PLATELIA ASPERGILLUS EIA 62796 96 TESTER

PLATELIA ASPERGILLUS EIA 62796 96 TESTER PLATELIA ASPERGILLUS EIA ER EN ENZYMIMMUNANALYSE BASERT PÅ SANDWICH- TEKNIKK I MIKROTITERPLATE FOR PÅVISNING AV ASPERGILLUS GALACTOMANNAN ANTIGEN I SERUM. 1 FORMÅL Platelia Aspergillus EIA er en enzymimmunanalyse basert på sandwich-teknikk i mikrotiterplate for påvisning av Aspergillus galactomannan antigen i serumprøver. 2 BRUKSOMRÅDE Platelia Aspergillus EIA er en test som, når den benyttes sammen med andre diagnostiske prosedyrer, for eksempel mikrobiologisk kultur, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografiske funn, kan brukes som et hjelpemiddel i diagnostiseringen av invasiv aspergillose. 3 OVERSIKT OG FORKLARING Aspergillus-infeksjoner forekommer vanligvis etter inhalering av Aspergillus-sporer som finnes i omgivelsene. Invasive former, som har hatt en økning i de siste 10 årene, står for de mest alvorlige infeksjonene. De forekommer hovedsakelig hos pasienter med neutropeni (etter behandling mot kreft) og hos pasienter som har fått immunsuppressiv behandling (organtransplantasjoner, spesielt benmargstransplantasjon) og kortikosteroider 7. Aspergillus er sjelden isolert fra blodkultur. Diagnosen er ofte basert på ikke-spesifikke diagnostiske eller radiologiske funn (kliniske symptomer, CT-scanning, røntgen av brystet, etc.) På det nåværende tidspunkt, ser det ut for at testen for oppløselig galactomannan antigen i serum vil være en serologisk metode som kan være en hjelp i diagnostiseringen av invasiv aspergillose 6, 9, 14, 34, 39. 4 PROSEDYRENS PRINSIPPER 27 Platelia Aspergillus EIA er en ettstegs enzymimmunanalyse etter sandwichprinsippet som påviser galactomannan fra humant serum. Analysen benytter monoklonale antistoffer fra rotte, EBA-2, som er rettet mot Aspergillus galactomannan, og som er blitt beskrevet i tidligere studier 16, 28. De monoklonale antistoffene brukes til, (1) å kle brønnene på mikroplaten og til å binde antigenet, og (2) å påvise antigenet som er bundet til den sensitiverte mikroplaten (konjugert reagens: peroksidase-bundne monoklonale antistoffer). Serumprøver blir varmebehandlet sammen med EDTA for å spalte immunkomplekser og for å felle ut serumproteiner som muligens vil kunne ha innvirkning på testen 15. De behandlete serumprøvene og konjugatet tilsettes brønnene som er påført monoklonale antistoffer, og inkuberes. Et monoklonalt antistoff - galactomannan - monoklonalt antistoff / peroxidase-kompleks dannes ved tilstedeværelsen av galactomannan antigen. Strimlene vaskes for å fjerne ubundet materiale. Deretter tilsettes substratløsningen, som vil reagere med kompleksene bundet til brønnen for å oppnå en blåfarget reaksjon. Enzymreaksjonen stoppes ved tilførsel av syre, som endrer blåfargen til gult. Absorbansen (optisk tetthet) av prøvene og kontrollene blir bestemt med et spektrofotometer innstilt på 450 og 620 nm bølgelengde. 5 REAGENSER Platelia Aspergillus EIA: produkt nr. 62796 (96 tester) Oppbevar settet ved 2-8 C. Alle reagenser må være romtempererte før de brukes (18-25 C). Bring alle reagenser, med unntak av kontrollene, tilbake til 2-8 C umiddelbart etter bruk. Etter rekondisjonering, må ubrukt negativ kontroll, cutoff-kontroll og positiv kontroll fryses ved -20 C. Legg alle ubrukte strimler tilbake i posen og forsegl den igjen. Ikke fjern porøsitetsmiddelet. Strimlene bør brukes innen 5 uker etter de er åpnet og lagt tilbake i forseglet pose/futteral. Etter fortynning kan arbeidsvaskeoppløsningen oppbevares i 14 dager ved 2-8 C. Alle andre reagenser er sikre frem til utgått-dato etter åpning. Reagenser leveres i tilstrekkelig mengde for å kunne utføre 96 tester i max 9 porsjoner/grupper. 1

