FORFATTER(E) OPPDRAGSGIVER(E) RAPPORTNR. GRADERING OPPDRAGSGIVERS REF. A112023 Åpen Bjørn Gjellan Nielsen (NCE), Siri Hanson (Vestlandsrådet)

1 TITTEL SINTEF RAPPORT SINTEF Fiskeri og havbruk AS Marin ressursteknologi Rotatorier som levendefôr til torskeyngel Postadresse: 7465 Trondheim Besøksadresse: SINTEF Sealab Brattørkaia 17C Telefon: 4000 5350 Telefaks: 932 70 701 E-post: fish@sintef.no Internet: www.sintef.no Foretaksregisteret: NO 980 478 270 MVA FORFATTER(E) Gunvor Øie, Ingrid Overrein, Werner Storøy, Jorunn Skjermo, Keshuai Lee, Marius Monsen og Trond Størseth OPPDRAGSGIVER(E) NCE Aquaculture, Vestlandsrådet og norske yngeloppdrettere av marine fiskelarver RAPPORTNR. GRADERING OPPDRAGSGIVERS REF. A112023 Åpen Bjørn Gjellan Nielsen (NCE), Siri Hanson (Vestlandsrådet) GRADER. DENNE SIDE ISBN PROSJEKTNR. ANTALL SIDER OG BILAG 978-82-14-05119-3 820156/820139 77 ELEKTRONISK ARKIVKODE PROSJEKTLEDER (NAVN, SIGN.) VERIFISERT AV (NAVN, SIGN.) 820156/Sluttraport (april 2011) Gunvor Øie Werner Storøy ARKIVKODE DATO GODKJENT AV (NAVN, STILLING, SIGN.) 2011-04-05 Gunvor Øie (Fung.Forskningssjef) SAMMENDRAG Stabil og forutsigbar produksjon av rotatorier er avgjørende for å lykkes med marin yngelproduksjon. I denne rapporten gis det en innføring i dagens kunnskap knyttet til rotatorier (DP1). Dette omfatter tema som generell biologi, ernæring, mikrobiologi, produksjonsformer og ny teknologi. Delprosjekt 2 (DP2) omfatter dyrking og kjemiske analyser av de vanligste dyrknings- og anrikingsfôrene som benyttes til rotatorier i Norske klekkerier i dag. Resultatene viste at næringsinnholdet i rotatorier kan variere vesentlig gjennom en dyrkningsperiode hvor det er blitt brukt samme fôringsdose av DHA Chlorella. Det ser også ut til næringsinnholdet rotatoriene får gjennom dyrkningsfasen bestemmer mye for rotatorienes ernæringsstatus etter en anrikning. Dette vil si deres innhold av protein, lipid, karbohydrat, og dermed også deres innhold av energi. I delprosjekt 3 (DP3) ble de to rotatorieartene B.plicatilis (Nevada) og B.ibericus (Cayma) sammenlignet. De ble vurdert ut fra vekst, vannkvalitet i kulturene, mikrobielle og ernæringsmessige forhold. Økende grad av vannutskifting gav en positiv effekt og reduserte nivået av ammoniakk og antallet koloniformende bakterier i rotatoriekulturene. De to rotatoriene B. Nevada og B. Cayman oppnådde like fettsyreprofiler når de ble anriket med same lipidkilde, og fettsyresammensetningen i begge rotatoriene var godt korrelert med nivåene i diettene. I delprosjekt 4 (DP4) ble rotatorier sammenlignet med pollplankton og dyrkede copepoder (Acartia tonsa) ved hjelp av NMR. Her ble det konkludert med at pollplankton og dyrkede copepoder er svært like i sammensetning. Det siste delprosjektet (DP5) omfatter analyser fra yngelklekkeriene i Norge. Yngelanleggene ble besøkt to ganger iløpet av en startfôringsperiode, og prøver av rotatorier og fiskelarver ble tatt ut. Rotatorieprøvene ble analysert ved hjelp av NMR. I tillegg ble det utført analyser av karbon og nitrogen innhold i rotatoriene og fiskelarvene. Det ble konkludert med at det er forskjeller mellom anleggene og at det er forskjeller i reproduserbarhet mellom prøveuttakene for de ulike anleggene. STIKKORD NORSK ENGELSK GRUPPE 1 Rotatorier Rotifers GRUPPE 2 EGENVALGTE

2 INNHOLDSFORTEGNELSE 1 ROTATORIER (DP1)... 4 1.1 Rotatoriebiologi... 4 1.1.1 Introduksjon og rotatoriebiologi... 4 1.1.2 Generell biologi... 4 1.1.3 Morfologi... 5 1.1.4 Fôring og fordøyelse... 6 1.1.5 Nervesystemet... 7 1.1.6 Bevegelse... 7 1.1.7 Reproduksjon... 7 1.2 Produksjon av rotatorier... 8 1.2.1 Dyrkingsmetoder... 8 1.2.2 Telling av rotatorier... 8 1.2.3 Vannkvalitet... 9 1.3 Ernæring... 9 1.3.1 Protein... 10 1.3.2 Lipider... 12 1.3.3 Marine fiskelarver har behov for essensielle fettsyrer i dietten... 12 1.3.4 Problemer med oksiderte emulsjoner... 13 1.3.5 Karbohydrat... 14 1.3.6 Mineraler... 14 1.3.7 Vitaminer... 14 1.4 Vasking og lagring av rotatorier før utfôring til fiskelarver... 14 1.5 Stamkultur... 15 1.6 Mikrobiell kontroll... 16 1.7 Ny teknologi... 18 1.7.1 Dyrking av rotatorier i resirkuleringssystem... 18 1.7.2 Automatisk telling av rotatorier... 19 1.8 Fordøyelse i marine fiskelarver... 20 2 DYRKING OG ANRIKING AV ROTATORIER (DP2)... 21 2.1 Bakgrunn... 21 2.2 Mål... 22 2.3 Materialer og metoder... 22 2.3.1 Dyrkning av rotatorier... 22 2.3.2 Anrikning... 23 2.3.3 Prøveuttak... 23 2.3.4 Vanninnhold og askefri tørrvekt... 24 2.3.5 Innhold av karbon og nitrogen... 24 2.3.6 Protein innhold per individ... 24 2.3.7 Lipid og fettsyreinnhold... 25 2.4 Analyser og beregninger... 25 2.4.1 Tørrvekt per individ... 25 2.4.2 Karbohydrat innhold... 25 2.4.3 Kalori innhold... 26 2.4.4 Innhold av iod og selen... 26 2.5 Resultater... 26 2.5.1 Målinger basert på innhold per tørrvekt... 26 2.5.2 Målinger basert på innhold per individ... 31

