Labøving nr. 6 ELEKTRONMIKROSKOPI

Transkript

1 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 1 Institutt for fysikk, NTNU, Gruppe for biofysikk og medisinsk teknologi Emne SIF4070 Cellebiologi Labøving nr. 6 ELEKTRONMIKROSKOPI Oppgavens formål: Oppgaveteksten er relativt omfattende og har til hensikt å sette studentene inn i viktige aspekter ved elektronmikroskopi (EM). I laboratoriedelen blir enkelte, men ikke alle av disse aspektene demonstrert: Grunnlag for bildedannelse i elektronmikroskopi Prinsippene for TEM, STEM og SEM elektronmikroskopi Oppløsning og forstørrelse Røntgenmikroanalyse Ulike metoder for preparering av biologiske prøver for elektronmikroskopi

2 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 2 Kort historikk de Broglie (1923): Busch (1926): Ruska og Knoll (1936) Ruska og von Borris (1932) Siemens, Haske, von Borris Ruska (1938): University of Cambridge, England (1965) Creive (1968) Elektroner har både partikkel og bølgenatur Teoretisk grunnlag for elektromagnetiske linser Første elektro-optiske avbildning (forstørrelse 17X). Ruska fikk nobelprisen i 1986 Magnetisk linse med jernkjerner Første serieproduserte elektronmikroskop (Oppløsning 500 Å). Første scanning EM (SEM). Scanning transmission EM (STEM). Elektromagnetisk linse Fokal lengden er avhengig av strømmen gjennom linsespolen. Mekanisme: 1. Elektron banen danner en vinkel med magnetfeltet mellom S og N. Pga. Lorentzkraftas hastighetskomponent normalt magnetfeltet, får vi en spiraliserende bane F = q E+ v B 2. Hastighetskomponent normalt magnetfeltet pga effekt 1 gir kraftkomponent mot symmetriaksen. Dette gir fokusering. Magnetiske linser er alltid samlelinser. En kan derfor ikke lage sammensatte linser for å korrigere linsefeil som for glasslinser. Pga linsefeil maks forstørrelse pr linse 100X. Bølgeteorien for optiske og elektromagnetiske linser svært lik.bølgelengde for elektroner ved 100keV 1240 λ( 100 kev) = = 0.04Å = nm E (ev) Lateral oppløsning er i praksis begrenset til 2-3 Å, hovedsaklig på grunn av sfærisk abberasjon. Fig. 1. Skjematisk illustrasjon av tverrsnitt av elektromagnetisk linse

3 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 3 N S Polsko (magnetpoler) O I O I symmetriakse N S Polsko (magnetpoler) Fig. 2. Sammenlikning av avbildning av objekt O til bilde (Image I) ved hjelp glasslinse og elektromagnetisk linse. Fokallengden til den elektromagnetiske linsa er avhengig av strømmen som går gjennom linsespolene Kontrast Begrepene amplitude- og fase-kontrast inngår i samband med elektrooptiske reelle bilder helt analogt til hva man har for reelle optiske bilder. I praksis er det imidlertid nesten alltid bare amplitudekontrast som er av interesse. Amplitude fremkommer pga spredning av elektroner på tunge atomkjerner. Objekt Tungt atom Θ Bane til spredt elektron Fig. 3 Skjematisk illustrasjon av avbøyning (spredning) av elektronbanen på grunn av tunge atomer Når elektroner spres over en viss vinkel θ fanges de ikke lenger opp av avbildningssystemet. Dette gir amplitude kontrast. Mens man i lysmikroskopi (LM) farger med kromoforer, farger man i EM med tungmetaller (Pt, U, Os). Ulike moder av elektronmikroskopi Det finnes tre ulike hovedmoder av elektronmikroskopi (EM): Transmisjons EM (TEM). Scanning transmisjons EM (STEM). Scanning EM (SEM). Et moderne forsknings EM kan brukes i samtlige av disse modene.

4 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 4 TEM - Transmisjons EM For et TEM er virkemåten helt analog til hva man har for vanlig lysfelt lysmikroskop. Figuren viser de vesentlige komponenter i et TEM. Kondensorlinsenes og aperturblenderens funksjon tilsvarer deres funksjon i et lysmikroskop. Grunnen til at man har to kondensorlinser er at man i elektronmikroskopet kan operere med så store forstørrelser at man bare med èn kondensorlinse ikke ville klare å redusere bildet av elektronkilden nok til at det bare dekker det ønskede synsfeltet ved de høyeste forstørrelsene. Oppløsningen i TEM på moderne elektronmikroskop er bedre enn 0.2 nm. Dette gjør at man kan forstørre bildet ca ganger uten å risikere å få tom forstørrelse. Den maksimalt brukbare forstørrelsen til en elektromagnetisk linse er ~ 100X (omlag som for et objektiv i et lysmikroskop). Derfor må man i avbildningssystemet i et TEM ha tre eller flere elektromagnetiske linser. Kontrasten i TEM blir dannet ved at spredte elektroner ikke blir fanget opp av objektivet og dermed skaper amplitudekontrast i bildet. Reduksjon av objektivaperturen vil derfor øke amplitudekontrasten. Men samtidig vil også lateral oppløsning reduseres fordi numerisk apertur for objektivet reduseres. Katode Anode Kondensor 1 Aperturblende Kondensor 2 Objektiv Prøve Avbildningslinser Vindu Fig. 4. Tverrsnitt gjennom Philips EM 400T

5 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 5 Fig. 5. Skjematisk illustrasjon av elektronstrålegang gjennom et elektronmikroskop STEM Scanning Transmisjons EM I STEM avbilder kondensorsystemet filamentet (elektronkilden) i et så lite punkt som mulig på objektet. For vanlig glødefilament er denne minstestørrelsen 1,5-2,0 nm. Dette er da identisk med oppløsningen i STEM. Billeddannelsen framkommer ved at den skarpt fokuserte elektronstrålen scanner over objektet i et rastemønster tilsvarende hva man har på vanlig TV. Scanningen av elektronstrålen over objektet oppnås vha. spesielle scanningspoler. I STEM benyttes objektiv og projeksjonslinene bare som hjelpelinser i samband med registreringen av strålestrømmen som kommer gjennom objektet. Denne strømregistreringen foregår på en egen elektrondetektor. Den registrerte strålestrømmen føres så til en monitor (TV-skjerm) som scanner synkront med elektronstrålesveipingen over objektet. På denne måten framkommer et TV-likt bilde på monitoren. Fordelene med STEM er i hovedsak:

