I løpet av cellens. fordobles. Dette skjer i S- (syntese-)fasen i cellesyklus. Selve prosessen kalles. DNA-replikasjon

Transkript

1 Geir Slupphaug Inst. For Kreftforskning og Molekylærbiologi Det Medisinske Fakultet DNA-replikasjon I løpet av cellens livssyklus, må DNAinnholdet i cellekjernen fordobles G0 G1 2n Dette skjer i S- (syntese-)fasen i cellesyklus. Selve prosessen kalles DNA-replikasjon 2n 2n M G2 S 4n Tallet foran n angir hvor mange kopier av hvert kromosom (unntatt xog y) som er tilstede i cellekjernen 4n

2 Ulike former for DNA-replikasjon Replikasjon av DNA i cellekjernen Skjer 1 gang pr cellegenerasjon, i S-fasen Replikasjon av mitokondrielt DNA I tillegg til kromosomene i cellekjernen, inneholder også cellenes mitokondrier DNA. Dette må også replikeres før mitokondriene deles, men denne replikasjonen er ikke synkronisert med celledelingen. Replikasjon ved DNA-reparasjon Ved skade i arvematerialet, vil cellulære enzymer kunne fjerne det skadde DNA-segmentet. Den manglende delen må deretter fylles inn ved DNA-replikasjon

3 DNA er selv templat for replikasjon I 1940-årene ble det kjent at DNA var det genetiske materialet i cellene. Det var imidlertid ikke før på slutten av 1950-tallet, etter at Watson og Crick utledet DNAstrukturen (1953), at en fant at DNA også kunne tjene som en templat (utgangspunkt) for replikasjon og overføring av genetisk informasjon

4 DNA-replikasjon er semikonservativ Meselsohn og Stahl (1958) dyrket celler i flere generasjoner i nærvær av 15 N inntil alt nitrogen i DNAet var 15 N. Cellene ble deretter overført til medium med normalt 14 N, og tettheten av DNAet i de påfølgende to generasjoner ble målt ved sentrifugering. Generasjon 0 Tungt DNA ( 15 N) Generasjon 1 Hybrid DNA ( 15 N/ 14 N) Generasjon 2 Lett DNA ( 14 N) g Originalmolekyl Førstegenerasjons dattermolekyler Slik ble det påvist at DNAet replikerte semikonservativt Hybrid DNA Andregenerasjons dattermolekyler

5 Kromosomal DNA replikasjon skjer i to retninger Etter at det ble slått fast at DNA replikeres semikonservativt, ble en rekke forsøk satt i gang for å finne ut hvordan dette foregikk. De fleste av disse ble gjort i bakterier og virus, og prosessen er fremdeles mye bedre kartlagt i disse enn i høyere organismer. Replikasjonsgafler Ved elektronmikroskopi kunne en vise at replikasjon av bakteriekromosomet skjedde ved at dobbelttråden åpnet seg til en boble, og at denne vokste i begge retninger under replikasjonen (bidireksjonell replikasjon) Endepunktene i denne boblen kalles replikasjonsgafler

6 DNA replikasjon starter i bestemte punkt DNA som varmes opp vil etterhvert denaturere til enkelttråder. Dette skjer først i A:T-rike DNAsekvenser. Ved å varme opp det sirkulære kromosomet fra bakteriofagen λ ( basepar), kunne en selektivt smelte disse områdene, og derved skaffe seg et kart over viruskromosomet. Ved å behandle λ-dna som inneholdt en replikasjons boble på denne måten, viste det seg at replikasjonen alltid startet i ett og samme punkt, som kalles et replikasjonsorigo. Hos mennesker finnes mange slike replikasjonsorigi på hvert kromosom, og de er lokalisert med bp mellomrom. Som hos bakterier og virus foregår replikasjonen bidireksjonelt. Smelte bobler Ny replikasjons boble

7 Initiering av replikasjonen Replikasjonsinitiering er best kartlagt i bakterier (E. coli). Eukaryote celler har også distinkte replikasjonsorigi, som sannsynligvis gjenkjennes ved lokal nukleotidesekvens (f. eks. DUE=DNA unwinding element), og tredimensjonal struktur (bøyd DNA, cruciform DNA), og grad av DNA-metylering.

