Methicillinresistens og glykopeptidresistens hos stafylokokker Overlege Hege Enger MRSA referanselab St Olavs Hospital
Plan Kort og S.aureus/koagulasenegative stafylokokker Meticillinresistens -forekomst, mekanismer og metoder for påvisning MRSA-screening Glykopeptidresistens(vankomycin) Begreper, mekanismer og metoder for påvisning Metodeproblemer
S. aureus/koagulasenegative S.aureus -kan gi infeksjoner i de fleste organer, fra milde til alvorlige -inf. hos friske og immunsvekkede individer -vanligste agens ved postoperative sårinfeksjoner -vanlig årsak til bakteriemi i Norge Koagulasenegative stafylokokker(kns) -heterogen gruppe med 47 species -økende medisinsk betydning -immunsupprimerte -kolonisering versus infeksjon -fremmedlegemeassosierte infeksjoner(cvk, proteser etc)
MRSA forekomst: stor variasjon Blodkulturer NORM 2015; 0,7% MRSA
Resistens, KNS Mye mindre oversikt, både nasjonalt og internasjonalt. F eks aldri inkludert i NORM* Generelt mer resistens enn hos S.aureus, ofte multiresistens Unntak: S.lugdunensis er ofte følsom for de fleste antibiotika Stor forskjell når en tester KNS fra sykehuspasienter og friske pasienter utenfor sykehus Meticillinresistens: ca 60-80% *NORM: Norsk overvåkningssystem for antibiotikaresistens hos mikrober
Meticillinresistens Skyldes et gen(meca/mecc) som koder for et endret penicillinbindende protein: PBP2a/PBP2c PBP2a/c har lav affinitet for betalaktamantibiotika -celleveggsyntese kan fortsette -resistens mot alle betalaktamantibiotika (unntatt ceftarolin og ceftobiprol)
meca/c meca/c :gen som koder for PBP2a/c Genet sitter i en kromosomkassett, SCCmec, som det finnes 11 typer av. Mobilt genetisk element Kombinasjon av mec gen og ccr gener gir ulike SCCmec-typer SCCmec kan inneholde andre resistensgener, f eks makrolider, klinda, TMS, tetracykliner, ciprofloxacin -> MRSA vanligvis mer resistent enn MSSA SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome
mecc/borsa mecc: -fanges ikke opp av alle kommersielle PCR -fanges ikke opp av meca PCR eller PBP2a agglutinasjonstest -krever egen mecc-pcr BORSA: bordeline resistant S.aureus -lavgradig resistens mot oxacillin -ikke resistent mot cefoxitin -meca/mecc negative -skyldes hyperproduksjon av betalaktamase -fanges ikke opp av screening med cefoxitin -uklar betydning
Påvisning av meticillinresistens Silemetode -resistensovervåkning Screeningmetode(MRSA) -oppklaring av utbrudd -screening i henhold til MRSA-veileder
Påvisning av meticillinresistens Cefoxitin lapp. Nordicast sin anbefalte metode Gradienttest cefoxitin/oxacillin -cefoxitin MIC S 4 -oxacillin MIC: ingen BP. MRSA kan ha lave MIC, men de fleste med MIC>2 er MRSA eller BORSA Automatisert metode: kombinasjon av cefoxiting og oxacillin+expert system tolkning
Supplerende metoder MRSA PBP2a agglutinasjon Påvisning av meca(evt mecc), samt S.aureusspesifikt gen(nuc, spa/sa442) Bekrefte meticillinresistens og ID S.aureus som er cefoxitin R og meca negativ bør få utført mecc-pcr Alle bekreftede MRSA sendes MRSA referanselab for genotyping Både kolonisering og infeksjon med MRSA er meldepliktig til MSIS
Resistenspanel MRSA lab
Supplerende metoder MRSE Cefoxitin lappediffusjon godt egnet-særlig for S.epidermidis, S.capitis, S.hominis, S.haemolyticus, S.xylosus og S. schleiferi. En del falske R Konfirmer med meca-pcr på klinisk viktige isolater -særlig ved mer sjeldne KNS -fare for falske S og R for S.simulans, S.warneri og S.cohnii
Silemetode(Nordicast) Cefoxitin 30 mikrogram på MH agar -S.aureus: S 22 mm R<22 mm -Koagulasenegative: S 25 mm R<25 mm
Cefoxitin lapp/s. aureus
Cefoxitin lapp/kns
Oxacillin MIC/S.aureus
MRSA screening Prøvetaking! -Når? Se MRSA-veileder -Hvor? Økt sensitivitet ved prøvetaking fra nese, hals, perineum -Hvordan? *Dyrkningbasert *Gendeteksjon Ingen entydig gullstandard
MRSA-screening(dyrkning) Konvensjonelle medier(blod, sjokolade) Selektive medier. Inneholder bl a antibiotika(cefoxitin) og fargeindikatorer Anrikningsbuljong -flere varianter Høyest sensitivitet: anrikningsbuljong over natta +utsåing på blodskål og kromagar neste dag. Men tidsfaktor!
