Påvisning av patogene bakterier og antibiotikaresistens (10) i drikkevann med PCR Dr. scient Vidar Lund og professor dr. philos Georg Kapperud

Transkript

1 Prosjektdeltakere: stipendiat Astrid S. Waage, avd. ing. Traute Vardund, Avdeling for bakteriologi, Folkehelsa. Prosjektledere: professor dr. philos Georg Kapperud, Avdeling for bakteriologi, Folkehelsa og dr. scient Vidar Lund, Avdeling for miljømedisin, Folkehelsa. Biveileder: dr. scient Henning Sørum, seksjon for farmakologi, mikrobiologi og næringsmiddelhygiene, Norges veterinærhøgskole. Problembeskrivelse I følge Folkehelsas vannverksregister mottar 10-15% av befolkningen som får drikkevann fra overflatevannkilder, udesinfisert vann. En rekke sykdomsfremkallende mikrober kan smitte via drikkevann. I perioden ble det oppklart til sammen 30 vannbårne utbrudd av akutt mage-tarminfeksjon i vårt land med ca sykdomstilfeller, hvorav omtrent 2700 var forårsaket av bakterien Campylobacter. Da det ikke finnes noe rapporteringssystem for vannbårne sykdomsutbrudd i Norge, må det antas at det totale antall sykdomstilfeller som skyldes smitte overført via drikkevann, høyst sannsynlig er langt høyere enn det som er oppklart. I tillegg antar en at antall sporadiske sykdomstilfeller som skyldes smitte overført gjennom drikkevann, er langt høyere enn antallet personer som er involvert i registrerte utbrudd. Det er vist at viltlevende fugler, spesielt måker, utgjør et viktig reservoar for bakterien Campylobacter, men også for andre sykdomsfremkallende bakterier. Større flokker av fugl er vanlig forekommende ved flere av våre drikkevannskilder. Det er også vist at husdyr kan være bærere av både bakterier som kan gi sykdom hos mennesker, og bakterier som er resistente (motstandsdyktige) mot antibiotika. Slike bakterier finnes dessuten regelmessig i kommunalt avløpsvann, noe som reflekterer at en viss prosent av befolkningen til en hver tid er bærere. Forurensing av drikkevannskilder fra ville fugler og pattedyr, husdyrbeiter, jordbruksarealer gjødslet med naturgjødsel, avløp fra slakterier eller kommunalt avløpsvann, representerer dermed et hygienisk problem dersom drikkevannet distribueres udesinfisert. Avdeling for bakteriologi ved Folkehelsa har i samarbeid med Norges veterinærhøgskole, Statens næringsmiddeltilsyn og Center for Disease Control and Prevention (CDC), USA, utført to case-kontroll-undersøkelser (en metode hvor man sammenlikner hva en syk person (casus) har gjort i perioden før sykdommen slo ut, med hva friske personer (kontroller) har gjort i samme periode) for å identifisere risikofaktorer for infeksjoner med Yersinia enterocolitica og Campylobacter jejuni/coli i Oslo-regionen. I begge disse undersøkelsene ble bruk av ubehandlet drikkevann identifisert som en betydelig risikofaktor. Det er også utført en tilsvarende undersøkelse av campylobacteriose i Trøndelag. Resultatene viser at konsum av ikke-desinfisert drikkevann er en langt mer dominerende risikofaktor i dette området enn i Oslo-regionen. Betydningen av drikkevann som spredningskilde for Campylobacter, fremkom også i en epidemiologisk undersøkelse av slaktekyllingbesetninger i Sørøst-Norge. Undersøkelsen konkluderte: "Desinfeksjon av drikkevannet er derfor det tiltaket som vil ha størst betydning for å forebygge Campylobacter blant kyllingbesetningene i det området undersøkelsen ble utført. Selv om forekomsten av Campylobacter blant slaktekyllingbesetningene var relativ lav, vil dette tiltaket kunne føre til ytterligere reduksjon i kontaminasjonen av fjørfeproduktene og dermed bidra til å redusere smittepresset overfor konsumentene." Tilsvarende intervjuundersøkelser som er blitt utført for Campylobacter og Yersina er også gjennomført for Salmonella i hele landet.