8 DNA-syntesen skjer i 5-3 retning De to trådene i DNA-heliksen går i motsatt retning av hverandre (de er antiparallelle). Den enden av DNAtråden som mangler en nukleotide i 5 -pososjon på sukkerringen, kalles 5 -enden, og tilvarende kalle den enden som mangler en nukleotide i 3 -posisjon, 3 -enden. 5 3 Den DNA-tråden som tjener som templat, leses alltid i 3-5 -retning, og dattertråden syntetiseres i retning

9 Nytt DNA dannes av DNA polymeraser På 1950-tallet begynte en også å lete etter enzymer som kunne syntetisere DNA. Det første av disse ble renset fra Eschericia coli, og ble kalt DNA polymerase I. Dette er fremdeles den best karakteriserte DNA polymerasen, og det har vist seg at virkningsmekanismen til dette enzymet har mange likhetstrekk med alle kjente DNA polymeraser. Enzymet katalyserer et nukleofilt angrep av oksygen på 3 -OH enden av en voksende DNA tråd mot 5 α-p i en innkommende nukleotid O O P O O O P O O O P O 5 P P P 3 HO O HO DNA polymerase I A T G C T A C G A C G OH 3 P P P P P P P 5

10 Hvordan blir riktig nukleotid satt inn? Spesifikk baseparing Tymin Adenin Cytosin Guanin Induced fit Polymerasen registrerer templat-basen, og modifiserer strukturen i det aktive setet slik at det er optimalt for binding av den korrekte basen

11 Mange polymeraser har rettefunksjon Enkelte ganger vil feil base bli satt inn i den voksende tråden. Flere av polymerasene har derfor utviklet en egen rettefunksjon - en eksonuklease-aktivitet. Når en feil base settes in, vil den nydannede dupleksen smelte ved enden, DNA-polymerasen stopper opp, og den nydannede 3 -enden overføres til et sekundært aktivt sete på enzymoverflaten. I dette eksonuklease-setet fjernes den feilinkorporerte basen, og 3 -enden føres tilbake til polymerasesetet. Binding av ssdna templat Polymerasesete Eksonuklease-sete

12 Ulike DNA polymeraser har ulik funksjon Mammalske polymeraser Poymerase Lokalisering Hovedfunksjon α (alfa) β (beta) δ (delta) ε (epsilon) γ (gamma) Cellekjernen Cellekjernen Cellekjernen Cellekjernen Mitokondriene Initiering av Okazakifragment DNA-reparasjon Kromosomal replikasjon Gjenfylling mellom Okazakifragment Replikasjon av mitokondriekromosomet

13 DNA-replikasjonen er semikontinuerlig Siden templattrådene har motsatt orientering, oppstår det tilsynelatende et problem når begge trådene ved en replikasjonsgaffel skal forlenges i samme retning etterhvert som replikasjons- boblen vokser. Dette er imidlertid løst ved at replikasjonen langs den ene tråden skjer diskontinuerlig i mindre fragmenter. Disse kalles Okazaki-fragmenter, og limes (ligeres) etterhvert sammen til en kontinuerlig tråd. Templattråd 3-5 -retning Leading strand Okazaki fragment nucleotides in bacteria, in eukaryotes Lagging strand Helicase Templattråd 5-3 -retning

14 Hvordan endre grad av supercoil - Topoisomeraser Topo I kutter den ene DNA- tråden, fører den ene enden rundt helixen, og religerer endene. Dette enzymet krever ikke ATP, kan fjerne negative supercoiler i E. coli, og både negative og positive supercoiler i eukaryote celler Topo II kutter den ene DNA- tråden, fører den ene enden rundt helixen, og religerer endene. Dette enzymet kan fjerne negative supercoiler i E. coli, og både negative og positive supercoiler i eukaryote celler