6 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 6 1. Det er mulig å få skarpe bilder av mye tykkere preparat enn vanlig TEM. Dette har sammenheng med at avbildningen ved TEM av tykke preparat er begrenset av at elektronene etter passasjen gjennom preparatet har ulike energi og dermed ikke lenger er monokromatiske, slik at man kan få kromatiske feil i avbildningen. Men i STEM brukes objektivlinsa bare til strømdeteksjon og ikke avbildning og derfor skaper dette ikke noe problem. 2. STEM gir mulighet til presis styring av elektronstrålen ned på prøven. Dette er være viktig ved røntgen mikroanalyse (se eget avsnitt). Strålen kan scanne et så lite område av prøven som en ønsker, eller ev. også stå i ro i et ønsket punkt på prøve. I det siste tilfelle vil området som bestråles bare svare til elektronstrålens diameter 3. Siden billeddannelsen er elektronisk kan man f.eks. manipulere (øke) kontrasten i bildet elektronisk. I STEM er det derfor mulig å studere objekt med vesentlig lavere kontrast enn hva man kan i vanlig transmisjonsmode. Høyspennings kilde Linsespennings kilde Objektivlinse Scannespoler Objekt Elektrondetektor Vakuum system Elektronkanon Kondensorlinse 1 Kondensorlinse 2 Forstørrelses kontroll Sekundærelektroner Scanning krets Signal forsterker TV-skjerm Fig. 6. Illustrasjon av tverrsnitt av Scanning elektronmikroskop To bilder fra transmisjonsmikroskopet. Bildet til venstre er av tynnsnitt kontrastert med tungmetall (fra epitelceller i lungevev, cellekjernene er ca 5 µm), mens bildet til høyre er tatt i STEM av et vesentlig tykkere snitt som det ville vært umulig å avbilde skarpt i TEM (proteingranula fra plantemateriale).

7 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 7 SEM - Scanning EM I SEM scannes objektet med en skarpt fokusert elektronstråle på samme måte som ved STEM. Billeddannelsen foregår imidlertid ved at man samler opp sekundærelektronene fra prøven, eventuelt primærelektroner som er tilbakespredt fra prøven. Sekundærelektronene er spredte elektron med lav kinetisk energi, ca 10 ev. Hvor mange sekundærelektron som frigjøres avhenger av prøveoverflatens sammensetning og vinkelen mellom flatenormalen og elektronstrålen. Ved at bildemonitoren scanner synkront med elektronstrålen (på samme måte som ved STEM) og lar intensiteten på skjermen moduleres av mengde elektroner som til enhver tid detekteres, dannes at bilde på skjermen. Dette vil være et topografisk bilde av prøveoverflata, i motsetning til TEM/STEM som gir et projeksjonsbilde av prøvetettheten (atomnummertettheten). De tilbakespredte elektronene har vesentlig høyere energi enn sekundær elektronene og kan pga dette detekteres ved hjelp av spesielle detektorer vist på skissen på foregående side. SEMbildet ved bruk av sekundær og tilbakespredte elektroner vil kunne gi vesentlig forskjellig kontrastfordeling. Denne forskjellen inneholder tilleggs informasjon om overflate vinklene til de ulike delene av prøven og til en viss grad også informasjon om element fordelingen i prøveoverflata. Dette siste har sammenheng med at antall tilbakespredte elektroner er 3 3/ 4 proporsjonalt med Z 2/ Z hvor Z er prøveoverflatas midlere element nummer. Disse to bildene viser innsiden av tykktarm, hvor det er store mengde bakterier (spirochaetes) festet til tarmveggen. Det første bildet er tatt i SEM, og viser hvordan en i SEM avbilderoverflater. Det neste bildet er fra TEM hvor tynnsnittetstår vertikalt på tarmens overflate. Oppløsning og forstørrelse I SEM-mode vil det generelt være slik at med samme primær elektron energi og preparat vi den laterale oppløsningen øke med minkende størrelse (d) på bildet av elektronkilden ned på objektet. Den laterale forstørrelsen vil imidlertid ikke være lik d. Dette har sammenheng med at inne i prøven vil primærelektronene kunne undergå multippel spredning og tilbakespredte elektroner vil kunne forlate prøveoverflaten fra et område med diameter større enn d: Objekt d e - e - e - Primærelektroner Sekundærelektroner Tilbakespredte elektroner Karakteristisk røntgenstråling Fig. 7 Elektronstråle- prøve vekselvirkninger

8 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 8 I spesialiserte SEM (arbeidsavstand [mm]) er den maksimale laterale oppløsningen ofte ca Å. I kombinasjonsmikroskop har man i SEM-mode ofte en lateral oppløsning på ca 30 Å. Et karakteristisk trekk i SEM-mode er ellers en meget stor aksial oppløsning. Dette har sammenheng med den meget lille numeriske aperturen til de magnetiske kondensorlinsene. Ved samme forstørrelse har derfor et elektronmikroskop i SEM-mode ofte mer enn 10X ganger større aksial oppløsning enn et standard lysmikroskop. I scanning elektronmikroskop er det vanlig med elektrooptisk forstørrelse fra 10X til ca X. Et særtrekk ved SEM-mode som skiller det sterkt ut fra TEM-mode er at i SEM-mode er forstørrelse og fokus uavhengige størrelser. Dette har sammenheng med at forstørrelsen i SME-mode er bestemt av størrelsen til det området av prøven som primærstrålen scanner over. Dette bestemmes av strømmen i scannespolene. Fokuseringen derimot bestemmes av strømmen i kondensorlinsene. Nyere styper canning elektronmikroskop. Inne i scanning eletronmikroskopet er det vakuum, og prøvepreparering må derfor ta hensyn til dette. I løpet av 1990 tallet er det kommet nye typer skanning elektronmikroskop på markedet hvor trykket kan økes inne i prøvekammeret (lavvakum SEM, LVSEM). Her er elektronkanonen og linsene plassert i høyvakuum, mens et lite hull danner skillet til prøvekammeret og lavvakuumdelen. Prøveprepareringen for lavvakum SEM er mye enklere; behøver prøven ikke være like vakum stabil, og en har ofte ikke behove for å legge et tynt metallsjikt over prøven. I ESEM (environmental SEM) kan trykket være høyere, og høyere en vanndamptrykket ved romtemperatur slik at prøven kan inneholde vann. Sekundær elektron-mode Sekundærelektron-mode vil si at man lar intensiteten på katodestråle røret som scannes synkront med primærstrålen på prøven være bestemt av antallet sekundær elektroner fra prøven. På grunn av sekundærelektronstrømmens avhengighet av vinkelen mellom primærstrålen og prøveoverflata, kan man av bildet på katodestrålerør skjermen enkelt tolke hvilke deler som danner liten vinkel med denne Sekundærelektron detektorsystemet i JEOL TMSCAN Fotomultiplikator rør Scanningspole Polsko Polsko Primærelektroner Sekundærelektroner Detektor for tilbakespredte elektroner Prøve Fig. 8 Figur Sekundærelektron detektorsystemet i JEOL TMSCAN Prøven befinner seg her både i et magnetisk og et elektrisk felt. Skjermelektroden trekker elektronene i retning denne, men pga. det aksialsymmetriske magnetfeltet vil man samtidig få en spiralisering av sekundærelektronene. I nærheten av fotomultiplikatoren er det magnetiske feltet svakt nok til at sekundærelektronene lett trekkes inn mot fotomultiplikator røret. Den teoretiske punktoppløsningen til dette oppsettet er Å. Sekundærelektronene stammer i praksis fra de ytterste Å av prøveoverflaten.