3 2.5.3 Innhold av energi i rotatorier... 34 2.5.4 Innhold av Jod og Selen... 38 2.5.5 Konklusjon... 38 3 NÆRINGSVERDI OG DYRKNINGS KARAKTERISTIKA FOR TO STAMMER FRA ARTSKOMPLEKSET BRACHIONUS PLICATILIS (B. Nevada og B. Cayman ) (DP3)... 39 3.1 Bakgrunn... 39 3.2 Materialer og metoder... 40 3.2.1 Fortynning av rotatoriekulturer... 40 3.3 Resultater effekt av ulik vannutskiftingsrater på rotatorier... 43 3.3.1 Morfometri... 43 3.4 Tetthet av rotatorier ved ulike fortynninger... 44 3.5 Ammoniakk... 46 3.6 Mikrobiologi... 48 3.6.1 Kulturvann... 48 3.6.2 Rotatorier... 50 3.7 Konklusjon... 51 4 Resultater manipulering av PC og PE i to arter rotatorier... 52 4.1 Anrikning av rotatorier med ulike lipidkilder... 52 4.1.1 Lipid innhold og fettsyrer i dietter... 52 4.2 Rotatorier... 56 4.2.1 Innhold av total lipid i rotatorier og copepoder... 56 4.2.2 Fettsyre sammensetning i rotatorier... 57 4.2.3 Kvantitativt innhold av fettsyrer i totale lipider... 58 4.2.4 PC og PE innhold i rotatorier... 60 4.2.5 Sammenheng n-3 HUFA nivåer i PC og PE mellom dietter og rotatorier... 60 4.3 Konklusjon... 63 5 SAMMENLIGNING AV DYRKEDE ROTATORIER, DYRKEDE COPEPODER OG PLANKTON FRA POLL (DP4)... 64 5.1 Bakgrunn... 64 5.2 Mål... 64 5.3 Materiale og metode... 65 5.4 Resultat og diskusjon... 66 5.5 Konklusjon... 67 6 NÆRINGSSAMMENSETNING I ROTATORIER VED ULIKE YNGELANLEGG (DP5)... 68 6.1 Bakgrunn... 68 6.2 Mål... 68 6.3 Materiale og metode... 68 6.3.1 Generell beskrivelse av rotatorieproduksjon ved anleggene... 68 6.3.2 NMR metabolomics... 69 6.3.3 CN analyser... 69 6.4 Resultat og diskusjon... 70 6.4.1 NMR analyser... 70 6.4.2 CN analyser... 72 6.5 Konklusjon... 76 7 Litteratur... 76

4 1 ROTATORIER (DP1) 1.1 Rotatoriebiologi 1.1.1 Introduksjon og rotatoriebiologi Rotatorier fra slekten Brachionus har blitt benyttet i akvakultur siden tidlig på 60-tallet. (Ito, 1960, omtalt av Nagata and Hirata, 1986). Rotatorier ble først sett på som ett problem pga. oppblomstring i ålekulturer, men etter hvert ble de testet som levendefôr til fiskelarver (Ito, 1960). Den første tiden ble rotatoriene dyrket opp på levende alger, noe som krevde store volum og førte til kulturer med lav tetthet. Etter hvert er nye fôrkilder blitt utviklet, og tettheten i rotatoriekultuer har økt betraktelig. I dag er rotatorier viktig som levendefôr for en lang rekke fiske- og skalldyrarter rundt om i verden. På norsk kalles rotatorier for hjuldyr på grunn av at ciliekransen på toppen av dyret ser ut som to hjul. Rotatorier blir benyttet som levendefôr fordi de er enkle å dyrke opp i høye tettheter hele året rundt. Rotatoriestørrelsen passer til munnstørrelsen på mange fiskelarver, og svømmeaktiviteten til rotatoriene er rolig, slik at de er enkle å fange for fiskelarvene. Rotatoriene er tolerante når det å tilpasse seg variasjoner i omgivelsene som temperatur, salinitet, ph og temperatur. Næringsinnholdet i rotatoriene er enkelt å manipulere, og kan bli tilpasset fiskelarvenes behov. De første ukene etter at fiskelarvene har begynt å spise levendefôr er helt avgjørende for fiskelarvens utvikling og levedyktighet. Det er derfor svært viktig å produsere rotatorier med godt næringsinnhold, god mikrobiell flora og høy viabilitet. 1.1.2 Generell biologi Rotatorier er små invertebrater som stort sett lever hovedsakelig i ferskvann, men det finnes arter som lever i sjøvann, brakkvann og i fuktige terrestriske miljø, som foreksempel på mose. Det finnes i overkant av 2000 ulike rotatoriearter, og det oppdages stadig nye arter. Slekten Rotifera er delt i to superklasser kalt Seisona og Eurotatoria. Brachionus-komplekset er en av de mest studerte gruppene av rotatorier og taksonomien blir stadig revidert. I akvakultur blir flere ulike Brachionus-arter benyttet. Genetiske analyser har vist at det man tidligere trodde var Brachionus plicatilis, ikke er en enkelt art men flere ulike arter. Det er antatt at Brachionuskomplekset består av 15 arter (Ciros-Perez et al., 2001, Gomez et al. 2002, Suatoni et al., 2006). Genetiske analyser har revolusjonert den taksonomiske klassifiseringen av Brachionus arter det siste 10 året.

5 Identifisering av arter brukt i eksperimenter og ved klekkerier er viktig fordi de ulike artene har forskjellig veksthastighet (Venetia and Vadstein, 2007), lorica lengde, optimum for salinitet og temperatur, svømmeaktivitet, størrelesespreferanse til fôrpartikler (Baer et al. 2008, Vadstein et al. 1993) og biokjemisk sammensetning (Monsen 2007). Dette fører til at både størrelse og næringssammensetning varierer mellom de ulike Barchionus artene, som i neste omgang vil være viktig for fiskelarvene. I perioden fra 1950 til år 2000 ble det publisert ca 750 artikler som omhandlet B.plicatilis. Dessverre er det kun noen få artikler som har riktig artsbestemmelse, slik at en del av denne akkumulerte kunnskapen har begrenset verdi i dag (Suatoni et al. 2006). 1.1.3 Morfologi Brachionus artene har noen særegne trekk som inkluderer corona ( hodet ) med en ciliekrans og mastax. På framsiden av hodet sitter corona som består av to konsentriske cilierte kroner. Dette roterende organet er viktig for matinntaket og for bevegelse. Kroppen er dekket med et skall kalt lorica, som består av keratinliknende proteiner. Lorica har pigger i toppen, og spissheten på disse piggene kan benyttes i artsbestemmelsen. Rotatoriene har også en fot med to tær. Et limliknende sekret kan skilles ut i tærne, slik at rotatorien blir i stand til å feste seg til underlaget. Rotatoriene er i stand til å trekke foten inn i lorica ved hjelp av langsgående muskler. Rotatoriene beveger seg ved hjelp av ciliekransen, foten og bevegelsen blir enklere ved kontraksjon av muskler inne i rotatorien. Rotatorier har et veldig enkelt nervesystem. Under corona ligger en enkel stor nerveknute. Fra denne enkle hjernen går to para nerveceller ned i foten, med forgreninger til ulike organer. Rotatoriene har også sensoriske celler som er delt opp i mekaniske reseptorer, kjemoreseptorer og fotoreseptorer.