15 DNA-replikasjon i eukaryote celler Mange sider ved eukaryot DNA-replikasjon er fundamentalt forskjellig fra E. coli Kromosomal replikasjon skjer inne i en cellekjerne Kromosomene i cellekjernen er lineære DNA-molekyler Eukaryote kromosomer er komplekse nukleoproteinstrukturer Replikasjonen må skje svært koordinert, da det er mange replikasjonsorigi i hver celle In vitro studier av DNA fra SV40-virus har vært et uvurderlig verktøy for å studere eukaryot DNA-replikasjon, da SV40 DNA har mange likhetstrekk med mammalsk DNA. Ved å sette ulike celleekstrakt og rensede proteiner til slikt DNA, har man kunnet studere effekten på replikasjonsprosessen.

16 Replikasjon av begge trådene er koordinert Studier av replikasjon i E. coli har vist at syntesen av begge trådene er koordinert Dette er sannsynligvis nødvendig for å hindre fortsettelse av replikasjon på en tråd hvis replikasjon på den andre stanser opp f. eks ved en DNA-skade I motsatt fall ville en fått utspoling av lange strekk ss-dna, og cellen ville raskt gått tom for enktlttrådbindende proteiner (SSB el RPA) til å beskytte dette DNAet.

17 Hva skjer ved enden av lineære kromosomer? Når replikasjonsgaffelen i eukaryote celler når enden av et kromosom (telomerregionen), vil ikke den ytterste 3 -enden kunne kopieres, da DNA-polymerasen ikke har en primer her. Dette gjør at kromosomene blir kortere og kortere for hver celledeling. Dette fenomenet har blitt satt i forbindelse med aldringsprosessen

18 I embryonale celler og mannlige kjønnsceller finnes et enzym - telomerase- som bidrar til å opprettholde korrekt lengde på kromosomene

19 Mekanismer som sikrer korrekt replikasjon Cellene har ulike mekanismer som tilsammen gjør at den akkumulerte feilfrekvensen (AEF) er 1 feil pr baser Balanserte nivå av de ulike byggestenene (dntp) Komplementær baseparing til templaten AEF = pr bp Induced fit mellom DNA-polymerasen innkommende nukleotid AEF = pr bp Proofreading ved 5-3 -exonukleaseaktivitet AEF = pr bp Mismatch reparasjon (skjer etter replikasjonen) AEF = pr bp

20 DNA skader og reparasjon Til tross for at alle organismer er avhengig av å bevare genomet intakt for å kunne leve og formere seg, er ikke DNA et kjemisk stabilt molekyl. Det kan skades spontant under normale fysiologiske betingelser og av en rekke faktorer i miljøet. I tillegg kan feil introduseres under replikasjon. For å motvirke disse skadene er levende organismer utstyrt med ulike mekanismer for å reparere skadene etter hvert som de oppstår, og før de kan manifistere seg som mutasjoner.

21 Ulike typer DNA-skader Ekstra basepar satt inn eller fjernet Enkelttrådbrudd Interkalerende agens Dobbelttrådbrudd Tap av base Pyrimidin-dimer Kryssbinding Base-skade eller feil base

22 Tap av baser Spontane-DNA skader Bindingen mellom deoksyribosen og nitrogenbasen (spesielt puriner, A og G), er den mest labile i DNA-molekylet, og fører til spontane basetap (<10 4 /celle/døgn). Når dette skjer, oppstår et apurint/apyrimidint (AP-) sete, som er mutagent, i og med at DNA-poymerasen ikke vet hvilken base som skal settes inn ovenfor et slikt sete når DNAet replikeres. Deaminering av baser A, C og G har aminogrupper som kan tapes spontant, og derved endre basenes baseparingsegenskaper. Den vanligste av disse er når cytosin deaminerer og danner uracil ( /celle/døgn). Uracil vil basepare mot adenin i stedet for guanin, og er derfor mutagen NH 2 O Cytosin O N H Deaminering H C 2 1 N H O N 1 N 4 3 U H H Uracil R R

