NTVA Julemøte 9. desember 2011 Hvordan klarer organismer å vedlikeholde arvematerialet? Hans E. Krokan Institutt for kreftforskning og molekylær medisin Det medisinske fakultet, NTNU DNA, vårt arvemateriale, er kjemisk ustabilt, men genetisk stabilt fordi det kontinuerlig repareres Uten DNA reparasjon ville vi dø i løpet av få dager
Våre hovedområder Base-eksisjons reparasjon - skadet base fjernes som første trinn i en flertrinnsprosess ( utskiftingsreparasjon ) Bruker skadefri tråd som templat Direkte-reparasjon Adaptiv immunitet og kreft i B- celler Predisposisjon for lungekreft Legemiddel targets - skadet base blir reparert av ett protein (visse alkyleringsskader) - større samarbeidsprosjekt ved IKM - genvarianter (SNPs) som øker risiko (opp mot dobling) - DNA reparasjonsproteiner som target (APIM Therapeutics AS)
Forskjellige former for arv Kjønnsceller Eggcelle og sædcelle fusjonerer (zygote) (i ovarium og testikkel) Gir opphav til nytt individ. Mutasjon i kjønnscelle kan føre til arvelig sykdom Kroppsceller Kroppsceller i et individ deler seg og gir to nye (alle andre celler) celler som oftest er lik cellen som delte seg. Mutasjon som oppstår i kroppsceller kan gi sykdom hos individet, men overføres ikke til nytt individ Epigenetikk (ofte vevsspesifikk) Reversibel endring i DNA eller proteiner bundet til DNA som kan gi endring i gen-funksjonen. Kan overføres til ny celle, men ikke til nytt individ
Gener og kreft gener alltid endret, men ofte bare i kroppsceller Arvelig kreft Arvelig risiko Ca. 15% av all kreft; 50-100% får kreft Arvelig brystkreft (DNA rep., BRCA2, BRCA1) Arvelig tykktarmskreft (DNA rep., MSH2, MLH1) Xeroderma pigmentosum (DNA rep., XPA) XP og mange andre sjeldne sykdommer Ca. 50-80% av all kreft Lavere risiko; (1.2 til 2x økt risiko) Forbundet med ulike SNPer Lunge, prostata, tykktarm, andre Miljø og tilfeldige mutasjoner bidrar også mye Miljøbetinget kreft Storrøykere,stråling, annen sterk eksponering Miljø og tilfeldige mutasjoner
EVOLUSJON OG GENETIKK Charles Darwin (1809-1882) Evolusjon Gregor Mendel (1822-1884) Genetikk
Jean-Baptiste Lamarck hadde også litt rett - naturen tar i bruk alle mulige midler Jean-Baptiste Lamarck s idéer om evolusjon ved direkte arvelig adaptasjon til miljøet ble forkastet til fordel for Darwinismen Han har til dels blitt latterliggjort i ettertiden Men ny forskning har vist at hans tanker var korrekte når det gjelder mikroorganismers forsvar mot inntrengende fiender (Det adaptive CRISPR systemet) I Frankrike regnes fortsatt Lamarck som evolusjonsvitenskapens far La Posterite vous admirera, elle vous vengera, mon père (Etterslekten vil beundre deg, den vil hevne deg, min far) Jardin des Plantes, Paris
De lange linjene mot en DNA verden Aristoteles - Den første professor i biologi (384-322 f.kr) hadde idéer om evolusjon Mendel/Darwin (1865/1859) Watson og Crick (1953) - Genetikk og evolusjon - DNA spiralen Kelner (1953), Rupert, Hanawalt, Setlow, Howard-Flanders (1963-64) - DNA reparasjon Nierenberg og Khorana (1960-65) - Den genetiske koden (base-tripletter) P. Berg - Genteknologi og rekombinant DNA (1972) Sanger og Gilbert (1977) HGP/CELERA (2001) - DNA sekvensering - Det humane genom Høyhastighets-sekvensering - Sykdomsgenom i individer (2005-2011)
DNA dobbeltspiralen nå 58 år James Watson (1928) Francis Crick (1916-2004) 1962: Nobelprisen i medisin og fysiologi til Watson, Crick, samt Maurice Wilkins Rosalind Franklin (1920-1958) bidro med viktige resultater
A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid J. D. Watson and F.H.C. Crick Nature 2 April 1953, vol. 171, page 737 We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.. It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.