R1 R2 R3 R4 R5 Konsentrert vaske-oppløsning Negativ Kontroll-serum Cut-off Kontroll-serum Positiv Kontroll-serum Bestanddel Innhold Mengde Mikrobrønn Mikroplate: 1 plate / Strimleplate -96 brønner (12 strimler med 8 brønner hver) belagt med anti- 12 x 8 brønner galactomannan monoklonale antistoffer Konsentrert vaskeoppløsning (10X): -Tris NaCl -1% Tween 20-0,01 % thimerosal Negativ kontroll-serum: -Frysetørret humant serum negativ for galactomannan -Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen Cut-off kontroll-serum: -Frysetørret humant serum som inneholder galactomannan -Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen Positiv kontroll-serum: -Frysetørret humant serum som inneholder galactomannan -Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen R6 Konjugat Konjugat (klar til bruk): -Anti-galactomannan monoklonalt antistoff / peroxidasemerket -Konserveringsmiddel: 0,01 % thimerosal R7 R8 R9 Serum Fremstillingsløsning TMB Substratbuffer Kromogen: TMBløsning Serum fremstillingsløsning (klar til bruk): -EDTA sur løsning TMB Substratbuffer (klar til bruk): -Sitronsyre- og natriumacetat-løsning -0,009 % hydrogenperoksid -4% dimetylsulfoksid (DMSO) Kromogen TMB-løsning (konsentrert): -90 % dimetylsulfoksid (DMSO)-løsning som inneholder 0,6 % tetrametylbensidin (TMB) Stopp-løsning (klar til bruk): 1 x 100 ml 3 x qs*1 ml 3 x qs*1ml 3 x qs*1 ml 1 x 8 ml 1 x 10.5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml R10 Stopp- 1 x 12 ml løsning -1,5 N svovelsyre (H 2 SO 4 ) Plateforseglere -Selvklebende ark for mikroplater 1 x 8 ark Mrk: TMB (tetrametylbensidin) er et ikke-karsinogent og ikke-mutant kromogen for peroksidase. *Mrk: qs: Tilstrekkelig mengde 6 ADVARSEL FOR BRUKERE 1. For in vitro diagnostisk bruk. 2. Bare til profesjonell bruk. 3. Det anbefales ikke å bruke dette testsettet med annet enn menneskelige prøver. 4. Den positive kontrollen, avkuttingskontrollen og den negative kontrollen er produsert av menneskelig serum som har blitt testet og funnet å være ikke-reaktivt for HBsAg og antistoffer for HIV-1, HIV-2 and HCV med CE-merkede tester. Men alle reagenser skal håndteres som om de er i stand til å overføre infeksjon. Alle tester skal utføres i henhold til OSHA-standarden for blodbårne patogener, biosikkerhetsnivå 2 eller andre korrekte biosikkerhetspraksiser. 5. Bruk vernetøy, inkludert laboratoriefrakk, øye/ansiktsbeskyttelse og engangshansker (syntetiske, ikkelatekshansker anbefales) og håndtere settets reagenser og pasientprøver med de påkrevde gode laboratoriepraksiser. Vask hendene grundig etter at du har utført testen. 6. Ikke pipettér med munnen. 7. Ikke røyk, drikk eller spis i områder der prøver eller settreagenser håndteres. 8. Unngå å sprute prøver eller løsninger. 9. Biologisk søl som ikke inneholder syre, bør vaskes grundig bort med et effektivt desinfiseringsmiddel. Desinfiseringsmidler som kan brukes, omfatter (men er ikke begrenset til) en løsning på 10 % blekemiddel (0,5 % løsning av natriumhypoklorid), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialer brukt til å tørke opp avfall, kan måtte deponeres som farlig biologisk avfall. FORSIKTIG: Ikke plasser løsninger som inneholder blekemidler, i autoklaven. 2

10. Søl som inneholder syre, skal fjernes på korrekt måte (tørkes opp) eller nøytraliseres med natriumbikarbonat og området vaskes og tørkes; hvis det inneholdt farlig biologisk materiale, skal du tørke av med ett av de kjemiske desinfeksjonsmidlene. 11. Deponer alle prøver og materialer brukt til å utforme testen som om de inneholder et smittsomt middel. Laboratoriets kjemiske og biologisk farlige avfallstoffer må håndteres og kastes i henhold til alle lokale, regionale og nasjonale regler. 12. FORSIKTIG: Det følgende er en liste over potensielle kjemiske farer som i noen settkomponenter (se seksjon 5- REAGENSER): 1,5 N svovelsyre (7,2 % H 2 SO 4 ) stoppløsning er korroderende, i stand til å forårsake brennmerker på øyne og hud; kan være skadelig om den blir svelget eller kommer i kontakt med hud; kan forårsake alvorlig øyeskade, inkludert permanent skade på syn eller blindhet. Holdes unna sterke baser og reduserende midler. C-Etsende R34-41 forårsaker brannskader. Risiko for alvorlige skader på øyne. S24/25-26-30-36/37/39-60. Unngå kontakt med hud og øyne. I tilfelle kontakt med øynene skal du umiddelbart skylle av med masse vann og søke medisinsk hjelp. Legg aldri vann til dette produktet. Bruk riktige klær, hansker og beskyttelse for øye/ansikt. Dette materialet og dets beholder må deponeres som farlig avfall. Avfall fra dette materialet betraktes som farlig, syreholdig avfall, men tillates det av lokale, regionale og nasjonale regler, kan det nøytraliseres til ph 6-9 for ikke-farlig deponering, hvis personell er opplært og utstyrt til dette. 0,01 % thimerosal (natriummerthiolat), et biocid konserveringsstoff med organisk kvikksølv som angriper sentralnervesystemet (CNS), er et reproduksjons-giftstoff og betydelig sensibilisator; forlenget eller gjentatt utsettelse for dette kan forårsake en allergisk reaksjon i visse sensitive individer; det er mange tilfeller av sensibilisering som kommer av utsettelse for fortynnede thimerosal-løsninger. Unngå å slippe ut i miljøet, det er fare for kumulative effekter. Brukte løsninger som inneholder kvikksølv og som har en konsentrasjon som er større enn 0,2 ppm, må deponeres i henhold til føderalt amerikansk RCRA for farlig avfall (D009), men deponer alt avfall i henhold til lokale, regionale og nasjonale regler. (Merk: kvikksølv (Hg) utgjør 49,55 % av thimerosal-molekylet, slik inneholder en komponent med 0,01 % thimerosal ~0,005 % (~50 ppm) kvikksølv w/v). I tilfelle kontakt med hud skal du umiddelbart vaske med mye vann. Advarsel: Thimerosal er kjent for delstaten California som å forårsake reproduksjons-giftighet. 13. Materialsikkerhetsdatabladet (MSDS) er tilgjengelig på forespørsel. 7 FORHOLDSREGLER FOR BRUKERE 1. FROSNE SERUMPRØVER LAGRET UNDER UKJENTE FORHOLD KAN GI FALSKE POSITIVE RESULTATER GRUNNET FORURENSING MED SOPP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Bruk ikke settet eller noen av reagensene i settet etter den påførte utløpsdatoen. 3. Med unntak av den konsentrerte vaskeoppløsningen (R2) og stopp-løsningen (R10), må reagenser fra andre sett med andre partinumre ikke blandes. 4. La alle reagenser romtempereres i minst 15 minutter før bruk. 5. Bland grundig under rekonstitusjon av reagensene. Forsiktighet må utvises for å unngå mikrobiell forurensing. 6. Utfør ikke prøven i reaktive stoffer (syrer, baser og aldehyder) eller støv, som kan påvirke den enzymatiske aktiviteten i konjugatet. 7. Bruk rene, engangs plastbeholdere av polypropylen ved tillaging av substratkromogenreaksjonsløsningen. Dersom glass må brukes, skal det først vaskes i 1N saltsyre, skylles med destillert vann og tørkes. 8. For manuell pipettering av kontroller og prøver, må det brukes særskilte pipettespisser for å hindre overføring av materiale mellom prøvene. 9. For å sikre tilstrekkelig vasking av brønnene, utføres dette i samsvar med det anbefalte antall vaskesykluser, og sørg for at alle brønner er helt fylt opp og deretter fullstendig tømt. Vasking bør ikke utføres manuelt med en klem-på-flaske. 10. La ikke mikroplaten tørke mellom slutten av vaskesyklusen og tilsetting av reagenser. 11. Ikke bruk samme beholder for konjugatet og substrat-løsningene. 12. Ikke la konjugat- eller substrat-kromogenreaksjonsløsningene komme i kontakt med metall eller metallioner. 13. Unngå å utsette kromogen- eller substrat-kromogenreaksjonsløsningene for sterkt lys under lagring eller inkubering. La ikke kromogenløsningene komme i kontakt med en oksiderende agens. 14. Sørg for å unngå at stopp-løsningen kommer i kontakt med en oksiderende agens. Ikke la stoppløsningen komme i kontakt med metall eller metallioner. 3