23 Ioniserende stråling DNA skader fra fysiske agens Naturlig bakgrunnsstråling har sannsyneligvis vært en forutsetning for evolusjonen. I dag er imidlertid menneskeskapte strålingskilder av mye større betydning UV-stråling UV-stråling fra sollys og solarier er en viktig kilde til DNA-skader i hudceller, spesielt hos mennesker med lavt pigmentinnhold i huden Temperatur Kan være en signifikant kilde til DNA-skader i organismer som lever under høye temperaturer. Vi vet imidlertid lite om hvordan slike organismer beskytter sitt arvematerialet

24 Ioniserende stråling To typer: Elektromagnetisk (γ- og X-) and partikkelstråling (α-and β-). Begge kan virke ioniserende, siden strålingsenergien kan avgis direkte til kjemiske bindinger og produsere eksiterte og ioniserte molekyler Det elektromagnetiske spekter (bølgelengde i cm): Ioniserende stråling Radiobølger, AM TV, FM Mikrobølger Infrarød Synlig lys UV Røntgen γ-stråling Økende energi Mutagent område

25 Direkte og indirekte effekter Ioniserende stråling kan enten avgi energien direkte til DNA (α, β, γ- X-), eller til andre organiske eller uorganiske molekyler i cellen (γ- and X-). Det har blitt beregnet at ~ 35 % av DNA skadene fra ioniserende stråling stammer fra direkte effekter, og størstedelen av de resterende skadene fra indirekte angrep av reaktive oksygen-species (ROS) dannet ved ionisering av vannmolekyler

26 Dannelse av reaktive oksygen-species H 2 O H 2 O + + e - H 2 O + + H 2 O OH + H 3 O + OH + OH H 2 O 2 e aq + O 2 O - 2 Hydroksylradikal Hydrogenperoksyd Superoksydradikal 2 O H + O 2 + H 2 O 2 OH er sannsyneligvis den ROS som hyppigst induserer DNA skader, men H 2 O 2 er også signifikant, da den diffunderer lett i cellene og lett kan indusere dannelse av OH i nærvær av metallioner som Fe 2+ som ofte finnes bundet til DNA

27 Angrep på baser Hydroksylradikal angriper oftest den umettede C5- C6 bindingen, men direkte stråling fjerner et elektron fra C5 eller C6 position. Direkte og indirekte effekter fører derfor til identiske reaksjonsintermediater, som igjen kan reagere med O 2 og danne en rekke modifiserte baser

28 UV-stråling UV-stråling er ikke ioniserende, men kan eksitere elektroner og forårsake DNA-skader. UV-stråling kan inndeles i tre undergrupper : Bølgelengde (nm) Røntgen UVC UVB UVA synlig Ozonabsorbsjon Luftabsorbsjon Penetrerer normalt glass Direkte effekter Indirekte effekter

29 Direkte UV-skader DNA har et absorbsjonsmaksimum på 260 nm, hvor 5,6-dobbeltbindingene i pyrimidinene (tymin og cytosin) kan mettes og det dannes syklobutanpyrimidindimerer. Dette er den vanligste årsaken til mutasjoner indusert av UV-lys En annen type skade som også kan bidra er imidlertid 6-4 fotoprodukter Mutasjonene er hovedsakelig av typen G C A T transisjoner, noe som tyder på at det er cytosin i TC, CC eller CT-dimerer som replikeres ukorrekt av DNApolymerasen UV-lys kan også indusere en rekke baseskader, som er identiske med de en finner ved ioniserende stråling syklobutanpyrimidindimer 6-4 fotoprodukt

30 DNA skader indusert av kjemiske agens En rekke kjemiske forbindelser i miljøet i tillegg til en rekke legemidler kan skade DNA, enten direkte, eller etter at de er aktivert via kroppens metabolisme (promutagener) Mange legemidler, spesielt cytostatika brukt i kreftbehandling, brukes for å innføre DNA-skader som hemmer cellenes DNA-replikasjon. Dette vil i større grad påvirke kreftceller enn kroppens øvrige celler, da kreftceller generelt har en høyere delingshastighet enn andre celler. Flere cytostatika kan imidlertid også gi mutasjoner.

