FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A KIT

FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A KIT REF til bruk sammen med LightCycler 1.2-instrumentet (I EU: serienummer 2021 til 5602) 03 610 195 001 Kit til 32 reaksjoner for maksimalt 30 prøver Til bruk i in vitro-diagnostikk. DENNE APPLIKASJONEN SKAL IKKE BRUKES I CANADA FORDI LIGHTCYCLER 1.2-INSTRUMENTET IKKE ER LISENSIERT SOM MEDISINSK UTSTYR. TILTENKT BRUK Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet brukes til deteksjon og genotyping av punktmutasjonen (G til A ved posisjon 20210) i det humane Factor IIgenet fra DNA, isolert fra humant perifert fullblod. Testen utføres på LightCycler 1.2-instrumentet ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) for amplifikasjon av Factor II-DNA fra kliniske prøver og deteksjon og genotyping av amplifisert Factor II-DNA ved hjelp av målspesifikk hybridisering som forårsaker fluorescens. Factor II (Prothrombin) G20210A-testen er en in vitro diagnostisk test for deteksjon og genotyping av Factor II (Prothrombin) G20210A-mutasjonen som hjelp til diagnostisering i utredningen av pasienter med mistenkt trombofili. Testen skal brukes på LightCycler 1.2-instrumentet (i EU: serienummer 2021 til 5602) med LightCycler Software 3.5. Prøveprepareringen må utføres i henhold til arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor. FORKLARING AV TESTEN Personer med arvelig trombofili er predisponert for trombotiske hendelser som for eksempel venøs trombose, den tredje mest vanlige hjerte- og karsykdommen (1). Aktivert protein C-resistens (APC) anses som den mest dominerende koagulasjonsforstyrrelsen assosiert med venøs trombose (1, 2). Pasienter som har testet positivt for APC-resistens eller Factor V Leiden-mutasjonen, bør vurderes for molekylærgenetisk testing for de hyppigst forekommende øvrige trombofilier med sammenfallende fenotyper, som det på det nåværende tidspunktet finnes test for [dvs. Factor II (Prothrombin) G20210A-varianten] (2). Den finnes hos 1 2 % av befolkningen, og dens forbindelse med venøs tromboembolisme er godt kartlagt (2). TESTPRINSIPP/SAMMENDRAG Prøvepreparering Prøveprepareringen kan enten utføres manuelt eller automatisk ved hjelp av High Pure PCR Template Preparation-kitet eller MagNA Pure LCinstrumentet med MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I. Deteksjon 1. Et 165 bp-fragment av Factor II-genet amplifiseres fra humant genomisk DNA ved hjelp av spesifikke primere. 2. Ampliconet detekteres ved hjelp av fluorescens fra et spesifikt H-probepar. H-probene består av to ulike oligonukleotider som hybridiserer til en intern sekvens av det amplifiserte fragmentet under PCR-syklusens hybridiseringsfase. Én probe er merket i 5'-ende med LightCycler Red 640-N-hydroxy-succinimid-ester (Red 640-NHS-ester) og modifisert ved fosforylering i 3'-ende for å unngå ekstensjon. Den andre proben er merket i 3'-ende med fluorescein. 3. Når hybridisering til templat-dna har funnet sted, kommer probene i innbyrdes nærhet til hverandre. Dette resulterer i overføring av resonansfluorescensenergi (FRET) mellom de to fluoroforene. Under FRET eksiteres fluoresceinet, eller donorfluoroforen, ved hjelp av LightCycler 1.2-instrumentets lyskilde. En del av eksitasjonsenergien overføres til LightCycler Red 640-NHS-ester, eller akseptorfluoroforen. 4. Den emitterte fluorescensen som slippes ut fra LightCycler Red 640-NHS-ester blir deretter målt av LightCycler 1.2-instrumentet. Genotyping H-prober brukes også til å bestemme genotypen ved at det utføres en smeltekurveanalyse etter at amplifikasjonssyklusene er fullført og ampliconet er til stede i økt konsentrasjon. Den Red 640-merkede H-proben hybridiserer til en del av målsekvensen som ikke er mutert, og fungerer som en ankerprobe. Den fluorescein-merkede H-proben dekker området for mutasjon (mutasjonsprobe). Under smeltekurveanalysen fører økende temperatur til at fluorescensen reduseres, fordi den korteste av de to probene (mutasjonsproben) dissosierer først, og de to fluorescensfargene er ikke lenger tilstrekkelig nær hverandre. Hvis Factor II (Prothrombin) G20210A-mutasjonen er til stede, vil uoverensstemmelsen mellom mutasjonsproben og målsekvensen destabilisere hybridiseringen, slik at reduksjonen i fluorescens skjer ved en lavere temperatur. Med villtype-genotypen forekommer det ingen uoverensstemmelse, og heteroduplex-dna-et har derfor et høyere smeltepunkt (T M ). Den heterozygote genotypen utviser en distinkt kombinasjon av disse egenskapene. 1

