COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV V2.0 72 Tests P/N: 04894570 190 HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liter P/N: 03587797 190 Wash Reagent TILTENKT BRUK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, versjon 2.0 (v2.0), er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av hepatitt B-virus (HBV)-DNA i humant plasma og serum ved hjelp av COBAS AmpliPrep Instrument for automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer for automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen skal brukes som et hjelpemiddel i utredning av pasienter med kronisk HBV-infeksjon som får antiviral behandling. Analysen kan brukes til å måle HBV DNA-nivåene ved baseline og under behandling som en hjelp for å vurdere respons på behandling. Resultatene fra COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, må tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og laboratoriefunn. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, skal ikke brukes som screeningtest for tilstedeværelse av HBV i blod eller blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av HBV-infeksjon. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Hepatitt B-virus (HBV) er ett av flere virus som er årsak til virushepatitt. Mer enn to milliarder mennesker i verden er infisert med HBV, og mer enn 350 millioner av disse er kronisk infiserte bærere 1,2. Kroniske bærere har høy risiko for å utvikle komplikasjoner av infeksjonen på lengre sikt, inkludert kronisk hepatitt, cirrhose og hepatocellulært karsinom 3,4,5. Serologiske markører er ofte brukt som diagnostiske og/eller prognostiske indikatorer for akutt eller kronisk HBV-infeksjon. Den vanligste markøren på HBV-infeksjon er tilstedeværelsen av HBV-overflateantigen (HBsAg). Selv om bærere kan bli kvitt HBsAg og utvikle antistoff mot HBsAg, ser det ut til fortsatt å være en risiko for alvorlige leverkomplikasjoner senere i livet 6,7. HBV e-antigen (HBeAg) brukes generelt som en sekundær markør som indikator på aktiv HBV-replikering som er forbundet med progressiv leversykdom. Hvis HBeAg ikke forsvinner, økes risikoen for å få kronisk leversykdom 8,9. Varianter av HBV-stammer kan enten produsere HBeAg som ikke kan påvises i serum, eller stammen kan miste evnen til å fremstille HBeAg, selv om det er en aktiv infeksjon til stede 10. Derfor kan bruken av denne markøren til monitorering av sykdomsprogresjon ha begrenset nytte 11. Evnen til å påvise HBV DNA i serum har vist seg å ha en prognostisk verdi for utfallet av akutte og kroniske HBVinfeksjoner 12-15. Metoden gjør det mulig å påvise HBV-DNA etter HBsAg-clearance 16 eller påvise HBV ved manglende serologiske markører 17. Et forhold mellom serologiske markører og HBV-DNA-nivåer er imidlertid ennå ikke etablert. Effekten av antiviral behandling av pasienter med HBV kan også vurderes med serologiske markører eller ved måling av leverenzymfunksjon. Den mest direkte og pålitelige målingen av virusreplikering anses imidlertid å være kvantitering av HBV-virus-DNA i serum eller plasma 14,18-20. Et raskt og vedvarende fall i HBV-DNA-nivåene hos pasienter som mottar behandling med alfainterferon, lamivudin, ganciklovir eller adefovir dipivoxil, har vist seg å være en prediktiv faktor for et gunstig behandlingsutfall 11,21-25. Monitorering av HBV-DNA-nivåer kan predikere utviklingen av lamuvidinresistens 26. En kvantitativ test til måling av HBV-DNA er derfor et verdifullt verktøy som kan brukes sammen med andre serologiske markører ved behandlingen av HBV-infeksjon. Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet. 05876621001-11NO 1 Doc Rev. 13.0