31 Oksyderende agens Reaktive oksygenforbindelser ( O 2, H 2 O 2 og OH ) dannes både fra kroppens egen metabolisme og fra eksterne agens som endel legemidler. Av disse er OH (hydroksylradikal) mest reaktivt mot DNA. OH kan angripe både nitrogenbasene og sukkergruppene i DNA, og kan indusere en mengde ulike skader, hvorav flere er mutagene O O Eks: H NH 2 N N N N R H H N H 2 N N N N R O Guanin 8-Oxoguanin

32 Alkylerende agens Svært mange kjemiske forbindelser (eks: sennepsgass, epoksyder, metylklorid og N- nitrosoforbindelser). samt enkelte intermediater i kroppens egen metabolisme, kan alkylere DNA. Nitrosoforbindelser er svært utbredt i miljøet (eks. sigarettrøyk), i maten vår og produseres i kroppen. Mange av disse forbindelsene er også cytotoksiske, og er mye brukt som antitumorforbindelser (Eks: BCNU). Stoffene kan alkylere ulike posisjoner i DNA-baser, og mange kan også danne kryssbindinger mellom DNA-trådene NH 2 O Mutagene skader O N C 1 N 5 6 H H H O N 4 3 T 2 1 N 5 6 CH 3 H Ikke-mutagene skader R R O NH 2 H 6 5 N N 1 G NH 2 N N R N 1 7 H A H N N N R H

33 Andre agens Cisplatin er en platinaforbindelse som er mye brukt i kreftbehandling, spesielt testikkelkreft. Det binder DNA, og kan danne monoadduktter eller intra- og interstrand kryssbindinger. Cl- Cl- NH 3 Pt 2+ NH 3 Bindingen introduserer en kraftig strukturendring in DNA-heliksen, og kan blokkere replikasjon. Det ser imidlertid også ut til å være mutagent (TLS over monoaddukter?) Polyaromatiske hydrokarboner (eks: benzo[a]pyren finnes i ufullstendig forbrent organisk materiale som tjære. De danner lett epoksider, som kan binde G i DNA. De er mutagene, muligens på grunn av feilinkorporering under TLS Benzo[a]pyren

34 Replikasjonsfeil I bestemte, repeterte basesekvenser kan forskyvninger av templat i forhold til dattertråd oppstå ved at en av trådene danner en loop Mismatch Loop ved poly-a Loop ved (CA) 4 Dette vil føre til enten delesjoner eller insersjoner i det nyreplikerte DNAet. I tillegg kan feil baser inkorporeres, og unnslippe proofreading -aktiviteten i polymerasen Templat Dattertråd

35 DNA reparasjon For å opprettholde genomets inegritet er levende organismer utstyrt med ulike DNA-reparasjonssystemer. Ulike enzymsystem gjenkjenner og reparerer ulike typer skader, og de ulike enzymene er ofte konserverte gjennom evolusjonen

36 Mekanismer for skadereparasjon og -toleranse Skase Direkte reparasjon (ingen utkutting) Excision repair (DNA excised) Skaden passeres (ikke reparert) Non-homologous end-joining Rekombinering Fotolyaser Alkyltransferaser DNA ligaser Base eksisjonsrep. (BER) Nukleotide eksisjonsrep. (NER) Mismatch reparasjon (MMR) Translesion DNA-syntese (TLS) Harmløs skade (eks: N 7 -MeG)

37 Direkte reversjon Fotolyaser Første DNA-reparasjons-mekanisme som ble oppdaget (på 40-tallet), men en ble ikke klar over at dette skyldtes et enzym (fotolyase), før sent på 50-tallet. Fotolyaser som reparerer cyclobutanpyrimidindimerer har blitt funnet i alle organismer, mens fotolyaser for 6-4 fotoprodukter bare er blitt påvist i noen få arter (bl. a. Drosophila) Fotolyase Lys ( nm) Pyrimidindimer