REAGENSER AKTIVE LØSNINGER 1. FIIG20210A MD Mix [Factor II (Prothrombin) G20210A mutasjonsdeteksjonsmiks] 1 78 µl 2. FIIG20210A R Mix [Factor II (Prothrombin) G20210A reaksjonsmiks] 1 78 µl 3. FIIG20210A CT [Factor II (Prothrombin) G20210A kontrolltemplat] 1 50 µl 4. FIIG20210A DIL [Factor II (Prothrombin) G20210A-diluent] 1 1 ml <0,01 % FIIG20210A oppstrøms- og nedstrømsprimer <0,01 % FIIG20210A H-probe Red 640 <0,01 % FIIG20210A H-probe Fluorescein Tris-HCl-buffer <0,01 % Taq DNA-polymerase, GMP-kvalitet <0,07 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp <0,01 % kontrolltemplat-dna inneholder plasmid: pf2 WT og pf2 MUT ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Polymorfi Innen Factor II-genet eksisterer en kjent mutasjon i tillegg til FIIG20210A-mutasjonen ved posisjon 20218 (dvs. mutasjon A20218G), og denne tilleggsmutasjonen dekkes av mutasjonsproben. Denne sjeldne mutasjonen vil føre til et ukjent resultat etter at genotypingen er utført. Krav til håndtering FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Dette produktet bør kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. Det må tas samme forholdsregler som ved håndtering av alle laboratoriereagenser. Denne testen skal kun brukes for humant fullblod tatt med EDTA eller sitrat som antikoagulant. Heparin kan interferere i PCR og må ikke benyttes i denne prosedyren. Arbeidsflyten i laboratoriet må skje i henhold til god laboratoriepraksis (GLP) og skal i tillegg foregå unidireksjonalt (dvs. prøvepreparering, oppsett av PCR og PCR-analysering med LightCycler 1.2-instrument må foregå fysisk atskilt). Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke slås sammen. Lukk alle flasker umiddelbart etter bruk for å unngå lekkasjer, varierende bufferkonsentrasjoner eller bufferforhold. Etter at flasker og rør er åpnet må de oppbevares stående. Reagenser fra ulike lot må ikke blandes. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. Unngå at lyserings-/bindingsbuffer og vaskebuffer I fra MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I eller bindingsbuffer og buffer for fjerning av hemmere fra High Pure PCR Template Preparation-kitet kommer i kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Lyserings-/bindingsbuffer fra MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I, som inneholder guanidintiocyanat, må ikke komme i kontakt med natriumhypokloritt (blekemiddel) eller sterke syreoppløsninger. Denne blandingen kan produsere en svært giftig gass. Laboratorierutiner Alt materiale som stammer fra mennesker, og alt resulterende avfall må betraktes som potensielt infeksiøst. Alle arbeidsoverflater må rengjøres og desinfiseres med et desinfiserende middel som er anbefalt av lokale myndigheter. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Ikke pipetter med munnen. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Unngå mikrobiell kontaminering og nukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Det anbefales bruk av sterile engangspipetter. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. Håndtering av avfall Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. Prøvepreparering Du finner mer informasjon om håndtering av avfall i pakningsvedlegget til MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I eller High Pure PCR Template Preparation-kit. MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I eller High Pure PCR Template Preparation-kit må oppbevares ved romtemperatur (+15 C til +25 C). Før bruk av lyserings-/bindingsbufferen i MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I, må løsningen rystes for å løse opp bunnfallet. Må ikke oppbevares kaldere enn romtemperatur. Bruk kun MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (kat.nr. 03 004 058 001) eller MagNA Pure LC Reagent Tub (stor) [kat.nr. 03 004 040 001] i de respektive posisjonene indikert av MagNA Pure LC-instrumentet i denne prosedyren. Amplifikasjon og deteksjon Se i operatørmanualen til LightCycler 1.2-instrumentet før bruk av dette kitet. Opprett en skriftlig oversikt over oppsettet knyttet til LightCycler -karusellens id. Opplysningene må inneholde LightCycler -prøvekarusellens posisjon, kapillærrørnummer og det navnet som er tilknyttet hver prøve for å sikre korrekt prøveidentifikasjon. Sammenlign de Factor II (G20210A)-spesifikke instrumentinnstillingene på LightCycler 1.2-instrumentets Programming-skjermbilde umiddelbart etter at du har gått inn i programvaren, eller senest rett før kjøring av LightCycler 1.2-instrumentet starter, med de instrumentinnstillingene som er angitt på siste side av dette pakningsvedlegget (tabell 2). Overflaten på kapillærrørene må ikke berøres. Bruk alltid hansker ved håndtering av kapillærrørene. Forholdsregler ved håndtering av LightCycler 1.2-instrumentet Følg alle generelle sikkerhetskrav som gjelder for elektriske instrumenter. Brytere eller strømledninger må aldri berøres med våte hender. Instrumentets ytre deksler må ikke åpnes. Instrumentet må aldri rengjøres uten at instrumentets strømbryter er slått av og strømledningen er trukket ut av stikkontakten. Merk: Service eller reparasjoner på denne enheten skal kun utføres av autorisert servicepersonell. Termoblokken må ikke åpnes under drift. Termoblokklokket og prøvekarusellen er varme under drift. Elektrisk sikkerhet for LightCycler 1.2-instrumentet LightCycler 1.2-instrumentet er utviklet i henhold til beskyttelsesklasse I (IEC). Hvis strømledningen revner, fliser seg, blir ødelagt eller skadet på annen måte, må den erstattes umiddelbart med en tilsvarende del fra Roche Diagnostics. 2 Brij 35 MgCl 2 Brij 35 MgCl 2 H 2 O, PCR-kvalitet (brukes også som negativ kontroll av amplifikasjon)