15. Bruk rene, støvfrie materialer (rør, spisser, beholdere, etc.) for å minske muligheten for forurensing med Aspergillus-sporer fra omgivelsene. Fordi galactomannan er varme-stabil, vil ikke sterilisering av brukt materiale garantere for fravær av forurensende antigen. Pyrogenfrie materialer vil være det optimale, men standardmateriale kan brukes med tilstrekkelig forholdsregler. 16. Begrens mulighetene for at løsningene (sera, serum dyrkingsløsning, konjugat) eller åpne beholdere (plater, rør, pipetter) utsettes for luft. 17. Ikke fyll noe av det ubrukt konjugatet tilbake i den originale beholderen. 18. Substrat-kromogenreaksjonsløsningene må være fargeløse. Tilsynekomst av blåfarge etter fortynning kan bety at reagensen er forurenset og bør derfor ikke brukes. Kasser den og lag til ny reagens. 8 REAGENSTILBEREDING OG LAGRING Mikrobrønn strimmelplate/skål (R1) Etter åpning av plateposen/futteralet, er mikrobrønnstrimlene brukbare i 5 uker når de lagres ved +2-8 C i originalpakken, som skal være skikkelig lukket og med porøsitetsmiddel vedlagt. Vaskeoppløsning (R2) Tilbered arbeidsvaskeoppløsningen som trengs ved å tilsette 1 del konsentrert vaskeoppløsning til 9 deler sterilt, deionisert eller destillert vann. Arbeidsoppløsningen kan oppbevares i 14 dager ved 2-8 C. Lag til en tilstrekkelig mengde av arbeidsvaskeoppløsning for å fullføre kjøringen (80 ml for en strimmel: 8 ml R2 + 72 ml destillert vann). Etter åpning, er den konsentrerte vaskeoppløsningen, når lagret ved +2-25 C, og ved fravær av forurensing, stabil fram til utløpsdatoen som er påført etiketten. Negativt kontroll-serum (R3) Rekonstituer innholdet av en flaske med kontroll med 1000 µl (1 ml) sterilt, renset vann (fortrinnsvis pyrogenfritt vann). Sera må rehydreres rett før testen utføres. Bland skikkelig etter at serum har fått rehydrere i 2-3 minutter. Aliquot 300 µl i hver av de 3 polypropylen mikrosentrifugerørene. Frys umiddelbart ved -20 C alle gjenværende polypropylen sentrifugerør som ikke kommer til å bli brukt etter rehydrering. Mrk: Kontrollsera som er blitt rehydrert tidligere og umiddelbart frosset ved -20 C kan tines og brukes uten ytterligere rehydrering. Frosne rehydrerte kontroller kan lagres ved -20 C I opp til fem uker. Behandl kontrollsera på samme måte som pasientprøver (300 µl serum + 100 µl serum dyrkningsoppløsning, etc...). Cut-off kontrollserum (R4) og positiv kontrollserum (R5) Lag til som beskrevet ovenfor for negative kontrollserum. Substrat-kromogen reaksjonsløsning (R8 + R9) Lag til substrat-kromogen reaksjonsløsningen ved å tilsette 1 del konsentrert kromogen TMB-løsning, R9, til 50 deler TMB substratbuffer, R8. Lag til 2 ml substrat-kromogen reaksjonsløsning per strimmel: 40 µl R9 + 2 ml R8. Løsningen er stabil i 6 timer når den lagres i mørke ved romtemperatur (+18-25 C). Etter åpning, er R8- og R9-reagensene, ved fravær av forurensing, stabile fram til utløpsdatoen som er oppgitt på etiketten når de er lagret ved +2-8 C. Konjugat (R6), serum dyrkningsløsning (R7) og stopp-løsning (R10) Etter åpning, er R6-, R7- og R10-reagensense, ved fravær av forurensing, stabile fram til utløpsdatoen som er oppgitt på etiketten når de er lagret ved +2-8 C. 9 PRØVETAKING Innhent blodprøver i henhold til standard laboratoriepraksis. Testene utføres på serum. Serumprøver må være uten forurensing fra soppsporer og/eller bakterier. Transporter og lagre prøvene i forseglete rør, uten at luft kommer til. Uåpnete prøver kan lagres ved 2-8 C i opp til 5 dager før testing. Etter første gangs åpning, kan prøvene lagres ved 2-8 C i 48 timer før testing. For ytterligere lagring, lagres serumet ved -70 C. Serumprøver kan tåle maksimum 4 fryse- / opptiningssykluser. Tidligere frosne prøver bør blandes grundig etter opptining før testingen. Resultatene påvirkes ikke av prøver som inneholder 20 mg/l bilirubin, lipemiske prøver som inneholder det tilsvarende til 2 g/l triolein (triglyserid) eller hemolyserte prøver som inneholder 165 mg/l hemoglobin. Interferenser relatert til for mye albumin er ikke blitt testet. Ikke fjern komplement fra sera. 4

