S. 1 (av 10) III. Væske-væske-kromatografi (Fordelingskromatografi del 1, LLC) C. Papirkromatografi (PC) III. C. Papirkromatografi (eng.: Paper Chromatography, "PC") Papirkromatografi er kromatografi i porøs papir ( type filterpapir, som regel cellulose). Papirkromatografi er (normalt) fordelingskromatografi (altså ikke adsorpsjonskromatografi). Planar teknikk (som regel; jfr. TLC) Brukes mest analytisk ; kan også brukes mikropreparativt (µg - mg) Ikke høyt-oppløsende Lav effektivitet, ikke særlig god R F -repeterbarhet, rel. sakte utvikling. Kan utføres med meget enkle og billige midler (f.eks. skoleforsøk i kromatografi), og anvendes på mange ulike stofftyper (inkl. uorganiske ioner). Relativ gammel metode (1940-tallet), i dag stadig mindre brukt, ofte erstattet med tynnsjikt-kromatografi, TLC (f.eks. LLC-TLC m. cellulose som bærematerial) TLC raskere og med høyere effektivitet enn PC).
S. 2 (av 10) Papirkromatografi er (normalt) fordelingskromatografi (altså ikke adsorpsjonskromatografi!) Papiret er "bærematerialet" for SF. Stasjonærfase-væsken er, i hovedsak, "oppløst" i de amorfe områdene, evt. noe adsorbert på mikrokrystall-overflatene av cellulosen i papiret. Mobilfase-strømmen forbi SF transporteres som regel av kapillærkreftene i papiret (med eller mot tyngdekraften). I papirkromatografi er det vanligst med normal fase-fordeling (SF= poplar, MF = upolar). SF består som oftest for en stor del av vann - tiltrukket av cellulosen som er hydrofil (hydrogenbindinger med glukose-oh) - det dannes en "cellulose-løsning" i de amorfe områdene. Noen skiller her mellom (1.) vann som er direkte bundet til cellulose og (2.) vann som er "mer løst bundet" og tilgjengelig, som SF, for solvatisering av prøvemolekyler ("...available for partitioning the solutes") 1 N.B. 1 : Ved manglende "solvatisering" av cellulosen kan det forekomme adsorpsjons-prosesser ("LSC"). Både da, og ved vanlige LLC- betingelser, kan også ionebytting opptre fordi det i cellulose også finnes enkelte COOH-grupper, som kan deprotoneres. Begge disse prosessene kan være mulige årsaker til uønsket oppførsel (f.eks. tailing ) av flekker. N.B.2 : Alternative papirtyper finnes/fantes/kan lages (ofte ikke fordelingskromatografi, (ikke pensum!) 2 ) 1 J. Sherma in "Handbookk of Chromatography" (editors : G. Zweig & J. Sherma), Vol 2, Section 1, s. 73, CRC Press, Cleveland,Ohio, 1972. Jfr. også diskusjon av hhv. sorpsjon og fortrenging i kap. II.C.1.d, Silikagel. 2 Eksempler for alternative papirtyper 1 : - Impregnert papir, f.eks. med kompleksdannere, flytende ionebyttere m.m. - kjemisk forandret papir : f.eks. delvis acetylert cellulose, - "Loaded paper" : papir inneholdende dispersjon av en annen SF : - adsorpsjonsmiddel-pulver for LSC ( redusert retensjon / "fortynnet" SF), - Ionebytter-materialer : ionebytter-celluloser, syntetiske ionebytter-resiner, uorganiske ionebyttere, - Glassfiber-papir (for korrosive forhold, evt. også "loaded" m. ads.-midler) - Teflon-"papir" (finnes bare fylt/"loaded", m. adsorpsjonsmiddel).