6 1.1.4 Fôring og fordøyelse Partikler fra vannet når munnåpningen og passerer svelget. Den cilierte kronen er viktig i fôropptaket. Svelget innholder mastax hvor fôrpartiklene blir knust i et oppmalingsorgan kalt trophi, trolig ved hjep av enzymer. De harde delene av trophi er viktig i taksonomisk bestemmelse av arter. De knuste fôrpartiklene blir deretter ført ned i fordøyelseskanalen sammen med magesaft fra store magesaftkjertler, og ekstracellulær fordøyelse skjer i magesekken. Mange ulike enzymer er rapportert fra B.plicatilis. Dette omfatter proteaser (Hara et al. 1984a,b, Kuhle og Kleinow 1985, Wetthmar og Kleinow 1993), α-amylase, laminarinase, cellulase, cellobiohydrolase, lysozyme og β-1,3-lucanase (Hara et al. 1997, Kuhle og Kleinow 1985, 1989, 1990). Deretter føres maten med i tarmen og i kloakken, hvor også væske fra blæren skilles ut sammen med egg fra egglederne. Rotatoriene har ikke respirasjonssystem eller sirkulasjonssystem, og kroppsvesker er lokalisert i pseudocoelom (uekte bukhule) (Lubzens 2003). Muskelsammentrekninger i kroppen hjelper til med sirkulasjon av kroppsvæske. Rotatoriene bytter gasser og kvitter seg med nitrogen avfall ved diffusjon gjennom kroppsoverflaten, i tillegg har de primitive nyrer som fører avfallstoffer ned i blæren. B.plicatilis er osmokonform og det vil si at de justerer kroppsvæskens osmolaritet til den konsentrasjonen i omgivelsene (Epp and Winston, 1977). Kun ved lave saltkonsentrasjoner i omgivelsene, så har rotatoriene høyere konsentrasjon i kroppen (Epp og Winston, 1977). Rotatoriene tåler store variasjoner i salinitet.

7 1.1.5 Nervesystemet Nervesystemet består av en hjerne-nerveknute, og er lokalisert under corona. Nerveceller går ned langs kroppen på hver side til foten, med greiner til andre organ. Rotatorienes senoriske organer kan deles i mekaniske reseptorer, kjemiske reseptorer og foto reseptorer. De mekaniske reseptorene finnes på corona, antenner, svelg og fot. Kjemiske reseptorer finnes på corona, og er viktig ved valg av forpartikler. Mange arter har en eller flere lysregistrerende øyeflekker. 1.1.6 Bevegelse Rotatoriene beveger seg ved hjelp av ciliekransen og foten. I tillegg vil muskelsammentrekninger i kroppen hjelpe til med bevegelsen. Svømmeaktiviteten blir påvirket av temperatur, salinitet, amoniakk konsentrasjon, ph, oksygen nivå og fôrkonsentrasjon. Svømmehastigheten kan være en indikator på om forholdene i kulturen er bra eller dårlig. 1.1.7 Reproduksjon I rotatoriekulturer er normalt alle individene hunndyr. Så lenge kulturbetingelsene er gode vil populasjonen øke ved hjelp av partenogenese (ukjønna formering). Diploide hunndyr produserer diploide egg (amiktiske egg), som vil klekke og utvikle seg til et diploid hunndyr. Seksuell reproduksjon kan skje ved spesielle omstendigheter, og haploide hanndyr vil bli produsert. Mekanismene bak skifte i seksuell og aseksuell formering er ikke helt klarlagt, men laboratoriestudier inkluderer næringstilførsel, tetthet, salinitet og genetiske faktorer (Pourriot and Snell, 1983, Serra and King, 1999, Ricci, 2001). Diploide hunndyr kan enten bli amiktiske eller miktiske og morfologisk er de umulig å skille. Amiktiske hunndyr produserer ved parthenogenese (jomfrufødsel) diploide egg som utvikler seg ved mitose* til hunndyr, mens miktiske hunndyr produserer partenogenetisk haploide egg ved meiose. Dersom en miktisk hunn ikke parer seg og egget ikke befruktes, så utvikles det til et hanndyr. Hanndyrene er mye mindre enn hunndyrene og de beveger seg veldig raskt. Etter kjønna formering vil det bli utviklet diploide hvileegg. Hvileeggene vil klekkes etter en hvileperiode (Hagiwara 1996, Lubzens et al. 2001), men de kan overleve mange år i sedimentene før de klekker. *Mitose er celledeling som fører til to identiske celler, lik den cellen som delte seg, og med like mange kromosomer. Meiose er celledeling hvor antallet kromosomer halveres.

8 1.2 Produksjon av rotatorier Rotatorier kan dyrkes i mange typer systemer, alt fra små bøtter til store betongdammer på mange hundre kubikk. I klekkerier rundt omkring i verden finnes produksjonstanker av ulikt materiale, størrelse og form. Det mest vanlige i norske klekkerier er runde plast eller glassfiber tanker med konisk bunn på ca. 1-5 m 3, men også større tanker med flat bunn på 5-10 m 3 blir benyttet. Tankene tilsettes luft via luftesteiner, som sørger for omrøring og oksygen tilførsel ved lave tettheter. Ved høyere tetthet (>500 ind/ml) er det i tillegg nødvendig å ha et system for tilsetting av ren oksygen. Det benyttes ulik temperatur og saltholdighet på vannet avhengig av hvilken rotatorie art som produseres. Vannet som benyttes bør være godt filtrert (ned til 1µm) for å redusere risikoen for forurensning. De vanligste artene benyttet i norske klekkerier dyrkes på 20-28 ºC og ved en saltholdighet på 20-35. I Japan blir rotatoriene fôret med konsentrerte alger (ferskvanns Clorella). Denne algen er nå kommersielt tilgjengelig i Norge, og flere klekkerier benytter seg av denne i sin produksjon. Da Chlorella inneholder lite av visse typer fettsyrer som EPA og DHA blir de produserte rotatoriene lite egnet som fôr til marine fiskelarver. Rotatoriene må derfor anrikes med et eget anrikingsfôr etter produksjonen. Rotatorier kan også dyrkes på vanlig bakegjær sammen med en emulgert olje, eller andre kommersielle dietter typisk bestående av en blanding av gjær og mikroalger tilsatt vitaminer og mineraler. 1.2.1 Dyrkingsmetoder Ulike metoder kan benyttes for dyrking av rotatorier. Disse kan beskrives som batch-, semikontinuerlig- og kontinuerlig dyrking. Batch kulturer er produksjon i lukket system med tilgang på luft, oksygen og fôr. Kulturene startes vanligvis på relativ lav tetthet, og høstes i sin helhet etter noen få dager når kulturen har oppnådd en tetthet på 3-4 ganger av start tetthet. Kontinuerlige kulturer er åpne kultursystemer som tilføres de nødvendige ressursene og høstes regulært ved å erstatte et bestemt volum av kulturen per dag (semikontinuerlig) eller kontinuerlig. Begge metodene, samt tilpassede kombinasjoner av metodene blir benyttet i klekkeriene i dag. Når det gjelder valg av dyrkingsmetode vil rotatoriekvalitet, skala for produksjonen, kostnader, risiko og klekkerirutiner påvirke valg av metode. Kunnskap om rotatoriebiologi, ernæring, omgivelsesbehov og egenskaper ved produksjonssystemet er viktig for å oppnå stabil og sikker produksjon av rotatorier. 1.2.2 Telling av rotatorier Det er viktig å beregne riktig tetthet av rotatoriene i en kulturtank pga. at dette tallet er grunnlaget for beregning av fôrdoser. Det er mange muligheter for feilkilder, som f.eks. ved uttak fra kultur tank, uttak fra prøveglass, kalibrering av pipette og menneskelige faktorer. Det er derfor en fordel