9 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 9 Røntgenmikroanalyse Røntgen mikroanalyse er en teknikk basert på scanning mikroskopi (SEM) eller også scanning transmisjons mikroskopi STEM, hvor røntgenemisjonsspekteret fra prøven detekteres. Med denne teknikken kan sammensetningen av grunnstoff og også konsentrasjonene av de enkelte grunnstoffene bestemmes i svært små og utvalgte områder av f.eks. et vevssnitt. Når elektroner med tilstrekkelig energi vekselvirker med atomer, vil elektroner kunne frigjøres med den følge at atomene eksiteres/ioniseres. Dette gjelder ikke bare for de ytterste atomære elektronene, men også for de innerste K-elektronene, og gir opphav til karakteristisk røntgen. Røntgenstråling er elektromagnetisk stråling med en viss kvanteenergi h ν, hvor ν er strålingens frekvens. Røntgenemisjonsspekteret består delvis av et uspesifikt bremsestråle spektrum som avhenger lite av prøvens sammensetning og delvis av spektrallinjer som er karakteristisk for hvert enkelt element i prøven. Når atomære elektroner fra yttre elektronskall fyller opp K-skallet, vil reduksjonen i potensiell energi omsettes til fotonenergi. Energien til karakteristisk røntgen er gitt for de ulike grunnstoffene. Det finns både bølgelengdedispersive- og energidispersive røntgendetektorer. Bølgelengde dispersiv analyse Ved bølgelengde dispersiv analyse benytter man seg av diffraksjon av den emitterte røntgenstrålingens fra en krystall. Krum analysatorkrystall Pågrunn av krumningen til analysatorkrystallen fokuseres Plan P røntgenstrålene fra prøven på planet P på figuren. I og med at diffraksjonsvinkelen vil være bølgelengde-avhengig vil røntgenstråler fra prøven Prøve Fig. 9 Krum analysatorkrystall med forskjellig bølgelengde treffe planet P ved forskjellige verdier av x. Kjenner man den emitterte røntgenstrålingens bølgelengde λ, kan dens energi beregnes fra uttrykket hc E = λ der h er Plancks konstant og c = lyshastigheten i vakuum. Da bølgelengde dispersive detektorer har flere størrelsesordener lavere følsomhet enn energidispersive røntgendetektorer, er de bølgelengdedispersive detektorene praktisk talt ikke brukt ved røntgenmikroanalyse av biologiske prøver.

10 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 10 Energidispersiv analyse At analysemetoden er energidispersiv vil si at utgangssignalet fra detektoren er direkte avhengig av energien til det detekterte røntgenkvantet. Ved energidispersiv røntgenanalyse er det vanlig å bruke Li-dopede Si detektorer (Fig. 10). Disse detektorene er elektrisk sett bygd C Ø mm Fig. 10. Li-dopet Si-detektor + - P-type materiale N-type materiale Li-dopet ("intrinsic") material (Si) Røntgenstråling opp som såkalte p-i-n dioder. Som basismateriale brukes normalt Si. Ved flytende nitrogen temperatur (-196 C ) er Si en meget god isolator. Eventuelle forurensninger vil imidlertid gi en dramatisk økning i ledningsevnen. Dersom forurensningene avgir elektroner til basismaterialet sier man at en har en N-type halvleder. I motsatt fall sier man at man har en P-type halvleder. For å eliminere uønsket elektrisk ledningsevne pga eventuelle uønskede forurensninger har tilsats av små mengder Li til basismaterialet vist seg å være meget effektivt. For å hindre at Li diffunderer ut av basis materialet er det imidlertid nødvendig å holde detektoren ved flytende N 2 temperatur. Dette har den viktige praktiske konsekvens at man aldri må la energidispersive røntgendetektorer varmes opp til romtemperatur. Ved å sette på et potensial over p-i-n dioden som vist på foregående side, vil eventuelle frie elektriske ladninger trekke ut av mellomområdet (i-området) noe som medfører at man i dette området får stor elektrisk feltstryke og ingen frie ladningsbærere. Dette aktive i-området vil i praksis kunne være flere mm tykt. Deteksjonen av røntgenstråler i en p-i-n diode er basert på at røntgenstrålingen vil kunne ionisere Si-atomer i det aktive i-området. I middel krever en slik ionisasjon ev og desto høyere energi røntgenkvantet har desto flere ionisasjoner vil det kunne gi opphav til. Hver ionisasjon vil gi opphav til en strømpuls i den ytre detektorkretsen. Et røntgenkvant vil gi opphav til en stor puls i den yttre kretsen som er summen av en rekke små pulser. Størrelsen til den resulterende pulsen i den ytre elektriske kretsen vil i praksis være direkte avhengig av røntgenkvantets energi. I praksis viser p-i-n detektorer seg å gi en røntgenkvant energioppløsning i energiområdet kev på ca 1% eller bedre. For å unngå kondens problemer er det vanlig å plassere detektoren i vakuum bak et beryllium vindu. Beryllium vindu absorberer imidlertid sterkt røntgenstråler med kvanteenergi mindre enn 1-2 kev. Kvanteenergier på 1-2 kev er derfor normalt nedre deteksjonsgrense for energidispersive røntgendetektorer. På grunn av den lave energien til Si-K-linjen (1.74 kev) vil en for den innkommende røntgenstråling på detektoren kunne få et energitap på 1.74 kev pga eksitasjon av Si og videre absorpsjon av resten av røntgenenergien i detektoren på vanlig måte. Dette betyr altså at selv om man sender inn monodispers røntgenstråling med kvanteenergi E hν, vil man i den energidispersive detektoren registrere to topper med henholdsvis energi E hν og E hν kev. Dette er et forhold man må være klar over da man ellers kan komme frem til de underligste konklusjoner med hensyn til elementsammensetning i prøven. Denne ekstralinjen