2 Undersøkelsene nevnt ovenfor understreker betydningen av drikkevannet som smittekilde i vårt land, og fremhever på nytt behovet for å sikre befolkningen en drikkevannsforsyning av tilfredsstillende hygienisk kvalitet. Det er en viktig oppgave for helsevesenet og næringsmiddeltilsynet å forebygge smittsomme sykdommer som skyldes drikkevann. For å oppnå dette er det viktig å: kartlegge og overvåke omfanget og alvorlighetsgraden av problemet, identifisere smittekilder og smittemåter (blant annet i forbindelse med sykdomsutbrudd) bryte smitteveier og eliminere eller redusere smittekilder. Sensitive (følsomme) og spesifikke metoder for påvisning av de aktuelle sykdomsfremkallende bakteriene er en nødvendig forutsetning for dette arbeidet. Mange sykdomsfremkallende tarmbakterier er svært vanskelige å påvise i vannprøver ved hjelp av konvensjonelle dyrkningsmetoder, som i tillegg har den ulempen at de er til dels tidkrevende og kostbare. Dette gjelder ikke minst for Yersinia enterocolitica og Campylobacter spp. En rekke ikke-sykdomsfremkallende varianter av Y. enterocolitica og nær beslektede arter er vanlige i vann, og forekomsten av slike bakterier vanskeliggjør påvisning av sykdomsfremkallende varianter. Det er derfor sannsynlig at Yersinia er blitt underestimert som en sannsynlig smittestoff overført via drikkevann. Et tilsvarende problem eksisterer for Campylobacter som kan danne hvilestadier som ikke lar seg dyrke med kjente metoder, men som likevel kan gi sykdom. Genteknologiske metoder basert på polymerase-kjedereaksjonen (PCR er nærmere beskrivelse senere) er et alternativ som i mange tilfeller har vist seg å være hurtigere og mer sensitive og spesifikke enn konvensjonelle mikrobiologiske påvisningsmetoder. DNA-laboratoriet ved Avdeling for bakteriologi ved Folkehelsa, har siden 1989 arbeidet med utvikling og anvendelse av PCR-metoder for påvisning av sykdomsfremkallende bakterier i pasientprøver såvel som i prøver fra matvarer, drikkevann og miljø. Økt bruk av antibiotika i humanmedisin, veterinærmedisin, husdyrhold og fiskeoppdrett har ført til stadig raskere utvikling av antibiotikaresistens både blant sykdomsfremkallende bakterier, vanlige tarmbakterer (normalflorabakterier) og bakterier i miljøet. Utviklingen representerer et alvorlig problem med store helsemessige, miljømessige og økonomiske konsekvenser. Kartlegging og overvåking av situasjonen er et viktig miljømikrobiologisk satsningsområde, og er en nødvendig forutsetning for å kunne iverksette effektive forebyggende tiltak. Bakterier som er resistente mot antibiotika, kan overføre genetisk materiale (deler av arveanlegg) til andre bakterier slik at disse også blir resistente. Integroner er en nyoppdaget gruppe overførbare deler av arveanlegg (DNA), som inneholder et varierende antall og typer antibiotikaresistensgener. Integroner kan finnes hos forskjellige bakterier, men forekomsten i miljøet er lite kjent. Mål for prosjektet Målet for prosjektet har vært å utvikle hurtige, sensitive og spesifikke metoder for påvisning av Yersinia enterocolitica, Campylobacter spp., Salmonella spp. og antibiotikaresistensgener i vann, kommunalt avløpsvann og matvarer ved hjelp av polymerase-kjedereaksjoner (PCR), og sammenlikne metodenes effektivitet med konvensjonelle standardmetoder for bakteriologisk dyrkning.

3 Metodebeskrivelse Polymerase-kjedereaksjonen (PCR) PCR-reaksjonen har fått sitt navn fra den engelske betegnelsen Polymerase Chain Reaction. Metoden vil lage millioner kopier av deler av en organismes arveanlegg (DNA eller RNA) dersom den aktuelle organismen finnes i prøven. De delene av arvestoffet som brukes i testen, er karakteristiske for hver organisme man ønsker å påvise, og de trenger i utgangspunktet kun finnes i et svært lavt antall i vannprøven. Teoretisk skal faktisk metoden kunne påvise arvestoff fra en enkelt celle enten det nå er en bakterie, virus eller parasitt. Det å lete etter noen få sykdomsfremkallende agens i en vannprøve med konvensjonelle metoder betegnes ofte som å lete etter en nål i en høystakk. Med PCR-teknikk vil metoden selv finne nålen i høystakken, og automatisk produsere en stakk av helt like nåler, og en stakk av like nåler er lett å påvise. PCR-metoden er derfor mye mer følsom enn tradisjonelle metoder, men i motsetning til konvensjonelle metoder som baserer seg på at bakteriene skal vokse, kan ikke PCR gi noe klart svar på om bakteriene som påvises er levende eller døde. Prøver av vann og avløpsvann Forsøkene ble utført på ulike vanntyper fra Oset vannrenseanlegg (Oslo vannverk) og vann av ulik forurensningsgrad fra forskjellige steder i Akerselva, samt to små bekker som er påvirket av kommunalt avløpsvann. I tillegg er det utført forsøk med avløpsvann fra Bækkelaget renseanlegg i Oslo. Alle vanntypene ble tilsatt et kjent antall av de aktuelle testbakteriene. Resultater Det er utviklet