10 PROSEDYRE Materiale som følger med Se REAGENS-delen. Materiale som er nødvendige, men som ikke medfølger 1. Sterilt destillert eller deionisert vann, til fortynning av konsentrert vaskeoppløsning. 2. Sterilt renset vann for rekonstituering av kontrollsera. 3. Absorberende papir. 4. Engangshansker. 5. Beskyttelsesbriller. 6. Natriumhypokloritt (blekemiddel) og natriumbikarbonat. 7. Pipetter eller multipipetter, regulerbare eller faste, for å måle og dispensere 50 µl, 100 µl, 300 µl og 1000 µl. 8. 1,5 ml polypropylen mikrosentrifugerør med lufttette stoppere, i stand til å tåle oppvarming til 120 C (varmeblokk) eller 100 C (kokende vannbad). a. Skrukorkrør: 1,5 ml kjegleformete rør, Bio-Rad Cat. # 224-0100 eller tilsvarende. b. Trykkorkrør: EZ Mikro Testrør, 1,5 ml, Bio-Rad Cat. # 223-9480 eller tilsvarende. 9. Mikro-rør m/hettelåser (VWR Cat. # 6054001 eller tilsvarende). Disse låsene forsegler trykkorkrørene ved å hindre at hettene åpner seg ved temperatur- og trykkendringer og gjør det også mulig å løfte rørene fra varmeblokken eller et kokende vannbad på en enkel måte. 10. Laboratoriebenksentrifuge for 1,5 ml polypropylenrør med kapasitet på 10.000g. 11. Rundt, floating mikrosentrifugestativ for et beger på 1 L. 12. Virvel-røreverk (Vortex). 13. Varmeblokk. Følgende modeller av varmeblokker anbefales. a. 1 block model: Grant Cat. # QBD1 (VWR Cat. # 460-0074) b. 2 block model: Grant Cat. # QBD2 (VWR Cat. # 460-0076) 14. Plate for varmeblokk: begge varmeblokkene må brukes med Grant block Cat. # QB-E1 (VWR Cat. # 460-8517) 15. Kokende vannbad på 100 C 16. Mikroplate-inkubator for 37 ± 1 C. 17. Halvautomatisk eller automatisk mikroplatevasker. 18. Mikroplateleser utstyrt med filtre for 450 nm og 620 nm. Prosedyrebemerkninger Negativ, positiv og cut-off kontroller må testes for hver kjøring for å validere testresultatene. Behandling av seraene Alle kontrollsera: negativ (R3), cut-off (R4) og positiv (R5) må bearbeides/behandles samtidig med testprøvene: 1. Pipetter 300 µl av hvert testserum og kontroll i særskilte 1,5 ml polypropylenrør. 2. Tilsett 100 µl av serumdyrkingsløsningen (R7) i hvert rør. 3. Bland grundig ved hjelp av kraftig miksing eller virvling for å få det skikkelig blandet. Lukk røret så stramt som mulig for å forhindre at det åpner seg under oppvarmingen, for trykkorkrør: bruk hettelås. Ikke lag hull i stopperen. 4. Mulighet for varmeblokk: Varm opp rørene i 6 minutter på en varmeblokk ved 120 C. Rørene må plasseres på platen bare når den foreskrevne temperaturen er oppnådd.(*) ELLER Mulighet for vannbad: Ved bruk av kokende vannbad: varm opp rørene i 3 minutter ved 100 C. (*) 5. Fjern forsiktig varme rør fra varmeblokken eller vannbadet med kokende vann og plasser i en sentrifuge. Sentrifuger rørene ved 10.000 x g i 10 minutter. 6. Den øverste væsken benyttes for detektering av galactomannan antigen. 7. Test de øverste væskelagene ved å benytte følgende prosedyre. Etter tillaging, kan det øvre væskelaget fjernes og lagres ved 2-8 C i opptil 48 timer før testing. Dersom analyse av resultatene gir en indikasjon på at det er nødvendig med ny testing, må en annen aliquot av serumet behandles for testing. (*) Streng overholdelse med den foreskrevne temperatur og den foreskrevne omløpstid og også bruk av de anbefalte materialene er viktig for å lykkes med testen. Ikke stol på temperaturen som vises på apparatet, vennligst kontroller at temperaturen er i henhold til spesifikasjonene ved å bruke et kalibrert termometer som skal plasseres i et rør som inneholder mineralolje: temperaturen må komme opp i 120 C inne i røret i en varmeblokk og 100 C i et kokende vannbad. 5