11 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 11 kalles unnslipningslinjen (escape line), og er vanligvis svært liten. Dataprogrammene for bearbeiding avslike spektra kan "automatisk" beregne og fjerne slike escape linjer. Opptak av røntgen energispekteret foregår i praksis ved å sende de forsterkede pulsene fra detektoren inn på en mangekanals pulshøyde analysator. Til denne analysatoren er gjerne Kollimator Si(Li) detektor β Elektronstråle (elektronprove) hv, bakgrunns røntgen stråling α Polsko hv Polsko Fig. 11. Detektorplassering i JEOL-TEMSCAN koblet datamaskin som inneholder opplysninger om de karakteristiske linjene til de ulike elementene samt deres tilhørende unnslippningslinjer. Her er β = 90, noe som gjør at man i praksis må la α være ca 45. Det gunstigste er å ha liten β. I Zeiss EM10 og i Hitachi EM β = Desto mindre β er desto bedre lateral oppløsning får man under røntgenmikroanalysen. I STEM-mode kan man i praksis foreta element analyse av areal med diameter ned mot 200Å. Nedre deteksjonsgrense er ca gram. Montert på elektronmikroskopet, lokalisert 10mm fra prøven sitter en energidispersiv røntgen detektor. Denne er laget av et halvleder materiale og avgir elektroniske pulser med pulshøyde proporsjonal med fotonets energi. Ved hjelp av en mangekanalanalysator fremstilles røntgenspekteret på en dataskjerm. Et slikt spekter er en grafisk fremstilling av energifordelingen i det totale røntgensignalet fra prøven (både av karakteristisk og bremsestråling). Karakteristisk røntgen gir topper i spekteret, og ved å avlese energien for disse, kan en raskt bestemme hvilke grunnstoffer som var tilstede i det området av prøven som ble undersøkt. I STEM modus kan elektronstrålen styres slik at bare et utvalgt område (ned til 0.1 µm 2 ) av prøven bestråles. Dermed kan grunnstoffsammensetningen i feks de enkelte organellene inne i en celle bestemmes. Det er også mulig å gjøre konsentrasjonsbestemmelser i de ulike vevs- og cellekomponentene. Når elektronene bremses ned ved passering av atomkjærner, genereres kontinuerelig røntgen, dvs røntgen som består av alle energiene fra null og opp til energien til elektronstrålen. Det detekterte røntgenspekteret består således et kontinuerelig signal overlagret topper. Røntgentoppenes høyde er proporsjonalt med antall mol av grunnstoffet i det analysertevolum av prøven, mens den totale mengden kontinuerelig røntgen er proporsjonalt med den totale masse i dette volumet. Forholdet mellom disse to størrelsene er derfor et uttrykk for grunnstoffkonsentrasjonen. Kvantitativ analyse krever imidlertid nøyaktig korreksjon av uønsket røntgen fra preparatet støttefilm, gridden og griddholderen. Preparater for kvantitativ analyse kan sjelden fremstilles på vanlig måte, dvs ved hjelp av kjemisk fiksering og innstøypning i plast, fordi alle salter og organiske substanser i stor grad vaskes ut. Best resultat får en ved bruk av fryseteknologi: Ved frysefiksering, skjæring av vevssnitt ved 120 C og frysetørring kan en lage prøver hvor utvasking og redistribusjon av de enkelte vevs- og celle bestandeler er sterkt redusert og den naturlige grunnstofffordelingen i vevs- og celle komponenter kan studeres. Mikroanalyse på biologiske tynnsnitt er ingen følsom metode, og minste detekterbare konsentrajoern ligger i området ppm (parts per million). Metodens store styrke ligger i at teknikken korrelerer konsentrasjonertil bildet av prøven.

12 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 12 I moderne instrumenter kan datamaskinen styre elektronstrålen fra pixel til pixel på prøven, og hele tiden registrere røntgenspekteret fra hvert punkt (typisk 1-10 sekund p. punkt). Deretter kan datamaskinen lage et grunnstoffkart, hvor intensiteten i hvert punkt i dette bildet er beregnet enten ut fra intesiteten til røntgenlinja for grunnstoffet, ev. også ut fra konsentrasjonen av grunnstoffet i dette punktet. Preparering av biologiske prøver Generelle krav Først og fremst må prøven være tilstrekkelig mekanisk stabil til at den kan plasseres i vakuumet til elektronmikroskopet uten at det medfører strukturelle endringer i prøven. I praksis er den viktigste faktoren her at den biologiske prøven ikke må inneholde fuktighet. Hvis det er tilfelle vil nemlig vannet raskt gå over til gass og ekspandere kraftig etterhvert som trykket rundt prøven reduseres. Dette medfører at prøven "sprenges", og resulterer i uakseptable artefakter og alle finere detaljer ødelegges. Dessuten må prøven motstå strålebelastning fra selve elektronstrålen. Den høye energien til primærelektron (100keV = 0.1 MeV) representerer en stor fare for "stråleskade" av prøven (ved strålebehandling av kreftpasienter benyttes energier som bare er 10 ganger større). Organisk materiale vil i elektronmikroskopet raskt kunne tape over 50 % av massen, og ved høyt doserater vil prøven svært lett gå i stykker. Prøven må også være "farget", dvs.det må være tilført tunge atomer på en slik måte at intensitetsforskjeller oppstår i bildeplanet (TEM/STEM). All Det finns svært mange måter å gjøre dette på. Metodene kan være veldig forskjellige og resultere i bilder med veldig forskjellig utseende. Valg av metode vil avhenge av hvilke typer biologiske prøver en har, og også av hvilke typer detaljer en ønsker å få frem i bildet. Ved publikasjon av bilder fra elektronmikroskopet sies ofte noe grovt om metodepreparering, da dette gjerne er av betydning når en skal tolke bildet. For å øke den mekaniske stabiliteten til biologiske prøver under fikseringen, er det vanlig å innlede prepareringen med fiksering, enten ved standard fiksativ som glutaldehyd eller ved frysefiksering. Kjemisk- eller frysefiksering er aktuelt på ved preparering for SEM og TEM/STEM. Frysefiksering. Ved frysefiksering avkjøles prøven meget raskt ( K/s) ned til -196 C. Dette kan gjøres med flere metoder:1) "plunge-freezing" -- hvor prøven dyppes raskt ned i et kjølemedium som f.eks. kondensert freon på frysepunktet 2) "rod-freezing" -- hvor prøven bringes i øyeblikelig kontakt med en metalblokk som er nedkjølt med flytende nitrogen eller helium 3) "jet freezing" -- hvor en stråle av flytende propan (- ca. 180 C) skytes mot prøven, eller 4) "high pressure freezing" -- hvor prøven fryses med en jet-metode under svært høyt trykk. Den meget store avkjølingshastigheten er nødvendig for at det skal bli så mange iskrystaller og så små krystaller som mulig, og dermed minimum ødeleggeses av finstrukturen i prøven. Best resultat får en ved "vitrifisering". Da er avkjølingshastigheten så høy at vannet "forglasser" uten krystalldannelse overhodet. Et generelt problem ved frysefiksering er at bare små prøver (<1 mm) vil kunne fryses med liten skade som følge av krystallvekst.