Kromogene medier Inneholder: Kromogent substrat for spesifikke bakterie enzymer - gir fargeendring Antibiotika-som regel cefoxitin Resultat etter 18-24t Lett å lese De fleste positive etter 24t 48 t: økt sensitivitet, men spesifisiteten faller Negativt svar først etter 48t
Kromagarprosjekt 2012 200 ulike spatyper undersøkt på 5 kromogene medier og blodagar (vekstkontroll) Standardisert utsæd og avlesning (CFU) Medium Antall kolonier (gj.snitt) % Blodagar 243 100 Chrom ID MRSA 143 59,1 CHROMagar MRSA 139 57,2 MRSA Select 130 53,6 BBL CHROMagar II 113 46,3 Brilliance MRSA 81 33,1
Resultater ulike genotyper BD/BBL CHROMagar MRSAII: Detekterte ikke 2,9% av genotypen (nr = 6) Oxoid/Brilliance MRSA: Detekterte ikke 2,9% av genotypene (nr = 6) BioMérieux/chromID MRSA: Detekterte ikke 1,4% av genotypene (nr = 3) Bio-Rad/MRSASelect: Detekterte ikke 3,3% av genotypene (nr = 7) CHROMAgar microbiology/ CHROMagar Detekterte ikke 1,9% av genotypene (n=4) BLODAGAR Detekterte alle genotyper
Konklusjon, kromagarprosjekt Best vekst og best sensitivitet på Chrom ID MRSA(mistet færrest spatyper) Klar veksthemning på alle kromogene medier sammenlignet med blodagar For enkelte isolater var det dårlig vekst på en eller flere medier. Hvorvidt dette er assosiert med spatype eller er stammespesifikt er ikke avklart De to mest brukte kromogene mediene i norske laboratorier ga best vekst. Valg av screeningmedium i norske laboratorier kan ha ført til seleksjon av hvilke MRSA typer som påvises
MRSA-screening med PCR Mange kommersielle varianter Kan gi svar etter 1-3 timer Ofte godkjent bare for neseprøver, dårligere sensitivitet og spesifisitet for andre prøvelokalisasjoner. En del MRSA gir hyppigere kolonisering ekstranasalt(f eks kun hals og/eller perineum) I Norge er det stor variasjon i spatyper sml med mange andre land(der flest studier er utført) Oftest deteksjon i MREJ-området, som overlapper mellom SSCmec(kun hos meticillinresistente) og orfx(hos S.aureus). Noen har spa-gen, meca, evt mecc Per i dag 11 ulike SCCmec og ca 20 ulike MREJ-typer. Stort behov for stadig oppdatering av primere for å fange opp flest mulige MRSAvarianter Pooling av prøver kan redusere sensitiviteten Alltid dyrkning i tillegg! Fanger opp evt falske negative ved PCR+får resistenstesting og genotyping)
MRSA-screening Ingen entydig beste metode for screening, store sprik i sensitivitet mlm studier Egne beregninger over kostnad/nytte ved ulike screeningstrategier er fornuftig. Tid, penger, sensitivitet Utfordringer: -ofte få kolonier MRSA -blandet flora inkl meticillinresistente KNS -ulike genotyper i ulike geografiske områder(og dermed behov for ulike screeningmetoder) -Ca 60% av screeningprøvene er fra primærhelsetjenesten Tidsfaktor mindre viktig Ca 33% av MRSA påvises ved aerob dyrkning Fanges ikke opp av dagens screeningrutiner
Oppsummering, MRSA-screening Dyrkningsbaserte metoder på kromogene medier er hyppigst brukt og rimelig Anrikning i selektiv buljong over natt øker sensitiviteten (parallellt med primær utsæd?) OBS forskjell mellom kromagarer! Ved utbrudd: sjekk at aktuelle utruddsstamme vokser på kromagar før oppstart av screening! PCR gir raskt svar og har brukbar NPV(men OBS sårbare avdelinger) Samtidig dyrkning nødvendig: Av negative for å finne stammer som ikke fanges opp Av positive for konfirmasjon og resistenstesting
Vankomycinresistens hos stafylokokker Vankomycin: virkning på celleveggen i grampositive mikrober Baktericid, med visse forbehold
Begreper VRSA: vankomycinresistent S aureus -høygradig resistens(mic>8 mg/l) -skyldes vana-genet(ervervet fra enterokokker) VISA: vankomycin intermediær S aureus -lavgradig resistens(mic 4-8 mg/l) -skyldes endringer i celleveggen(tykkere) -vil utfra nåværende brytningspunktet bli definert som resistent, men begrepet VISA er nyttig for å vise at disse isolatene har en annen resistensmekanisme enn VRSA hvisa: heteroresistent vankomycin intermediær S aureus -in vitro sensitiv for vanko med MIC 2 -men subpopulasjon av bakterier(1 av 10 6 ) med MIC >2 mg/l påvist med populasjonsanalyse undersøkelse(pap/auc) -skyldes endringer i celleveggen KNS: VRSE, VISE og hvise