Genetic Implications of the Structure of Deoxyribonucleic acid J.D. Watson and F.H.C. Crick Nature 30 May, 1953, vol. 171, page 964 Our model suggests possible explanations for a number of other phenomena. For example, spontaneous mutations may be due to a base occasionally occurring in one of its less likely tautomeric forms At the 21 year jubilee for the DNA double helix in 1974 F. Crick said: We totally missed the possible role of enzymes in repair, although due to Claude Rupert s early very elegant work on photoreactivation, I later came to realize that DNA is so precious that probably many distinct repair mechanisms would exist. Nowadays one could hardly discuss mutation without considering repair at the same time
Fra en beskjeden start til grenseløs interesse Vitenskaplige artikler om DNA (PubMed) 1953: 59 1954: 78 2003: 94921 2010: 112 823 (pr. 17/11) 1953-2010: 1101253
DNA REPARASJON ER ESSENSIELL FOR OVEREVELSE Uten normal DNA reparasjon: Mutasjoner kreft, tidlig aldring, utviklingsdefekter, arvelig sykdom Genotoksisk skade - Celle skade eller celledød, utviklingsskader Uten noen DNA reparasjon: Vitale funksjoner stopper Død vil inntreffe i løpet av få dager Nøyaktige DNA reparasjonssystemer reparerer 99.99% av all DNA skade Resten på 0.01% er nødvendig for evolusjon og genetisk diversitet, men gir også sykdom
HVOR STORT ER PROBLEMET SPONTANE SKADER I DNA? I II I. Tap av base: Depurinering AP-sete (10 000/celle/dag) Depyrimidinering AP-sete (500/celle/dag) II. Deaminering: Adenin Hypoxantin (10/celle/dag) Cytosin Uracil (500/celle/dag) III. Oksidativ skade: Guanin 8-oxoGuanin (500/celle/dag?) Thymine Thymineglycol (500/cell/dag?) IV. Alkylerings skade: Guanin O 6 -methylguanine (spont./indusert) Adenine 3-methylAdenine ( spont./indusert) Konsekvenser: 1. Replikasjonsfeil (mutasjoner) 2. Blokkert replikasjon (cytotoksisk) 3. Blokkert transkripsjon (cytotoksisk)
Ultraviolet lys skader DNA Uten reparasjon fører det til kreft; Xeroderma pigmentosum som eksempel DNA skade av UV-lys XP pasient- ubeskyttet Fra Nature Education XP pasient- beskyttet mot UV-lys
BASESKADE (HER DEAMINERING AV C TIL U) KAN FØRE TIL KOPIERINGSFEIL I DNA-SYNTESEN (MUTASJON) OG FEIL I mrna OG PROTEIN T C G A U T C A C A G C T G A G T G Transkripsjon mrna (feil budskap) Feil translasjon Protein (protein-feil eller intet protein)
Arvematerialet holdes intakt ved: DNA replikasjon Nøyaktig duplisering av DNA i S-fase før cellen deler seg Kompleks, men en prosess Nøyaktig, ca. 1 feil pr. 10.000.000.000 (etter proof reading og mismatch repair ) DNA reparasjon Alle faser av cellesyklus 6 ulike mekanismer, kompleks Ca. 250 av cellens 25.000 gener koder for DNA reparasjonsproteiner Nøyaktig rep: ca. 1 feil pr. 10.000 Unøyaktig rep: ca. 1 feil pr. 100 Cellesyklus DNA reparasjon
