Vannringens Seminar, 4.4.2014, Molde HPLC Rudolf Schmid

HPLC Litt om Hva, Hvordan Rudolf Schmid, Institutt for kjemi NTNU, Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Vannringens Seminar, 4.4.2014, Molde HPLC Rudolf Schmid på Norsk (bokmål) de facto: ca. Høytoppløsende (instrumentell) kolonne væskekromatografi High Pressure Liquid Chromatography (historisk) High Performance Liquid Chromatography (korrekt i dag) High Price Liquid Chromatography (av og til korrekt også) 2 1

Definisjon : IUPAC (1993) : "Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction. " International Union of Pure and Applied Chemistry, Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure & Appl. Chem. 65, 819 (1993) " Kromatografi er en fysikalsk separasjonsmetode der komponentene som skal separeres fordeles mellom to faser, hvorav den ene er stillestående (den stasjonære fasen) mens den andre forflytter seg i en bestemt retning (den mobile fasen). " (Uautorisert norsk oversettelse v. Rudolf Schmid, 2008) 3 Kromatografi: barn av det 20. århundre Omkring 1905: Teknikk og navn introdusert ved Michail Semenovitsj Tsvett (1872-1919, russisk botanikker). Tswett systematisk brukte adsorpsjons-kolonne-kromatografi til analyse/karakterisering av plantepigment-ekstrakter. Registrerte mønstre av fargede bånd "fargeskriving/ -tegning" kromatografi. 4 2

Chromatography = Kromatografi Illustrasjon: Eluerings kromatografi, vist på en kromatografikolonne: "Bremsvirkningen" av den stasjonære fasen på prøve-komponentenes (analyttenes) framdrift kalles: Retensjon (eller retardering) Kromatografikolonne: (pakket type) porøse partikler pakket i et rør, gjennomstrømmet av en "mobil fase" - (væske, gass, s.f. ) Utviklingen av et kromatogram (generelt) og framdriften av analyttene (prøvekomponentene) takket være den mobile fasens forflytting (spesielt) kalles : Eluering Deteksjonspunkt "Kromatogram" av denne separasjonen/ analysen A.D.C. Skoog & al. : Fundam. of. Analyt. Chem., 8 th ed. (2004) : P. 922 - Ch. 30.E. 5 Chromatography = Kromatografi Kromatografi er en samlebetegnelse på teknikker for separering av stoffer Klassifisering av kromatografi-teknikker. Etter fasenes natur Stasjonær fase (SF) Mobil fase (MF) Forkortelse (fra eng.) Navn gass GSC adsorpsjons-gasskromatografi, gass-faststoff-kromatografi fast stoff væske LSC adsorpsjons- (væske-) kromatografi _ superkritisk fluid SFC Superkritisk fluid kromatografi væske LLC væskæ-væske-kromatografi væske gass GLC (GC) Gass- (væske-) kromatografi 6 3

Chromatography = Kromatografi Kromatografi er en samlebetegnelse på teknikker for separering av stoffer Klassifisering av kromatografi-teknikker Etter separasjonsprinsipp Metode Adsorpsjons kromatografi Fordelings kromatografi Ionebytter kromatografi Eksklusjons kromatografi (Bio )affinitets kromatografi Natur av hovedprosessen Adsorpsjon Fordeling ("ekstraksjon") Elektrostatisk tiltrekning, kompleksering (Hindret) diffusjon (Bio )spesifikke vekselvirkninger mellom prøve og "selektiv ligand" 7 Chromatography = Kromatografi Enda litt mer klassifisering... bl.a. etter utformingen av systemet : kolonnekromatografi (søylekromatografi) NB.: Ikke HP-, men LP-LC planar kromatografi (tynnsjikt-, papirkromatografi) Bilder fra "Google pictures" 8 4