13 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 13 "Rod-freezing" og "jet" frysing fins i flere varianter. Kommersielt utstyr er tilgjengelig ( kkr), og kan gi meget bra resultat. "Plunge" freezing er enklere og få til, og kan gjøres med utstyr som allerede finns i et laboratorium, men gir et klart dårligere resultat. "High pressure" freezing krever kostbart utstyr (>1.5 mil. kr) og utføres bare få steder. "High pressure freezing": Figuren til høyre viser trykk og temperaturforløp inne i en prøve ved "high pressure. En jetstråle av flytende nitrogen skyter mot prøven og bygger opp trykket, mens temperaturen synker. Når trykket er 2000 bar begynner prøven å fryse. Ved denne frysemetoden er det letter å "forglasse" vannet, ev. oppnå veldig små iskrystaller, i hele prøver på opp til 2-3 mm. Preparering for SEM. Her er det to hovedmetoder. 1) kjemisk fiskering i kombinasjon med kritisk punkttørring. 2) frysefikering (omtalt foran) etterfulgt frysetørring. før videre preparering for studium i SEM-mode. Dehydrerte biologiske prøver er oftest svært dårlige elektriske ledere. Dette fører til at prøven lett blir elektrostatisk oppladet som følge av primærelektronstrålen. Da sekundærelektron emisjonen påvirkes sterkt av lokale elektriske felt på prøve overflaten, vil dette lett føre til dramatiske og uønskede endringer i SEM-bildet av prøven. Det er vanlig å forsøke å motvirke den elektrostatiske oppladningen av prøven ved å legge et tynt elektrisk sjikt på prøven. Frysetørring Det viser seg at fjerning av vann fra biologiske prøver ved vanlig lufttørking er helt uakseptabelt i de aller fleste tilfeller. Problemet er at når væskefronten under tørking trekker seg tilbake gjennom prøven fører de sterke overflate spenningene til at prøvens struktur lett endres sterkt selv om prøven på forhånd er fiksert. En måte å omgå problemet på er ved først å fryse prøven og deretter la isen sublimere. Vanndampen vil under disse forholdene ikke ha større problem med å diffundere gjennom de alt tørkede delene av prøven etter hvert som isoverflaten trekker seg tilbake innover i prøven. Sublimeringsbetingelsene er i prinsippet de samme som ved fryse-etsing. Sublimeringshastigheten for et gitt trykk over prøven reguleres ved å variere prøvetemperaturen. Et godt resultat forutsetter at prøven ble hurtigfryst og inneholder svært små iskrystaller. Metoden brukes også ved tørring av tynne frysesnitt for TEM. Kritisk punkt tørking Kritisk punkt tørking er en annen og enklere metode å tørre prøven på enn frysefiksering/tørring. Denne metoden innbefatter bruk av den egenskap at over en viss kritisk temperatur vil det spesifikke volumet til et stoff øke kontinuerelig og uten at man på noe tidspunkt har tilstede væske og gassfase som separate faser etter hvert som en reduserer trykket i systemet.

14 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 14 Trykk 1 atm Fastfase Væskefase Gassfase Kritisk punkt Romtemperatur Temperatur Fig. 12 Prinsipp for kritisk-punkt tørking av biologiske prøver for EM Prosedyre for kritisk punkt tørking av biologiske prøver: 1. Fiksering av prøven med osmiumteroksyd eller glutaraldehyd 2. Vask i destillert H 2 O for fjerning av fikseringsmiddel 3. Dehydrering \% etanol erstattes med 100% aceton eller amylacetat 5. Plassering av prøven i aceton (amylacetat) inne i trykk kammeret i kritisk punkt tørkings instrumentet 6. Øk trykket i trykk-kammeret ved å slippe inn CO 2 -gass til ca 50 atm (likevektstrykket for CO 2 gass/væske ved romtemperatur) 7. Fyll opp trykk-kammeret med CO 2 -væske. Dette foregår automatisk pga kondensasjon dersom temperaturen i trykk-kammeret er lavere enn i CO 2 beholderen. 8. Tapp ut en del av CO 2 -væska, men ikke mere enn at prøven hele tiden er under væske overflata 9. Gjenta pkt 7 og 8 til all aceton (amylacetat) er vasket ut 10. Øk temperaturen i trykk-kammeret til ca 40 C (trykket øker samtidig til ca 85 atm) 11. Slipp CO 2 sakte ut av trykk-kammeret. Dersom dette blir gjort for raskt vil en kunne få avkjøling pga ekspansjon av gassen og pga dette rekondensering av CO Ta ut den kritiske punkt tørkede prøven og beskytt den mot fuktighet da den er meget hygroskopisk. Mye brukte væsker ved kritisk punkt tørking: CO 2 Kritisk punkt 31.1 C, 72.9 atm. Freon 13 Kritisk punkt 28.9 C, 38.2 atm Antistatisk film - Termisk pådamping For at pådampingen skal bli så jevn som mulig over hele prøven er det ønskelig å kunne rotere prøven simultant om to akser under pådampingen av den elektrisk ledende filmen. Vanlige elementer for pådamping av antistatisk film for SEM er karbon, platina, gull og gull/palladium. For at den elektriske ledende antistatiske filmen ikke skal maskere detaljene i objektet i for stor grad bør tykkelsen helst ikke være over ca 50 Å. Preparering for TEM. Gridder og bærefilmer Ved studium av biologiske prøver er det i praksis vanlig å plassere disse på nettingformede holdere, eller såkalte gridder (en grid, flere gridder). Vanligvis benyttes gridder med diameter Ø 2.3mm eller Ø 3.0mm og laget av kopper. Ved spesielle anvendelser vil det være aktuelt