Vedlikehold av LightCycler 1.2-instrumentet Generelt vedlikehold Se LightCycler 1.2-instrumentets operatørmanual. Rengjøringsinstruksjoner Væske må ikke tømmes ned i termoblokken. Håndtering og avhending av infeksiøst materiale må utføres i henhold til lokale sikkerhetsbestemmelser. Rengjør instrumentets overflater med et mildt rengjøringsmiddel. Bruk om nødvendig 70 % etanol for å desinfisere instrumentets overflater. Hvis kapillærrør knuses, rengjør LightCycler -prøvekarusellen ved å fjerne kapillærrørfragmentene med børstene som følger med instrumentet. Forebyggende vedlikehold Sjekk området rundt instrumentet regelmessig for å kontrollere at det er fri passasje av luft rundt instrumentet og for å kontrollere at bøker, papir eller annet utstyr ikke kommer i veien for luftpassasjen. LightCycler arbeidsstasjon Konfigurasjonen av datamaskinens arbeidsstasjon kan variere fra land til land og kan endre seg etter komponenttilgjengelighet og tekniske fremskritt. Kontakt din lokale Roche-representant for å bekrefte eksakt konfigurasjon og for å få teknisk hjelp. HÅNDTERING AV REAGENSER 1. FIIG20210A MD Mix (gul kork, rør 1), klar for bruk Oppbevar ved -15 C til -25 C. Må oppbevares beskyttet mot lys! 2. FIIG20210A R Mix (rød kork, rør 2), klar for bruk Oppbevar ved -15 C til -25 C. 3. FIIG20210A CT (lilla kork, rør 3), klar for bruk Oppbevar ved -15 C til -25 C. 4. FIIG20210A DIL (fargeløs kork, rør 4), klar for bruk Oppbevar ved -15 C til -25 C. OPPBEVARING/STABILITET (REAGENSER) Uåpnede kit må oppbevares ved -15 C til -25 C inntil utløpsdatoen angitt på etiketten. FIIG20210A MD Mix (rør 1, gul kork) må oppbevares beskyttet mot lys. Tin komponentene i Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet, bland dem forsiktig, og oppbevar på is. Fryses umiddelbart etter bruk. Kit-reagenser kan fryses ned og tines opptil fem ganger. PRØVETAKING, PREPARERING OG STABILITET For preparering av genomisk DNA fra humant blod, utføres nukleinsyreopprensingen ved hjelp av High Pure PCR Template Preparation-kit (kat.nr. 11 796 828 001) eller MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I (kat.nr. 03 003 990 001) i kombinasjon med MagNA Pure LC-instrumentet (kat.nr. 12 236 931 001) som beskrevet nedenfor. EDTA- eller sitratantikoagulert, perifert humant blod er stabilt i minst 7 dager ved +2 C til +8 C. Det kan oppbevares frosset ved -20 C i opptil 12 måneder og tines én gang. Eluert DNA kan oppbevares i et forseglet prøvebrett ("Sample Cartridge") eller i et Sarstedt-rør ved +2 C til +8 C i opptil 7 dager. Det er langtidsholdbart (ca. 3 uker) ved -15 C til -25 C. Eluert DNA kan fryses og tines opptil tre ganger. MATERIELL SOM MEDFØLGER Se "Reagenser aktive løsninger" på side 2. NØDVENDIG MATERIELL OG UTSTYR SOM IKKE MEDFØLGER LightCycler 1.2-instrument (EU: serienummer 2021 til 5602 MagNA Pure LC-instrument (kat.nr. 12 236 931 001) kat.nr. 12 011 468 001) MagNA Pure Software 3.011 eller høyere (kat.nr. 03 322 025 001) Merk: I USA kan det være andre katalognumre som gjelder. Ta MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I (kat.nr. 03 003 990 001) kontakt med salgskontoret i USA for ytterligere opplysninger. LC-karusellsentrifuge [kat.nr. 12 189 682 001 (230 V) eller 03 030 512 001 LightCycler Software 3.5 (kat.nr. 11 909 304 001) (115 V)]. Bestill LC-karusellsentrifuge 2.0 ved nyanskaffelser [kat.nr. LightCycler Capillaries (20 µl) (kat.nr. 11 909 339 001) 03 709 582 001 (230 V) eller 03 709 507 001 (115 V) ]. I dette tilfellet er LC High Pure PCR Template Preparation-kit (kat.nr. 11 796 828 001) Carousel Centrifuge 2.0 Bucket 2.1 (kat.nr. 03 724 689 001)* også påkrevd. Mikrosentrifugerør, 1,5 ml, sterile, nukleasefri Etanol p.a. Isopropanol p.a. H 2 O, dobbeltdestillert, sterilt, nukleasefritt Sarstedt-rør med skrukork, 1,5 ml, sterile * Se operatørmanualen til LightCycler 1.2-instrumentet, eller kontakt teknisk brukerstøtte for å få tilsvarende sentrifugespesifikasjoner hvis en LC-karusellsentrifuge ikke er tilgjengelig. I dette tilfellet må det også brukes LightCycler sentrifugeadaptere (kat.nr. 11 909 312 001). VALGFRITT TILLEGGSUTSTYR Thrombophilia Post-Elution Protocols-CD (kat.nr. 04 378 784 001) MagNA Pure LC-strekkodeetiketter (kat.nr. 03 531 520 001) MagNA Pure LC Barcode Reader Quick Scan 1000 MagNA Pure LC-strekkodeetikettbånd (kat.nr. 03 531 538 001) (kat.nr. 03 186 580 001) MagNA Pure LC-kjøleblokk, LC-prøvekarusell (kat.nr. 12 189 704 001) MagNA Pure LC-strekkodeskriver TLP 2844 (kat.nr. 03 576 094 001) LightCycler Capping-verktøy (kat.nr. 03 357 317 001) Generelt laboratorieutstyr 3