EIA-prosedyre Overholdes helt og holdent i henhold til foreslått protokoll, og i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. 1. La reagensene oppnå romtemperatur (18-25 C) minst 15 minutter før bruk. 2. Gjør klar arbeidsvaskeoppløsning, substrat-kromogen reaksjonsløsning og negative, positive og cutoff kontrollprøver. 3. Gjør klar et diagram for identifikasjon av testsera og kontroller i mikroplaten. Bruk en brønn for det negative kontrollserumet (R3), to brønner for cutoff-kontrollserumet (R4) og en brønn for det positive kontrollserumet (R5). 4. Fjern plateholder og mikrobrønnstrimlene (R1) fra platefutteralet. Legg tilbake eventuelle strimler som ikke kommer til å bli brukt i futteralet, sammen med porøsitetsmiddelet og forsegl futteralet igjen. 5. Bland innholdet i konjugatflasken (R6) ved å snu den opp ned før bruk. Tilsett 50 µl konjugat (R6) i hver brønn. Deretter tilsettes 50 µl av behandlet serum i den øverste væske i hver brønn, som angitt ovenfor. Ikke tilsett serumprøver i brønnene før konjugatet. 6. Dekk platen med plateforsegler eller annet middel for å hindre fordamping, og sørg for at hele overflaten er dekket og vanntett. 7. Inkuber mikroplaten i en tørr mikroplateinkubator i 90 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Fjern plateforseglingen. Sug innholdet fra alle brønnene i en avfallsbeholder (som inneholder natriumhypokloritt). Vask platen 5 ganger ved å benytte minimum 370 µl av arbeidsvaskeoppløsningen. Etter den siste vasken snus mikroplaten opp ned og deretter slås det forsiktig på det absorberende papiret for å fjerne gjenværende væske. 9. Tilsett raskt 200 µl av substrat-kromogenreaksjonsløsningen (R8 + R9) i hver brønn og unngå eksponering mot skarpt lys. 10. Inkuber mikroplaten i mørket ved romtemperatur (18 to 25 C) i 30 ± 5 minutter. Bruk ikke klistrefilm i løpet av dette inkubasjonstrinnet. 11. Tilsett 100 µl stopp-oppløsning (R10) i hver brønn, og anvend samme rekkefølge for tilsetning av substrat-kromogenreaskjonsoppløsningen. Bland godt. 12. Tørk grundig av bunnene på hver plate. 13. Les av optisk tetthet for hver brønn ved 450 nm (referansefilter på 620 nm). Mikroplater må avleses innen 30 minutter etter tilsetting av stopp-løsningen. 11 KVALITETSKONTROLL (VALIDITETSKRITERIER) Cutoff kontroll: O.D.-en for hver cut-off kontrollserum må være 0,300 og 0,800 Positiv kontroll: Indeksen for positiv kontrollserum må være større enn 2,00. OD positiv kontroll (R5) I = > 2,00 Gj.snitt cut-off kontroll OD Negativ kontroll: Indeksen for negativ kontrollserum må være mindre enn 0,40. OD negativ kontroll (R3) I = < 0,40 Gj.snitt cut-off kontroll OD Dersom noen av kontrollene mislykkes i å tilfredsstille validitetskriteriene beskrevet ovenfor, fører det til at analysen er ugyldig, og resultatene av pasientprøvene bør ikke rapporteres. Operatøren kan avgjøre om analysen skal gjentas etter å ha gjennomgått prosedyren, eller han kan kontakte produsenten for å få assistanse. Dersom en gjenanalyse foretas, bør en ny aliquot fra den samme prøve bli brukt i gjenanalysen. Eksempelutregning: Prøve Absorbans (OD) Negativ kontroll (R3) OD 0,117 Cut-off kontroll (R4) OD 0,596 0,576 Positiv kontroll (R5) OD 2,602 Utregninger Gjennomsnittlig Cut-off kontrollverdiområde For å regne ut gjennomsnittlig cut-off Kontroll (R4) OD, legg til OD-verdiene for hver cut-off kontroll-dublisering sammen og del resultatet på 2: (0,596 + 0.576) 2 = 0,586 6

Negative kontrollindeks For å regne ut indeksen for negativ kontroll, deles OD-en for negativ kontroll på gjennomsnittet av cut-off kontroll OD: 0,117 I = 0,586 = 0,20 Positiv kontrollindeks For å regne ut indeksen for den positive kontrollen, deles OD-en for positiv kontroll på gjennomsnittet av cut-off kontroll OD: 2,602 I = 0,586 = 4,44 Validitet I ovenstående eksempel: Hver cut-off kontrolls OD er 0,300 og 0,800, noe som indikerer at cut-off kontrollen er gyldig. Indeksen for den negative kontrollen er < 0,40, noe som indikerer at den negative kontrollen er gyldig. Indeksen for positiv kontroll er > 2,00, som indikerer at positiv kontroll er gyldig. Testkjøringen i dette eksempelet anses som gyldig fordi resultatene er i samsvar med validitetskriteriene for hver kontroll. 12 TOLKING AV RESULTATENE Tilstedeværelsen eller fraværet av galactomannan antigen i testprøven bestemmes ved å regne ut indeksen for hver pasientprøve. Indeksen (I) er OD-verdien for prøven delt på gjennomsnittlig optisk tetthet i brønnene som inneholder cut-off kontrollserum. Beregning av gjennomsnittlig optisk tetthet for cut-off kontroll: Legg til de optiske tetthetsverdiene i de to brønnene som inneholder cut-off kontrollserum (R4) og del summen på 2. Beregning av en indeks (I) for hvert testserum: Regn ut følgende ratio for hvert testserum: OD-prøve I = Gj.snitt cut-off kontroll OD Sera med en indeks < 0,50 ansees for å være negative for galactomannan antigen. Mrk: Et negativt resultat kan være en indikasjon på at pasientens resultat ligger lavere enn deteksjonsnivået for analysen. Mrk: Negative resultater utelukker ikke diagnosen invasiv aspergillose. Gjentatt testing anbefales dersom resultatet er negativt, men at der er mistanke om sykdom. Sera med en indeks 0,50 ansees å være positive for galactomannan antigen. For alle positive pasienter anbefales det at en ny alikvot av same prøve gjentas så vel som innsamling av en ny prove fra pasienten for oppfølgingstesting. Merk: en absorbsjonsverdi på mindre enn 0,000 kan tyde på feil i prosedyren eller instrumentene som skal vurderes. Det resultatet er ugyldig og prøven må tas på nytt. Regelmessig undersøkelse (to ganger i uken) av høyrisikopasienter anbefales for å øke sensitiviteten og tidlig positivitet i testen. Merk: Platelia Aspergillus EIA skal brukes som hjelp i diagnose på invasiv aspergillose. Positive resultater oppnådd med Platelia Aspergillus EIA skal vurderes sammen med andre diagnostiske prosedyrer slik som mikrobiologisk kultur, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografisk bevis. Eksempelutregning: Prøve Absorbans (OD) Negativ kontroll (R3) OD 0,117 Cut-off kontroll (R4) OD 0,596 0,576 Positiv kontroll (R5) OD 2,602 Pasientprøve #1 0,134 Pasientprøve #2 0,436 Pasientprøve #3 1,196 7