S. 3 (av 10) IIV. Væske-væske-kromatografi (Fordelingskromatografi del 1) C. Papirkromatografi 1. om papir - cellulose III. C. 1. Om papir / cellulose Vanlig (porøs (filter-)) papir er cellulose... (3.) Cellulose: Naturlig polysakkarid: -1,4-bundet glukose kryssbundet ved hydrogenbindinger mellom polymerkjedene i fibrillene (krystall-pakning). Stabilitet: kjemisk: rel. god mekanisk: rel. god Porøsitet: Egenskaper: Anvendelser: porer av sterkt forskjellig størrelse (Fig. via Paintbrush WINDOWS\BMP\52CELLUL.BMP; fra "WIMP 2001" WINDOWS\WIMP\52CELLUL.NFT hydrofil, ikke-svellende, benyttes med vann eller organiske løsningsmidler, OH-grupper kan benyttes til derivatisering. Brukes som papir eller pulver, består av ca. 80% krystalline (fibriller) og ca. 20% amorfe områder; adsorpsjon og (stasjonær-)væskefaseinnlagring skjer i den amorfe delen. Fordelingskromatografi, papirkromatografi, papirelektroforese; som matriks i ionebytter- og (sjeldent idag) bioaffinitetskromatografi. En skjematisk opprinnelses-historie for naturlig cellulose er vist i Figur 1 (på neste side) : Det som i den engelske figurteksten i figur 1 omtales som "Interceding noncellulose materials" består av hemicellulose 3 og lignin. I tørket trevirke utgjør de hovedkomponentene : ca. 25-30 % hemicellulose og ca. 25-30 % lignin (foruten de ca. 40-45 % cellulose). De utgjør "limet" mellom mikrofibrillene og mellom makrofibrillene i treet, mens fibrillene selv er bygget opp av cellulosen. Under "koking" og "bleking" av tremassen fjernes limet, d.v.s. hemicellulose og lignin, og cellulosemassen får sin porøse / fibrøse struktur. Glukosepolymer-kjedene i de amorfe områdene mellom mikrofibrillene og på overflaten til mikrofibrillene blir dermed tilgjengelig for væske - f.eks. potensiell SF. Væsken kan svelle / solvatisere ("løse opp") de amorfe polyglukose-kjedene og og den vil også adsorberes til karbohydratmolekylene på mikrofibrillenes overflate. Den delen av mikrofibrillen som i Figur 1 omtales som "(E), Region of the microfibril where the cellulose chains exhibit a high degree of order" kalles ofte for et mikro- krystallinsk område. Det antas at disse kan være i størrelsesorden 3 x 3 nm i tverrsnitt og ca. 100 nm lang før glukosekjedene antar en uordnet (amorf) struktur. (Noen av) Kjedene kan, lenger borte, igjen ordnes inn i et nytt mikrokrystallinsk område (overgangen krystallinsk amorf krystallinsk er antydet i Figuren i mellom (D) og (E)). 3 Hemicellulose : fellesnavn for polysakkarider med kortere kjeder enn cellulose. Hemicellulose:er forgreinet, lettere hydrolyserbar - bygget opp av flere ulike typer sukkermolekyler (ikke bare glukose).
S. 4 (av 10) Figur 1 : Se den engelske figurteksten Gjengitt i / kopiert fra : Jim D. Wilson & J. Kelvin Hamilton, "Wood Cellulose as a Chemical Feedstock for the Cellulose Ester Industry", Journal of Chemical Education, (1986) vol. 63, s. 49-53, som igjen har lånt/adaptert figuren fra : K. Esau "Anatomy of Seed Plants", John Wiley & Sons, New York 1960, s. 50).
S. 5 (av 10) III. Væske-væske-kromatografi (Fordelingskromatografi del 1) C. Papirkromatografi 2. Løsningsmiddelsystemer III. C 2. Løsningsmiddel-systemer (= kombinasjon av MF og SF): Viktigste faktor for å styre elueringsstyrke og selektivitet er valget av MF/SF-system. Prøvens krav styrer valget. Som regel : polare prøver - normal fase-system hydrofobe prøver - omvendt fase-system apropos : valg av system : Det finnes for mange tilfeller forslag til egnede systemer i litteraturen for prøvetypen din eller +/- nære slektninger (F.eks. i bind 1 til ref. 2 ) To grupper av systemer : 1. to-fase-systemer : 2 ikke-blandbare faser i likevekt, 2. én-fase-systemer : som regel blandinger (homogent blandet) av rel. polare og noe mindre polare løsningsmidler (bare brukt for normal fase-systemer). (F.eks.: ad 1. : n-butanol - eddiksyre- vann 4 + 1 + 5 (v/v, Partridge-system); ad 2. : pyridin - n-butanol - vann 1 + 1 + 1 v/v).