ANALYSEPROSEDYRE ➀ Automatisert prøveprepareringsprosedyre for 15 eller 30 prøver med MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I (kat.nr. 03 003 990 001) i kombinasjon med MagNA Pure LC-instrumentet (kat.nr. 12 236 931 001) A. OPPRENSING Før du starter Sett MagNA Pure LC-kjøleblokken og LC-prøvekarusellen (kat.nr. 12 189 704 001) i et kjøleskap ved +2 C til +8 C (i minst 2 timer). Start av MagNA Pure LC-instrumentet og programvaren 1. Slå på MagNA Pure LC-instrumentet. Slå deretter på datamaskinen. 2. Start MagNA Pure LC-programvaren, og klikk deretter på knappen Sample Ordering i skjermbildet Main Menu. 3. Velg protokollen med navnet DNA I Blood Cells Fast Protocol i skjermbildet Sample Ordering. Skriv deretter inn lotnumrene for MagNA Pure LC DNA Isolation-kit I (kat.nr. 03 003 990 001) og Factor II (Prothrombin) G20210A-kit, og skriv inn LightCycler -karusell-id-en (andre innstillinger må ikke endres). 4. Legg inn den negative kontrollen (FIIG20210A DIL, rør 4, fargeløs kork) i rad 1 i Sample Order-tabellen (posisjon A1) ved å skrive "Negative Control". Legg inn 50 µl som Sample Volume og 0 µl som Dilution Volume (forhåndsinnstilt). Elution-volumet er forhåndsinnstilt til 100 µl. 5. Start i rad 1 (posisjon B1), og skriv inn prøvenavnene eller bruk MagNA Pure LC-strekkodeleseren (valgfritt). Legg inn 50 µl som Sample Volume og 0 µl som Dilution Volume (forhåndsinnstilt). Elution-volumet er forhåndsinnstilt til 100 µl. 6. Lagre og skriv ut Sample Order-filinformasjonen. 7. Bruk funksjonen Print Sample Names for å lage en utskrift som viser prøvenavn og korrekt posisjon i prøvebrettet. (Valgfritt) 8. Skriv ut strekkodeetiketter for prøvebrett i tre eksemplarer. (Valgfritt) 9. Merk prøvebrettet (til eluering) og utskriftene med strekkodeetikettene. (Valgfritt) 10. Klikk på Stage Setup. Tillaging av aktiv proteinase K-løsning (nok til 32 prøver) 1. Tilsett 3 ml elueringsbuffer (flaske 6, gul kork) til et rør proteinase K, lyofilisert (rør 4, rosa kork). Etter at proteinase K er helt løst opp tilsettes ytterligere 2 ml elueringsbuffer til et endelig volum på 5 ml. 2. Sett kork på røret og bland godt. Merk: Hvis den rekonstituerte løsningen ikke brukes samme dag, kan den oppbevares ved +2 C til +8 C i rør 4 (opptil 4 uker). Alle andre reagenser er klare til bruk. Innsetting av reagenser og engangsplastmateriale Merk: Ikke bruk MagNA Pure LC Tub 30. Bruk kun MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (kat.nr. 03 004 058 001) eller MagNA Pure LC Reagent Tub (stor) [kat.nr. 03 004 040 001] i de posisjoner som angis av MagNA Pure LC-instrumentet for denne prosedyren. Statusen for "Heat Unit" og "Cool Units 1 & 2" må vises som PASS før reagenskarene ("Reagent Tubs") fylles med MGP-suspensjonen (magnetiske glasspartikler, MGP). 1. Fyll reagenskarene manuelt (utenfor MagNA Pure LC-instrumentet) med volumene indikert i skjermbildet Start Information (i illustrasjonen Stage Layout). Lukk deretter reagenskarene med tilhørende lokk og lokkforseglere. Plasser de fylte reagenskarene inn i reagenskarholderen, i de posisjonene som er angitt i skjermbildet Start Information [unntatt MGP-suspensjonen, se trinn 4]. 2. Sett på plass det øvrige nødvendige engangsplastmaterialet (som angitt) og den klargjorte reagenskarholderen på reagens-/ prøvestasjonen i henhold til informasjonen gitt i skjermbildet Start Information. 3. Pipetter manuelt 50 µl resuspendert EDTA- eller sitratantikoagulert humant perifert fullblod fra hver prøve direkte i prøvebrettet (utenfor MagNA Pure LC-instrumentet) i henhold til prøveordrelisten. 4. Vortex MGP-glassrøret kraftig umiddelbart før opprensingen skal utføres. Fyll et reagenskar med MGP-suspensjon, sett på tilhørende lokk, og plasser den på instrumentets reagens-/prøvestasjon i den posisjonen som er angitt i skjermbildet Start Information. 5. Sett prøvebrettet inn i MagNA Pure LC-instrumentet. Opprensingskjøring 1. Bekreft alle innlastede posisjoner på MagNA Pure LC-instrumentet via museklikk i skjermbildet (skjermbildet Start Information). Knappen OK vises etter at alle elementer er bekreftet. 2. Fjern forseglingen fra reagenskarlokkene og lukk låsestangen og døren på MagNA Pure LC-instrumentet. 3. Klikk på knappen OK for å starte opprensingen. Skjermbildet Batch Status vises, og en lilla linje som flytter seg fra venstre til høyre indikerer den faktiske fremdriften for isoleringsprosedyren. 4. Skjermbildet Result vises etter at opprensingen er fullført. 5. Lagre og skriv ut skjermbildet Result. 6. Velg eventuelt funksjonen Open Post-Elution i menyen Action. Gå ellers videre til trinn B i kapittel 2 (manuell prøvepreparering) i dette pakningsvedlegget. 7. Hvis MagNA Pure-ekstraksjonen mislykkes for en individuell prøve (angitt i skjermbildet Result), må den tilsvarende prøven ekstraheres på nytt. Hvis postelueringsfunksjonen ikke kan utføres, gå videre til trinn B i kapittel 2 (manuell prøvepreparering) i dette pakningsvedlegget, og bruk de prøvene som opprinnelig ble ekstrahert eller ekstrahert på nytt. B. POSTELUERING (valgfritt) Før du starter På LightCycler 1.2-instrumentet: Legg inn de Factor II (Prothrombin) G20210A-spesifikke instrumentinnstillingene i skjermbildet Programming på LightCycler 1.2-instrumentet i henhold til tabell 2 på den siste siden av dette pakningsvedlegget. Postelueringsprosedyre (valgfri) 1. Kontroller at MagNA Pure LC-kjøleblokken og LC-prøvekarusellen er på plass og er kjølt ned (f.eks. nedkjølt ved +2 C til +8 C i minst 2 timer). 2. Last inn postelueringsprotokollen med navnet Thrombophilia 15 or 30 samples fra Thrombophilia Post-Elution Protocols-CD-en (kat.nr. 04 378 784 001). 4