9 at samme person har ansvar for disse analysene. Prøvetaking kan gjøres ved bruk av en lang glasstav som senkes ned i kulturen. Denne fylles flere ganger over i et begerglass. Fra begerglasset blir 12 prøver tatt ut (25, 50 eller 100 ul). Det er viktig at prøven er homogen ved uttaket. Dette kan gjøres ved å slå innholdet i begerglasset over i et nytt glass rett før uttaket. Både antall rotatorier og antall egg telles i alle dråpene, deretter fjernes det høyeste og det laveste tallet, og gjennomsnittet beregnes. Regn om til antall dyr per ml, og beregn total biomasse i tanken. Biomassen kan deretter benyttes til beregning av daglig fôr dose. Eggratioen er bestemt av antall egg dividert på antall rotatorier i prøven. Eggratio eller eggfrekvens (antall egg per rotatorie) er en viktig indikator for å vurdere kulturstatus. Dette tallet vil gi en indikasjon på forventet vekst til neste dag. Eggratio vil, slik som veksthastighet, avhenge av fôrkvalitet og kvantitet, oksygennivå, ammoniakk nivå, ph, temperatur og salinitet. 1.2.3 Vannkvalitet Rotatoriekulturer må observeres daglig siden larveproduksjonen i marine yngelanlegg er helt avhengig av en stabil og forutsigbar produksjon av høykvalitets rotatorier. Et vanlig problem i rotatorieproduksjonen er overfôring, som i neste omgang kan føre til oksygenmangel eller for høye ammoniakkonsentrasjoner. Det optimale ammoniakk nivået er <1mg l -1 og et akseptabelt nivå for ammoniakk og nitrat er 6-10 mg l -1 (Lubzens, 2003). I vann vil ammoniakk finnes i to former: NH 4+ (ammonium) og NH 3 (ammoniakk). NH 3 er giftig for rotatoriene, og andelen av NH 3 i kulturvannet blir påvirket av temperatur, salinitet og ph. Den optimale ph i rotatoriekulturer er 7,5-8,5 (Hirano 1987). For å sikre omrøring og tilstrekkelig oksygen til kulturene blir luft og oksygen tilsatt over konen i kulturtankene. Oksygennivået bør være over 4ppm. De fleste klekkerier har automatisk overvåkning og dosering av oksygen konsentrasjonen i vannet. Dette gjør det enkelt å holde oksygeninnholdet godt innefor tålegrensen til rotatoriene og kulturene har typisk en oksygenmetning på 90-100 %. 1.3 Ernæring Rotatorier kan spise et stort spekter av partikler, inkludert bakterier, protozoer, mikroalger og dødt organisk materiale. Rotatorier kan spise partikler innen en viss størrelse, så det er derfor viktig å sjekke partikkelstørrelse på kultiveringsfôr og anrikingsfôr. B.plicatilis er i stand til å konsumere større partikler enn B. rotundiformis. I tillegg til partikkelstørrelse må fôret tilfredsstille de ernæringsmessige kravene og gi tilfredsstillende hygieniske forhold i kulturtankene. Mange arter av mikroalger er perfekt fôr for rotatorier. Det finnes flere ulike konsentrat av mikroalger som er kommersielt tilgjengelig. Bruk av mikroalger som fôr gir ofte høyere eggratio og veksthastighet, i

10 tillegg til lavere bakterietall enn bed bruk av formulerte dietter eller bakegjær. Mikroalgediettene er ofte mer kostbare enn gjær og andre kulturfôr. En relativt billig diet kan være bakegjær sammen med en liten andel mikroalger (5-10 %). En annen fordel med bruk av mikroalger er at overfôring tåles bedre enn ved gjærbaserte dietter. Som regel så vil ikke kultiveringsdiettene inneholde nok av de næringsstoffene som fiskelarven trenger, så rotatoriene må korttidsanrikes noen timer før de benyttes som fôr til fiskelarvene. 1.3.1 Protein Protein er hovedbyggesteinene for biomasse, og mengden vil reflektere energinivået i organismen. Proteinnivået per rotatorie er en dynamisk variabel som er relatert til fôrtilgjengeligheten og veksthastigheten. I litteraturen blir proteininnholdet rapportert til å være 28-63 % av tørrvekt. Denne store variasjonen kan skyldes ulike analysemetoder, men også en reell variasjon i individuelt proteinnivå hos rotatoriene. I nitrogenbaserte estimater for protein innhold benyttes ofte omregningsfaktoren 6,25 mg protein/mg nitrogen. Denne faktoren overestimerer proteininnholdet på samme måte som sum aminosyrer kan underestimere proteininnholdet. En omregningsfaktor på 4,2 mg protein/mg nitrogen er etablert ved testing av både nitrogen og aminosyrer (Øie and Olsen, 1997, Lie et al. 1997). Proteininnholdet per rotatorie er relatert til fôrkilde og spesifikk veksthastighet. Proteininnholdet i en rotatorie er vanligvis 100-200 ng protein per individ (type Nevada), hvor det laveste tallet representerer en sultet rotatorie og det høyeste tallet representerer en fôret rotatorie. Proteinverdier per tørrvekt gir mindre variasjon på grunn av at en stor del av tørrvekten er protein. Selv om proteininnholdet per individ varierer i rotatorier, så er aminosyreprofilen lik. Den blir ikke påvirket av fôrmengde eller fôrkvalitet som tilbys rotatorien. Protein er hovedkomponenten i fiskevev, og utgjør 65-75 % av total kroppsvekten (Wilson 1989). Proteiner er viktig for en lang rekke livsfunksjoner (enzymer, hormoner, immunforsvar, transport av småmolekyler, bevegelse). De grunnleggende byggesteinene i alle proteiner er 20 ulike aminosyrer. Optimalt diett protein nivået for fisk, som for andre dyr, er avhengig av diett protein til energi balansen, aminosyre sammensetningen, proteinenes fordøyelighet, og andel av ikkeprotein energi kilder i dietten (Wilson, 1989). Det finnes lite informasjon om protein behovet hos fiskelarver.

11 En vanlig misforståelse er at protein og aminosyre innholdet i rotatorier er konstant og uavhengig av vekst forholdene. Dette skyldes stabile aminosyreprofiler, så prosent aminosyre innhold av totale aminosyrer er uavhengig av fôringsforholdene, men protein per rotatorie er signifikant høyere i rotatorier med høy veksthastighet, enn i sulta rotatorier. Proteininnholdet øker med økende veksthastighet i kulturen (Figur 1). Det er derfor en forenkling å konkludere med at protein og aminosyre innholdet i rotatorier er konstant.