HBV-DNA i plasma kan kvantiteres ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjon, som for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR) 27-29. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0, bruker PCRteknologi for å oppnå maksimal sensitivitet og dynamisk område for kvantitativ påvisning av HBV-DNA i plasma og serum antikoagulert med EDTA. TESTPRINSIPPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er en nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av hepatitt B-virus (HBV)-DNA i humant plasma og serum. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er basert på to hovedprosesser: (1) prøvepreparering for å isolere HBV-DNA og (2) samtidig PCR-amplifikasjon 27 av mål-dna og deteksjon av splittede dobbelmerkede og målspesifikke oligunukleotiddeteksjonsprober. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, muliggjør automatisk prøvepreparering etterfulgt av automatisk PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-hbv-dna og HBV-kvantiteringsstandard (QS)-DNA. Master Mix-reagenset inneholder primerpar og prober som er spesifikke for både HBV-DNA og HBV-QS-DNA. Master Mix er utviklet for å sikre en likeverdig kvantitering av HBV-genotypene A til H. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved hjelp av en målspesifikk og en kvantiteringsstandardspesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe som gir uavhengig identifisering av HBV-amplicon og HBV-QS-amplicon. Kvantiteringen av HBV-virus-DNA utføres ved hjelp av HBV-QS. Kvantiteringsstandarden kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer preparerings- og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av HBV-DNA blir korrekt i hver prøve. Den er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder HBVsekvenser med identiske primerbindingsregioner som mål-hbv-dna, og en unik probebindingsregion som gjør det mulig å skille HBV-QS-amplicon fra HBV-amplicon. Et kjent kopiantall av HBV-QS tilsettes i hver prøve og medføres gjennom trinnene med prøvepreparering, samtidig PCR-amplifikasjon og deteksjon av splittede dobbelmerkede oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner HBV-DNA-nivåene i testprøvene ved å sammenligne HBV-signalet med HBV-QS-signalet for hver prøve og kontroll. Valg av mål Valget av mål-dna-sekvensen for HBV avhenger av identifisering av regioner innen HBV-genomet som viser maksimal sekvenskonservering mellom de ulike HBV-genotypene. Generisk silisiumbasert prøvepreparering blir benyttet til å binde HBV-DNA og HBV-QS-DNA, og definerte oligonukleotider brukes som primere ved amplifikasjon av HBV-DNA og HBV-QS-DNA. En målspesifikk og en QS-spesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe muliggjør uavhengig identifisering av HBV-amplicon og HBV-QSamplicon. Derfor er riktig valg av primere og dobbelmerket oligonukleotidprobe avgjørende for testens evne til å amplifisere og detektere HBV-genotypene. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, bruker tre amplifikasjonsprimere for PCR. En signalgenererende dobbelmerket probe hybridiserer til "anti-sense"-tråden og splittes av Z05 DNA-polymerase under forlenging av primerne. Amplicon av genotypene A F og H består av en sekvens på 145 nukleotider. Genotype G-amplicon består imidlertid av en sekvens på 181 nukleotider. Et innskudd på 36 baser innen den enkelttrådete høykonserverte precore/core-regionen i HBV-genomet gir et større amplicon for genotype G 31. Prøvepreparering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep Instrument ved hjelp av en generisk silisiumbasert bindingsteknikk. I prosedyren blir 500 μl plasma eller serum bearbeidet. HBV-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte HBV-DNA fra DNaser i plasma og serum. Protease og et kjent antall HBV-QS-DNA-molekyler tilsettes til hver prøve sammen med lyseringsreagens og magnetiske glasspartikler. Deretter blir blandingen inkubert, og HBV-DNA og HBV-QS-DNA bindes til overflaten av de magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes ved å vaske de magnetiske glasspartiklene. Etter separasjon av mikropartiklene og fullføring av vasketrinnene elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur i en vandig løsning. Den preparerte prøven, som inneholder magnetiske glasspartikler i tillegg til det frigjorte HBV-DNA og HBV- QS-DNA, tilsettes til amplifikasjonsblandingen og overføres til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. 05876621001-11NO 2 Doc Rev. 13.0

PCR-amplifikasjon PCR-amplifikasjonsreaksjonen utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05). I nærvær av mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 DNA-polymeraseaktivitet 32, 33. Dermed kan PCR-amplifikasjon finne sted sammen med sanntidsdeteksjon av ampliconet. Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der PCR-amplifikasjon skjer. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridintrifosfater, forlenger Z05 DNA-polymerasen de hybridiserte primerne og danner en DNA-tråd. Målamplifikasjon Termocycleren i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer varmer opp reaksjonsblandingen for å denaturere det dobbelttrådete DNA-et og eksponere de spesifikke primermålsekvensene i det sirkulære HBV-DNA-genomet og HBV-QS-DNA. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleosidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridintrifosfater (i stedet for tymidintrifosfater), forlenger termostabilt Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05) de hybridiserte primerne langs måltemplaten og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl som kalles et amplicon. COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. Amplifikasjonen skjer kun i HBV-genomets region mellom primerne. Hele HBV-genomet amplifiseres ikke. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBVtesten, v2.0, ved hjelp av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylase) og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 34, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål- DNA. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med mangan, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon- DNA-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet forblir inaktivt i lengre tid når det utsettes for temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjonen, ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, anvender sanntids 27,28 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroscensmerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av HBV- og HBV-QS-spesifikke oligonukleotidprober med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er HBV- og HBV-QS-probene merket med ulike rapporteringsfluoroforer. Når disse probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluoroforenes fluorescens på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescensaktivitet øker. Amplifikasjonen av HBV-DNA og HBV-QS-DNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av HBV og HBV-QS-DNA. Den PCR-syklusen hvor starten på en eksponensiell vekstkurve inntreffer, er relatert til mengden kildemateriale ved starten av PCR-reaksjonen. 05876621001-11NO 3 Doc Rev. 13.0

Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, gir et nøyaktig kvantitativt resultat i et stort dynamisk område ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere HBV-titer i prøven, jo tidligere øker fluorescenssignalet fra HBV-probens rapporteringsfluorofor ut over fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av HBV-QS-DNA er konstant i alle prøver, skal HBV-QS-probens rapporteringsfluorescens bli påvisbar i samme syklus for alle prøver (se figur 2). I tilfeller der QS-fluorescensen påvirkes justeres konsentrasjonen tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter signalets eksponensielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere titer av det introduserte mål-hbv-materialet. En 2-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-hbv-dna, mens en 10-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct. Figur 1 viser målvekstkurvene for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. Figur 1 Målvekstkurvene for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 9,00 8,00 7,00 Normalisert fluorescens 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Høyeste titer Laveste titer -1,00 0 10 20 30 40 50 Syklusnummer 05876621001-11NO 4 Doc Rev. 13.0

Figur 2 viser vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve, er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. Figur 2 Vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 35,00 30,00 25,00 Laveste titer Normalisert fluorescens 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Høyeste titer -5,00 0 10 20 30 40 50 Syklusnummer Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescensterskelnivået. Figur 3 Fluorescensverdier i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve Normalisert fluorescens 1 0,9 0,8 Ct-verdi = 27,1 0,7 Tilordnet fluorescens-terskelnivå 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0,2 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Syklusnummer 05876621001-11NO 5 Doc Rev. 13.0

HBV-DNA-kvantitering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, foretar en kvantitering av HBV-viralt DNA ved å utnytte en annen målsekvens (HBV-kvantiteringsstandard), som tilsettes prøven i kjent konsentrasjon. HBV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av HBV-sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-hbv-sekvensen. HBV-QS inneholder HBVprimerbindingsregioner og genererer et amplifikasjonsprodukt av tilsvarende lengde og basesammensetning som mål-hbv-dna. HBV-kvantiteringsstandardens deteksjonsprobebindingsregion er modifisert for å kunne skille HBV-QS-amplicon fra mål-hbv-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrerte emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK Software, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for HBV-DNA og HBV-QS-DNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for HBV-DNA og HBV-QS-DNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på HBV-DNAs og HBV-QS-DNAs Ct-verdier. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er standardisert i henhold til WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29, og titerresultater rapporteres i internasjonale enheter (IU/ml). REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: 04894570 190) HBV2 CS1 (HBV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) Magnetiske glasspartikler 93 % isopropanol HBV2 CS2 (HBV lyseringsreagenskassett) Natriumsitratdihydrat 42,5 % guanidintiocyanat < 5 % polydocanol 0,9 % ditiotreitol HBV2 CS3 HBV multireagenskassett inneholder: Pase (proteinaseløsning) Tris-buffer < 0,05 % EDTA Kalsiumklorid Kalsiumacetat 7,8 % proteinase Glyserol EB, v2.0 (Elueringsbuffer, v2.0) Tris-base-buffer 0,2 % metylparaben HBV V2.0 72 tester 1 x 72 tester 1 x 7,0 ml 1 x 72 tester 1x 78 ml 1 x 72 tester 1 x 3,8 ml 1 x 8,1 ml 05876621001-11NO 6 Doc Rev. 13.0

HBV2 CS4 HBV testspesifikk reagenskassett inneholder: HBV QS, v2.0 (HBV kvantiteringsstandard, v2.0) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøs, linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder et område med HBV-primerbindende sekvenser og en unik probebindende region 0,05 % natriumazid HBV MMX, v2.0 (HBV Master Mix, v2.0) Trisinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroksid 0,09 % natriumazid Glyserol < 0,04 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,003 % HBV oppstrøms- og nedstrømsprimere < 0,003 % oligonukleotidaptamer < 0,003 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for HBV og HBV-kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) HBV Mn 2+ (HBV manganløsning) < 0,5 % manganeseacetat Isedikk 0,09 % natriumazid HBV H(+)C, v2.0 (HBV høy positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske 1 x 72 tester 1 x 3,6 ml 1 x 3,4 ml 1 x 19,8 ml 6 x 1,0 ml 6 x 1,0 ml 05876621001-11NO 7 Doc Rev. 13.0

CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HBV H(+)C, v2.0 Clip (strekkodeklips for HBV høy positiv kontroll, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (strekkodeklips for HBV lav positiv kontroll, v2.0) HBV ( ) C Clip (strekkodeklips for HBV negativ kontroll) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumsitratdihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 6 x 1,0 ml 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 5,1 l ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal brukes til humane serum- eller plasmaprøver med EDTA som antikoagulant. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra kontrollflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. G. Kontroller fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. H. Reagenskassetter eller kontroller fra ulike kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, og flasker må ikke byttes om, fjernes eller settes til. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om sikkerhet (SDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. 05876621001-11NO 8 Doc Rev. 13.0

M. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og i CLSI-dokument M29-A3 36. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. N. ADVARSEL: CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24-antigen. Testing av negativt humant plasma med PCR-metoder viste ikke detekterbart HIV-1-RNA, HCV-RNA eller HBV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 må håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og i CLSI-dokumentet M29-A3 36. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. O. HBV QS, v2.0, HBV Mn 2+ og HBV MMX, v2.0 inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Q. Ikke la HBV2 CS2 og flytende avfall fra COBAS AmpliPrep Instrument, som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. R. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Specimen Processing Units), som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. Oppbevar HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 ved 2-8 ºC. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, er disse reagensene stabile i 63 dager ved 2-8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 kan brukes i maksimalt 64 timer til sammen i COBAS AmpliPrep Instrument. Reagenser må oppbevares ved 2-8 C mellom instrumentsykluser. C. Oppbevar HBV H(+)C, v2.0; HBV L(+)C, v2.0 og CTM ( ) C ved 2-8 ºC. Disse kontrollene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. D. Oppbevar strekkodeklips [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip og HBV ( ) C Clip] ved 2-30 C. E. Oppbevar PG WR ved 2-30 C. PG WR er stabilt til angitt utløpsdato. Etter åpning er dette reagenset stabilt i 28 dager ved 2-30 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. 05876621001-11NO 9 Doc Rev. 13.0

MATERIELL SOM MEDFØLGER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: 04894570 190) HBV V2.0 HBV2 CS1 (HBV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler)) HBV2 CS2 (HBV lyseringsreagenskassett) HBV2 CS3 (HBV-multireagenskassett) HBV2 CS4 (HBV-testspesifikk reagenskassett) HBV H(+)C, v2.0 (HBV høy positiv kontroll, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontroll, v2.0) CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] HBV H(+)C, v2.0 Clip (HBV høy positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HBV L(+)C, v2.0 Clip (HBV lav positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HBV ( ) C Clip (HBV negativ kontroll strekkodeklips) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS AmpliPrep Instrument COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Tilleggsutstyr: dokkingstasjon Tilleggsutstyr: cobas p 630 instrument AMPLILINK Software, versjon 3.3 eller 3.4 Kontrollenhet for AMPLILINK Software, med skriver 05876621001-11NO 10 Doc Rev. 13.0

Instrument- og programvaremanualer: Instrumentmanual for COBAS AmpliPrep Instrument for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Instrumentmanual for COBAS TaqMan Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Instrumentmanual for COBAS TaqMan 48 Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software, versjon 3.3 for bruk med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software, versjon 3.4 Valgfritt: operatørmanual for cobas p 630 instrument, programvareversjon 2.2 Testdefinisjonsfil (TDF). Se produktinformasjonskortet som følger med kitet for TDFnavn og gjeldende versjon. Engangsartikler Prøveprepareringsenheter: SPUs Rør for innmating av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter K-spiss rack K-rør, eske med 12 x 96 ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Prøvestativ (SK24-stativ) Reagensstativ SPU-stativ K-carrier K-carrier, løfteverktøy K-carrier, rack Pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser (kapasitet 1000 μl)* Engangshansker, uten pudder Vortexmikser * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. 05876621001-11NO 11 Doc Rev. 13.0

TAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Merk: Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant serum eller plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. A. Taking av prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, skal brukes for serum- eller plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA (lyselilla topp) som antikoagulant eller i SST serumseparatorrør. Oppbevar fullblod ved 2-25 C i maksimalt 24 timer. Separer plasma eller serum fra fullblod innen 24 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved 800-1600 x g i 20 minutter i romtemperatur (15-30 C). Overfør plasma eller serum til et sterilt polypropylenrør. Figur 4 og 5 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. Figur 4 HBV-stabilitet i fullblod; (tatt på rør for EDTA-plasma) 3,0 Titerlogg 10 (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Prøve 2-8 C <1 t. 25-30 C, 24 t. 2-8 C, 24 t. Titerlogg 10 (IU/ml) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Figur 5 HBV-stabilitet i fullblod; (tatt på serumseparatorrør) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Prøve 2-8 C <1 t. 25-30 C, 24 t. 2-8 C, 24 t. 05876621001-11NO 12 Doc Rev. 13.0

B. Transport av prøver Transport av fullblod, plasma eller serum må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 37. Fullblod må transporteres ved 2-25 C og sentrifugeres innen 24 timer etter prøvetaking. Plasma eller serum kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. C. Oppbevaring av prøver Plasma- eller serumprøver kan oppbevares ved 25-30 C i inntil 3 dager, ved 2-8 C i inntil 7 dager eller nedfrosset ved -20 C til -80 C i minst seks uker. Det anbefales at prøvene oppbevares i porsjoner à 800-900 μl i sterile 2,0 ml polypropylenrør med skrukork (for eksempel Sarstedt 72.694.006). Figur 6 og 7 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. 3,0 Figur 6 HBV-stabilitet i EDTA-plasma Titerlogg 10 (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Prøve 2-8 C, 2 t. 25-30 C, 3 d. 2-8 C, 7 d. -20 C, 6 u. -70 C, 6 u. Titerlogg 10 (IU/ml) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Figur 7 HBV-stabilitet i serum 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Prøve 2-8 C, 2 t. 25-30 C, 3 d. 2-8 C, 7 d. -20 C, 6 u. -70 C, 6 u. 05876621001-11NO 13 Doc Rev. 13.0

Plasma- og serumprøver kan fryses ned og tines inntil fem ganger uten tap av HBV-DNA. Figur 8 og 9 viser data fra fryse/tine-studier utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 Figur 8 HBV-resultater etter inntil fem fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (EDTA-plasma) 3,0 Titerlogg 10 (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Prøve 0x Fryse/tine 3x Fryse/tine 5x Fryse/tine Figur 9 HBV-resultater etter inntil fem fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (serum) 3,0 Titerlogg 10 (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Prøve 0x Fryse/tine 3x Fryse/tine 5x Fryse/tine 05876621001-11NO 14 Doc Rev. 13.0

BRUKSANVISNING Merk: For detaljert bruksanvisning og informasjon om bruk av instrumentet, detaljert beskrivelse av mulige konfigurasjoner, utskrift av resultater og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se: (1) instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep Instrument for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (2) instrumentmanualen for COBAS TaqMan Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (3) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48 Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (4) applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, versjon 3.3 for bruk med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, versjon 3.4; (5) valgfritt: operatørmanualen for cobas p 630 instrument, programvareversjon 2.2. Størrelse på analyseserie Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for 72 tester, og disse kan utføres i analyseserier på 12 til 24 tester. Minst én av hver kontroll [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] må tas med i hver analyseserie (se "Kvalitetskontroll"). Arbeidsflyt Analyseringen i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne prøver må prøvene stå i romtemperatur (15-30 C) til de er helt tinte og deretter vortexes i 3-5 sekunder før bruk. Kontrollene skal tas ut fra kjølelagringen på 2-8 C og oppnå romtemperatur før bruk. Klargjøring av COBAS AmpliPrep Instrument Del A. Vedlikehold og gjennomskylling A1. COBAS AmpliPrep Instrument er klart for drift i stand-by-modus. A2. Slå kontrollenheten for AMPLILINK Software på ON. Klargjør kontrollenheten på følgende måte: 1. Logg på operativsystemet Microsoft Windows. 2. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK Software. 3. Logg deg på AMPLILINK Software ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av PG WR ved hjelp av skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på fliken Due. COBAS AmpliPrep Instrument vil automatisk skylle igjennom ("prime") systemet. 05876621001-11NO 15 Doc Rev. 13.0