3. Master Mix-tillaging (kun for postelueringsprosedyren) Klargjør kun nødvendig mengde rett før bruk. Tin opp komponentene i Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet, bland dem forsiktig, og oppbevar på is. Plasser ett LightCycler -kapillærrør per DNA-prøve og ett for hver av kontrollene i LightCycler -karusellen, dvs. henholdsvis 17 kapillærrør for 15 prøver eller 32 kapillærrør for 30 prøver. Klargjør Master Mix: Trinn Hva du må gjøre 1 Tilsett følgende komponenter i rekkefølgen angitt under til et 1,5 ml Sarstedt-rør med skrukork på is. (de viste eksemplene gjelder for 15 eller 30 prøver): Reagenser aktive løsninger Volum* / 15 prøver Volum* / 30 prøver FIIG20210A DIL, rør 4 209 µl 396 µl FIIG20210A MD Mix, rør 1 38 µl 72 µl FIIG20210A R Mix, rør 2 38 µl 72 µl Totalt volum 285 µl 540 µl * angitt volum inkluderer kontroller og pipetteringsmarginer 2 Bland forsiktig. Kontroller at det ikke finnes luftbobler i spissen av røret. 3 Plasser røret med Master Mix på MagNA Pure LC-kjøleblokken i posisjon 1. Ta av korken. 4. Sett LightCycler -karusellen inkludert kapillærrørene som angitt i postelueringsprotokollen inn i kjøleblokken, og plasser det nødvendige antallet pipettespisser, som angitt i skjermbildet, inn i deres stasjon i MagNA Pure LC-instrumentet. 5. Åpne FIIG20210A CT (rør 3, lilla kork), pipetter 25 µl i et nytt 1,5 ml Sarstedt-rør med skrukork, og plasser det deretter på MagNA Pure LC-kjøleblokken i posisjon 16 som angitt i postelueringsprotokollen. Merk: Sentrifuger røret som inneholder FIIG20210A CT for å spinne ned innholdet før åpning. Kontroller at det ikke finnes luftbobler i spissen av røret. Bytt hansker etter håndtering av kontrolltemplatet. 6. Lukk instrumentet og klikk på Start og OK for å starte automatisk pipettering. Så snart postelueringen er ferdig, vises skjermbildet Post- Elution Result. 7. Skriv ut strekkoder for kjøleblokken i tre eksemplarer. (Valgfritt) 8. Lagre (Save) og skriv ut resultattabellen (Print Post-Elution). Merk deretter utskriften med en kjøleblokkstrekkode. (Valgfritt) 9. Merk en tom diskett med navnet på opprensingskjøringen, eller med en kjøleblokkstrekkode. Opprett en LightCycler SAM-fil (Sample Pattern File) på disketten. 10. Lukk hvert kapillærrør med en kork ved hjelp av LC Capping-verktøyet (kat.nr. 03 357 317 001). 11. Merk LightCycler -karusellen med en kjøleblokkstrekkode. (Valgfritt) 12. Plasser LightCycler -karusellen i LC-karusellsentrifugens rotorinnsats. 13. Overfør rotorinnsatsen med LightCycler -karusellen til LC-karusellsentrifugen. Merk: Hvis ingen LC-karusellsentrifuge er tilgjengelig, er det mulig å bruke en bordsentrifuge med LightCycler -sentrifugeadaptere. Sentrifuger ved maks. 735 g i 30 sekunder. 14. Trykk på Start for å starte LC-karusellsentrifugen. 15. Overfør LightCycler -karusellen til LightCycler 1.2-instrumentet etter sentrifugeringen. Merk: Oppbevar eluert DNA ved +2 C til +8 C i opptil sju dager og ved -15 C til -25 C ved langtidsoppbevaring (ca. 3 uker). Hvis postelueringsprotokollen med MagNAPure LC ikke benyttes, gå til trinn B i kapittel 2 (manuell prøvepreparering) for PCR Master Mixoppsett. 16. Hvis ingen flere MagNA Pure-kjøringer skal utføres, må MagNA Pure LC-datamaskinen og MagNA Pure LC-instrumentet slås av. C. AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON LightCycler 1.2-instrument 1. Hvis karusellen tidligere har vært merket (trinn B.11), fjernes strekkodeetiketten fra LightCycler -karusellen. (Valgfritt) 2. Sett karusellen inn i LightCycler 1.2-instrumentet. 3. Klikk på Open Experiment File. Velg det eksperimentet som inneholder Instrument Settings angitt på side 9. Still inn Display Mode til deteksjonskanal F2. 4. Klikk på knappen Edit Samples i skjermbildet Programming for å gå inn i skjermbildet Sample Loading. 5. Klikk på Run. 6. Ved bruk av en tidligere opprettet SAM-fil (trinn B.9), sett disketten som inneholder SAM-filen inn i LightCycler 1.2-instrumentet. (Valgfritt) 7. Velg listen File/Load MagNA Pure LC på menylinjen i skjermbildet Loading. Velg prøvefilen (SAM-filen) fra MagNA Pure LC, og klikk på Open for å laste inn dataene. (Valgfritt) 8. Skriv inn negativ som Sample Type for karusellposisjon nr. 1. 9. Skriv inn positiv som Sample Type for karusellposisjon nr. 2. 10. Klikk på Done for å gå tilbake til skjermbildet Programming. 11. Klikk på Save Experiment File. 12. Klikk på Run for å starte. 13. Når amplifikasjonen er ferdig, utfør Melting Curve-analyse for å genotype det humane genomiske DNA-et. 5