Chromatography = Kromatografi Enda litt mer klassifisering... bl.a. etter fasenes polaritet : - "normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar jfr. Tsvett mobil fase (MF) = upolar "separerer etter polaritet" - "omvendt fase"-kromatografi: stasjonær fase (SF) = upolar mobil fase (MF) = polar "separerer etter hydrofobisitet" Repetisjon: Eluering = "Lagingen" / "utviklingen" av et kromatogram (generelt) og framdriften av prøvekomponentene på grunn av mobil-fasens forflytting (spesielt). Retensjon (eller retardering) = "Bremsvirkningen" av stasjonærfasen på prøvekomponentenes framdrift. 9 Den mobile fasen er en væske!! de fleste separasjonsmekanismer er i bruk, der prøve-komponenter separeres v.h.a. Adsorpsjon (Adsorption, LSC), Fordeling (Partition, LLC), Ionebytting (Ion-exchange, IEC), Eksklusjon (Size exclusion, SEC), de viktigste, pluss litt til Valget bestemmes av prøven - separasjonsproblemet: 10 5

Adsorpsjon (Adsorption) og fordeling (Partition), finnes - med Normal fase (Normal phase = NP ) og - med Omvendt fase (Reverse(d) phase = RP ) Kontakten med stasjonærfasen (= SF) er ved. Fordeling, gjennom ABsorpsjon Ved adsorpsjon gjennom ADsorpsjon Fra: James M. Miller "Chromatography, Concepts & Contrasts", Wiley (2005 ) 11 Et konstruert (?) eksempel Takker Youtube.com, og Phenomenex (video clip produsent) http://www.youtube.com/watch?v=mpo7tv2miju Hoste- og forkjølelsesmedisin analysert ved HPLC: 1. chlorpheniramine maleate (antihistamin) 2. aspirin (smertedempende) 3. dextromethorphan HBR (hostedempende) 12 6

Grunnleggende : 2 hovedfaktorer for vellykket separasjon: (Forskjell i) vandrings-lengde/-hastighet /-tid av analyttene: (forskjell i) retensjon Hvor samlet (eller hvor spredd) analytten er etter separasjonen: sonespredning Sammen beskriver de "oppløsningsevnen" for separasjonen av to topper. 13 Kolonne-kromatogram Separasjon alene (viser kun retensjon, antyder "separasjonspotensialet") Separasjon med sonespredning (viser faktisk mulig oppløsning / separasjon) Typisk for reelle topper (med sonespredning): Bredden øker med økende retensjonstid (ved konstante analysebetingelser) 14 7

(Forskjell i) vandrings-lengde / hastighet /-tid av analytter: retensjon - utrykkes som : retensjonstid t R, som retensjonsvolum V R, eller som retensjonsfaktor k (analytt-eluering uavh. av hastighet & dim.; målt i forh.t. MF-"eluering") Hvor samlet (eller hvor spredd) analytter er etter separasjonen: sonespredning - måler spredning (som toppbredde) i forhold til retensjonen Som 'platehøyde', H (= prop. (bredde/ret.-tid) 2, eller Som 'platetall', N (= prop. (ret.-tid/bredde) 2 ) Samlet beskriver de "oppløsningsevnen" i en separasjon, R S (eng.: Resolution): numerisk: R S = t R / ½(w b,a + w b,b ) = toppavstand delt med toppbredde (gjennomsnitt) i eksempelet over: R S = ca. 2 N.B.: ang. R S og platetall: 15 For god oppløsning kan vi : Øke separasjonen for analyttene - mest mulig ulike t R, V R, k Tiltak: endring av analyttenes fordeling mellom MF og SF ("kjemiske endringer" (mest)) Reduseres sonespredningen (høyest mulig N, lavest mulig H) Tiltak: endring av stoffspredningen under elueringen (fysiske parametere i kolonnen (mest)) For øvrig: Oppløsningen R S øker med N ½, d.v.s. det trengs 4 x større N for å doble R S. 2 topper "basislinje-separert" (ved R S = 1,5 ) 16 8

Krav om god oppløsning viktigere når : Topper har ulik størrelse Vanskelig identifisere og (særlig kvantifisere den minste av toppene Topper er asymmetriske haledannelse - "tailing" el. "fronting" Haledannelse, 'tailing' 'Fronting' 17 Sonespredning (og asymmetri) er alltid uønsket Smalere topper gir større sikkerhet ved identifisering, Enklere, sikrere kvantifisering mindre fare for topp-overlapp Å bekjempe spredning koster innsats: kunnskap og 'cash' 18 9