Del B. Lasting av reagenskassetter Merk Alle reagenskassetter skal tas ut fra 2-8 C lagringsstedet, umiddelbart lastes inn i COBAS AmpliPrep Instrument og skal stå i romtemperatur i instrumentet i minst 30 minutter før den første prøven skal analyseres. Ikke la reagenskassettene oppnå romtemperatur utenfor instrumentet, da det kan forårsake kondens på strekkodeetikettene. Ikke tørk av kondens fra strekkodeetikettene hvis dette skulle forekomme. B1. Plasser HBV2 CS1 i et reagensstativ. Plasser HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 i et eget reagensstativ. B2. Sett inn reagensstativet som inneholder HBV2 CS1 i posisjon A i COBAS AmpliPrep Instrument. B3. Sett inn reagensstativet som inneholder HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4, i posisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep Instrument. (Se tabell 1 for ytterligere informasjon.) Del C. Lasting av engangsartikler Merk: Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), Input S-rør, K-spisser og K-rør som skal brukes. Én SPU, ett Input S-rør, én K-spiss og ett K-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. Det finnes flere mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep Instrument med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. Se tabell 1 under som referanse. Avhengig av den valgte konfigurasjonen settes det inn passende antall reagenskassettstativer, prøvestativer med Input S-rør, SPUstativer, K-spiss racks, K-rør racks og K-carriers på K-carrier racks i de respektive stativposisjonene i COBAS AmpliPrep Instrument (se tabell 1 for ytterligere informasjon). C1. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i posisjon J, K eller L i COBAS AmpliPrep Instrument. C2. Avhengig av den valgte arbeidsflyten settes fylte K-rør rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep Instrument. C3. Plasser fylte K-spiss rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep Instrument. C4. Til arbeidsflyt 3 med COBAS TaqMan 48 Analyzer, settes K-carriers på K-carrier-stativ(er) i posisjon M & N eller O & P i COBAS AmpliPrep Instrument. 05876621001-11NO 16 Doc Rev. 13.0

Tabell 1 Mulige arbeidsflyter ved bruk av COBAS AmpliPrep Instrument med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer 1 2 3 Arbeidsflyt COBAS AmpliPrep Instrument pluss Dokkingstasjon pluss COBAS TaqMan Analyzer COBAS AmpliPrep Instrument pluss COBAS TaqMan Analyzer COBAS AmpliPrep Instrument pluss COBAS TaqMan 48 Analyzer(er) Overføringsmodus for COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Automatisert overføring av K-carrier Manuell overføring av K-rør via prøvestativ til COBAS TaqMan Analyzer Manuell overføring av K-carrier via K-carrier-stativ til COBAS TaqMan 48 Analyzer Stativer og engangsartikler K-rør i fulle K-rør racks K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ K-rør i fulle K-rør rack K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i prøvestativ (klar for manuell overføring) K-rør i prøvestativ K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Tom, strekkodemerket K-carrier i K-carrier rack Etter fullført prøvepreparering: K-rør i K-carrier i K-carrier rack Posisjon på COBAS AmpliPrep Instrument M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som over (F H) F H M P F H J L A B E M P Samme som over (M P) 05876621001-11NO 17 Doc Rev. 13.0