metoder basert på polymerase-kjedereaksjonen (PCR) som muliggjør hurtig, sensitiv og spesifikk påvisning av de sykdomsfremkallende tarmbakteriene Salmonella, Yersinia og Campylobacter i vann og matvarer. Disse bakteriene er de tre vanligste bakterielle årsakene til mage-tarminfeksjoner i Norge. I motsetning til tradisjonelle metoder for påvisning av bakterier, som baserer seg på vekst, bygger PCR-metodene på påvisning av bakterienes arvestoff (DNA). Med konvensjonelle bakteriologiske metoder for sykdomsfremkallende bakterier kan det ta opptil flere uker før et resultat foreligger. PCR-metoden gir resultater i løpet av et par dager, og metodene som er utviklet gjør det mulig å påvise færre enn 10 bakterier pr. 100 ml vann. Her følger en kort beskrivelse av de ulike metodene: 1. Påvisning av et lavt antall bakterier av slekten Salmonella i prøver fra overflatevann, kommunalt avløpsvann og matvarer ved bruk av en to-trinns PCR-metode En to-trinns PCR-metode for påvisning av Salmonella ble utviklet ved bruk av to par med kunstig framstilte biter av arveanlegg (DNA) fra Salmonella Typhimurium. Denne to-trinns PCR-metoden identifiserte 128 av totalt 129 testede Salmonella-stammer. Samtlige tester med 31 andre bakterietyper enn Salmonella var negative. Metoden klarte å påvise ned til 2 bakterier, målt som bakterier som klarte å vokse på standard bakteriemedium. Metodens anvendbarhet ble undersøkt for vannprøver, prøver av kommunalt avløpsvann og matvarer tilsatt S. Typhimurium. Ved bruk av denne metoden kunne en påvise ned til 10 Salmonellabakterier pr. 100 ml vann, med en bakgrunnsflora av bakterier på opptil 8700 kimtallsorganismer pr. ml og koliforme bakterier pr. 100 ml.

4 Matvarer tilsatt et kjent antall bakterier ble analysert med og uten oppformering av bakteriene, ved bruk av samme metodikk som beskrevet ovenfor. To-trinns PCR utført på matvareprøver, hvor bakteriene hadde fått mulighet til å formere seg før PCR-analysen, muliggjorde påvisning av <10 bakterier pr. gram mat. Varierende resultater ble oppnådd for matprøver analysert uten forutgående oppformering, og de fleste resultatene var negative. Denne enkle og raske metoden vil kunne bidra til sensitiv og spesifikk påvisning av Salmonella spp. i vann og mat. 2. Påvisning av et lavt antall bakterier av artene Campylobacter jejuni og Campylobacter coli i prøver fra overflatevann, kommunalt avløpsvann og matvarer ved bruk av en totrinns PCR-metode En rask og sensitiv metode for deteksjon av et lavt antall Campylobacter jejuni og Campylobacter coli i overflatevann, kommunalt avløpsvann og matvarer ble utviklet. Overflatevann- og avløpsvannsprøvene ble filtrert, og bakteriene på filtrene fikk vokse over natten i bakteriemedium. Før PCR ble utført, ble bakteriekulturene behandlet med en hurtig og enkel prosedyre som omfattet sentrifugering, tilsetning av et enzym som bryter ned proteiner (proteinase K) og koking. PCR-metoden gjorde det mulig å påvise ned til 3-15 C. jejuni pr. 100 ml vann i vannprøver med en bakgrunnsflora av bakterier på opptil 8700 kimtallsorganismer pr. ml og koliforme bakterier pr. 100 ml vann. PCR-metodens anvendbarhet for å påvise Campylobacter-bakterier i kjøttprøver tilsatt et kjent antall bakterier ble også undersøkt både med og uten oppformering av prøvene før prøvebehandling og PCR. For oppformerte prøver kunne det påvises 3 Campylobacterbakterier pr. gram mat, mens variable resultater ble oppnådd for prøver analysert uten forutgående oppformering. Denne hurtige, følsomme og enkle PCR-metoden vil gi et nyttig bidrag til spesifikk deteksjon av C. jejuni og C. coli i vann, kommunalt avløpsvann og mat, selv for prøver med et høyt innhold av andre bakterier. 3. Påvisning av et lavt antall patogene bakterier av arten Yersinia enterocolitica i prøver fra overflatevann- og kommunalt avløpsvann ved bruk av to-trinns PCR-metode. Isolering av patogene (sykdomsfremkallende) Yersinia enterocolitica-bakterier fra vann og kommunalt avløpsvann ved bruk av tradisjonelle dyrkingsmetoder er tidkrevende, og det er svært vanskelig å skille mellom sykdomsfremkallende og ikke sykdomsfremkallende bakteriestammer. En to-trinns PCR-metode ble derfor benyttet for påvisning av et lavt antall Y. enterocolitica i prøver fra naturlige overflatevannkilder med forskjellig forurensningsgrad, samt fra kommunalt avløpsvann. Vann- og avløpsvannsprøvene ble filtrert, og bakteriene på filtrene fikk vokse på et bakteriemedium over natten. PCR-analysen, som ble utført som beskrevet under 2. ovenfor, muliggjorde påvisning av 8-17 Yersinia-bakterier pr. 100 ml vann med en bakgrunnsflora av bakterer i vannet på opptil 8700 kimtallsbakterier pr. ml og koliforme bakterier pr. 100 ml vann. Analysen kan fullføres i løpet av 2-3 dager, og kan benyttes til overvåkning av vannkilder for forekomst av sykdomsfremkallende Y. enterocolitica-bakterier.