➁ Manuell prøveprepareringsprosedyre for én prøve ved hjelp av High Pure PCR Template Preparation-kit (kat.nr. 11 796 828 001) A. OPPRENSING Før du starter Kjøl ned LightCycler -sentrifugeadapterne i et kjøleskap ved +2 C til +8 C (i minst 2 timer). Tillaging av aktive løsninger Reagens Rekonstituering/tillaging av aktive løsninger Oppbevaring av aktiv løsning og stabilitet Proteinase K Løs opp proteinase K i 4,5 ml dobbeltdestillert vann, Oppbevar ved -15 C til -25 C. Stabil i 12 måneder. (rør 3, rosa kork) fordel løsningen i passende porsjoner. Buffer for fjerning av hemmere Tilsett 20 ml etanol til buffer for fjerning av hemmere. Oppbevar ved +15 C to +25 C. Stabil til utløpsdatoen (rør 4a, svart kork) Merk: Merk og dater flasken når etanolen er tilsatt. angitt på kit-etiketten. Vaskebuffer Tilsett 80 ml etanol til vaskebuffer. Oppbevar ved +15 C to +25 C. Stabil til utløpsdatoen (rør 4, blå kork) Merk: Merk og dater flasken når etanolen er tilsatt. angitt på kit-etiketten. Opprensingsprosedyre Merk: Sørg for å følge prosedyren nedenfor svært nøye, ikke den prosedyren som er beskrevet på pakningsvedlegget for High Pure PCR Template Preparation-kit. 1. Fordel 200 µl elueringsbuffer per prøve i sterile 1,5 ml reaksjonsrør, lukk rørene og forvarm dem til +70 C. 2. Til 200 µl resuspendert EDTA- eller sitratantikoagulert humant perifert fullblod tilsettes: 200 µl bindingsbuffer (grønn kork) 40 µl proteinase K (rekonstituert) Bland umiddelbart ved å vortexe, og inkuber ved +70 C i 10 min. 3. Tilsett 100 µl isopropanol, og bland godt ved å vortexe. 4. Pipetter prøveblandingen i det øverste reservoaret i en montert enhet av High Pure filterrør og oppsamlingsrør. 5. Sentrifuger i 1 min ved 6000 g i en standard bordsentrifuge. 6. Kast oppsamlingsrøret med væskeinnhold. 7. Sett filterrøret sammen med et nytt oppsamlingsrør. 8. Tilsett 500 µl buffer for fjerning av hemmere (svart kork) i det øverste reservoaret. 9. Sentrifuger i 1 min ved 6000 g. 10. Kast oppsamlingsrøret med væskeinnhold. 11. Sett filterrøret sammen med et nytt oppsamlingsrør. 12. Tilsett 500 µl vaskebuffer (blå kork) i det øverste reservoaret. 13. Sentrifuger i 1 min ved 6000 g. 14. Kast oppsamlingsrøret med væskeinnhold. 15. Sett filterrøret sammen med et nytt oppsamlingsrør. 16. Tilsett 500 µl vaskebuffer (blå kork) i det øverste reservoaret. 17. Sentrifuger i 1 min ved 6000 g. 18. Slå ut den oppsamlede væsken. 19. Sett filterrøret sammen med det samme oppsamlingsrøret. 20. Sentrifuger i 10 sekunder ved maksimal hastighet (13 000 g eller høyere) for å fjerne resterende vaskebuffer. 21. Kast oppsamlingsrøret. 22. Sett filterrøret inn i et 1,5 ml reaksjonsrør. 23. Tilsett 200 µl forvarmet (+70 C) elueringsbuffer til filterrøret. 24. Sentrifuger i 1 min ved 6000 g. Mikrosentrifugerøret inneholder nå det eluerte DNA-et. 6

B. MASTER MIX-TILLAGING Før du starter Legg inn de Factor II (Prothrombin) G20210A-spesifikke instrumentinnstillingene i skjermbildet Programming på LightCycler 1.2- instrumentet i henhold til tabellen på den siste siden av dette pakningsvedlegget. Tillaging av Master Mix 1. Tin opp komponentene i Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet, bland dem forsiktig, og oppbevar på is. 2. Plasser ett LightCycler -kapillærrør per DNA-prøve og ett for hver av kontrollene i de avkjølte LightCycler -sentrifugeadapterne. 3. Klargjør Master Mix ved å multiplisere mengden i kolonnen "Volum/reaksjon" med antall reaksjoner som skal kjøres (dvs. DNA-prøver, negative og positive kontroller), legg til én ekstra reaksjon. Fortsett slik det er beskrevet nedenfor for en 20 µl standardreaksjon. Trinn Hva du må gjøre 1 Tilsett følgende komponenter i rekkefølgen angitt under til et 1,5 ml reaksjonsrør på is. Reagenser aktive løsninger Volum/reaksjon FIIG20210A DIL, rør 4 11 µl FIIG20210A MD Mix, rør 1 2 µl FIIG20210A R Mix, rør 2 2 µl Totalt volum 15 µl 2 Bland forsiktig. Pipetter 15 µl Master Mix i hvert avkjølt LightCycler -kapillærrør. Kontroller prøvelistens identitet (kapittel 1, A7, utskrift) opp mot det respektive prøvebrettet ved å sammenligne strekkodenumrene (valgfritt). Tilsett 5 µl isolert prøve-dna eller 5 µl FIIG20210A CT (rør 3, lilla kork) som positiv kontroll eller 5 µl FIIG20210A DIL (rør 4, fargeløs kork) som negativ kontroll. 3 Lukk hvert kapillærrør med en kork ved hjelp av LC Capping-verktøyet (kat.nr. 03 357 317 001). 4 Hvis LC-karusellsentrifugen benyttes, gå til trinn 5. Hvis en tilsvarende bordsentrifuge blir benyttet (f.eks. Biofuge 13 fra Heraeus Instruments eller Kendro Laboratory Products), plasseres hvert kapillærrør i de respektive avkjølte LightCycler -sentrifugeadapterne, og følgende trinn utføres: Plasser adaptere i bordsentrifugen Sentrifuger ved maks. 735 g i 30 sekunder. Gå videre til trinn 5. 5 Plasser kapillærrøret som inneholder den negative kontrollen i posisjon 1, og kapillærrøret som inneholder den positive kontrollen i posisjon 2 i LightCycler -karusellen. 6 Start i posisjon 3, og plasser kapillærrørene som inneholder prøve-dna i LightCycler -karusellen. 7 Overfør rotorinnsatsen med LightCycler -karusellen til LC-karusellsentrifugen. 8 Trykk på Start for å starte LC-karusellsentrifugen. 