitemelk utvikler antistoffer mot CAEV. Mulig positiv effekt mot HIV??

11 I samarbeid med UMB (v/ Prof. G. Vegarud), er det blitt utført in vitro studier av antivirale egenskaper av geitemelk (myseproteiner), fordøyd med human mage/tarmsaft på enteriske virus. Rasjonale: -Geitemelkekomponenter kommer i direktekontakt med virus som smitter tarmepithel. -For at geitemelk skal kunne ha en virkning in vivo kan det være viktig at det beholder eventuelle antivirale egenskaper gjennom fordøyelse

12 Enteriske virus hos mennesker Human enteriske virus definerer gruppen virus som kan infisere mennesker gjennom og/eller replikere i tarmen og forårsake 1) Gastroenteritt (astrovirus, rotavirus, norovirus) Astrovirus 2) Smittsom hepatitt (Hepatitis A and E virus) 3) Sykdom i indre organer (hjerte, hjerne, for eks), etter migrasjon fra initiell replikasjon i tarm (enteroviruses) Rotavirus Overføres faecalt-oralt Tåler ulike ph (3-10), varme, frysing, tining. Modifisert fra Colbere-Garapin. F. et al (2007) 12 Poliovirus (enterovirus)

13 Master prosjekt på Ås i 2008 på antivirale egenskaper av geitemyseproteiner (C. Furlund) Myseprotein fraksjoner fra geitemelk ble studert, ufordøyd, fordøyd med mage saft, og fordøyd med både mage og tarmsaft. De ulike melkefraksjonene: 1) Whey Protein Concentrate of Goat Milk (WPCG) 2) A1: WPCG fordøyd med humant Magesaft i 30 min, ph 2.5, 37 C. - Hel fordøyd fraksjon - Fraksjon <8000 Da - Fraksjon >8000 Da 3) A2: A1, ph justert til 7.5, fordøyd videre 30 min med human tarmsaft. Fraksjon 5000<A2<8000 prøvd ut 13

14 Antivirale assay Utført på echovirus 1 (ATCC stamme) og astrovirus 8 (fått ved Nederlandske Public Health Institute, Bilthoven) og dyrket i Caco2 celler Alle geitemelkeprotein fraksjonene ble tilsatt i konsentrasjon 10mg/ml (1% vkt/vol) i dyrkningsmedium. Negative (virus frie, med og uten fraksjon), og viruspositive kontroller inkludert Fraksjoner og virus ble pre-inkubert sammen, så ble blandingen satt på celler og latt stå for virus replikasjon. Prøver (supernatant/lysert celleteppe) ble tatt på ulike tidspunkter 3 paralleler ble kjørt/fraksjon/virus/tidspunkt Antiviral effekt ble målt ved observasjon av cytopatisk effekt (CPE) på cellene, og ved virus spesifikk real-time RT-PCR, normalisert med GAPDH for de korte tidspunkt

15 Resultater Det ble observert en svak hemming av Echovirus 1 replikasjon med WPCG og A1>8000 Da, men ikke signifikant. Både WPCG og 5000<A2<8000 (for de første tidspunktene) førte til signifikant hemming av astrovirus, målt med realtime RT-PCR. I tillegg, virus dyrket sammen med WPCG fraksjon ga ingen CPE, selv etter 4 dager Bilde ved C. Furlund

16 Sammenligning av ufordøyd clf og blf effekt på echovirus 5 Echovirus 5 tilsatt ved multiplicity of infection (MOI) 1 plaque forming units per celle konfluent Caco-2 celler 1mg/ml Lf 1h 37 C 5%CO 2 EV5 MOI 1 3 ulike antivirale forsøksbetingelser 1. Effekt av Lf på cellene før virusinfeksjonen (ingen kontakt mellom Lf og viruset) 2. Effekt av Lf tilsatt samtidig med viruset på cellene 3. Effekt av Lf tilsatt etter at viruset har bundet seg til cellene 4. Lf var tilstede under hele forsøket 16 1mg/ml Lf Virus binding 1h 37 C 5%CO 2 1mg/ml Lf Virus propagering 5h 37 C 5%CO 2 Celleteppe lyseres, og NA ekstraheres Figur etter C. Furlund 1mg/ml Lf Virus inoculums fjernes, cellene vaskes 1mg/ml Lf Enterovirus og husholdnings gen måles med RT-PCR

17 Sammenligning av antiviral effekt av clf og blf på enterovirus 0, Fig. 2: Box plots (2 - CT ) for pos.ctr, blf (1mg/ml) and clf (1mg/ml) in different stages of infection (S1, S2 and S4). Data normalized with the endogenous control GAPDH 0, , , , Positiv Ctr Caprine S1 Bovine S1 Caprine S2 Bovine S2 Caprine S4 Bovine S4 Furlund et al, Poster, Int Symp on Sheep, Goat and other Non-Cow milk, 2011

18 Videre studier på fordøyd blf viste at den HGJ fordøyd blf fraksjon hadde en signifikant høyere antiviral effekt enn intakt blf på echovirus 5 replikasjon (Furlund et al. 2012) Til gjengjeld hadde blf ingen antiviral effekt på astrovirus. Effekt av fordøyde clf på enteriske virus er ikke blitt utprøvd

19 Konklusjon Det finnes komponenter i geitemelk som har direkte antiviral effekt på enteriske virus in vitro. Den ene fordøyde fraksjonen av geitemyseprotein beholdt en antiviral effekt mot det diarrheassosierte astrovirus I tillegg til en direkte effekt på virus replikasjon, kan geitemelk også indirekte påvirke menneskers immunstatus, og fremme bedre helse.