15 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 15 med annet materiale enn Cu. Se feks under røntgenmikroanalyse. De nyttes i praksis gridder med en rekke ulike nettingformer. Hvor finmasket en grid er angis i mesh. Mesh-tallet angir hvor mange hull det er i gridden pr tomme (en tomme =25.4mm). Fig. 13 Eksempler på gridder for EM Det finnes også gridder med bokstaver og tall i netting mønsteret for at man lettere skal kunne finne tilbake til samme sted på gridden. Hvor stor del av en grid som er åpen, varierer svært meget fra grid-type til grid-type. Det åpne arealet minsker sterkt med økende mesh-tall, og det vil for de største mesh-tall kunne være nede i 25-30%. For et gitt mesh-tall vil denne prosent andelen kunne variere betydelig fra fabrikant til fabrikant. Det finnes eksempel på at sidekanten i et 400 mesh grid er større enn sidekanten i et tilsvarende 200 mesh standard grid. Grid tallet sier bare noe om hvor mange hull man har pr. tomme og ikke noe om størrelsen på hullene. Det er ønskelig med relativt store åpninger i gridden fra et rent praktisk bruker synspunkt, men man skal også være klar over at desto større hullene i gridden er desto mere utsatt er man for å få lokal elektrostatisk oppladning og lokal oppvarming med deformasjon og forskyvning av prøven. For å kunne bruke relativt store åpninger i gridden er det mye brukt å legge en tynn bære film på gridden før prøven legges på. Ved siden av stor mekanisk styrke bør slike filmer kunne framvise liten eller ingen elektronabsorbsjon og/eller spredning. Dersom bære filmen har periodisk struktur vil man lett ved hjelp av optisk filtrering kunne filtrere bort bidraget fra bærefilmen til det endelige bildet. Det vanligste er å bruke bærefilmer av karbon eller forskjellige plastmaterialer. Karbonfilmer kan feks fremstilles ved å la karbon sublimere ved høy temperatur og deretter la det kondensere på en fersk bruddflate fra glimmer. Dette gir en amorf karbonfilm som ved oppvarming til ca 2800 C i alle fall i prinsippet vil kunne gå over til grafitt. Plast bærefilmer lages ved å løse opp feks polyvinylformal (Formvar) eller nitrocellulose (Collodium) i et organisk løsningsmiddel som har lavere egenvekt enn vann og så slippe en dråpe av denne løsningen (inneholdende 1% plastmateriale) på en støvfri vannoverflate. Dråpen vil flyte utover på vannoverflata samtidig med at løsningsmiddelet fordamper. Dette gir i praksis lett plastfilmer med tykkelse Å Å.

16 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 16 Positiv og negativ farging Ved plassering av et rent faseobjekt på en bærefilm er de to hovedfremgangsmåtene for via fargeteknisk vei å få frem amplitudekontrast: 1. Positiv farging Ved denne farge-metoden tilsettes tungmetallholdige molekyler som ideelt binder seg til spesielle steder på faseobjektet. Overskuddet av farge-molekyler vaskes så bort: Primærelektroner Objekt "Farge"molekyler Før farging 'Støtte' Etter farging Elektron mikrografer Fig. 14. Skjematisk illustrasjon av positiv farging Elektronmikrografer er tegnet lyse hvor mange elektroner treffer billedplanet (filmplanet). 2. Negativ farging. Ved denne farge-metoden tilsettes en tungmetallholdig løsning som man så lar tørke inn på bærefilmen sammen med preparatet Før farging Primærelektroner Objekt 'Støtte' Etter farging (idealisert) "Farge"molekyler Elektron mikrografer Fig. 15. Skjematisk illustrasjon av negativ farging Elektronmikrografene er tegnet lyse hvor mange elektroner treffer filmplanet. Ved positiv farging får man altså ekstra spredning av primærelektronene fra de stedene på objektet hvor farge molekylene er bundet, men man ved negativ farging får lyse områder på den fluorescerende skjermen svarende til områder i projeksjonen av objektet hvor det de negative farge molekylene ikke har klart å feste seg inn.

17 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 17 Det finnes en rekke forskjellige molekyler og salter som nyttes til positiv og negativ farging. her skal bare nevnes noen av de viktigste ( indikerer positiv farging mens Θ indikerer negativ farging): 1. Osmium tetroksyd [OsO 4 ] : Dette er et av de vanligste fiksativene for preparering av biologiske prøver for elektronmikroskopering. Osmiumtetroksyd reagerer og danner kovalente bindinger særlig med umettede lipider og proteiner. 2. Kaliumpermanganat [KmnO 4 ] : Også dette fargemiddelet virker samtidig som fiksativ. Kaliumpermanganat reagerer særlig med umettede lipider og gir god farging av cellemembraner 3. Blynitrat [Pb(NO 3 ) 2 ] : Blyioner Pb 2+ binder seg særlig til fosfat, sulfhydryl og karboksyl grupper, og gir sterk farging av nukleinsyrer (spesielt RNA), proteiner og fett. 4. Uranylacetat [UO 2 (CH 3 COO) 2 2H 2 O] og Θ: Farger særlig DNA og visse ribonukleoproteiner, histoner og fosfoproteiner sterkt ved positiv farging. Mye brukt til negativ farging av virus- og muskelprotein 5. Fosforwolframsyre [H 3 PO 4 12WO 3 24H 2 O ] og Θ: Gir i sur løsning sterk positiv farging av proteiner og polysakkarider. Brukes til negativ farging feks. av bakterievegger, flageller og virus. 6. Vismut [BiO + ] : Gir kraftig farging av fosfater og karbohydrater. Gir eksempelvis god farging av DNA uten samtidig å gi farging av proteiner. 7. Ammoniummolybdat [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O] Θ: Brukt til negativ farging feks av katalysekrystaller. Negativ farging er særlig aktuelt når en skal se på virus partikler eller store molekyler i elektronmikroskopet. Teknikken kan være avgjørende inne virusdiagnostikk. Her ser vi to Orf virus (karakteristisk rillemønster), som smitter til mennesker fra sau og gir store sårdannelser. Flere sauebønder får denne sykdommen i Norge hvert år. Fremstilling av vevssnitt Fremstilling av vevssnitt for elektronmikroskopi er i prinsippet svært lik det som er beskrevet tidligere av vevssnitt for lysmikroskopi. Ved elektronmikroskopi er det nødvendig å kunne fremstille tynnere snitt enn hva man behøver ved lysmikroskopi. Da det å skulle bruke tynnere snitt setter større mekaniske krav til innsprøytningsmaterialet, er forskjellige to-komponent plaster (epoxider og metacrylat) så å si enerådende når det gjelder innsprøytningsmedier for elektronmikroskopi. Snittingen av det innstøpte vevet foretas med hjelp av spesielle mikrotomer med glass eller diamantkniv. I praksis er det ønskelig med snitt-tykkelser på ned mot Å. Hvor tykt et gitt snitt er kan bedømmes ved å se på dets interferens farge når snittet flyter på vann: Farge Snitt-tykkelse Å Mørke grå 400 Grå Sølv Gull Purpur 900 Blå,grønn, gul > 900

