NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR KJEMI Kontaktperson-faglærer-eksaminator: Anne Fiksdahl LØSNINGSFORSLAG EKSAMEN I FAG KJ 2053 KROMATOGRAFI Fredag 23. mai 2008 Tid: kl. 9.00-13.00 1. PAKKEMATERIALER / STASJONÆRE FASER / RETENSJON a) Nevn tre grunner til at derivatisering utføres i forbindelse med GLC. (3p) i) kolonne-orientert, ii) detektor-orientert, iii) sep. av enantiomere vha. diastereomere b) Nevn to måter å utføre derivatisering i forbindelse med HPLC. (2p) i) post-(etter)-kolonne-deriv., ii) pre-(før)-kolonne-deriv. c) Hva brukes syklodekstrin (cyclodextrin) til i forbindelse med kromatografi? (1p) chirale separasjoner, sep. av enantiomere (både GLC/SF og HPLC/SF og MF) d) Strukturene i) og ii) under viser to stasjonære faser som er mye brukt i GLC. Hva slags materialer er brukt? (Angi de generelle navnene på forbindelsene) Angi omtrentlig CP indeks for de to stasjonære fasene. (4p) e) Hva menes med elueringsstyrke i kromatografi? (3p) Vil høy eller lav elueringsstyrke gi kortest retensjonstid? El-styrke er et mål for hvor godt MF løser komponentene i blandingen som skal separeres. Høy elueringsstyrke betyr at MF løser komp. godt og at eluerings-/retensjons-tiden blir kort. Hva skjer med hhv. i) elueringsstyrke og ii) retensjon når andelen av den minst polare komponenten i eluenten økes ved bruk av en C18 omvendt fase (C18) HPLC kolonne? (2p) i) elueringsstyrken øker og ii) retensjon reduseres Hvilke forandringer av eluenten kan gjøres for å øke elueringsstyrken i hhv. i) kationebytter og ii) anionebytter kromatografi? Forklar kort hvilken effekt som oppnås (4p) kationebytter; senke ph gir mindre ionisering (carboxylat anioner) av carboxylsyrer anionebytter; øke ph gir mindre ionisering (ammonium kationer) av aminer (eller øket ionestyrke gir større kapasitet av MF) 1
2. ADSORPSJON a) Hvordan er likevekskonstanten, Kads, definert i adsorpsjonskromatografi? (1p) K ads = X ads / X non-ads (X = konsentrasjon; hhv. g/g og g/ml) b) Svar ja eller nei på følgende spørsmål i) v) og angi hvilken parameter i ligningen under som beskriver det aktuelle fenomenet i) v) (10p) log K = log Va + (S 0 As 0 ) Dersom alle andre forhold er uendret; i) Vil mer polare stoffer elueres ut før mindre polare stoffer? nei S 0 ii) Vil små molekyler elueres ut før større? nei As iii Øker retensjonen med økende polaritet av stoffene? ja S 0 iv) Vil tilsats av vann til adsorpsjonsmidlet øke retensjonen? nei Va og v) Vil endring til et mer polart løsningsmiddel gi øket retensjon? nei c) Hvordan endres hhv. tr (retensjonstid), VR (elueringsvolum))og Rf-veridiene når et adsorpsjonssystem blir overbelastet? Gi en generell forklaring. Ved overbelastning vil ads.matr. (SF) ikke ha kapasitet til å ads. den forventede mengde stoff og stoffet vandrer for fort gjennom kolonnen med MF (for høy kons. i MF for lav kons. i SF.) tr / VR blir derfor mindre og Rf-veridiene større. d) Hva er isoeluotropiske blandinger? (1p) Forskjellige / ulike løsningsmiddelblandinger som alle har samme løsningsmiddelstyrke, e) Hvilke fire egenskaper utgjør et molekyls polaritet? (2p) Evne til å danne: - dispersjonsinteraksjoner, - dipolinteraksjoner, - H-bindinger, - syre/base-interaksjoner el. komplekser f) Situasjon (I): HPLC kromatogrammet under er oppnådd med normal fase (NP) med en Eluent(I) med 0 I = 0,25. Situasjon (II): En tommelfinger-regel sier at en reduksjon i løsningsmiddelstyrken, 0, på ca 0,05, en økning av kapasitetskonstanten, k, med en faktor på ca 3,5. Beregn den nye ret.tiden, trii, og skisser et tilsvarende krom. for en ny Eluent(II) med 0 II = 0,20. (2p) ki = (tri t0) / t0 = (2,5 1)/1 = 1,5 k II = k I + x 3,5 = 5 5,25 t RII = t 0 (k II +1) = 1 (5,25+1) = 6,25 min Hva er sammenhengen mellom kapasitetskonstanten, k, og R f -verdi brukt for retensjon på TLC? (1p) k = (1 Rf ) / Rf (3p) Skisser de to situasjonene (I) og (II) på en TLC plate og beregn Rf verdiene, RfI og RfII, for eluering på TLC ved bruk av hhv. Eluent(I) og Eluent(II). Rf = 1 / (k+1); RfI = 1 / (1,5+1) = 0,4; RfII = 1 / (5,25 +1) = 0,17; 0,16 (2p) II) TLC: t RII = 6,0 min (I); R fi = 0,4; k I = 1,5; = 0,25 (II); R fii = 0,17; k II = 5; = 0,20 2