High Performance / High Pressure LC Viktigste parametere som har effekt på sonespredning: Diameter av SF-partiklene: mindre spredning med mindre partikler. Mobilfase-hastighet (lineær hastighet), u avhengighet jfr. van Deemter kurver (rød) Diffusjonskonstanten, D, av analytten i MF og i SF : 2 sprikende effekter, hhv. ved høy og ved lav hastighet. (ofte lite å gjøre med D) 19 Ad: Viktigste parametere som bidrar / har effekt på sonespredning: Diameter av SF-partiklene: mindre spredning med mindre partikler Begrensing: små partikler gir stor motstand mot gjennomstrømning av MF (økende med 1/d 2 p ) 'High Performance' partikler (små partikler) kan bare brukes ved 'High Pressure', for å kunne oppnå akseptabel retensjonstid / mobilfasehastighet) Derfor HPLC!!. Balansering mellom 'High Performance' og 'High Pressure', i For HPLC: partikler på 3-5 μm (10 μm "på vei ut") - opptil ca. 350 bar kolonneinngangstrykk. For UHPLC (Ultra HPLC) : partikler på 1,5 2,5 μm - UHPLC: > 1000 bar inngangstrykk, teknisk/praktisk noe mer krevende. Diameter av SF-partiklene: Enda en fordel : Mindre partikler tillater høyere elueringshastigheter Etter: Lundanes & al., "Chromatography, " Wiley VCH, 2014. 20 10

Parametere som bidrar / har effekt på sonespredning: Diameter av SF-partiklene: Enda en fordel med mindre partikler Mindre partikler tillater høyere elueringshastigheter/kortere analysetider: Kolonne- lengde [mm] Partikkeldiameter [μm] 5 (HPLC) 250 3,5 (HPLC) 100 1,8 (UHPLC) 30 1,8 (UHPLC, rask) 30 "Fast, Faster, Ultrafast; Optimization ", Agilent Techn., LC-GC; Feb.2005 21 Det allermeste er instrumentstyrt, "Manuelt system" Fra Google.com HPLC pictures 22 11

Det allermeste er instrumentstyrt, manuell aktivitet er uønsket (!) maskinene leverer mer nøyaktig og mer reproduserbar. Fordel (krav) for sertifisering og GLP (?) Variasjonen i teknikken / anvendelsen : Er bestemt av valg av stasjonærfase - seprarasjonsprinsippet - kolonnen De mest-brukte separasjonsprinsipp: Kjemisk bundne omvendt-fase-kolonner Ionebytterkromatografi for biomolekyl-separasjoner, og for ionanalyse (ionekromatografi) Ekslusjonskromatografi for syntetiske og bio-polymerer (delvis mitt subjektive inntrykk, muligens ikke helt korrekt) "Manuelt system" Fra Google.com HPLC pictures 23 Det meste er instrumentstyrt, manuell aktivitet er uønsket (!) maskinene leverer mer nøyaktig og mer reproduserbar. Oversikt over instrumentering "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Her vises skjematisk : Høytrykks-blandende to-løsningsmiddel-system, programmerbar for å endre MF-sammensetning underveis (gradient-analyse) 24 12

Instrumentering: "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Løsningsmiddel: Valget sterkt avhengig av separasjonsproblemet: prøve & kolonne Generelle ønskede egenskaper: Rene: partikkelfrie, ikke forstyrrende i detektoren Lav viskositet Miljø- og HMS-messig akseptable Kjemisk inert under analysebetingelsene Fri for gass (luft) Nøyaktig blandet, hvis MF er en blanding. Riktig pris Evt. temperert Skal levere separasjon med passe (ikke for stor retensjon / retensjonstid / retensjonsvolum). Kanskje mest brukt : Vann, acetonitril, metanol, ("omvendt fase løsningsmidler") 25 Instrumentering: Løsningsmiddel: Valget sterkt avhengig av separasjonsproblemet: prøve & kolonne Skal gi separasjon med passe (ikke for stor retensjon / retensjonstid / retensjonsvolum). Retensjonen reguleres av mobilfasens / løsningsmiddelets " styrke": Styrke er evnen til å forflytte analytten raskt. Sterke MF gir lav retensjon, korte retensjonstider, Svake MF gir høy retensjon, lange retensjonstider Om en MF er sterk eller svak avhenger av separasjonsmekanismen For "Normal fase" : sterk MF = polar, svak MF = upolar (f.eks. alifater) For "Omvendt fase": sterk MF = lite polar, svak MF = sterkt polar (f.eks. vann) s.o. Kanskje mest brukt : Vann, acetonitril, metanol, ("omvendt fase løsningsmidler") 26 13