9 Overfør LightCycler -karusellen til LightCycler 1.2-instrumentet etter sentrifugeringen. C. AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON LightCycler 1.2-instrument 1. Sett karusellen inn i LightCycler 1.2-instrumentet. 2. Klikk på Open Experiment File. Velg det eksperimentet som inneholder Instrument Settings angitt på side 9. Still inn Display Mode til deteksjonskanal F2. 3. Klikk på knappen Edit Samples for å åpne skjermbildet Sample Loading. 4. Klikk på Run. 5. Skriv inn prøvenavn og prøvetype i skjermbildet Sample Loading i samsvar med den faktiske innlastingsrekkefølgen for prøver. 6. Velg File/Save As/ på menylinjen i skjermbildet Loading, og skriv inn navn på prøvefilen. Prøveopplysningene lagres som en separat fil i User/Protocol-mappen. 7. Klikk på Done for å gå tilbake til skjermbildet Programming. 8. Klikk på Save Experiment File. 9. Klikk på Run for å starte. 10. Når amplifikasjonen er ferdig, utfør Melting Curve-analyse for å genotype det humane genomiske DNA-et. INSTRUMENTKALIBRERING Kalibrering er ikke nødvendig. 7

KVALITETSKONTROLL For å kunne utføre en entydig genotyping er det nødvendig at negativ FIIG20210A-kontroll (FIIG20210A DIL, rør 4, fargeløs kork) i posisjon 1 og positiv FIIG20210A-kontroll (FIIG20210A CT, rør 3, lilla kork) i posisjon 2 i LightCycler -karusellen analyseres sammen med hver batch med prøver. Merk: Den anbefalte Crossing Point (cp)-terskelverdien er 31. Hvis den er høyere, må genotyperesultatene rapporteres som "equivocal" (usikre). Crossing Points kan ses etter at amplifikasjonssyklusene er fullført ved å klikke på knappen Quantification i skjermbildet Data Analysis Front for å komme til skjermbildet Quantification. Dette gjelder kun for villtypemutanttyper og heterozygote mutanttyper. På grunn av analysens design vil ikke homozygote mutantprøver gi en cp-verdi. For sikker identifikasjon av en homozygot mutant, sjekk nøye at den negative kontrollen ikke viser en smeltekurveprofil. Negativ kontroll: Smeltekurveanalysen for den negative kontrollen skal alltid vise et negativt resultat. Hvis dette ikke er tilfelle, er analyseserien ugyldig og hele prosedyren (prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon) må gjentas. Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis den negative kontrollen gjentatte ganger gir et ikke-negativt resultat. Positiv kontroll Smeltekurveanalysen for den positive FIIG20210A-kontrollen (FIIG20210A CT, rør 3, lilla kork) skal alltid vise to smeltetopper, den første toppen med en T M på 49 C ± 2,5 C og den andre toppen med en T M på 59 C ± 2,5 C. ΔT mellom disse to smeltetoppene er 10 C ± 1,5 C. Hvis dette ikke er tilfellet, er analyseserien ugyldig, og hele prosedyren (prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon) må gjentas. Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis den positive kontrollen gjentatte ganger gir et ikke-positivt (ikke-heterozygot) resultat. Prøveresultat: Analyseresultatet for prøve-dna skal alltid utvise smeltekurveprofil for den homozygote villtypen, homozygot mutant eller heterozygot genotype. Profilen må være i overensstemmelse med akseptkriteriene beskrevet over, i avsnittet "Positiv kontroll". Hvis dette ikke er tilfelle, er resultatet for denne prøven ugyldig, og hele prosedyren (prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon) må gjentas. Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis prøveresultatet gjentatte ganger er negativt for alle genotyper. BEGRENSNINGER OG INTERFERENS FIIG20210A MD Mix (rør 1, gul kork) er sekvensspesifikk for det humane Factor II-genet. Høye konsentrasjoner av heparin kan interferere i polymerasekjedereaksjonen. Andre mulige interferenser er ikke kjent. FORVENTEDE VERDIER / TOLKNING AV RESULTATER Smeltekurveprogram De resulterende smeltetoppene gjør det mulig å skille mellom homozygot (villtype eller mutant) og heterozygot genotype. Fig. 1: Smeltekurveanalyse av de tre mulige genotypene av Factor II (Prothrombin) G20210A-sekvensen. Grafen, som fremstiller det første negative derivatet av fluorescens i forhold til temperatur [ d(f2)/dt], viser topper med ulik T M. Smeltetoppene indikerer at den fullt homologe sekvensen (villtype-genotype) har en høyere T M enn sekvensen som har en mismatch med mutasjonsproben (mutantgenotypen). Prøver som inneholder begge sekvenser (heterozygot genotype) viser to topper ved nøyaktig de samme temperaturene som de respektive homozygote prøvene. Som en negativ kontroll, ble templat-dna erstattet med FIIG20210A DIL. Tolkning Villtype-genotypen og den fluoresceinmerkede H-proben danner en perfekt match. Dette gir en T M som kan variere ± 2,5 C fra T M for den andre smeltetoppen for den positive FIIG20210A-kontrollen (FIIG20210A CT, rør 3, lilla kork) ved 59 C. Når mutantgenotypen er til stede, finnes det en mismatch, og det resulterende T M kan variere ± 2,5 C fra T M for den første smeltetoppen i den positive FIIG20210A-kontrollen (FIIG20210A CT, rør 3, lilla kork) ved 49 C. Heterozygote genotyper viser to smeltetopper med de tilhørende T M -ene ved henholdsvis 49 C og 59 C. Templat-DNA som inneholder... Antall smeltetopper T M for smeltetoppen ΔT mellom smeltetoppene Homozygot villtype-genotype 1 59 C ± 2,5 C Heterozygot genotype 2 59 C ± 2,5 C 10 C ± 1,5 C 49 C ± 2,5 C Homozygot mutantgenotype 1 49 C ± 2,5 C Merk: Total presisjon ble bestemt i henhold til NCCLS-anbefalingene (3) ved tre ulike, eksterne laboratorier ved hjelp av en human heterozygot DNApreparering. Det ble oppnådd median-smeltetemperaturer på 49,51 C og 58,89 C og en median-cv på 0,36 %. 8