Del D. Bestilling og innlasting av prøver D1. Klargjør prøvestativene på følgende måte: Fest en strekkodeklips til hver prøvestativposisjon der en prøve (S-rør) vil bli plassert. Fest en av de spesifikke strekkodeklipsene for kontrollene [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i hver prøvestativposisjon der kontrollene (S-rør) skal plasseres. CTM ( ) C må plasseres i prøvestativposisjonen etter den siste kliniske prøven eller positive kontrollen [HBV L(+)C, v2.0 eller HBV H(+)C, v2.0] i hver analyseserie på 12 til 24 tester. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Plasser ett Input S-rør i hver posisjon som har en strekkodeklips. D2. Bruk AMPLILINK Software til å opprette prøvebestillinger for hver prøve og kontroll i vinduet Orders i mappen Sample. Velg den korrekte testfilen, og avslutt med å lagre. D3. Tildel prøve- og kontrollbestillinger til prøvestativposisjoner i vinduet Orders i mappen Sample Rack. Prøvestativnummeret må stemme overens med det stativet som ble klargjort i trinn D1. D4. Skriv ut rapporten Sample Rack Order og bruk den som arbeidsark. D5. Klargjør prøve- og kontrollstativ i det reserverte området for tilsetting av prøver og kontroller på følgende måte: Vortex hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i 3 til 5 sekunder. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles. D6. Overfør 650 μl av hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] til det korresponderende strekkodemerkede Input S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra den opprinnelige prøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og registrert på arbeidsarket i trinn D4. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Vær forsiktig, slik at den øvre delen av S-rørene ikke kontamineres av prøver eller kontroller. D7. Se i operatørmanualen til cobas p 630 instrument ved bruk av cobas p 630 instrument til klargjøring av prøver. D8. Til arbeidsflyt 1 og 2 settes prøvestativ med Input S-rør i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep Instrument. D9. Til arbeidsflyt 3 ved bruk av COBAS TaqMan 48 Analyzer settes prøvestativ med Input S-rør og K-rør (ett til hvert Input S-rør, innsatt i posisjonen til høyre ved siden av Input S-rør) i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep Instrument. Del E. Start av kjøringen på COBAS AmpliPrep Instrument E1. Start COBAS AmpliPrep Instrument med AMPLILINK Software. Del F. Avslutning av kjøringen på COBAS AmpliPrep Instrument og overføring til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer (kun for arbeidsflyt 2 og 3) F1. Sjekk om det kommer opp flagg eller feilmeldinger. F2. Ta ut de preparerte prøvene og kontrollene fra COBAS AmpliPrep Instrument på enten prøvestativ (for COBAS TaqMan Analyzer uten dokkingstasjon) eller K-carrier racks (for COBAS TaqMan 48 Analyzer), avhengig av valgt arbeidsflyt (se del G for ytterligere informasjon). F3. Fjern avfall fra COBAS AmpliPrep Instrument. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke utsettes for lys etter at prøve- og kontrollprepareringen er fullført. 05876621001-11NO 18 Doc Rev. 13.0

Amplifikasjon og deteksjon Klargjøring av COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Analyseringen i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares. Del G. Innlasting av preparerte prøver G1. Avhengig av den valgte arbeidsflyten utføres de nødvendige trinnene for å overføre K-rør til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer: Arbeidsflyt 1: Automatisk overføring av K-carrier via dokkingstasjon til COBAS TaqMan Analyzer. Dette krever ikke manuelle inngrep fra brukeren. Arbeidsflyt 2: Manuell overføring av K-rør i prøvestativ til COBAS TaqMan Analyzer Arbeidsflyt 3: Manuell overføring av K-carrier på K-carrier rack(s) til COBAS TaqMan 48 Analyzer. Manuell overføring av K-carriers til COBAS TaqMan 48 Analyzer ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. Del H. Start av kjøringen på COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer H1. Start COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer ved å foreta et av valgene nedenfor avhengig av hvilken arbeidsflyt som er brukt: Arbeidsflyt 1: Arbeidsflyt 2: Arbeidsflyt 3: Krever ingen inngrep fra brukeren. Automatisk start av COBAS TaqMan Analyzer etter innsetting av prøvestativ. Fyll K-carrier med tomme K-rør hvis det er færre enn 6 K-rør i K-carrier. AMPLILINK Software veileder i fyllingen. Åpne termoblokkdekselet, sett inn K-carrier i termoblokken og steng lokket. Start kjøringen på COBAS TaqMan 48 Analyzer. Del I. Avslutning av kjøringen på COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer I1. Skriv ut resultatrapporten når analyseserien i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer er fullført. Sjekk om det finnes flagg eller feilmeldinger i resultatrapporten. Prøver med flagg og kommentarer tolkes slik som beskrevet under "Resultater". Lagre dataene i arkivet når de er godkjent. I2. Ta ut brukte K-rør fra COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. 05876621001-11NO 19 Doc Rev. 13.0

