Studie av tidlig mangel av mikronæringsstoff i regnbueørret med neste-generasjons sekvenseringsteknologi Rune Waagbø, Gro-Ingunn Hemre og Pål Olsvik (NIFES)
Mikronæringsstoffmangel - i norsk oppdrett? NRC 2011 mye gammelt på nytt papir Moderne behov Intensiv vekst Ny fôrsammensetning - nye fôrvarer Fordøyelighet biotilgjengelighet Antinæringsstoffer Endrete oppdrettsbetingelser - økte behov? Nytt fokus på næringsstoffbehov hos fisk
Behov for mikronæringsstoff sett med nye øyne Hvert mikronæringsstoff avhenger av en rekke prosesser som igjen er styrt av relaterte gener absorpsjon transport biotransformasjon ekskresjon binding og lagring cellulære mekanismer Eksempel fra vitamin B 12 Hansen et al 2013 mikronæringsstoff relaterte prosesser relaterte gener
Materiale Regnbueørret (28g) gitt plantebaserte dietter (50%) med (fôr S) eller uten (fôr U) tilsetning av en vitamin- og mineralblanding (premiks) i 10 uker Begynnende vekstreduksjon i gruppen gitt fôr uten premiks (fôr U) Kan vi avdekke dette som tidlig mangel på mikronæringsstoff ved hjelp av studie av fiskens levertranskriptom? Premiks Vitaminer Vitamin E Vitamin K 3 Tiamin (B 1 ) Riboflavin (B 2 ) Niacin (B 3 ) Pantotensyre (B 5 ) Pyridoksin (B 6 ) Biotin Folat Vitamin B 12 Vitamin C Element Sink (Zn) Iod (I) Kopper (Cu) Kobolt (Co) Mangan (Mn)
Subtraksjonsbibliotek Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Sammenlikning av transkriptomet i lever hos regnbueørret som har fått fôr med og uten ekstra mikronæringsstoffer metoden subtraherer de transkriptene som er likt uttrykt i de to gruppene Verdifull sammenstilling med fenotypiske data og status av mikronæringsstoff Gen mrna Protein Transkripsjon Translasjon
Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Gruppe U gitt fôr uten premiks cdna 1 Gruppe S gitt fôr med premiks cdna 2 Samleprøve av lever fra to grupper regnbueørret mrna isolering SSH (1-2) treatment-specific library Clontech PCR Select cdna Subtraction Kit Lager to SSH cdna bibliotek next-generation sequencing clustering/assembly bioinformatics real-time qpcr verification Roche 454 GS- FLX System BLAST BLAST2GO Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Neste-generasjons sekvensiering Bioinformatikk Bruk av RT-qPCR for å verifisere noen av de opp- og nedregulerte genene
Næringsstoff med størst endring i status hos ørreten Næringsstoff Fôr U (mg/kg) Fôr S (mg/kg) NRC 2011 (mg/kg) Forskjell i status Fôr S vs Fôr U (x) Vitamin C 0 57 20 9 Vitamin E 44 103 50 4 Pantotensyre 6 36 20 3 Pyridoksin 3 8 3 3 Folat 1 6 1 1.5 Sink 60 155 15 1.5 Resten av mikronæringsstoffene var >behov eller gav ikke endringer i ørreten
Forskjell i genontology (GO) basert på lengre gensekvenser fra gruppe U og S sine SSH cdna bibliotek - programvare som knytter enkeltresponser til metabolisme indikerer overrepresentasjon av genprodukt hos fisk gitt fôr U innen: Veksthemming Lipidmetabolske prosesser ATPase aktivitet indikerer underrepresentasjon av genprodukt hos fisk gitt fôr U innen: Hematologiske prosesser Vekst og utvikling Mange oppregulerte transkripter i ørret gitt fôr U kan tolkes som aktiverte kompensatoriske metabolske mekanismer for bl.a. energiproduksjon
IPA core analyse - detaljerte funksjonelle gentranskripter knyttet til vitamin- og mineralmetabolismen i lever hos regnbueørret gitt fôr med og uten premiks Syntese, metabolisme og homeostase av Terpenoider (isoprene forbindelser) Steroider (hormoner) Vitaminer (retinoider) Kolesterol Terpenoider syntese (CoA) kolesterol steroider metabolisme (Cyt P450 enzymer)
IPA-tox programvare - avdekker biologiske mekanismer på molekylært, cellulært og biokjemisk nivå Signifikante økte uttrykk av responser i lever hos regnbueørret gitt fôr U eller fôr S Fôr U Mitokondriell dysfunksjon LXR/RXR aktivering (kolesterol sensing; katabolisme) Fettsyremetabolisme Negativ akuttfase responsprotein (avtar i inflammasjon) LPS/IL-1 hemming av RXR funksjon Fôr S PXR/RXR aktivering (xenobiotika sensing) Cytochrome P450 panel (xenobiotika som substrat humant) Cytochrome P450 panel (xenobiotika som substrat mus) Oksidativt stress Redusert depolarisering av mitokondriemembran (økt ATP syntese)
Pantotensyremangel? Pantotensyre = Coenzym A Fettsyreoksidasjon, kolesterolsyntese, hemesyntese, aminosyrekatabolisme, acetylcholinsyntese, acetyl- og acyleringsreaksjoner Lav muskel pantotensyrestatus Begynnende gjellepatologi Mitokondrierike vev utsatt ved mangel Pantotensyre (CoA) mangel kan knyttes til de fleste funn i IPA screening analysen: mitokondriell dysfunksjon; lipidmetabolisme o.a. 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Muskel Pantotensyre (ug/g) 0 20 40 60 80 Fôr Pantotensyre (mg/kg)
Askorbinsyre (µg/g) Vitamin C mangel i ørret gitt fôr uten premiks? Vitamin C deltar i kollagensyntese, sårheling, mineralmetabolisme, hematologi, stressrespons, immunreaksjoner, detoksifiseringsreaksjoner og steroidogenese (mixed function oksidaser) o.a. Suboptimal lever askorbinsyrestatus Nedregulerte GO-termer i gruppe U som kan tilskrives lav vitamin C status: sårheling, oksygentransport, vevsutvikling og vekst Redusert hemoksigenase (redusert nedbrytning av hem) Vitamin C trenges for ny hemsyntese Lever askorbinsyre 140 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 Vitamin C i fôr (mg/kg)
Konklusjon Prosesser knyttet til lipidmetabolisme, peptidnedbrytning, oksygentransport og vekstutvikling var mest påvirket Resultatene kan relateres til blant annet suboptimal ernæring av pantotensyre og vitamin C Transkripsjonsanalyse som SSH er nyttig i ernæringsstudier - utvalgte nøkkelmarkører vil bli brukt i videre behovsstudier hos laks
Takk for oppmerksomheten Og stor takk til: Ing. Tina Constance Rosvold, Ing. Hui-shan Tung og Dr. Kai K. Lie (NIFES) Dr. Anne B Olsen (Veterinærinstituttet, Bergen) for gjellehistologi Dr. Kjell Petersen og Dr. Svenn H. Grindhaug (FUGE Bioinformatics platform, Universitetet i Bergen) for hjelp med bioinformatikkanalyse Dr. Morten Skage og Dr. Ave Tooming-Klunderud (NCS, CEES, Universitetet i Oslo) for hjelp og råd med 454 FLX sekvensieringen Det biologiske materialet i denne studien var fra et samarbeidsprosjekt mellom BioMar AS (Trondheim; Hirtshals) og NIFES Finansiert av NIFES