Vankomycin brytningspunkter Endring Observert VISA og hvisa med behandlingssvikt på vankomycin Erkjennelse av at et isolat med MIC 8(for S.aureus 4) er R og ikke I -begrepet VISA/hVISA brukes fortsatt for å skille fra VRSA(vanA-mediert resistens) -høyere dosering kompenserer ikke for nedsatt følsomhet hos VISA/hVISA-isolater
Vankomycinresistens Fortsatt sjelden VRSA: bare ca 20 tilfeller på verdensbasis. 1 tilfelle i Europa(Portugal 2015). Hittil ingen i Norge VISA: <0,1 % av S.aureus globalt hvisa: generelt lav forekomst, men lokal opphopning/utbrudd forekommer
KNS KNS: -vana beskrevet hos S.succinus EUCAST: >12000 isolater KNS. Ingen vankomycinresistente
Resistens/heteroresistens Per defenisjon betraktes nå både VRSA og VISA som resistente Betydningen av hvisa er fortsatt ikke avklart,,men antas å være relevant ved alvorlige infeksjoner, spesielt der man mistenker dårlig respons på vankomycinbehandling Selv om vankomycinresistens foreløpig er sjelden i Norge og på verdensbasis, er det sannsynlig at det kan være opphopning av tilfeller ved enkelte sykehus dersom en resistent klon får innpass i miljøet Glidende overgang mellom resistens og følsomhet Betydning av MIC-nivå innenfor følsomhetskategori? MIC-verdier>1 gir dårligere prognose ved invasive infeksjoner tross plassering i følsom kategori Daptomycinbeh ved MRSA-sepsis med vanko MIC>1 gir bedre prognose enn vankomycinbeh.
Mekanismer VRSA: ervervet vana-gen VISA/hVISA: -mange mutasjoner -reverserbart -ulike fenotyper -ikke noe fremmed DNA -tykkere cellevegg -økt forekomst ved økende vankomycin MIC -ofte tidligere vankomycin eksponering -ofte trinnvis utvikling
Hvilke MRSA-isolater skal testes for vankomycinresistens? Per i dag anbefales det å screene alle MRSA-stammer med vanko MIC Oppdager VISA og VRSA, men ikke hvisa hvisa kan utvikle seg til VISA under vankomycinbehandling Test på hvisa kan være aktuelt hos pasienter med: -infeksjoner assosiert med biofilm -infeksjoner med høyt bakterietall -infeksjoner som krever langvarig antibiotikabehandling -infeksjoner med terapisvikt på vankomycinbehandling tross MIC 2 OBS evt repetere MIC-test og test for hvisa etter noen dager ved mistanke om terapisvikt på vankomycin KNS: tester vankomycin MIC ved invasive infeksjoner(bk, proteseinfeksjoner)
Vankomycinresistens, metoder for påvisning hos S.aureus Buljongfortynning. Gullstandard Gradientmetodikk Screeningtester for hvisa: -MET(Macro gradient test). 2 McFarland, BHI. 48 t -GRD(Glykopeptid resistens deteksjonsgradient test). 0.5 McFarland. 48 t. MH med 5% blod -screeningagarer Konfirmasjon hvisa: PAP-AUC
Vankomycinresistens, metodeproblemer Buljongfortynning er gullstandard for MIC-bestemmelse -usikkerhet på et fortynningstrinn i hver retning fra MIC-verdien -påviser VRSA og VISA, ikke hvisa Gradientmetodikk -overestimerer MIC-verdien med 0,5-1 fortynningstrinn sammenlignet med buljongfortynning -Nordicast-dokumentet: MIC bør bestemmes med buljongfortynning Automatiserte metoder? -generelt lavere MIC-verdier enn buljongfortynning(1 trinn) Lappediffusjon -kan bare påvise VRSA, ikke anbefalt Konklusjon: buljongfortynning eller MIC bestemt ved gradientmetode anbefales, spesielt ved MRSA-infeksjoner. Av hensyn til overvåkning ønsker MRSA referanselab vankomycin MIC på alle stammer
Screeningtester for hvisa Enten høyere inokulat, lengre inkubasjon og/eller rikere medier for å detektere resistent subpopulasjon Ingen gullstandard, varierende sensitivitet og spesifisitet MET: Macro gradient test med vanko og teicoplanin strips. Høyre inokulat GRD: glykopeptid resistens deteksjonsgradient, har også vankomycin og teicoplanin strips. Rikere medium Screening-agarer: Både CLSI og Nordicast nevner en screeningagar i sine anbefalinger, men ikke EUCAST. MRSA referanselab har testet ut flere av disse, veldig mange falske positive Konfirmasjon av hvisa: PAP/AUC. Svært arbeidskrevende. Tar 1 uke og krever erfaring
Oppsummering, vankomycinresistens hos S.aureus Lappediffusjon ikke anbefalt Vanko MIC detekterer VRSA og VISA Screening hvisa: macrogradienttest eller GRD. Konfirmasjon av hvisa: PAP-AUC
KNS/vankomycin Vanko MIC. S<4. Buljongfortynningsmetoden anbefalt som for S.aureus hvrse? Usikkert. Ingen test