SPESIFIKKE YTELSESDATA Analytisk spesifisitet Ved hjelp av sekvensanalyse ble det vist at de selekterte syntetiske oligonukleotidene som brukes som primere, spesifikt amplifiserer et 165 bpfragment på Factor II-genet som inneholder Factor II (Prothrombin) G20210A-sekvensen. Sekvensanalysen viste videre at de selekterte oligonukleotidene som blir brukt som H-prober under smeltekurveanalysen, entydig identifiserer Factor II (Prothrombin) G20210Amutasjonen i posisjon 20210. Smeltekurveanalysen vil imidlertid gi et ukjent resultat for den kjente, men svært sjeldne mutasjonen i posisjon 20218. Analytisk sensitivitet Renset humant DNA, heterozygot for Factor II (Prothrombin) G20210A-mutasjonen, ble fortynnet i fire serielle fortynningstrinn. Hver fortynning ble analysert i seks replikater, og det ble foretatt statistisk tolking av resultatene. Det ble beregnet en laveste deteksjonsgrense på 50 kopier per reaksjon for Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet. Diagnostisk sensitivitet og spesifisitet I en prospektiv studie med nylig tatte og lagrede humane DNA-prøver, ble 572 prøver fra pasienter av kaukasisk rase med mistanke om trombofili analysert ved hjelp av Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet, og det ble utført enkelt- eller dobbelttrådet sekvensanalyse på et MegaBACE 500 Sequencing System ved hjelp av Cimarron Base Caller SW 3.12. Begge paneler representerer alle rutinemessig innsamlede trombofiliprøver fra pasienter på et universitetssykehuslaboratorium over et gitt tidsrom. Nivå av overensstemmelse mellom Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet og sekvensanalyse var 99,5 % (569/572). Detaljerte data vises i tabellen nedenfor. Tabell 1: Factor II (Prothrombin) G20210A-kit sammenliknet med sekvensanalyse Sekvensanalyse Factor II (Prothrombin) G20210A-kit villtype (wt) heterozygot (het) mutant (mut) wt 519 0 0 het 0 50 0 mut 0 0 0 Merk: Totalt 40,7 % av de humane DNA-prøvene ble tatt fra pasienter med mistanke om venøse tromboemboliske hendelser i overensstemmelse med konsensuserklæringer fra én av, eller både American College of Medical Genetics (ACMG) og College of American Pathologists (CAP) (2,4), 37,9 % fra pasienter med arteriell trombotisk sykdom (f.eks. slag), 18,9 % fra pasienter med mistanke om trombofili av andre årsaker og 2,4 % av ukjente årsaker. For tre av prøvene kunne genotype ikke bestemmes med Factor II (Prothrombin) G20210A-kitet. Tabell 2: Instrumentinnstillinger 1: Denaturation 2: Amplification 3: Melting Curve Analysis 4: Cooling Cycle Program Data Value Cycles 1 45 1 1 Analysis Mode None Quantification Melting Curves None Temperature Targets Segment 1 1 2 3 1 2 3 4 5 1 Target Temperature ( C) 95 95 55 72 95 55 45 40 70 40 Incubation Time (sec) 30 0 10 5 60 30 30 120 0 30 Temperature Transition Rate ( C/s) 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 0,1 20,0 Second Target Temperature ( C) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Step Size ( C) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Step Delay (cycles) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Acquisition Mode None None Single None None None None None Cont. None MERKNAD TIL KJØPER Kjøp av dette produktet gir brukeren rett til å bruke det til amplikasjon og deteksjon av nukleinsyresekvenser i forbindelse med human in vitro-diagnostikk. Det gis ingen generelle patent- eller andre lisensrettigheter i forbindelse med kjøpet bortsett fra bruksretten. 9

REFERANSER 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, 1305-1307. 2 Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol.2,139-148. 3 Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia. 2012 Roche Molecular Systems, Inc. Teknologien som brukes i LightCycler-systemet er lisensiert fra Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. ROCHE, LIGHTCYCLER, MAGNA PURE, LC, HYBPROBE og HIGH PURE er varemerker for Roche. Biofuge er et varemerke for Heraeus Instruments GmbH. Brij er et registrert varemerke for ICI Americas, Inc., PA, USA. MegaBACE er et varemerke for Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, UK. Cimarron er et varemerke for Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA. Produsert i Tyskland Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Tyskland For USA: Distribusjon i USA: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA Teknisk kundestøtte i USA: 1-800-526-1247 09/2012 (03708594001-07ENGL) 04984170170-02 10