18 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 18 Vanlige fiksativer: Osmiumtetraoxid, glutaraldehyd og kaliumpermanganat. Vanlige innstøpningsmedier: Araldite, Epoxy, Methacrylat, Vestopal (Vestopal er et polyester) Vanlige fargereagenser: De fleste positive fargereagenser gitt i forrige avsnitt. Fryseultramikrotomi brukes i spesielle tilfeller. Etter hurtig frysefikering skjæres tynne snitt ved -100 C, som enten frysetørres før mikroskopi eller de kan også mikroskoperes direkte i frossen tilstand ved bruk av spesiell cryoprøveholder. Fryseteknologien er særlig aktuell ved røntgenmikroanalyse og ved immunmerking av antigen i vevsnittet. Skyggelegging Skyggelegging var den første prepareringsmetoden for biologiske prøver som med hell ble brukt for elektronmikroskopi. For blant annet å få god amplitudekontrast brukes tungmetall atomer til skyggelegging. Skyggeleggingsprosessen vist skjematisk i Fig. 16. Tungmetallatomer "VACUUM" Skygge En viktig forutsetning for at tungmetallatomer skal gå langs rettlinjede baner er at gasstrykket i rommet mellom kilden for tungmetallatomene og prøven er tilstrekkelig lavt. Ved et gasstrykk p 10-5 torr vil den midlere fri veglengden til tungatomene være vesentlig større enn den typiske avstanden mellom objektet og tungmetallatomkilden, som normalt er 5-20 cm. Av dette følger at skyggelegging av biologiske prøver må foregå i etter måten høgt vakuum (p 10-5 torr). Til bruk i samband med skyggelegging består tungmetallatom kilden ganske enkelt av en bit av vedkommende tungmetall som er varmet opp til dennes smeltepunkt. Man får da en kraftig sublimering/fordamping av tungmetall atomer fra biten. Da tungmetallatomene går langs rettlinjede baner, vil deler av prøven som stikker opp fra de omliggende deler av prøven, gi opphav til skarpe skygger. I skyggene får man ingen akkumulering av tungmetall og i et transmisjonselektronmikroskop vil bildet av filmen på fluorescensskjermen fremvise lyse felter i de områdene som svarer til skyggene på den skyggelagte prøven. Når det gjelder oppvarmingen av materialet som brukes til skyggelegging, skiller man mellom to hovedmåter: 1. Motstandsoppvarming: Dette er en metode som var svært utbredt tidligere, men som på grunn av relativt dårlig reproduserbarhet er i ferd med å gå stadig mere ut av bruk. En pådampningsenhet for tungmetall som gjør bruk av motstandsoppvarming, består i all enkelhet slik som vist i Fig. 17. Ved å sende i størrelsesorden 50A gjennom karbonelektrodene får man en meget kraftig lokalisert oppvarming i innsnevringen ved Tungmatellfilm Objekt Fig. 16. Skjematisk illustrasjon av skyggeleggingsprosessen Ø 5 mm Karbon Karbon Spiral av tungmetall (tråd Ø 0.3 mm) Fig. 17. Motstandsoppvarming for tungmetallpådamping

19 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 19 overgangen mellom de to elektrodene. Problemet er at temperaturen ved overgangen mellom de to elektrodene har lett for å være heller ustabil foruten at dersom skyggeleggingen mislykkes må man slippe luft inn på vakuumkammeret og starte helt forfra igjen. 2. Elektronstrømoppvarming: En pådampningsenhet for tungmetall som gjør bruk av elekronstrømoppvarming, er i prinsippet bygd opp slik Spenningsforsyning Filament glødespenning Anode Hjelpeelektrode Karbonstav Tungmetall Wolframfilament Apertur Avbøyningsplater Detalj av tungmetallinnsats i C-stav Tungmetallatomer Fig. 18. Prinsipp for elektronsrømoppvarming ved tungmetallpådamping Spenningen mellom filamentet og anoden er typisk ca 2000V. Gløding av wolframfilamentet fører til at man får en strøm av elektroner fra filamentet mot anoden. Elektronenes kinetiske energi går over til termisk energi i anoden når elektronene når denne. Dette resulterer i en meget lokalisert oppvarming ytterst på anoden. Avbøyningsplatene er for å bøye av eventuelle ladede partikler som måtte komme ut fra anoden slik at de ladede partiklene ikke når prøven. Dette pådampningssystemet gir en relativt stabil og lett regulerbar strøm av tungatomer mot prøven, samtidig med at skyggeleggingen kan startes opp igjen flere ganger uten at man behøver å åpne vakuumkammeret i mellomtida. Tykkelsen av tungmetallfilmen som til en hver tid er dampet på prøven bestemmes i praksis best ved hjelp av en såkalt kvartskrystall tynnfilm monitor: Tungmetallatomer Kvartskrystall oscillator krets Frekvens Prøve Kvartskrystall Fig. 19. Kvartskrystall tynnfilm monitor Den består ganske enkelt av en kvartskrystall plassert like ved prøven og som inngår i en oscillator krets. Egen frekvensen til krystallen reduseres etter hvert som tungmetall filmen øker krystallens vekt. Etter kalibrering kan man enkelte følge med i oppbyggingen av tungmetallfilmene ved å følge med i endringen i frekvensen f. På denne måten er det teknisk

20 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 20 relativt enkelt å stoppe tungmetall pådampinga når tungmetall film trykkelsen på prøven har nådd en forutbestemt tykkelse på f.eks 15 Å. Den lokale oppløsningen ved tungmetall pådampning er bestemt av flere faktorer. For det første vil man ikke kunne vente en lateral oppløsning som er bedre enn tykkelsen til den pådampede tungmetall filmen. En 10 Å tykk Pt-film gir tilstrekkelig amplitudekontrast for standard lysfelt TEM. Det mulige for en slik 10 Å Pt film er en lateral oppløsning på Å. årsaken til dette er at tungmetall tynnfilmer med tykkelse Å ikke er homogene selv om underlaget er halt plant. Dette har i sin tur sammenheng med at i det tungmetallene treffer prøven har de en betydelig kinetisk energi (termisk energi) og på grunn av dette har tungmetall atomene en betydelig mobilitet på selve prøveoverflata. Tungmetallatomene kommer enten til ro ved at de bindes til visse punkter på prøveoverflata med særlig sterk vekselvirkning med tungmetallatomene eller ved at tungmetallatomene bindes til andre tungatomer eller klynger av slike. Selv ved tungmetall pådampning på helt plant underlag vil derfor tungmetall filmene virke kornete, og det er denne kornigheten som i praksis oftest setter den nedre grensen for den laterale oppløsningen til en tungmetall film. Desto kaldere prøven er desto mindre er tungatomenes mobilitet på prøveoverflata, og desto mindre blir kornene i tungmetall filmen. Desto høyere smeltepunktet til tungmetallet desto sterkere er vekselvirkningen mellom atomene og desto kortere tid vil det gå før innkommende atomer kommer til ro på prøveoverflata. Hovedregelen er derfor at desto høyere smeltepunkt et tungmetall har desto finere er kornigheten i tungmetallfilmen. Et annet fenomen i forbindelse med tungmetall skyggelegging som kan gi feiltolkning, dersom man ikke er oppmerksom på det, er hva som refereres til som dekorasjonseffekt. Dette er en effekt som fremkommer dersom det er lokale forskjeller i bindingsenergien mellom tungmetallatomene og prøveoverflata. Pga overflate mobiliteten til tungmetallatomene vil disse tendere til å konsentreres i områdene med størst bindingsenergi. Den amplitudekontrasten som fremkommer som resultat av dette har imidlertid ingen ting med skyggelegging som sådan å gjøre. Da den mekaniske styrken til f.eks Å tykke tungmetallfilmer er meget liten, er det vanlig å dampe på en støttefilm av karbon på tungmetallfilmen. Dette gjøres i praksis ved hjelp av en pådampningsenhet hvor anoden består av bare karbon. Tykkelsen på karbon støtte filmen er typisk Å. Tungmetall tynnfilmen plus karbon støttefilm refereres vanligvis til som et replika. Fryse-etsing (frysefraktur). Dette er en preparativ teknikk som gjør bruk av frysefikering (se foran)som første trinn i prepareringen. Deretter plasseres den nedfrosne prøven på en prøveholder ved ca 150 C inne i et kammer som kan pumpes ned til et trykk på torr eller bedre. Denne frosne prøven kuttes så av til man får en høvelig stor bruddflate. Av bruddflata lages til slutt et tungmetall replika med karbonstøtte film som beskervet i forrige avsnitt. Dette replikaet løsnes fra prøven ved å ta prøven ut av vakuumkammeret, la den varmes opp til romtemperatur og deretter ganske enkelt dykke den smeltete prøven forsiktig ned i vann slik at replikaet blir flytende oppe på vannoverflaten. Etter fjerning av eventuelle rester av preparatet på replikaet ved bruk av kjemiske midler er replikaet klart for undersøkelse i et vanlig transmisjons elektronmikroskop.