Utregninger/Beregninger Konsultér kvalitetskontrolldelen (validitetskriterier) for eksempel på utregning for bestemmelse av validiteten av kontrollprøvene. Gjennomsnittlig cut-off kontrollverdi For å regne ut gjennomsnittlig cut-off kontroll (R4) OD, legges OD-verdiene for hver cut-off kontroll-dublisering sammen og deretter deles resultat på 2: (0,596 + 0,576) 2 = 0,586 Pasientprøve #1 For å regne ut indeksen for pasientprøve #1, deles OD-en for pasientprøve #1 på gjennomsnittlig cut-off kontroll OD: 0,134 I = 0,586 = 0,23 I dette eksempelet, er pasientprøve #1 negativ, fordi indeksen av 0,23 er < 0,50. Pasientprøve #2 For å regne ut indeksen for pasientprøve #2, deles OD-en for pasientprøve #2 på gjennomsnittlig cut-off kontroll OD: 0,436 I = 0,586 = 0,74 I dette eksempelet, er patientprøve #2 positiv, fordi indeksen av 0,74 er 0,50. Pasientprøve #3 For å regne ut indeksen for pasientprøve #3, deles OD-en for pasientprøve #3 på gjennomsnittlig cut-off kontroll OD: 1,196 I = 0,586 = 2,04 I dette eksempelet, er pasientprøve #3 positiv, fordi indeksen av 2,04 er 0,51. 13 BEGRENSNINGER I PROSEDYREN 1. En negativ prøve kan ikke utelukke en diagnose for påvist invasiv aspergillose. Pasienter som kan være utsatt for invasiv aspergillose bør testes to ganger per uke. 2. Platelia Aspergillus EIA-prosedyren og fortolkningen av resultatene må følges når prøvesampling for tilstedeværelse av galactomannan antigen skjer. Bruker av settet rådes til å lese pakkeinnstikket nøye før testen utføres. Spesielt må testprosedyren følges nøyaktig når det gjelder prøve- og reagenspipettering, platevasking og timing av inkubasjonstegene. 3. Unnlates det å tilsette prøve eller reagens som forklart i prosedyren, kan dette resultere i en falsk negativ test. Gjentagelse av testingen med flere prøver bør vurderes der hvor det er klinisk mistanke om invasiv aspergillose eller en prosedyrefeil. 4. Forurensing av brønner med negativ pasientprøve av brønner med positive kontroll/pasientprøve er mulig dersom innholdet i en brønn renner over i en annen brønn på grunn av røff håndtering av mikroplaten eller dårlig pipetteringsteknikk når reagensene tilsettes. 5. Platelia Aspergillus EIAs yteevne er ikke evaluert med neonatale eller barnesykdomserumprøver. 6. Platelia Aspergillus EIA kan vise redusert detektering av galactomannan hos pasienter med kronisk 36, 37. granulomatøs sykdom (CGD) og Jobs syndrom 7. Ledsagende bruk av muggsoppaktiv antisoppterapi hos noen pasienter med invasiv aspergillose kan resultere i redusert følsomhet i forhold til Platelia Aspergillus EIA 20. 8. Platelia Aspergillus EIA er ikke blitt evaluert for bruk med plasma eller andre prøvetyper som urin, BAL eller CSF(cerebrospinalvæske). 9. Ytelsen hos Platelia Aspergillus EIA er ikke fastslått for manuell avlesning og/eller visuell resultatbedømming. 10. Andre typer sopp slik som Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum og Histoplasma har vist reaktivitet med rotte, EBA-2 monoklonale antistoffer brukt i undersøkelse for oppdagelse av Aspergillus galactomannan. Histoplasmose skal vurderes i endemiske områder inkludert deler av USA 23, 32, 38. 11. Positive reaksjoner uten kliniske tegn: Når en tar i betraktning en tidlig detektering av galactomannan antigen- detektering i serum selv før tilsynekomsten av kliniske og/eller radiologiske trekk, er vanligvis positive reaksjoner uten kliniske tegn blitt målt: de samsvarer med "ekte positive" prøver hos pasienter som får fastslått diagnose for påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose på et senere tidspunkt. 8

Men, i noen spesielle tilfeller, bør noen faktorer tas med i betraktning når tolkningen av testene skal foretas: a. Positive reaksjoner uten kliniske tegn er rapportert, spesielt hos yngre barn 26. Selv om noen av disse kasusene kan relateres til faktisk sirkulasjon av Aspergillus antigener 5, kan de fleste kasusene betraktes som falskt positive. b. Galaktofuranose er blitt påvist i forskjellige matvarer, spesielt i kornblandinger, kornproducter og kremdesserter 1,17. I motsetning til menneskemelk, inneholder menneskeliggjort melk (designermelk) høye konsentrasjoner av galaktomannan 10. Kostholdsfaktoren må derfor tas med i betrakningen når tolkning av forløpet i antigentilstedeværelse i blod hos yngre barn, og mer generelt i alle pasienter med en endret intestinal barriere. 4, 10. Ethvert tilfelle av positiv antigenemi som ikke er ledsaget av kliniske tegn bør fortolkes enda mer forsiktig i denne pasientpopulasjonen 17. c. Det er rapportert om positive galaktomannan testresultater hos pasienter som får piperacillin / tazobactam. Det er også kommet rapporter om at visse partier eller porsjoner av piperacillin / tazobactam har vært positive mht galaktomannan antigen. Derfor bør positive testresultater hos pasienter som gis piperacillin / tazobactam tolkes på en forsiktig måte og bli bekreftet ved hjelp av andre diagnostiske metoder. Detektering av galaktomannan er også blitt rapportert i noen porsjoner av amoxicillin i forbindelse med parenterale klavulansyre-tillaginger. Derfor bør halvsyntetiske β-laktame kurer/behandlinger tas med i betraktning ved fortolkningen av testen 1, 21. Men, siden Platelia Aspergillus EIA kan detektere galaktomannan antigen lenge før kliniske eller radiologiske tegn viser seg, kan forekomst av invasiv aspergillose ikke utelukkes. Derfor bør pasienter behandlet med piperacillin/tazobactam med positive testresultater følges nøye. d. Positive reaksjoner i fravær av kliniske tegn kan observeres i pasienter som mottar produkter som inneholder galaktomannan, enten parenteralt eller oralt (i nærvær av en endring i intestinal barriere). Nærvær av galaktomannan i disse produktene kan ofte forklares med bruk av en gjæringsprosess basert på soppmikroorganismer. Et positivt resultat vil ikke observeres i en pasient, hvis ikke serumkonsentrasjon av eksogent galaktomannan når eller overgår testenes registreringsterskel. Derfor, om det er et mistenkelig positivt resultat i fravær av andre tegn, anbefaler vi å undersøke produktene som pasienten tar og spesielt deres produksjonsprosesser og opprinnelsen til råmaterialene som er brukt. 11, 24, 31. 14 FORVENTEDE VERDIER Den forventede utbredelsen av invasiv aspergillose varierer i forhold til pasientbefolkningen; tallmateriale på 5-20 % er blitt rapportert 7, 13. En klinisk studie ble gjennomført på totalt 4873 serumprøver fra 239 episoder (203 pasienter) med malign hematologisk sykdom eller hematopoetisk stamcelle- transplantasjon diagnostisert med eller uten invasiv aspergillose ved to testsentre i Europa for å bestemme ytelseegenskaper for Platelia Aspergillus EIA. Ettersom en pasient kunne være med i studien mer enn 1 gang, ble analyse foretatt i overensstemmelse med hver behandlingsepisode. En episode regnes for å være en tidsbasert periode som omfatter en klinisk hendelse (for eksempel transplantasjon, transplantat mot vert-sykdom/gvhd etc.) Som et resultat av dette kan mer enn en episode ha blitt observert for en enkelt pasient. Den gjennomsnittlige utbredelsesrate for denne studien var 16 % (38/239). Fordelingen av indeksverdier for disse populasjonene er vist i diagrammene nedenfor. 9