3. DETEKTORER Hvilke av de fire vanligste GC-detektorene har lavest følsomhet? TCD er særlig egnet for deteksjon av halogenerte forbindelser? ECD er universell? TCD er særlig egnet for sporanalyser av pesticider? AFID = NPD (organofosfor p.) ECD (organohalogen (persistente) p.) er basert på at el.ledn.evne i en gass er prop. m/ kons. av ladede partikler i gassen? FID 4. KAPILLÆR-GLC a) Svar ja/nei på følgende spørsmål i) iv) og forklar kort begrunnelsen. (8p) Dersom alle andre forhold er uendret; i) Vil en lengre kolonne gi øket oppløsningsevne? ja -Rs= f(n(prop m/l)) ii) Vil øket filmtykkelse av stasjonær fase gi øket retensjon? ja -øket d f gir øket kapasitet/k iii Vil øket filmtykkelse av stasjonær fase gi øket oppløsningsevne? ja -øket k gir øket Rs = f(k) iv) Vil mindre indre diameter av kolonnen gi øket effektivitet? ja -Golay; H= f(id) (5p) b) Ved mistanke om promillekjøring benyttes ofte 2-propanol som intern standard (IS) ved GLC-analyser av blodprøver Hva tror du er begrunnelsen for valg av 2-PrOH som IS i slike etanol-analyser? 2-PrOH er egnet som IS ved EtOH-analyser fordi: - den kan lett separeres fra EtOH i et GLC-kromatogram, - den har sammenlignbar ret.-tid med EtOH, - den oppfører seg likt med EtOH ved prøveopparbeidelse, - den er stabil, - den er lett tilgjengelig i ren form. (5p) 5. HPLC Svar ja eller nei på følgende spørsmål i) xi) og gi en kort begrunnelse. (22p) i) Bør en HPLC eluent ha lav viskositet? ja - stor viskositet krever høyere trykk; uønsket ii) Er det en ulempe ved stempelpumper at de er lite egnet til gradienteluering? nei - gradient-el. krever rask endring av eluent-smn.setn.; dette er fordelen med stempelpumper pga små stempel-volumer iii) Er ventil-injeksjon den vanligste injektotoren for HPLC? ja - fordel; fast volum/loop, unngår lekkasje iv) Øker ret. på en omvendt fase (RP) kolonne når andel vann i en vann-metanol eluent økes? - ret. på RP øker med økende andel polar (overflatespenning) eluent ja v) Øker retensjonen på en RP kolonne ved å gå fra C8 til C18 stasjonær fase? ja - retensjonen på RP øker med økende alkyl-kjedelengde på SF vi) Vil en tetra-alkohol generelt ha større retensjon enn en di-alkohol på RP-HPLC? nei - retensjonen på RP reduseres med økende polaritet av stoffene vii) viii) Kan ninhydrin derivatisering av aminosyrer bare gjøres som pre-kolonne derivatisering? - ninhydrin-deriv. gir fargete forbindelser og derfor andre abs.egenskaper enn nei ninhydrin-reagenset; deriv. kan derfor gjerne skje post-kolonne Må separering av diastereomere derivater av enantiomere forbindelser utføres på 3
chirale stasjonære faser/kolonner? nei - to diastereomere har forskjellige kjem/fys. egenskaper og kan ofte sep. på konvensjonelle kol. ix) Er en UV detektor mer følsom enn en fluorescens detektor? nei - fluoresc.det er selektiv; følsomhet øker ofte med selektivitet x) Er brytningsindeks (RI) detektor godt egnet for gradient eluering? nei - kont. endring av eluent gir uønsket endring av RI og ustabil grunnlinje xi) Er bensen et dårlig løsningsmiddel for HPLC-UV detektor? ja - bensen har max 254 nm midt i det viktigste UV deteksjons-området 6. SUPERKRITISK FLUID KROMATOGRAFI (SFC) a) Hva er den særlige fordelen ved bruk av SFC? (4p) - kombinasjon av detektormuligheter; HPLC -det. (eks. UV-det) kan brukes til GC -kolonner (kap. Me-silicon) og motsatt; GC -det. (eks. FID) kan brukes til HPLC -kolonner (eks C18) b) Hvilken mobilfase er mest brukt i SFC? Hvorfor? (nevn 5 positive egenskaper) - CO2 - godt egnet pga. praktiske fysikalske egenskaper: superkr. trykk (73,8 atm) / temp. (31,4 o C), - annet: ikke brannfarlig, ingen lukt, ikke giftig, ingen UV-abs., billig i høy renhet, flyktig. Hvilken ulempe medfører bruk av denne mobil fasen? Hva gjøres for å unngå denne ulempen? CO2 ganske upolar, ikke egnet for polare forbindelser; tilsettes ofte modifikator. (8p) c) Svar ja eller nei på følgende spørsmål: (3p) Er løselighetsegenskapene til superkritiske fluider sammenlignbare med væsker? ja Er viskositeten til superkritiske fluider sammenlignbare med væsker? nei Er diffusjonskoeffisientetn til superkritiske fluider sammenlignbare med gasser? ja d) Forklar kort de to måtene restriktorer kan benyttes på ved SFC. (4p) - før GC-detektorer; opphever trykket slik at eluatet er i gass-form ved deteksjon - etter HPLC-det.; opprettholder trykket slik at eluatet er en fluid/væske ved deteksjon 7. FASTFASE EKSTRAKSJON (SPE) (5p) i) Hvilke to fordeler kan særlig oppnås ved bruk av fastfase ekstraksjon i forhold til væske-væske ekstraksjon? - redusert i) tids- og ii) løsningsmiddelforbruk - (evt. høyere utbytte/gjenvinning + evt. bedre reproduserbarhet) ii) Nevn tre viktige typer sorbenter som benyttes til fastfase ekstraksjon. - normal fase / silica - omvendt fase / C18 (silica modifiserte silyl-ethere) - ionebyttere (alle typer silica baserte kation/anion, svake/sterke) -------------------------------------------------------------------------- 4
SUM 105 p 5