S. 6 (av 10) To-fase-systemer: med to ikke-blandbare væskefaser i likevekt, gir ideelt en klassisk fordelingskromatografi-situasjon. De kan brukes for normal fase- (vanligst) eller omvendt faseutvikling. SF-påføring ("impregnering") kan skje ved ulike metoder: For rel. flyktige polare SF-komponenter : opptak i cellulosen via atmosfæren mettet med SF-damp Anvendelig for vann, og lavere - eller omtrent likt - kokende løsningsmidler; basert på cellulosens hygroskopiske (vanntiltrekkende) egenskaper (i et lukket (utviklings-)kar, med MF, SF eller begge faser tilstede). Papiret dyppes i en løsning av SF'en i et godt og lettflyktig løsningsmiddel (væskeoverskudd fjernes); alternativt sprayes SF-løsningen. Vanskelig med jevn og reproduserbar dosering). Papiret henges til tørk (avdamping av løsningsmiddelet) før prøve appliseres og kromatogrammet utvikles. MF som brukes er som regel mettet med SF. Anvendelig for SF med tungtflyktige komponenter (væsker som f.eks. N,N-dimetylformamid (DMF)=, buffersalter, og de typiske omvendt fase SF'ene som silikon-, paraffin-, olivenolje, etc. I én-fase-systemer tiltrekker den polare, hydrofile cellulosen (polare) komponenter fra elueringsmiddelet under utviklingen av kromatogrammet. Dermed bygges opp en væskefase (primært absorbert i cellulosens amorfe områder) som er stasjonær (= SF), og noe mer polar enn resten av væsken som strømmer gjennom papiret ( =MF) 4. Papiret reduserer dermed lokalt konsentrasjonen av de polare komponentene i elueringsmiddelet når det plukker dem ut av den til bruk som SF'en under utviklingen. Det oppstår derfor en konsentrasjons-gradient, med minst polar MF nær fronten, økende til den opprinnelige konsentrasjonen lenger bak, der SF og MF (mengde og konsentrasjoner) er kommet i likevekt. (Figur 2a) Teknikken krever ca. 10 % vanninnhold i elueringsmiddelet. Ellers blir konsentrasjonsgradienten så stor at den "synes ", og kan forandre R F -verdier. I verste fall kan løsningsmiddelet nærmest fronten "tørkes helt opp" 5 (Figur 2b). 4 Det sies at selv med rent vann som løsningsmiddelsystem vil det kunne foregå fordelingskromatografi mellom SF ("cellulose-sukkerlake") og MF (rent vann) ved papirkromatografi. 5 Ved for lav vann-innhold kan det i verste tilfelle dannes 2 fronter, den første er fronten til ut-tørket MF (sone med "adsorpsjonskromatografi"), den andre er fronten der løsningsmiddelet ennå inneholder vann (om enn for lite; fronten til fordelingskromatografi). Dette kan, for lite retarderte stoffer (høy R F, føre til to flekker, der en del av stoffet følger i LSC-sonen nærmest (1.-)fronten og en annen del i LLC-området lenger bak.
S. 7 (av 10) a) Paintbrush bilde :appl\windows\bmp-egen\52pclsm1.bmp b) Paintbrush bilde :appl\windows\bmp-egen\52pclsm2.bmp Figur 2 : Skjematisk fremstilling av konsentrasjons-forløpet (kvalitativt) i den mobile fasen nær løsningsmiddel-fronten ved "SF-impregnering under utvikling" : a) høyt nok vanninnhold i MF for avsetting av SF fra elueringsmiddel; b) for lite vanninnhold i MF, derfor tyde0lig "opptørking" av elueringsmiddelet med dannelse av 2 fronter : 1. front (fremst) for "tørt" elueringsmiddel i kontakt med tørr cellulose (LSC-forhold), 2. front (lenger bak) for dannelse av SF, og for polar lsm.-komponenter/vann i elueringsmiddel. Foruten hovedkomponentene inneholder løsningsmiddelsystemer ofte mindre tilsettinger som syrer, baser, buffere, salter m.m. Disse brukes for "selektivitets-styring" (f.eks. justere hydrogenakseptor-/donor-evne, eller til ph-justering (syrer, baser, buffere) som regulerer sure og basiske prøvekomponenters ioniseringsgrad polaritet RF-verdier / selektivitet), reduksjon av flekkdeformasjon / flekkstørrelse (redusere ikke-linearitet). Papirkromatografi er etter hvert blitt mest brukt til polare organiske stoffer, særlig naturstoffer (aminosyrer, peptider, karbohydrater, pigmenter). Ioniske (organiske og uorganiske) og upolare stoffer kan også analyseres, men her foretrekkes oftere andre teknikker i dag.