Pasienter diagnostisert uten invasiv aspergillose (kontrollpopulasjon) Totalt 3691 serumprøver fra 201 episoder (168 pasienter) ved to testsentre i Europa ble testet med Platelia Aspergillus EIA-testen. Fordelingen av indeksverdier ser slik ut på nedenforstående diagram/kurve/fremstilling. Dette spredningsdiagrammet viser galaktomannan analyseresultater for de 3691 serumprøvene fra 201 episoder (168 kontrollpasienter) i denne studien (pasienter som mottar immundempende therapi for HSCT eller for å behandle for malign hematologisk sykdom). 10

Patienter med diagnosen invasiv aspergillose Dette spredningsdiagrammet viser galaktomannan analyseresultater for de 1182 serumprøvene fra 38 episoder (35 pasienter) i denne studien diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose som bestemt i EORTC/NIAID-definisjoner. Ikke alle serumprøvene fra hver pasient forventes å være positive. Den forventede prevalens av invasiv aspergillose varierer med pasientpopulasjonen; tall fra 5-20 % er blitt rapportert 7, 13. Prevalensraten for denne studien var 16 %. Følgende grafer representerer eksempler på en pasient uten kliniske tegn eller symptomer på invasiv aspergillose (negativ for Aspergillus) og en pasient med påvist invasiv aspergillose (positiv for Aspergillus) på tilsvarende måte/henholdsvis. Negativ pasient: Cut-off 0.5 11

Positiv pasient: 15 SPESIFIKKE YTELSESEGENSKAPER A Reproduserbarhetsstudier Inter-assay og Intra-assay variabilitet for Platelia Aspergillus EIA ble fastslått i en studie ved å bruke en gruppe på 6 sammenslåtte pasientserumprøver (en negativ, en lav positiv, to positive og to høyt positive) ervervet fra tre kliniske prøvesteder i Nord-Amerika. Hver av de 6 gruppemedlemmene ble testet tre ganger (x3) på 3 forskjellige dager, for ett parti, på to steder (totalt antall gjentagelser for hvert sted = 9). Hver av de 6 gruppemedlemmene ble testet to ganger (x2) på tre forskjellige dager, for 1 parti, et tredje sted (totalt antall gjentagelser på det tredje stedet = 6). En (1) operatør utførte all presisjonstesting på hvert sted. Dataene ble analysert i samsvar med standardene fra the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Den gjennomsnittlige optiske tettheten (OD) og gjennomsnittlige indeksverdien, standard avvik (SD), prosentkoeffisient for variasjon (% CV), innenfor kjøringspresisjon (intra-assay) og innenfor stedet- (inter-assay) presisjon for hvert gruppemedlem på hvert sted, er opplistet i tabellene vist nedenfor. B Kryssreaktivitet En studie for å evaluere effekten av potensielt hemmende medisinske tilstander ubeslektet med invasiv aspergillose ble utført med et parti av Platelia Aspergillus EIA-settet. Følgende serumprøver ble testet for kryssreaktivitet med Platelia Aspergillus EIA. Totalt 151 sera ble testet. Patologi # prøver testet # positive Revmatoid faktor 10 0 ANA-positiv 10 0 IgG Hypergammaglobulinemi 10 0 IgM Hypergammaglobulinemi 10 0 Kreft * 11 0 Ikke-viral cirrhose (primær biliær); Alkoholbevirket; pillebevirket) 10 0 Multiple transfusjoner 10 0 Høyparitetsmødre 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Røde hunder 10 0 CMV 10 0 Syfilis (RPR+) 10 0 Toksoplasmose 10 0 Mykoplasma 10 0 * En av hver fra blære, bryst(2), kolon, endometriell, lunge, prostata, nyre og overflateceller(3). 12

