NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 1 av 4 ppgave 5: HPLC-analyse av UV-solfilterstoffer i solkrem. Hensikt/Mål: Hensikten med denne oppgaven er å gi en innføring i bruk av HPLC som analysemetode. I dette forsøket er SF og MF valgt på forhånd. Målet med oppgaven er derfor å se hvordan separasjon påvirkes ved å endre sammensetningen av MF og andre analyseparametere underveis. Denne oppgaven er også semi-kvantitativ, og bygger på kunnskaper om kvantitativ analyse fra GC-2 Sammendrag: Ved HPLC med UV-lysdeteksjon, utarbeides en analysemetode for analyse av UVfilterstoffer i solkrem. Først testes analysebetingelser med gradienteluering og deretter velges en isokratisk analysebetingelse. Deteksjon av analyttene gjøres ved bølgelengde(r) tilpasset ulike solfilterstoffers UV-spektra. Solfiltrene detekteres ved v.h.a. UV-detektor og identifiseres ved hjelp av standarder. Innledning: UV-filtre, også kalt solfiltre, i solkremer er stoffer med sterk absorpsjon av potensielt skadelig UV-lys som ellers kunne trenge inn i huden vår og utløse solbrenthet og andre skader. Slike UV-filterstoffer må absorbere en størst mulig del av det skadelige UV-lyset uten selv å bli omdannet til noe skadelig, eller miste UV-lysabsorpsjonsevnen. De må være hudvennlig, miljøvennlig, og ikke gi akutt eller langsiktig toksisk skade. Av helse- og miljøhensyn, er konsentrasjonene som kan selges i preparater begrenset, og det er behov for metoder som kan identifisere og kvantifisere solfilterstoffer i solkrem. Tabell 1: Kjente solfilterstoffer vi har identifiseringsstandarder til. 2292: 4360: 4-metoksykanselsyre-(2-etylheksyl)-ester 2-Ethylhexyl 4-methoxycinnamate, EMC ctyl Methoxycinnamate, MC "ctinoxate" Benzophenon-3, BP xybenzone (B) 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon ECnr. 2.13 1.4 H 6300: 4-metylbenzylidenkamfer MBC 2.26
NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 2 av 4 I dette forsøket skal vi analysere solkrem, og undersøke om solkremen inneholder en eller flere aktuelle og mye brukte UV-filter fra tabell 1. Det brukes omvendt-fase HPLC, RP-HPLC, med en UV-DAD (diode array detector) som detektor Eksperimentelt: Eusolex-standardene (Tabell 1) benyttes som identifikasjonsstandarder for noen solfilter vi forventer å finne i solkremen. Identifiseringstandarder: (Laget på forhånd) Standarder er laget ferdig på forhånd ved å fortynne hver enkelt Eusolex-standard 1 + 1000 med 96 % etanol. Konsentrasjonen til de enkelte standardene er da 1mg solfilter per 1 ml etanol. En blanding av alle tre standarder er ferdiglaget med blandingsforholdet 1+1+1, heretter kalt standardblanding. Herfra utfører studentene oppgaven selv: Prøve: Ca. 100 mg solkrem veies inn i en 10 ml målekolbe. Kolben ristes og/eller settes i ultralydbad for å få løsningen homogen før den fortynnes opp til menisken med 96 % etanol. Noter eksakt mengde som veies inn da det benyttes til beregning av mengde solfilter i solkremen. 1 ml av prøveløsningen filtreres gjennom et sprøytefilter (0,2 μm) og overføres til et prøveglass. Prøven skal være helt blank og partikkelfri. Metode: Vi håndterer analyser av solkrem som en analyse med ukjent prøve og metode. Derfor gjennomføres først en gradientanalyse med økende elueringsstyrke for å få et overblikk over når stoffene forventes å eluere. Deretter testes ulike konstante elueringsbetingelser basert på gradientelueringen, for å optimere en isokratisk analysebetingelse for separasjon av de aktuelle stoffene. Injeksjonsvolum er avhengig av type injektor (vanligvis i intervallet 1-20 ul). Deteksjon settes til 254 nm Gradientanalyse: Benytt standardblandingen til dette. Gradient: Injeksjon/start 0-2 min. 10 % acetonitrill i dest.vann Flow: 1,0 ml/min. 2 10 min. 10-100 % acetonitrill i dest.vann Flow: 1,0 ml/min 10-12 min. 100 % acetonitrill Flow: 1,0 ml/min. Stopptid 12 min Analysen stoppes automatisk når stopptid er aktivert Flow: 1,0 ml/min Isokratisk analyse: Ulike løsningsmiddelsammensetninger gir ulike retensjonstider og ulik separasjon, på samme måte som temperatur i GC. I dette forsøket skal dere teste en blanding av vann og acetonitrill. Blandingsforholdet av MF optimeres for analyttene i prøven (jfr.
NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 3 av 4 TLC). ptimer analysen med henblikk på best mulig separasjon og kortest analysetid (jfr. GC) Ved den optimerte MF-sammensetningen: Analyser først standardblandingen på de optimerte betingelsene, deretter solkremprøven. Analyser blankprøve, som er løsningsmiddelet (96 % etanol) Analyser hver av de enkelte Eusolex-standardene for identifikasjon Analyser standardblandingen med en høyere MF-hastighet (trykket i systemet avgjør hvor høy hastighet som kan oppnås) Analyser standardblandingen på en annen bølgelengde. Bruk de enkelte filtrenes spektra til å velge en mer optimert bølgelengde Skriv lab.notater da ikke all informasjon kommer på utskriftene (bl.a. trykket i systemet), men observeres underveis og skal diskuteres i rapporten. Dere trenger forstørret kromatogram for å beregne N, H og Rs Rapportering: Rapporter retensjonstidene (med 3 desimaler) til aktuelle topper i solkremprøven og identifiseringsstandardene fra de optimerte betingelsene. Identifiser solfiltrene i prøven vhj av retensjonstidene til identifikasjonsstandardene Beregn Rs for toppene i standardblandingen og i solkremprøven. Beregn N og H for toppene i standardblandingen din ved 254 nm. Anslå konsentrasjonene av solfiltrene basert på en ekstern standard ettpunktskalibrering (responsfaktorregning). Sammenlign/diskuter likheter og forskjeller med sist vi gjorde tilsvarende i GC forsøket. ppgi konsentrasjon i mg/ml, og beregn mengden solfilter i den aktuelle solkremen i %. Sammenlign mengde med det som framkommer i produktspesifikasjonen for solkremen (hvis tilgjengelig). Diskuter/forklar endringer i kromatogrammene fra gradient til isokratisk, og mellom ulike isokratiske analyser under optimeringen. Diskuter elueringsrekkefølgen for solfiltrene i RP-HPLC-analysen, basert på stoffenes fysiske og kjemiske egenskaper. Ved økt MF-hastighet Sammenlign trykk, retensjonstid og vurder separasjonsevne og effektivitet. Bruk kvantitative mål. Ved endret bølgelengde: Diskuter ulikheter i topphøyde/toppareal mellom de ulike bølgelengdene.
NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 4 av 4 Figur 1: Autosamplermodul på (Ser.1200) instrumentet som noen av dere vil utføre forsøket på. Manuel injektor kan ses til høyre for autosampleren. Figur 2: Pumpeenheten (binær UHPLC-pumpe) på et av HPLC instrumentene (Ser. 1200) dere vil gjøre analysen på. Figur 3: Kolonnemodul (med termostateringsmulighet) til HPLC instrumentet (Ser. 1200) noen av dere vil gjøre analysen på. Her er en standard HPLC-kolonne med en forkolonne installert.
NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 5 av 4 Tabell 2: Utvalg av flere kjemiske solfiltre 2292: 4360: ECnr. Alternative (kjemiske og systematiske) navn 4-metoksykanselsyre-(2-etylheksyl)-ester 2-Ethylhexyl 4- MethoxyCinnamate, EMC ctyl MethoxyCinnamate, MC "ctinoxate" 2-hydroxy-4- methoxybenzophenon BenzoPhenon-3, BP xybenzone (B) Produktnavn 2.13 1.4 CAS-nr. 5466-77-3 131-57-7 Struktur 6300: 4-Metylbenzylidenkamfer MBC 2.26 36861-47-9 9020: CR ButylMetoksyDiBenzoyl- Metan 4-t-butyl-4 -methoxydibenzoylmethane BMDBM "Avobenzone" 2-ethylhexyl 2-cyano-3,3- diphenyl-2-propenoate ctocrylene 1.8 70356-09-1 6197-30-4 HMS 3,3,5-Trimethylcyclohexyl 2- hydroxybenzoate 118-56-9 Homosalate Eusolex S 2-ethylhexyl 2- hydroxybenzoate ethylhexyl salicylate ctyl Salicylate ctisalate 232: 2-Phenylbenzimidazol-5- sulfonic acid (Vannløselig/Water soluble) [(2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2- [(4R,8R)-4,8,12- trimethyltridecyl]chroman-6- yl] acetate 118-60-5 27503-81-7 58-95-7 (for R = R = methyl) Tocopheryl acetate Virtamin E acetate
NTNU, Institutt for kjemi Kromatografi KJ2053 / 2017 / s. 6 av 4