Instrumentering: Løsningsmiddel: Valget sterkt avhengig av separasjonsproblemet: prøve & kolonne Driftsmuligheter : Isokratisk : Konstant mobilfase-sammensetning optimal oppløsning - for prøver med noenlunde lik retensjon Gradient-eluering: MF-endres, fra svakt til sterkt for prøver med sprikende retensjon kan analyseres i samme analyse 27 Instrumentering: Pumpe(r ): avhengig av bruken: (konstant MF (=isokratisk analyse), eller varierende MF (gradient analyse) "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Typisk brukt i dag: ("resiprokerende") stempelpumper (rel. lite slagvolum, mye mindre enn retensjonsvolumet) sprøytepumper (stort volum i forhold til retensjonsvolm, brukt for små trange kolonner) Generelle ønskede egenskaper: Tåler de fleste aktuelle mobilfaser (polar, upolar, sur, basisk, salt) Presise, driftssikre, pulserer lite Lett regulerbare / programmerbare Stort reguleringsområde for pumpehastighet og kan pumpe mot høyt trykk Lite dødvolum Riktig pris. Eventuelt med avgasser / fjerner luft fra MF, og mikser (blander blandinger homogent) Konstruksjon i rustfritt stål (evt. titan), teflon, PEEK-plast, bl.a. 28 14

Instrumentering: "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Injektor: (i dag praktisk alltid en ventil-injektor) Doserer prøvemengde i en rørstrekning "off-line (en "loop"), som så svitsjes in i MF-strømmen (som tar med prøven) til kolonna. Loop-volum kan velges tilpasset analysen. "Lading av loop" Injeksjon til kolonna Loopen kan fylles delvis (< 50% av loopen) (volum-kontroll gjennom sprøyta), eller loppen kan fylles/skylles med prøve (> 200%) (fast volum bestemt av loopens interne volum) i automatiske prøvegivere ("Autosamplere"), er ventilinjektoren innebygget. Den ordner prøve-dosering, -injeksjon og analysestart automatisk, også for lange serier. Ventil-svitsjing skjer som regel elektrisk. 29 Instrumentering: Filtrering: Systemet tåler ikke partikler: Filtrering av MF før bruk Filtrering av prøver før injeksjon Inntaksfiltre for MF til pumpen (beskyttelse av pumpa), Ofte in-line filtre mellom injektor og kolonna (evt. erstattet med beskyttelseskolonne). "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Partikler av kritisk størrelse kan akkumuleres på kolonna, evt. delvis trenge inn i kolonnepakningen og plugge den igjen over tid (trykkøkning) Termostatering ("kolonneovn"): I dag ganske vanlig: temperaturkontroll for HPLC-kolonna (f.eks. v. Peltier-elementer). Mest normalt med noe økt temperatur : Reduserer viskositeten av MF mindre mottrykk Kan for noen analytter øke løseligheten i MF Kan forbedre analysen: reduserer retensjonen (retensjonsfaktoren minker med økende temp.) Kan forbedre analysen: endret relativ retensjon for analytter ved endret temp. 30 15