RESULTATER COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner automatisk HBV-DNAkonsentrasjonen for prøvene og kontrollene. HBV-DNA-konsentrasjonen uttrykkes i IU/ml. Omregningsfaktoren mellom HBV-kopier/ml og HBV IU/ml er 5,82 kopier/iu, basert på WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29. Resultatene kan konverteres manuelt til kopier/ml ved bruk av omregningsformelen beskrevet under: HBV-DNA-konsentrasjon i IU/ml x 5,82 kopier/iu = HBV-DNA i kopier/ml Eksempel: 1,23E+04 IU/ml x 5,82 kopier/iu = 7,16E+04 kopier/ml Merk: Det analytiske måleområdet for analyttverdier som kan måles direkte på en prøve uten fortynning med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er 20 til 1,7E+08 IU/ml. Merk: Det klinisk rapporterbare området for analyttverdier som kan måles direkte på en prøve med en maksimal fortynning på én til ti ved bruk av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er 20 til 1,7E+09 IU/ml. AMPLILINK Software: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for HBV-DNA og HBV-QS-DNA. Bestemmer HBV-DNA-konsentrasjon basert på Ct-verdiene for HBV-DNA og HBV-QS-DNA samt de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene angitt på kassettenes strekkoder. Bestemmer at beregnet IU/ml for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 faller innenfor de fastsatte akseptområdene. Validering av analyseserie - AMPLILINK versjon 3.3 og versjon 3.4 For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK Software eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontroller blir det foretatt en sjekk for å bestemme om IU/ml-verdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis IU/ml-verdien for kontrollen ligger utenfor akseptområdet, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen har feilet. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. 05876621001-11NO 20 Doc Rev. 13.0

Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for HBV-kontrollene. Negativ kontroll: Flagg Resultat Tolkning NC_INVALID Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-hbv HBV lav positiv kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning LPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet HBV høy positiv kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater Hvis analyseserien er gyldig, må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Titerresultat Tolkning Target Not Detected Rapporter resultatene som "HBV-DNA ikke detektert". < 2.00E+01 IU/mL Beregnet IU/ml er lavere enn analysens deteksjonsgrense. Rapporter resultater som "HBV-DNA detektert, mindre enn 20 HBV-DNA IU/ml". 2.00E+01 IU/mL og 1.70E+08 IU/mL Beregnet resultat er større enn eller lik 20 IU/ml og mindre enn eller lik 1,70E+08 IU/ml, og ligger innenfor analysens lineære område. > 1.70E+08 IU/mL Beregnet IU/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,70E+08 HBV DNA IU/ml". Om et kvantitativt resultat er ønskelig, må originalprøven fortynnes med HBV-negativt humant serum eller EDTA-plasma, avhengig av originalprøvens matriks, og analysen må repeteres. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Prøver som ligger høyere enn analysens måleområde og som gir et ugyldig resultat med flagget "QS_INVALID", må ikke rapporteres som >1,70E+08 IU/ml. Originalprøven bør fortynnes med HBV-negativt humant serum eller EDTA-plasma, avhengig av originalprøvens matriks, og analysen må repeteres. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Titerresultat "Failed". Tolkning: Prøven er ikke behandlet på korrekt måte under klargjøring på COBAS AmpliPrep Instrument. Merk: Titerresultat "Invalid". Tolkning: Et ugyldig resultat 05876621001-11NO 21 Doc Rev. 13.0

KVALITETSKONTROLL Én CTM ( ) C, én HBV L(+)C, v2.0 og én HBV H(+)C, v2.0 må inkluderes i hver analyseserie. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Det er ingen krav til plassering av positive kontroller [HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i prøvestativet. CTM ( ) C må imidlertid plasseres i prøvestativposisjonen etter den siste kliniske prøven eller positive kontrollen [HBV L(+)C, v2.0 eller HBV H(+)C, v2.0] i hver analyseserie på 12 til 24 tester. Kontroller om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CTM ( ) C skal vise resultatet "Target Not Detected". Hvis CTM ( ) C flagges som ugyldig, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis CTM ( ) C er ugyldig i flere gjentatte analyseserier. Positive kontroller De fastsatte titerområdene for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 er angitt på strekkodene for reagenskassettene for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. HBV-DNA IU/mL for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 må ligge innenfor de fastsatte titerområdene. Hvis en av eller begge de positive kontrollene flagges som ugyldige, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve - og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis HBV-DNA-titer for en av eller begge de positive kontrollene konsekvent er utenfor akseptområde i flere analyseserier. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Denne testen er validert for bruk sammen med humant serum eller plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. 2. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. 3. Tilstedeværelsen av AmpErase-enzymet i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Master Mix, v2.0, reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Men kontaminering fra HBV-positive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 4. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 5. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS AmpliPrep Instrument og COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. 6. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor den høyt konserverte regionen av virusgenomer som er dekket av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 primere og/eller prober, føre til manglende evne til å påvise viruset. 7. Deteksjon av HBV-DNA er avhengig av antall viruspartikler som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoden for prøvetaking og pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer og/eller infeksjonsstadium). 05876621001-11NO 22 Doc Rev. 13.0