C Klinisk testing Klinisk testing for å evaluere sensitiviteten, spesifisiteten og den prediktive verdi for Platelia Aspergillus EIA ble utført på to lokaliteter i Belgia og Nederland. Studien ble gjennomført restrospekt ved hjelp av totalt 4873 serumprøver innsamlet fra 203 pasienter fra følgene populasjoner*: pasienter uten tegn til invasiv aspergillose (kontrollpasienter) pasienter med sannsynlig invasiv aspergillose pasienter med påvist invasiv aspergillose * Gruppen The Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) i the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) og the Mycosis Study Group (MSG) of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) har definert kriterier for diagnose av invasiv aspergillose (IA) hos pasienter med malign hematologisk sykdom eller hematopoetisk stamcelletransplantasjon 2. Påvist invasiv aspergillose bestemmes ved hjelp av positiv mikrobiologisk kultur oppnådd ved steril prosedyre fra det affiserte sted, og histopatologisk påvisning av de riktige morfologiske formene i en vert med symptomer tilskrevet soppinfeksjonen. Sannsynlig invasiv aspergillose bestemmes ved ett mikrobiologiskl kriterium, samt ett større eller to mindre kliniske kriterier fra et sted i overensstemmelse med infeksjon, i en vert med symptomer tilskrevet soppinfeksjonen. Mulig invasiv aspergillose bestemmes ved hjelp av minst ett mikrobiologisk kriterium eller ett eller to mindre kliniske kriterier fra et sted i overensstemmelse med infeksjon, i en vert med symptomer tilskrevet soppinfeksjonen. Tatt i betraktning den relative sjeldne forekomsten av sannsynlig og påvist invasiv aspergillose, tilbyr vi følgende definisjon på klinisk sensitivitet og spesifisitet med hensyn til formålet med denne studien. SENSITIVITET Resultater fra denne studien er blitt analysert med hensyn til pasientsensitivitet. Sensitivitetstesting ble utført ved bruk av Platelia Aspergillus EIA på to steder for en kombinert total på 38 episoder fra 35 benmargtransplantasjon- (BMT) og leukemipasienter diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose. 1. Påvist aspergillose (som definert av IFICG / EORTC ; se ovenfor) Kombinerte steder N = 19 episoder fra 16 pasienter Sensitivitet: 100 % (19/19). Mrk: Konfidensintervallet på 95 % kunne ikke beregnes på grunn av utilstrekkelig prøvestørrelse. 2. Sannsynlig aspergillose (i henhold til definisjon gitt av IFICG / EORTC; se ovenfor) Kombinerte steder N = 19 episoder fra 19 pasienter Sensitivitet: 94,7 % (18/19). Mrk: Konfidensintervallet på 95 % kunne ikke beregnes på grunn av utilstrekkelig prøvestørrelse. 3. Kobinert Påvist og sannsynlig aspergillose (i henhold til definisjon gitt av IFICG / EORTC; se ovenfor) Kombinerte steder N = 38 episoder fra 35 pasienter Sensitivitet: 97,4 % (37/38). 95 %-konfidensintervallet er 86,2 99,9 %. SPESIFISITET Spesifisitetstesting ble utført ved å benytte Platelia Aspergillus EIA på to steder for en kombinert total på 3691 prøver ervervet fra 201 episoder (168 pasienter) uten tegn til invasive aspergillose (kontrollpasienter). Sted 1: N = 3060 prøver, fra 103 episoder (70 pasienter) Spesifisitet: 92,2 % (95/103) 95 %-konfidensintervallet er 85,3 96,6 %. Sted 2: N = 631 prøver fra 98 episoder (98 pasienter) Spesifisitet: 88,8 % (87/98) Med 95 % konfidensintervall på 80,8 94,3 %. Kobinerte steder N = 3691 prøver fra 201 episoder (168 pasienter) Spesifisitet: 90,5 % (182/201) 95 %-konfidensintervallet er 85,6 94,2 %. 13

PREDIKTIV VERDI Positive og negative prediktive verdier (PPV, NPV) er blitt analysert for pasientpopulasjonen i denne studien, basert på faktisk gjennomsnittlig forekomst på 16 % avlest i denne studien. PPV: 66,1 % (37/56) NPV: 99,4 % (182/183) Analyse ble også foretatt med henblikk på positive resulter når 2 påfølgende prøver hadde en indeks over eller lik 05. Ytelse er oppsummert i tabellen nedenfor: Sensitivitet* Spesifisitet PPV NPV Kombinerte steder når 1 prøve 0,5 Kombinerte steder når 2 påfølgende prøver 0.5 97,4 % (37/38) 92,1 % (35/38) 90,5 % (182/201) 97,5 % (196/201) *: sensitivitet ble beregnet på påvist og sannsynlig invasiv aspergillose 66,1 % (37/56) 87,5 % (35/40) 99,4 % (182/183) 98,5 % (196/199) 16 VALITETSKONTROLL HOS PRODUSENT Alle produserte reagenser er laget i overensstemmelse med vårt kvalitetskontrollsystem som starter ved mottakelse av råvarene og fram til det ferdigstilte, kommersielle produktet. Hvert parti er underlagt kvalitetskontroll og frigis til markedet kun dersom det er i samsvar med de fastsatte kvalitetskriterier. Dokumentasjon relatert til produksjon og kontroll av hvert enkelt parti oppbevares hos Bio-Rad. 17 BIBLIOGRAFI 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p. 353-7. 2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p. 7-14. 3. Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian. 2006. Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p. 389-94 4. Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002. Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65. 5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 2001. Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214. 6. de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews. 1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p. 239-252. 7. Denning, D. W. 1998. Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p. 781-803. 8. Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis. 2000. Invasive aspergillosis. Medical Mycology 38: p. 215-224. 9. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 2002. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p. 3-10. 14

10. Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer. 2002. Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p. 1251. 11. Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 2007. Plasmalyte as a Cause of falsepositive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p. 676-677. 12. Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi. 2002. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p.1898-1906. 13. Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 2002. Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p. 408-415. 14. Latge, J. P. 1995. Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p. 245-281. 15. Latge, J. P. 1999 Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], 310-50. 16. Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet. 1994. Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p. 5424-5433. 17. Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi. 1998. Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus : antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p. 112-113. 18. Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts. 1999. Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p. 3223-3228. 19. Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts. 2001. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p. 1604-1610. 20. Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring. 2005. Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p. 1762-9 21. Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini. 2004. False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p. 5362-5363. 22. Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij. 2005 Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p. 3925-3931. 23. Nareddy, S., P. H. Chandrasekar. 2008. False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p. 80-81. 24. Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer. 2007. Intravenous PLASMA-LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p. 3141-3142 25. Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe. 1999. Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p. 25-8. 26. Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude. 1998. False positive results in premature infants with the Platelia Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41 : p. 373-7. 27. Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge. 1995. A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p. 497500. 15

28. Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge. 1992. Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p. 2237-2245. 29. Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin. 2001. Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p. 311-318. 30. Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin. 1996. Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p. 139-145. 31. Surmont,I., W. Stockman. 2007. Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of falsepositive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p. 1373. 32. Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij. 1997. Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p. 257-260. 33. Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis. 1997. Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p. 86-89. 34. Verweij, P. E. and J. F. Meis. 2000. Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl.Infect.Dis. 2: p. 80-87. 35. Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis. 1995. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p. 1912-1914. 36. Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis. 2000. Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p. 3900-3901. 37. Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland. 2002. Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr. 345. 38. Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage. 2007. Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p. 638-40. 39. Yeo, S. F. and B. Wong. 2002. Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p. 465484. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 881045 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 03/2009 16