Instrumentering: Detektor: Skal detektere analyttene : Finnes som selektive og som generelle/universelle. Finnes i variert følsomhet (i dag typisk uttrykt v.hj.av deteksjongrense) Finnes som robuste og mer delikate (f.eks. ikke kompatible med gradient) Finnes som relativt enkle billige, og som avanserte kostbare (f.eks. MS-detektor) Mest vanlig brukt detektorermed noe selektivitet: Mest brukt / kjent: UV-detektoren: detekterer bare UV-absorberende stoffer. "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Andre vanlige HPLC-detektorer: o Brytningsindeks-detektor o Elektrokjemisk e detektorer o Ledningsevne-det. o Fluorescens-det. o Fordampings-lysspredn.-det. o M.fl. univ. selekt. selekt. selekt. univ. UV/Vis.-"Photo Diode Array"-detektor for HPLC: Detekterer ved flere λ samtidig, svitjser λ veldig fort, tar opp hele UV-spektrum kontinuerlig. 31 Instrumentering: "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Detektor: Mer avansert: spektroskopiske detektorer - her spesielt massespektrometri Gir tilleggs-identifikasjon for kromatografiske topper: karakterisering ved MS-data i tillegg. MS er mye brukt som detektor i dag fordi den er ofte er både selektiv, gir identifikasjonshjelp fra MS data OG har høy følsomhet. MS kan være ganske/veldig selektiv : vurdering av selektive masser(-områder) eller fragmenterings-reaksjoner (masse-overganger, v. MS/MS) Alternativt: MS kan skanne bred og registrere total-ionestrøm (som er relativ universell deteksjon). Mest vanlig MS-ioniseringsmetode for ESI (elektrospray-ionisering). Mest brukte masseanalysatorer for LC/MS: enkel-kvadrupol (lineær el. ionefelle), trippel-kvadrupol MS/MS, Time-Of-Flight. 32 16

Instrumentering: "Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004 Dataanalyse / systemkontroll: Rel. avansert programvare kontrollerer instrumentet (ønskelig for større nøyaktighet og pålitelighet) og samler inn, lagrer og analyserer data (etter digitalisering av kromatogrammet). Mulighet for, langt på vei, automatisk kvantifisering av (rutine-) analyseserier. Viktig med etterkontroll av integrering og kalibreringer m.m. 33 Instrumentering: Kolonnen 34 17

Instrumentering: Kolonnen Ett rør (stål, PEEK) med SF-pakningsmaterialet inn i med end-koblinger med sinterplater ("filter-skiver",holder pakningsmaterialet på plass) og for tilkobling av ledninger. Dimensjoner typisk: Lengde inntil ca. 25-30 cm, men nyere ned til 3-5 cm Diameter klassisk 4,6 mm i.d. (1/4" o.d.), men nyere ned til 3-2,5 mm i.d. Ekstra-tynne: "micro-bore"-kolonner (ca. 1 mm) og kapillærkolonner (< 0,2-0,5 mm) Inneholdet: pakningsmaterial: Kjemisk egenskaper : avhengig av separasjon-mekanisme Fysiske egenskaper: porøse partikler, irregulære eller sfæriske, dia. 3 5 μm (HPLC), 1,5 2,5 μm (UHPLC). Men også: overflateporøse partikler y.d. 3,5-5 μm (kjerne-diam. 2,5 5,3 μm); kompakte partikler 1,8-2,5 μm; Monolitt-kolonner (ikke-partikulært porøst SF-"blokk" som fyller hele røret). (Mikro-)Porestørrelser i partiklene varierer, 40-300 nm (snittverdier). Basismaterialer: uorganiske oksider (mest silikagel), syntetiske polymerer (sterkt kryssbundne, makroporøse). 35 Instrumentering: Kolonnen Spesielle formater: Patron-kolonner (Cartridge columns) Sparer penger og ressurser dyrt kolonne-"innpakkingsmaterial" (spesielt end-koblingene) kan brukes om igjen når pakningsmaterialet blir dårlig (uten å måtte pakke kolonnen om selv). Forkolonner (Guard columns) plasseres mellom injektor (el. in-line -filter) og hovedkolonna: brukes for å beskytte hovedkolonnen (Den Kostbare) : Små korte (1-3 cm) rel. effektive kolonner med lignende eller lik pakningsmaterial som hovedkolonnen, som kobles mellom injektoren og (hoved-) kolonnen. 36 18