12 Figur 1. A: Innhold av protein pr. tørrvekt og pr. individ i rotatorier dyrket ved ulik veksthastighet. B: Sammenheng mellom aminosyre mengden i sulta og velfødde rotatorier uttrykt ved % AA av totale AA og AA per rotatorie. 1.3.2 Lipider Lipidnivået og fettsyresammensetningen i rotatorier gjenspeiler sammensetningen i dietten, rotatorienes metabolisme og genetiske egenskaper. Rotatorier er gjennom evolusjon adaptert til varmt vann og deres behov for omega 3 fettsyrer er relativt lavt. Diett lipider vil derfor påvirke sammensetningen av både triglyserider og fosfolipider. Diettsammensetningen er derfor helt avgjørende siden metabolsk aktivitet er mindre viktig. Rotatorier egner seg derfor godt til fettsyre manipulering. Fettsyresammensetningen i triglyseridene blir lik lipidsammensetningen i diett lipidet. Rotatorienes innhold av essensielle n-3 fettsyrer kan bli fullstendig kontrollert ved å velge riktig lipidekilde under dyrkingen. Når prosentandelen av n-3 fettsyrer er kjent, kan rotatorienes innhold av n-3 estimeres fra følgende ligning (Olsen, 2004). Rotatorie %n-3 = 0,86 * Fôr %n-3 (1) Rotatorie %EPA = 0,81 * Fôr %EPA (2) Rotatorie %DHA = 0,72 * Fôr %DHA (3) 1.3.3 Marine fiskelarver har behov for essensielle fettsyrer i dietten Det er i løpet av de siste 10-20 år, vist at marine fiskelarver har essensielt krav om bestemte næringskomponenter. Dette gjelder spesielt flerumettede n-3 fettsyrer. Dette kravet kan gjenspeiles i sammensetningen av fettsyrer i egg. Egg fra marin fisk har høyt innhold av de essensielle fettsyrene EPA og DHA, og egg fra de fleste arter hos oss har et DHA/EPA forhold på

13 ca 2 (Tabell 1). Dette er relativt generelt, slik at forholdet mellom DHA/EPA i rotatoriene bør ligge i overkant av 2 for at de skal være fullverdige for marine fiskelarver. Tabell 1. Innhold av fettsyrene arakidonsyre (ARA), eicosapetaensye (EPA) og docosahexaensyre (DHA) i fosfolipid i egg av torsk, sild, sei og hyse (Data fra Tocher & Sargent, 1984). Fettsyre Torsk Sild Sei Hyse ARA (%) 1,9 1 1,6 3,7 EPA (%) 15,3 13,7 11,5 12,6 DHA (%) 28,6 31,4 27,7 27,6 DHA/EPA 1,9 2,3 2,4 2,2 EPA/ARA 8,1 13,7 7,2 3,4 Fiskelarver, som torsk, har begrenset evne til å syntetisere de langkjedede flerumettede fettsyrene DHA og EPA. Disse fettsyrene sammen med noen få andre blir ofte benevnt som n-3 HUFA (highly unsaturated fatty acids). Som vist i Tabell 1 inneholder fiskeegg relativt mye av disse fettsyrene og dette er en indikasjon på at larvene har et essensielt behov av fettsyrene. I den første startfôringsfasen vokser larvene raskt og utvikler syn hjerne og nervevev som er helt fundamental for den videre veksten i senere livs faser. Spesielt DHA er viktig i dannelsen av slikt vev og larvene må derfor få tilført de essensielle fettsyrene gjennom dietten. Og i den første fasen er rotatoriene den viktige dietten. Næringssammensetningen i rotatoriene kan manipuleres slik at sammensetningen kan styres mot den vi tror er best for torskelarvene. Rotatorier (Brachionus plicatilis) har ikke et ernæringsmessig krav om fettsyrer som vist i Tabell 1, og har derfor ofte et lavt innhold av flerumettede n-3 fettsyrer. Slike fettsyrer kan imidlertid lett bygges inn i rotatoriene ved valg av riktig diett. En slik prosess benevnes ofte for anriking, "anriking med essensielle fettsyrer", ved at man velger en diett som har høyt innhold av n-3 fettsyrer slik at rotatoriene får tilsvarende høyt innhold. 1.3.4 Problemer med oksiderte emulsjoner Anrikingsemulsjonene har høyt innhold av flerumettede fettsyrer, og disse fettsyrene er utsatt for oksidering (harskning). For å unngå, eller begrense, oksidering blir emulsjonene tilsatt antioksidanter. Likevel er dette et problem for de fleste fettemulsjonene som brukes. En viktig årsak til dette problemet er at emulsjonene oppbevares i flasker og pakninger som brukes over en viss tid etter at de er åpnet. Resultater fra forsøk som er gjennomført for å undersøke stabilitet av emulsjoner og for å undersøke effekt av bruk av oksiderte emulsjoner, viser at:

14 1. Rotatorier kan bli anriket med oksiderte emulsjoner uten negativ effekt på vekst reproduksjon og overlevelse hos rotatoriene. 2. Næringsverdien av rotatorier anriket med oksiderte emulsjoner dårligere enn ved bruk av ikke oksiderte emulsjoner. 3. Innholdet av DHA og EPA var lavere i rotatorier anriket med oksiderte emulsjoner 4. Lavere innhold av aminosyrer, spesielt metionin, i rotatorier anriket med oksiderte emulsjoner. 1.3.5 Karbohydrat Karbohydrat innholdet i rotatorier varierer fra 11-27% av tørrvekten, og de består hovedsaklig av glukose (61-80%), ribose (9-18%) og 0,8-7% galaktose, mannose, deoxyglukose, fruktose og xylose (Whyte and Nagata, 1990, Frolov et al. 1991, Frolov and Pankov 1992, Nagata and Whyte 1992, Fernandez-Reiriz et al 1992). 1.3.6 Mineraler Mineralinnholdet i rotatorier er generelt lavere enn i copepoder, unntatt kalsium, magnesium og jern. Innholdet av magnesium og selen er også lavere i rotatorier enn det som er anbefalt behov for større fisk av NRC (1993). I eksperiment hvor rotatoriene ble anriket med selen og jod, økte overlevelsen hos torskelarver med 32% (Hamre et al 2008). 1.3.7 Vitaminer Vitaminbehovet for de fleste fiskelarver er ikke kjent. Mange studier har funnet en direkte effekt mellom mange vitaminer og brusk og beindannelse i tidlige stadier av fiskelarvens liv. Det er anbefalt at rotatoriene anrikes ned vitamin C,E,A og B1 (Thiamin), men det absolutte behovet er ikke kjent. Rotatorier har et krav til vitamin B12. 1.4 Vasking og lagring av rotatorier før utfôring til fiskelarver Ved anriking av rotatorier vil valg av anrikingsfôr ha en sterk innvirkning på bakterieantallet i produksjonstanken. Anriking med alger gir en langt lavere bakteriebelastning enn anriking med ett mel/pulver produkt. For at bakteriebelastningen i fisketankene skal bli minst mulig er det viktig å vaske rotatoriene godt før utfôring. Rotatoriene bør vaskes i vann med samme temperatur og salinitet som ved anrikingen.

15 Etter vasking bør rotatoriene sakte kjøles ned før utfôring. Rotatoriene tåler store variasjoner i både temperatur og salinitet, dersom variasjonene skjer gradvis. Raske skiftninger i temperatur eller salinitet (eks. for kaldt vaskevann) bør unngås. Dette kan føre til at rotatoriene immobiliseres og blir liggende urørlige i lang tid. Ved nedkjøling konserveres næringsverdien i rotatoriene slik at de kan brukes som fôr over en lengre periode enn dersom de lagres ved produksjonstemperatur. Figur 2 viser tapsraten for lipid er ca. 40 % per dag ved 20 C, men ved en sakte nedkjøling til 10-15 C vil tapsraten reduseres til 10-20 % per dag for lipid. Figuren viser også at DHA nivået avtar raskere enn de andre fettsyrene. Figur 2. Tapshastighet av karbon, protein, fett, fettsyrer, EPA og DHA ved økende temperatur 1.5 Stamkultur Rotatorier fra de ulike arts linjene kan oppføre seg ulikt med hensyn på vekst kinetikk, saltholdighets og temperatur optimum (Gómez et al., 1997), som kan influere på produksjonseffektiviteten. Hvilken innvirkning ulike arter rotatorier har og hvordan blanding av ulike arter har på effektiviteten i rotatorie produksjonen ved klekkeriene er ukjent. Studier som tok for seg genetisk karakterisering av ulike stammer rotatorier fra ulike europeiske klekkerier (Papakostas et al., 2006; Dooms et al., 2007) avslørte at de fleste klekkerier i virkeligheten kultiverte rotatorie arter som var forskjellig fra hva de selv trodde de hadde. Resultatene viste at mange klekkerier hadde kulturer med et dominerende innslag av arten Cayman, og i mindre grad arten Nevada. Uten et system for hold av stamkulturer kan det være en risiko for at rotatorie arter forvinner og blir utilgjengelig for klekkeriene. Det har også etter hvert kommet hvile egg fra en del arter rotatorier som kan kjøpes, dette kan være en grei strategi hvis hvileegg er tilgjengelig fra de rotatorie artene en ønsker å benytte på klekkeriet. Hvileegg kan desinfiseres og faren for