Dette bildet kan ikke vises for øyeblikket. Reparasjon av skadet DNA før replikasjon gir normalt DNA Stråling, kjemikalier Normalt DNA DNA spontan skade DNA skade Unøyaktig reparasjon Mutasjoner Evolusjonon Aldring Kreft Adaptiv immunitet (normal prosess som krever mutasjoner) Replikasjon av skadet DNA før reparasjon gir mutasjoner og kreft Men B-celler i immunsystemet gjennomgår en superrask evolusjon i prosessen med å lage spesifikke antistoffer med nye effektor-funksjoner DNA reparasjonsenzymer bidrar da til å lage mutasjoner
Det humane genom vårt arvemateriale 3 milliarder basepar i en kjønnscelle 23.000 proteinkodende gener 220 gener for DNA reparasjonsproteiner (3 av disse først identifisert i Trondheim) ca. 700 RNA gener (ulike typer) I tillegg har vi ca. 100 millioner immunoglobulin gener (som koder for antistoffer evolusjon i hvert individ!!!) DNA reparasjonsproteinet uracil-dna glycosylase har blitt «vårt enzym»
Uracil i DNA og uracil-dna glykosylase Uracil i DNA: dannes spontant fra cytosin ved deaminering (mutasjoner) inkorporeres i DNA under replikasjon dannes enzymatisk i B-celler ved adaptiv immunitet C U UNG kutter ut uracil fra DNA og initierer BER i alle celler Bidrar til somatisk hypermutasjon og klassskift rekombinasjon i immunsystemet Alle levende organismer har reparasjons-enzymer som fjerner uracil fra DNA (de fleste tilhører UNG familien)
En DNA glycosylase finner DNA skade og starter reparasjon En av ~10 ulike DNA glycosylaser starter base-eksisjonsreparasjonen Den flipper basen ut av dobbeltspiralen og ned i en katalytisk lomme Der blir deoksyribose-base bindingen klyøvd ved hydrolyse Flipping ble først beskrevet av oss for uracil-dna glycosylase, men er senere vist å være en helt generell mekanisme i DNA reparasjon Oversikts -struktur Katalytisk lomme Slupphaug et al., Nature, 1996 Mol et al., Cell, 1995
Flipp basen og fjern den!
GENET UNG KODER FOR TO PROTEINER Mitokondriell UNG1 og kjerne UNG2 1A 1B 2 3 4 5 6 0 5 10 15 kb MGVFCLGPWGLGRKLRTPGKGPLQLLSRLCGDHLQ AIPAKKAPA MIGQKTLYSFFSPSPARKRHAPSPEPAVQGTGVAGVPEESGDAA AIPAKKAPA.. PCNA RPA RPA sortering til kjerne (UNG2) sortering til mitokondrier (UNG1) Ved: bruk av to promotorer og alternativ spleising av mrna UNG2 UNG1 H. Nilsen et al., 1997, Nucl Acids Res
Fra enzymaktivitet til sykdom - Uracil-DNA glycosylase 1978 1989 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2002 2003 UNG akt i HeLa celler Kartlagt Ung genet på krom 12 UNG/U-DNA kompleks, flipping UNG2 er cellesyklus regulert Ung -/- mus akkumulerer uracil i genomet Human UNG defekt fører til HIGM syndrom Renset UNG fra human placenta Klonet cdna for UNG1 Karakterisering av rekombinant hung (CD) UNGmut* med endret substrat Klonet cdna for UNG2 UNG2 kjerne signal, UNG1 mit signal UNGmut* i studier av DNA skade UNG2 er lokalisert til replikasjons foci 3D strukturen for første humane DNA rep protein. Mutagenese UNG1 og UNG2 genereres fra samme gen ved alternativ splicing Ung -/- mus har immunologisk defekt og økt forekomst av B- celle lymfom
INTERAKTOMET Professorer og postdoktorer i DNA reparasjonsgruppen(e) Bodil Kavli Lars Hagen Cathrine B. Vågbø Per Arne Aas Karin Gilljam Hans Krokan Geir Slupphaug Marit Otterlei Henrik AS. Pettersen Frank Skorpen
God jul! MONOTON AKTIVITET KAN VÆRE DØDELIG