Instrumentering: Kolonnen Stasjonærfaser for HPLC: Enormt utvalg p.g.a. mange separasjonsmekanismer Praktisk sett skilles det også ofte mellom "Bonded Phase"- og "non-bonded phase"-materialer, i dag dominer bonded phase (BP) materialer. Hoved-HPLC-kolonnetyper systematisert ved US Pharmacopeia (USP): 60 typer pr. 2009 (men for hver type ofte dusinvis av (lignende) alternativer) USP Designations L1 USP Packing Materials Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic micro-particles, 1.5 to 10 µm in diameter Teknikk (Gjettet v. R.Sch., ) RP-HPLC L3 Porous silica particles, 5 to 10 µm in diameter NP-HPLC L6 Etc. L60 Strong cation-exchange packing: sulfonated fluorocarbon polymer coated on a solid spherical core, 30 to 50 µm diameter IEC (HPLC / MPLC ) 37 Instrumentering: Kolonnen (i) Adsporpsjon: Normalfase (NP-LSC) : Mindre brukt enn RP i dag Silika (silikagel), (sjeldent aluminiumoksid) - LSC Brukes typisk med ganske upolare mobilfaser Retensjon av silikagel varierer med adsorbert fuktighet ("aktivitet") Varierende aktivitet vanskeliggjør reproduserbarhet og bruk av gradienter NB: når silika brukes med vannholdige MF fås trolig fordeling (LLC) ikke adsorpsjon (LSC) Alternativt: polare kjemisk bundne faser brukt m. upolare MF ( NP). cyanopropyl-, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -C N diol-, -(CH 2 ) 3 -O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 OH amino-, -CH 2 -(CH 2 )n-nh 2 (n = 2, 3) Mye lettere resirkulering ved gradient-analyser. 38 19

Instrumentering: Kolonnen I HPLC viktig : Overflatemodifiserte materialer - Faste kjemisk bundne stasjonærfaser " Viktig - basismaterialer: Trenger gode fysiske egenskaper, lett og variert (og stabilt) derivatiserbar. Aller-viktigst i dag : Silikagel (s.n.) HPLC-egnede alternativer: organiske polymerer : spesielt styren/divinylbenzen kopolymerer (PS/DVB) også : polyakrylater også : poyvinylalkoholer 39 Instrumentering: Kolonnen For Omvendt-fase kolonner : Aller-viktigst i dag : Silikagel - kan derivatiseres på silanolgruppene (-OH-gruppene) mest kjent silikagel med oktadekyl-gruppene -n-c 18 H 37 (typiske forkortelser : "RP18", "C18", "ODS" (for OctaDecyl Silica)). Silika O Si(R ) 2 n-c 18 H 37 (R' = vanligvis methyl) Popularitet skyldes : rask ekvilibrering, gradient-dugandes, greit (grov-)regulerbar retensjon, rel. lett forutsigbar retensjon (kan vurderes ut fra analyttens: andel hydrofobisk overflateareal, eller fra dens vannløselighet). lite uønsket kraftige interaksjoner med analytter. Viktig! Silikagel er kjemisk labil i basisk miljø (ph < ca. 5-7) går i oppløsning!! Eluering med basiske MF må unngås hvis mulig. Omvendt-fase-silka finnes som "monomer", oligomer, "polymer", "end-capped" (s.n.). 40 20

Instrumentering: Kolonnen For Omvendt-fase kolonner : SiOH + Cl Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 SiO Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 Monomere faser ("brushes") : Ulike derivatiseringsmåter gir utslag i noe varierende retensjon og noe ulik selektivitet. 41 Instrumentering: Kolonnen Strukturer av SF (på eksempelet "polymer oktadekyl-silika fase") SF-lagets sammensetning, og tykkelse, varierer med type og andel organisk modifikator i den vandige MF, modifikator som løser seg i/assosierer seg med RPligand-fasen, (el. modifikator-molekylen solvatiserer alkyl-kjedene) Teoretisk modellerte (del-)strukturforslag for polymere C18-faser (på silikaoverflate, (nederst i figurene), her med litt atypisk mye orden (p.g.a. høy C18-tetthet) i kontakt med organiske MF-komponenter (i fra MF-blandingen med vann). (Pemberton &al. Anal.Chem.(2003), 75, p.3360ff; strukturene baserte på Molecular Mechanics -regninger) Spørsmål om mekanisme adsorpsjon eller absorpsjon adsorpsjon eller fordeling fortsatt under diskusjon (?!) 42 21