21 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 21 Pådampingsenhet for karbon Pådampingsenhet for tungmetall Termostat regulert prøvebord (-150 C C) Frosset prøve Termostat regulert kniv (-150 C C) Kvartskrystall tynnfilm monitor Fig. 20 Skjematisk illustrasjon av ulike deler i en fryse-etsemaskin Transmisjone elektronmikroskop bilder av fryseetsereplika. Slike bilder er karakteristsike ved at skyggeleggingen gjør at bruddflaten fremstår med 3D effekt. Det første bilde er fra det intracellulære området i en gjærcelle (A: bruddet har gått rett igjennom et mitokondrion. B: avtrykk av en organelle). I bildet helt til høyre er går bruddet igjennom flere røde blodceller.i begge bildene er prøven fryst ved "plunge" freezing. I det første bildet ser vi ingen tegn til iskrystallvekt fordi frysebeskyttelse ble benyttet. I det neste bildet er fullblod fryst direkte uten og frysebeskytelse, og inni blocellene ser vi tydelig hvordan iskrystaller er dannet. Et meget viktig punkt ved preparering av prøver for fryse-etsing er å sikre seg at man under nedfrysning av prøven ikke får dannet store iskrystaller i denne. Iskrystaller vil nemlig tendere til å skyve annet materiale i prøven foran seg etterhvert som de vokser. Dersom man har store iskrystaller i prøven vil man derfor kunne få uakseptable forskyvninger av feks makromolekyler og mindre celleorganeller. Man kan også risikere at organeller regelrett sprenges. Disse uønskede hendelsene refereres til som fryseartefakter. Det er i praksis to veier å gå for å minimalisere fryseartefaktene. De ene er å sette til kjemiske substanser til prøven som gjør at man lettere får iskrystall kimer. Desto flere iskrystall kimer desto mindre blir i middel iskrystallene i og med at den midlere største dimensjon til iskrystallkimene vil tilnærmet være lik midlere største dimensjon til iskrystallene. For å sikre at den kjemiske tilsetningssubstansen ikke påvirker den strukturen man ønsker å studere, er det tilrådelig å fiksere den på vanlig måte med feks glutaraldehyd før tilsetning av substansen som skal gi økt iskrystallkimdannelse. I engelskspråklig litteratur refereres slike substanser til som cryo-protectives. Mye brukte substanser er glycerol, sukrose og dimethylsulfoksyd (DMSO). Den andre veien å gå for å minimalisere iskrystall størrelsen er å øke nedkjølingshastigheten under frysingen av prøven. I og med at man ikke har noen mulighet til å endre prøvens termiske parametre så som varmekapasitet,

22 NTNU, Inst. for fysikk EMNE SIF4070 Cellebiologi V2001 Labøving 6 Elektronmikroskopi 22 varmeledning og smeltevarme er de eneste parametrene av betydning for iskrystall størrelsen som kan manipuleres 1. Prøvens geometri 2. Prøvens temperatur før nedfrysning tar til 3. Prøvens overflate temperatur under frysningen 4. Trykket I praksis har punkt 2 og 4 liten interesse i og med at det vanlige er å foreta nedfrysning med prøven ved romtemperatur og trykk 1 atm, og det er lite å vinne ved å redusere prøvetemperaturen eller å øke trykket. Når det gjelder prøvens geometri er hovedpoenget at den raskeste nedfrysingen og dermed de minste iskrystallene finner man i de ytterste µm tykke laget av prøven. Det er derfor gunstig å bruke så små prøver som mulig. Når det gjelder prøvens overflatetemperatur er hovedpoenget at denne så instantant som mulig bringes så lavt som mulig og holdes der inntil prøven er helt nedfrosset. For å oppnå dette har en rekke forskjellige og mer eller mindre eksotiske metoder vært forsøkt, men det som i praksis viser seg å være både det enkleste, best reproduserbare og det som gir den raskeste prøvenedkjølingen og dermed de minste iskrystallene, er følgende: Kopper 'hatter' Tykkelse: µm Propan (-190 C) Propan (-190 C) Prøve Propanstrålene skytes simultant mot de to kopperfoliene under et trykk på 3-10 kp/cm 2. Frakturen (oppbrytingen) av prøven foregår ved at de to kopperfoliene mekanisk skilles fra hverandre. Det mest utbredte til nå har likevel vært og er fortsatt dypping av prøven i delvis frosset Arcton-22 (difluor-dikloroetan) selv om det gir svært mye dårligere frysing enn ved oppsettet skissert over. Metningstrykket til is er sterkt avhengig av temperaturen. Ved 100 C er metningstrykket ca torr. Dette innebærer at dersom trykket i vakuumkammeret feks er torr og prøvetemperaturen er 100 C, vil isen i prøven sublimere, og isoverflatene i prøven vil senkes med ca Å pr minutt. Ikkesublimerbare deler i prøven som feks makromolekyler og celleorganeller som før sublimeringen var helt omgitt av is, vil som følge av dette kunne bli helt blottlagt. På engelsk refereres dette oftest til som etching, og det er dette som har gitt denne prepareringsmetoden navnet fryse-etsing. Metoden refereres også til som fryse-fraktur.