16 kontaminering av ciliater og patogene bakterier vil være redusert. Det er fullt mulig å holde stamkulturer på anleggene hvis ønskelig, evt kan klekkeriene leie inn et miljø som de mener er i stand til å holde slike kulturer som en backup for seg. Det stilles store krav til nøyaktighet, stabile forhold og til god hygiene når en skal holde stamkulturer. Det er en fordel om levende alger kan dyrkes i samband med stamkultur hold men dette er ikke en absolutt nødvendighet. Det er mulig å holde stamkulturer også på pasta alge blandinger, men vil da kreve en tettere oppfølging i forhold til om en har tilgang på levende alger. Sentrifuge rør (50 ml konisk bunn) eller cellekultur flasker (50-250ml) er gode beholdere for hold av stamkulturer. Ideell fortynningshyppighet er noe avhengig av hvilken art en holder og er også avhengig av arten sin vekst under de forholdene den blir holdt ved. Dette kan variere noe men det er viktig å fortynne før det blir for tett og før bunnvannet blir dårlig. En grei kjøreregel kan være å inokulere med rundt 2 rotatorier per ml og fortynne ved 200 rotatorier per ml. Ved tynning blir rotaotriene skylt og en liten andel brukt for vedlikehold av stamkulturen og resten kan brukes til oppskalering til ny produksjonskultur. Hygiene er svært viktig, og spesielt dersom en holder flere arter rotatorier. Det kan være stor risiko for blanding av arter, og da vil den arten som vokser best under de gjeldende forhold være den dominerende ved oppskalering til produksjonskulturer. Utstyr tilhørende en art bør holdes adskilt fra utstyr tilhørende andre arter, og hender bør desinfiseres eller vaskes i såpevann mellom håndtering av rotatorier typene. Det kan være greit å benytte sterilt vann hvis en har muligheten for dette (som f.eks autoklavert eller kloret/avkloret som benyttes på enkelte laboratorier), evt kan vann til stamkulturer kokes (og avkjøles) før bruk (justere med ferskvann hvis salinitet er utenfor ønsket område). Men, et kontinuerlig vedlikehold av stamkulturer vil ikke eliminere risiko for bakteriell kontaminering. Hvis en ønsker å vite hvilken art en har er det mulig å sende inn for verifisering, flere laboratorier internasjonalt kan disse metodene. SINTEF Fiskeri og havbruk har også etablert metoder for å kunne gjøre slike analyser av de mest brukte typene rotatorier. 1.6 Mikrobiell kontroll Når man dyrker rotatorier i kultur dyrker man samtidig mikroorganismer. Fôring, feces, rester fra døde dyr, høy temperatur og lufting gir gode vilkår for vekst av bakterier og sopp i rotatoriekulturer. Men rotatoriene er filter-feeders og filtrerer vannet for mikroorganismer som

17 de fordøyer, og på denne måten kan bakterienivået holde seg relativt jevnt. Bakterieinnholdet i en rotatorie avhenger av flere faktorer, som størrelse, kondisjon og helsetilstand på rotatoriene, og fôrkonsentrasjon (partikkeltetthet) og bakterietetthet i kulturvannet. Derfor kan bakterietallet pr individ variere fra noen hundre til mange tusen, uten at det behøver å være fare for sammenbrudd av kulturen. Som en tommelfingerregel sier vi at nivået bør ligge rundt 1000 CFU/individ. Friske og sultne rotatorier filtrerer mange bakterier og vil på den måten bidra til å regulere bakterietettheten i en kultur. De fordøyer bakteriene fortløpende men vil likevel inneholde mange levende bakterier, enten som de nettopp har tatt opp fra kulturvannet og ikke har fordøyd enda, eller som vokser i fordøyelseskanalen eller utenpå dyrene. Rotatorier i dårlig kondisjon vil også kunne inneholde mange bakterier, trolig på grunn av at rotatoriene ikke klarer å fordøye dem lenger slik at bakteriene kan fortsette å vokse i og på rotatoriene. I dårlige kulturer som nærmer seg sammenbrudd ser man gjerne høye bakterietall. Sultede rotatorier inneholder få bakterier, på grunn av at filtreringsaktiviteten er lav ved lav fôrkonsentrasjon (Skjermo&Vadstein, 1993). En kultur av god kvalitet bør ikke ha rotatorier med høye bakterietall, da dette medfører tilførsel av store mengder bakterier til fiskelarvene. Fiskelarvene tåler selvsagt bakterier, men levendefôrkulturer inneholder gjerne en stor andel opportunistiske bakterier, deriblant typer som kan utkonkurrere de normale bakteriene i larvenes tarm og dermed forstyrre fordøyelsen og den normale tarmfunksjonen, eller typer som kan være patogene for fiskelarver og forårsake infeksjoner. Sammensetningen av mikrofloraen er altså like viktig som antallet bakterier. Rotatorienes flora gjenspeiler den som er i kulturvannet (Skjermo&Vadstein, 1993). Den er dermed lett å skifte ut med andre bakterier, men stabiliteten er svært lav (Skjermo&Vadstein, 1999). Rotatoriekulturer er komplekse systemer og det er ikke nødvendigvis enkelt å ha en god mikrobiell kontroll i dem. For å bestemme bakterietall i rotatorier kreves egnet utstyr, medier og helst sterile betingelser og det tar noen dager før man vet resultatet. Det vil derfor normalt være for krevende å registrere bakterietall i den daglige driften av en levendefôrproduksjon. For å tilstrebe mikrobiell kontroll i rotatoriekulturene bør man heller etablere gode rutiner for hygiene og nøyaktig fôring av kulturene, samt bruke dietter av høy kvalitet. I vår strategi for mikrobiell kontroll i marin yngelproduksjon (Vadstein et al., 1993) opererer vi med tre elementer, og innenfor disse er det flere tiltak som er aktuelle i rotatorieproduksjon:

18 1) Ikke-selektiv reduksjon av bakterier fjerne bakterier ved desinfeksjon, spesielt aktuelt som smittebarriære redusere tilførsel av organisk materiale (fôr) gjennom balansert fôring fjerning av organisk materiale (fôrrester, døde dyr) ved god vasking, spesielt før utfôring til fiskelarvene beiting av bakteriene ved å sørge for god kondisjon på rotatoriene 2) Selektiv styring av bakterier stabilisering av bakteriefloraen ved bruk av resirkulering av vannet tilførsel av probiotika (gunstige, levende bakterier), prebiotika (stimulerer de gunstige bakteriene) og mikroalger 3) Styrking av individets resistens mot mikoorganismer ernæring (evt. immunstimulanter til fiskelarvene) De ikke-selektive metodene bør være selvsagte i enhver levendefôrproduksjon. Det finnes også gode teknikker og produkter for de to siste elementene, men vi anbefaler at man stiller krav til god dokumentasjon på effekt og setter seg godt inn i bruken før man velger om man skal bruke dem. 1.7 Ny teknologi 1.7.1 Dyrking av rotatorier i resirkuleringssystem I løpet av de siste årene er det blitt forsket på mer intensiv og kontrollert produksjon av rotatorier. Det er nødvendig å øke intensiteten av kulturene da klekkeriene er blitt større, og trenger større mengder med rotatorier. Samtidig som intensiteten av kulturene økes må nærings- og bakterie innhold overvåkes, slik at kvaliteten på rotatoriene opprettholdes. Ulike metoder for høytetthetsproduksjon av rotatorier er utviklet både i Belgia og Japan. Disse metodene er utviklet for B. rotundiformis, og vil ikke fungere direkte for B. plicatilis. I Japan blir membran filtrert vann (0,1 µm filter) brukt i rotatorieproduksjonen. Produksjonen er i tillegg basert på innblåsing av ren oksygen, samt streng ph-kontroll og fjerning av avfall i kulturene ved hjelp av spesielle filter. I Japan blir rotatorien Brachionus rotundiformis dyrket i tettheter på 10000-30000 rotatorier per ml (Yoshimura et al. 1996). I enkelte småskala førsøk er tettheten

19 kommer opp i over 100 000 dyr/ml (Yoshimura et al. 2001). Denne dyrkingsmetoden er også prøvd på Brachionus plicatilis og tettheten har kommet opp i ca. 2000 dyr/ml (Fu et al, 1997). Ved universitetet i Gent, Belgia, er det utviklet et resirkuleringssystem for produksjon av rotatorier. Dette er et fullstendig lukket resirkuleringssystem hvor avløpsvann fra produksjonstankene blir renset ved hjelp av proteinskimmere med ozon og filtrering gjennom et biofilter. Etter den biologiske filtreringen blir det behandlede vannet tilført til produksjonskarene igjen med en daglig fornyelse på 500 % (Suantika et al. 2000, Suantika et. al. 2001). Denne produksjonsmetoden gir rotatorietettheter på 7000-22000 rotatorier per ml. Problemet med denne metoden er at ozon dreper en del av de nitrogenfikserende bakteriene i biofilteret, slik at nytt medium jevnlig må tilsettes i biofilteret. I tillegg er det problemer med rensing av filteret. Enkelte norske klekkerier har også kjøpt inn ferdige systemer fra Aquatic Eco-systems for produksjon av rotatorier. Disse systemene inneholder noen av komponentene som kjennetegner et resirkuleringssystem (biofilter og protein skimmer). Tester utført ved SINTEF fiskeri og havbruk viser imidlertid at disse systemene ikke kan betegnes som ekte resirkuleringssystem da renseprosessene ikke er fullgode samt at det må tilføres for mye spedevann til at det oppfyller kravet til et resirkuleringssystem. Dette reduserer stabiliteten som kjennetegner ekte resirkuleringssystem. Enkelte anlegg rapporterer likevel å ha stabil produksjon ved 7000-8000 individ/ml og lavere fôrfaktor sammenlignet med gjennomstrømssystem. Dette viser at systemet fra Aquatic kan være en løsning som bør vurderes ved innkjøp av nye produksjonsenheter. Ved SINTEF Fiskeri og havbruk er det de siste årene blitt arbeidet mye med å videreutvikle produksjonssystem for rotatorie produksjon. Tester viser at det ved hjelp av resirkuleringssystem er mulig å produsere rotatorier kontinuerlig og kontrollert ved høye tettheter. Bruken av slike systemer krever mer kompetanse og mer og bedre overvåkning av kulturene og medfører en økt risiko for kultur krasj sammenlignet med tradisjonelle gjennomstrøm kulturer. Det gjenstår ennå en del arbeid før man kan konkludere med at gevinsten med resirkuleringssystem gjør det hensiktsmessig å investere i dette på yngelanleggene, men slike systemer kan gi økt mikrobiell stabilitet i rotatorie produksjonen som igjen vil kunne gi en gevinst i form av økt vekst og overlevelse i larve og yngel fasen. 1.7.2 Automatisk telling av rotatorier I et samarbeid mellom SINTEF, NTNU og Thelma har det blitt utviklet en planktonteller (Alver et al. 2007) som automatisk kan overvåke tettheten av rotatorier både i rotatoriekulturer og i

20 startfôringskar. Telleren bruker en pumpe og et sett av ventiler for å pumpe inn vannprøver fra slanger plassert i karene som skal overvåkes, og prøvene sendes gjennom et glass rør hvor de fotograferes av et digitalt kamera. Belysningen av glasset er tilpasset for å gi bilder med god kontrast. Hvert bilde analyseres for å beregne antall synlige rotatorier, og dette brukes for å beregne tettheten i hvert kar. Telleren beregner tettheten ut fra et utvalg på 10-50 bilder for å sikre at det statistiske utvalget er stort nok til å gi nøyaktige målinger. Telleren har et grafisk grensesnitt på en PC som gir enkel bruk og tilgang på alle tidligere målinger som er gjort for hvert enkelt kar. Målingene kan også benyttes til å gjøre fôringen av kulturene mer nøyaktig ved at de benyttes til kontinuerlig oppdatering av fôrtabeller som benyttes. Planktontelleren er ennå ikke kommersielt tilgjengelig med det jobbes med å få til dette. 1.8 Fordøyelse i marine fiskelarver Fôrutvelgelse, fordøyelse og assimilasjon av fôret er kritisk for vekst og overlevelse hos fiskelarver. Fiskelarver har ett fordøyelsessystem som er veldig forskjellig fra voksen fisk. Ved startfôringen er larvens tarmkanal funksjonell, men morfologisk, histologisk og fysiologisk mindre kompleks enn hos voksne fisk. Fiskelarvenes tarmkanal forblir uforandret fram til metamorfose. Ved metamorfose forandres tarmkanalen, slik at den blir lik voksen fisk (Figur 3). Assimilasjonseffektiviteten kan være lavere hos larver enn hos voksne fisker på grunn av mangel på funksjonell mage hos larvene. Differensiering av tarmkanalen hos fisk Plommesekklarve plommesekken abs. larve omdannelse Juvinile og voksne Begynnende tarm Fortarm Midttarm Spiserør Mage Fortarm Baktarm Baktarm Figur 3. Differensiering av tarmkanalen hos fisk.