Instrumentering: Kolonnen For kjemisk bundne omvendt-fase kolonner: Retensjon er sterkt avhengig av mengde organiske substituenter RP-ligandens kjedelengde (f.eks. C8, C18, C30) bestemmer også retensjonen, og litt selektiviteten: Retensjonen øker med økende kjedelengde (omtrent inntil kjeden er lengre enn de analytten). Ulik alkylgruppe-tetthet (bl.a. monomer- vs. polymer-faser) skaper selektivitet m.h.t. stereokjemi: (særlig tydelig for polysyskliske aromater. Rest-silanolgruppe-mengde er også medbestemmende for selektiviteten av RP-SF en. Porestørrelsen kan også bestemme om eksklusjonseffekter må vurderes Typisk : 100 Å-porer for normal HPLC ( små molekyler), 300 Å-silikagel for protein-hplc 43 Instrumentering: Kolonnen Retensjonen blant silika-rp-faser kan variere i stort omfang (her C8 og C18-faser): k (for toluen i MeOH-H 2 O 50:50 (åpne firekant-symboler)) 44 22

Instrumentering: Kolonnen For kjemisk bundne omvendt-fase kolonner: Og så finnes mange andre substituentgrupper "bonded" til silikagel : cyano-faser Si-O-(CH 2 ) 3 -CN nitro-faser Si-O -(CH 2 ) n -Ph-NO 2 amino-faser Si-O -(CH 2 ) 3 -NH 2 diol-faser Si-(CH 2 ) 3 -O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 OH "phenyl", "nitro", fluoroakyl, med (mange) flere Varierende polaritet, og selektivitet delvis varierende - avhengig av mobilfasen som brukes 45 Extreme High Resolution LC : UHPLC analysis Reversed phase analysis Sample: "4 preservatives". Sample: "various steroids" ANALYSIS time : 10 sec (net) / at 90 C ANALYSIS time : 45 sec (net) / at 90 C 1,8 ml/min (t 0 = ca. 1,5 s ), gradient analyse (ulike gradienter for (a) og (b)), kolonne 50 mm lang, 2,1 mm i. diameter, 1.7 μm partikler 46 23

Extreme High Resolution LC : Proteomics : E-Coli proteom 41,5 timers hour analysis (gradient)! Identified: 16.000 peptides and 2.200 proteins in one single analysis - by LC/MS, i.e. with some extra help from mass spectrometry for the identification job in addition to the HPLC separation. Using a monolithic porous/packed capillary column for LC : 0,1 mm i. diam., 35 cm long. 47 Multi-dimensional Chromatography In particular "Comprehensive 2-D chromatography" Example: Comprehensive 2 D HPLC of triglycerides (TAC, triacylglycerols) : "1 st dimension" column (x-axis): slow separation (nearly 6 hrs). Separation principle: polar/special interaction (argentation) between silver ions and C-C double bonds (Ag + on a Cation-Exchanger; separates by number of double bonds, unsaturation) "2 nd dimension" column (y-axis): fast separation (every 1.0 min). Separation principle: Reversed phase LC (non-polar SP; separates according to (non-)polarity; for these TAG analytes: approximately. according to molecular weight/no. of methylene groups (homologous series). Fig. 6. Contour plots of corn oil constructed on the basis of the TIC chromatogram. Dots represent peaks detected automatically by the software. (a) Total contour plot. Dots remaining unlabeled correspond to peaks that could not be identified by manual inspection of the MS. Dashed lines refer to the PN, numbers at the bottom to the DB number; (b) expansion of contour plot in (a). First-dimension from 97.5 115 min, second-dimension from 0.84 1.18 min. Lines linking dots indicate peaks that were pooled by the merging algorithm and are considered to originate from the same compound. Numbers after the name of the TAG correspond with the molecular weight of the TAG. Adapted from: Van der Klift & al, Journ. Chromatography A 1178, 43 55 (2008) 48 24