38 Alkyltransferaser MGMT Guanin metylert på O 6 -posisjon kan repareres direkte av enzymet O 6 -alkylguanin-dna metyltransferase (MGMT) T A T A A T G C C G Me G C T A A T Enzymet spalter metylgruppen fra basen, og binder den kovalent til aminosyren cystein i det aktive setet. MGMT mister derved enzymaktiviteten, men blir i stedet en aktiv transkripsjonsfaktor T A T A A T G C C G Me G C T A A T O 6 -benzylguanin er en potent inhibitor av MGMT, og brukes ofte sammen med metylerende cytostatika for å øke virkningen T A T A A T G C C G G C T A A T Me

39 Non-homologous end-joining Dette er mekanismen for reparasjon av DNA-dobbelttrådbrudd.. I motsetning til de andre mekanismene for direkte reparasjon, krever prosessen flere enzymer og hjelpeproteiner. Sentralt er binding av Ku-proteiner og kinasen DNA-PK, som fosforylerer komplekset slik at andre proteiner rekrutteres Under prosessen kan det av og til oppstå litt trimming av endene, noe som kan føre til mindre delesjonsmutasjoner.

40 Base-eksisjons eksisjons reparasjon (BER) (a) Skadde eller feilparede baser gjenkjennes av ulike DNA glykosylaser. Flere av disse flipper den skadde basen ut av DNAheliksen, og kutter N- glykosylbindingen mellom basen og deoksyribosen. (b) Eks: Uracil-DNA glycosylase

41 Baseeksisjon lager et baseløst sete (AP-sete) som i seg selv er mutagent, og må repareres videre. Dette skjer ved en flertrinns enzymatisk prosess I BER gjøres kun ett kutt i DNA-tråden ved skadestedet, og en (eller noen få) nye baser settes inn P P OH OH P DNA glykosylase AP-endonuklease drpase DNA polymerase og DNA ligase

42 Nukleotide-eksisjons eksisjons reparasjon (NER) Større ( bulky ) skader kan repareres av en prosess kalt nukleotideeksisjonsreparasjon (NER). Her kuttes DNA-tråden på begge sider av skadestedet, og skaden fjernes i form av et oligonukleotid. A B C XPF ERCC1 XPA XPA TFIIH (XPB,XPD oa) XPA TFIIH RPA RPA RPA XPG NER kan være koblet til transkripsjon, skjer da raskest i aktivt transkriberte gener. D RFC POL E DNA ligase

43 Syndrom forbundet med defekt NER Allerede i 1968 viste man at syndromet Xeroderma pigmentosum (XP), som bl.a. er forbundet ved sterkt økt kreftforekomst, skyldes defekt DNA reparasjon. XP opptrer i flere varianter (XPA - XPG) alt etter hvilket enzym i NER som er defekt. Studier av ulike XP-celler har bidratt mye til selve forståelsen av reparasjonsprosessen. Noen syndrom er også karakterisert ved at koblingen mellom NER og transkripsjon er defekt. Dette gjelder Cockaynes syndrom, og bestemte typer arvelig brystkreft (BRCA1)

44 Kliniske manifestasjoner av defekt nukleotide-eksisjonsreparasjon eksisjonsreparasjon (NER) (Xeroderma pigmentosum) Sykdommen gir ofte alvorlige pigmentforandringer og økt forekomst av hudkreft. Hudområder som normalt ikke utsettes for sollys er ikke påvirket Hudforandringene kan sette inn i svært ung alder. Øynene blir svært ofte påvirket, med uklar cornea og atrofi i nedre øyelokk

45 Mismatch-reparasjon Mismatcher kan oppstå under DNA-replikasjonen enten ved at feil baser settes inn (og unnslipper proofreading), eller ved såkalt slippage (ekstra eller manglende baser). Reparasjon av disse ble først oppdaget i E. coli, and omfatter proteinene MutS, MutL and MutH. I E. coli benyttes DNA-metylering for å bestemme hvilken tråd som skal repareres. Tilsvarende diskriminering kan ikke brukes av eukaryoter E. coli Mammalske celler En har funnet at MMR hos mennesket foregår ved proteiner homologe til E.coli-proteinene, og at mutasjoner i hmsh2 eller hmlh1 opptrer i ca. 90% of alle tilfeller av arvelig ikke-polypøs kolonkreft (HNPCC)

46