21 Hos marine fiskelarver utvikles bukspytt kjertel og lever forholdsvis tidlig, noe som demonstrerer deres rolle for fiskelarvens videre vekst og utvikling. Bukspytt kjertelen (eksokrin) er en kilde til viktige enzymer som deltar i hydrolyse av lipider i tarmen før lipider blir absorbert i tarmens epitel. Leveren er sentral for omsetning, omdanning og forberedelse for transport av næringsstoffer til vevet. Fiskelarvene har høy vekst hastighet i den første fasen av deres liv. Siden veksten i all hovedsak er økning i kroppens muskel masse, vil de ha et stort behov for aminosyrer fra kosten. Fiskelarver som utvikler mage sent, har en lav proteolytisk kapasitet i fordøyelsessystemet ved startfôring, og in vivo studier har vist høyere absorpsjon av frie aminosyrer enn peptider og protein bundne amino syrer fra larvens tarm i den tidligste fasen etter klekking (Rønnestad et al. 1999). Delvis hydrolyse av proteiner er også funnet å være fordelaktig i dietten for de tidligste stadier hos noen arter av marin fisk (Zambonini Infante et al. 1997; Cahu et al. 1999; Kvåle et al 2009). Fiskelarver synes å inneha de viktigste lipolytiske enzymer fra omkring det tidspunkt hvor de begynner å spise (Hoehne-Reitan and Kjørsvik, 2004). Fosfolipase A2 og gallesalt avhengig lipase er blant de enzymene som er blitt funnet allerede plommesekk fasen (Ozkizilcik et al., 1996; Evans et al., 1998; Ribeido et al., 1996; Lazo et al., 2000; Hoehne-Reitan and Kjørsvik 2001). 2 DYRKING OG ANRIKING AV ROTATORIER (DP2) 2.1 Bakgrunn Norske klekkerier for torsk har over de senere årene arbeidet målbevisst for å forbedre produksjon og øke næringsverdien av rotatorier, og har gjennom dette arbeidet gjort store fremskritt. Dette målrettede arbeidet resulterte i økt produksjon av yngel i årene frem til 2009. De finansielle utfordringene de siste årene resulterte i at mange klekkerier fikk problemer med å opprettholde sin produksjon og per i dag er bare et par klekkerier i operativ drift for å produsere torskeyngel, mens de aller fleste andre nå har gått over til produksjon av leppefisk for å avhjelpe de prekære problemene med lakselus i Norske lakseanlegg. Erfaringene man skaffet seg i perioden før de finansielle problemene er viktige både for de anleggene som fortsatt er involvert i produksjon av torskeyngel og for de av disse anleggene som nå er involvert i produksjon av leppefisk. Mikroalgen DHA Chlorella sp. var og er i bruk i de aller fleste av disse klekkeriene, og ved bruk av dette produktet har man erfart svært høy vekst av rotatorier gjennom dyrkningsfasen. Imidlertid var der også perioder hvor man opplevde lav vekst og problemer i rotatorie-kulturene. Man har mistenkt utarming av mikronæringsstoffer som en av årsakene til periodevis lav vekst. Samstundes hadde man ikke helt oversikt over kvaliteten av rotatorier produsert under disse

22 forholdene med svært høye vekstrater, og klekkeriene ytret ønske om mer kunnskap omkring hvordan næringsverdien av rotatorier ble påvirket ved langvarig kultivering på DHA Chlorella og etter påfølgende anrikning. Man opplevde vekslende suksess i produksjonen av rotatorier og man erfarte perioder med svært høy produksjon etterfulgt av perioder hvor man hadde problemer med denne produksjonen. Det var et ønske om å klarlegge mer omkring disse forholdene med spesielt fokus på innhold av mikronæringsstoffene jod og selen. I tillegg var det et ønske om å finne næringsverdi av rotatorier fra denne produksjonen som senere var blitt anriket med de to anrikningsproduktene Multigain (Biomar) og Ori-green (Skretting). Det var også et ønske om å kartlegge tilsvarende rotatorier produsert på Ori-culture med etterfølgende anrikning med Multigain og Ori-green. 2.2 Mål Hensikten med de dyrknings- og anrikningsstudiene som ble gjort var å undersøke nærings innholdet av rotatorier (type Cayman) som var langtidsdyrket på: 1. DHA Chlorella 2. Ori-culture Innhold av protein, lipid, fettsyrer, iod og selen skulle måles, og effekten av en anrikning med Multigain og Ori-green skulle undersøkes på samme vis. Biokjemiske analyser ble designet slik at det var mulig å kalkulere innholdet av kalorier i rotatoriene, og disse ble beregnet basert på standard metoder brukt i næringsmiddelkjemien. I tillegg ble det tatt høyde for at næringsinnhold skulle beregnes i form av mg per g tørrvekt og innholdet per individ. 2.3 Materialer og metoder 2.3.1 Dyrkning av rotatorier Rotatorier (Brachionus plicatilis, B. Cayman ) ble langtidsdyrket i 34 sjøvann ved 24 C for fire måneder i 250 L tanker med konisk bunn, utstyrt med sentralt plassert sil (64µm), lufting og 100 % vannutskifting per døgn. Daglig ble sil rengjort ved bruk av høytrykks-spyler. Daglig

23 fôrdose med DHA Chlorella (2.4 ml per milllion rotatorier; Pacific Trading Ltd., Japan) ble blandet i sjøvann og distribuert gjennom døgnet ved hjelp av peristaltisk pumpe. Tankene ble rengjort regelmessig og tynnet slik at tetthet ble holdt rundt 600 dyr per ml. Flere batcher med DHA Chlorella ble brukt, og det ble utført anrikning av rotatorier som var blitt dyrket på nyåpnet Chlorella og Chlorella som hadde stått tre uker i kjøleskap ved 4 C og dermed var nærmere utløpsdato for holdbarhet. Alle som har brukt dette produktet kjenner godt til at det avgis en nokså streng odør for å si det forsiktig. En var derfor ikke helt trygg på om produktet holder konsistent kvalitet gjennom en lagringsperiode. Samme type rotatorier ble satt opp for dyrkning med Ori-culture (). 2.3.2 Anrikning Rotatorier ble høstet fra dyrkningskulturene, vasket i temperert (24 C) og filtrert (1 µm) sjøvann og overført til 50 L anrikningstanker (34, 24 C, tilsatt lufting) til en tetthet på mellom 350-400 dyr per ml. Rotatorier dyrket med DHA Chlorella (heretter kalt Chlorella) ble i separate forsøk anriket for 2 timer med Multigain (Biomar, Norge) og Ori-green (Skretting, Norge). Anrikninger ble utført i 3x3 replikat. Rotatorier ble skånsomt vasket i temperert vann ved 24 C før de ble overført til egne anrikningstanker en time før de ble tilsatt anriknings medium. Det ble anriket med 0,2 gram Multigain per million rotatorier, og anrikningsdosen ble mixet med stavmikser for 3 minutter i ferskvann (24-25 C) før dette ble gitt til rotatorier. Det andre anrinkningsproduktet; Ori-green ble mixet med stavmikser i sjøvann (24 C) for 2 minutter, satt til hydrering for 20 minutter og mixet på nytt for 1 minutt. Anrikningsdose som ble benyttet var 0,25 g Ori-green per million rotatorier. 2.3.3 Prøveuttak 2.3.3.1 Karbon og nitrogen Før anrikning og etter 2 timer anrikning ble prøver for tetthet, karbon og nitrogen analyser tatt ut. Prøver fra kultur ble vasket godt med filtrert sjøvann (1µm) ved bruk av en sil (64 µm), og fortettet ned til 150 ml (med filtrert sjøvann) slik at det endte opp på rundt 2000 rotatorier per ml. Fra denne ble det så tatt ut 8 sub samples a 100 µl som ble overført til tinnbåter, og 24x 20 µl som ble overført til brønnbrett for senere tetthets- og egg registrering, disse prøvene ble tilsatt Lugol