S. 8 (av 10) III. Væske-væske-kromatografi (Fordelingskromatografi del 1) C. Papirkromatografi 3. Papirkromatografi-praksis III. C 3. Papirkromatografi i praksis Papir for papirkromatografi : type filterpapir, rent, uten tilsatser; klassiker "Whatman no. 1". Noe tykkere versjon (raskere og grovere) for preparativ bruk. Evt. forbehandling / forhåndsimpregnering, s.o. For impregnering ved dypping før prøvepåsetting, for impregnering v.h.a. væskedamp etter prøvepåsetting. Applisering av prøven: som for TLC. Som fortynnet løsning i "minst mulige" flekker, størrelsesorden g-mg/flekk for analytisk, mg opp mot g, som streker, ved preparativ bruk. Utvikling av papirkromatogram - hoved-teknikkene (jfr Fig 3) : lineær - oppadstigende (mot tyngdekraften, jfr. K252-lab.) - nedadstigende (med tyngdekraft; ofte med overutvikling: elueringen fortsetter videre når MF-fronten når enden av papirarket - MF- overskudd drypper ut av papiret. - horisontal - 2-dimensjonal (lineær, 1 prøve pr. ark, som regel med ulike MF/SF-systemer for de to ortogonale utviklings-retningene), radiær (eng.: radial, circular) horisontal utvikling, prøveflekkene applisert konsentrisk rundt midten av papiret, dit tilføres MF v.h.a. veke eller slange / kapillaærrør. Gir et annet strømningsprofil med avtagende linær MF-hastighet fra appliseringspunktet utover og dermed andre _ R-verdier (større spredning ved lave "R F -verdier") R F(rad) = R F(lin) gjentatt utvikling og over-utvikling (eng.: multiple development og overrun development), spesielt det andre er ganske vanlig ved nedadstigende lineær utvikling.
S. 9 (av 10) a) b) c) Figur 3 : Noen vanlige utviklingsmetoder for papirkromatogrammer : a) nedadstigende utvikling, b) radiær utvikling (i petriskål, med filterpapir og veke). c) meget enkle oppadstigende: øverst : i reagensglass, nederst : i erlenmeyerkolbe Paintbrush-bilde : Windows\BMP_egen\52pcdvl1.bmp, 52pcdvl2.bmp & pcdvl3.bmp Viktig med lukkede systemer og stabile/konstante betingelser som bl.a. temperatur (ofte over rel. lang tid p.g.a. langsom utvikling), Deteksjon : jfr. TLC - men cellulosen er kjemisk mindre inert enn typiske TLCadsorpsjonsmidler, slik at de mest drastiske TLC-metoder (noen av de mest universelle!) ikke er anvendbare på papir. Hvis ikke prøven er direkte synlig - farget (eller synlig fluorescerende) - brukes spesifikke / selektive fargereaksjoner som synliggjør flekkene på papiret, direkte eller via fluorescens. Reagenspåføring ved spraying eller dypping. Eksempler: ninhydrin for aminosyrer / primære aminer, difenylhydrasin for aldehyder / ketoner,... Også radiografi for radioaktivt merkede stoffer. Synlig lys- eller UV-aktive stoffer kan detekteres, dokumenteres, kvantifiseres ved bruk av UV-(TLC-)scanner. Evt.: isolering ved utklipping av flekken - ekstraksjon av papiret - analyse av ekstrakt.
S. 10 (av 10) Dokumentasjon : Numerisk som RF-verdier eller andre R-verdier. Spesielt i lineært utviklede kromatogram er det vanlig å bruke R F -verdier, men det stoles noe mindre på repeterbarhet av R F -verdier innen papirkromatografi. Det benyttes derfor som regel ko-kromatograferte interne standarder / referanse-stoffer og derfor er også relative R-verdier utbredt (relativ retardering). Disse er målt relativ til et standardstoff ("st"), beregnet ut fra R F -verdier eller direkte fra vandringslengdene L : R rel = R F(X) / R F(st) = L X / L st Ved rapportering av stoffene bør man også ta med videre karakterisering av flekkene: reaksjon på visualiseringsmetoden(e), inkl. farge(r), form. Dette kan evt. suppleres med grafisk gjengivelse av kromatogrammet: tegning, kopi, fotografi, scanner-profil, autoradiografibilde...