5 4. Utvikling av en "ekstra lang" PCR-metode for påvisning av integroner og deres antibiotikaresistensgener i bakterier fra overflatevann og kommunalt avløpsvann Bakterier som er motstandsdyktige mot antibiotika, kan overføre denne egenskapen ved å overføre deler av sine arveanlegg til andre bakterier. Prosjektet har utviklet en PCR-metode for påvisning av en nyoppdaget type overførbar antibiotikaresistens, som overføres når bakterier utveksler kassetter med arveanlegg (integroner) seg i mellom. En to-temperaturs, "ekstra lang" PCR-metode (XL-PCR) for påvisning av integroner ble utviklet. For å undersøke metodens anvendbarhet for deteksjon av integroner i dyrkbare bakterier fra vann, ble prøver fra overflatevann og kommunalt avløpsvann filtrert, og filtrene ble inkubert over natt i et næringsmedium som bakteriene kunne vokse på. XL-PCR ble utført på kokte, anrikede kulturer. Flere PCR-produkter ble dannet fra to av de tre prøvene som ble analysert, og resultatene indikerte at bakteriene inneholdt de aktuelle integronene. XL-PCR-metoden trenger imidlertid videre optimalisering. Metoden vil kunne detektere integroner i bakterier i vann fra ulike kilder, og dermed bidra til økt kunnskap om disse elementenes og deres resistensgeners betydning for spredning av antibiotikaresistens i miljøet. Konklusjon Resultatene som er oppnådd i dette prosjektet vurderes som svært nyttige for alle som er engasjert i analyse av vannprøver og matvareprøver med hensyn på sykdomsfremkallende mikrober. De metodene som er utviklet, er ikke bare hurtigere, men også mer følsomme enn tilgjengelige bakteriologiske metoder for å påvise sykdomsfremkallende mikrober direkte. Det er lite trolig at metoden som er beskrevet her vil bli en rutineanalyse for vanlig bakteriologisk overvåkning, men den vil kunne bli aktuell i spesielle tilfeller, der hvor man trenger et verktøy for å kartlegge og overvåke forekomsten av sykdomsfremkallende mikrober i drikkevann. Metodene vil ikke minst kunne være nyttige under oppklaring av sykdomsutbrudd i befolkningen der drikkevann er antatt å være smittekilden, under forutsetning av at det kan fremskaffes en vannprøve som kan være representativ for det vannet som er drukket av dem som er blitt syke. Metoden krever imidlertid fortsatt noe mer utprøving på naturlige vannprøver før den kan taes i allmenn bruk. Resultatene danner grunnlaget for videre forskning for å kartlegge forekomst av sykdomsfremkallende mikrober og antibiotikaresistente bakterier i norske vannforekomster. Dette vil i sin tur være utgangspunkt for kontrolltiltak med sikte på kvalitetsforbedring. Artikler og manuskripter fra prosjektet 1. Waage, A. S., T. Vardund, V. Lund & G. Kapperud. Detection of low numbers of Salmonella in environmental water, sewage and food samples by a nested PCR assay. (Manuscript). 2. Waage, A. S., T. Vardund, V. Lund & G. Kapperud Detection of Small Numbers of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Cells in Environmental Water, Sewage and Food Samples by a Seminested PCR Assay. Appl. Environ. Microbiol. 65 (4), Waage, A. S., T. Vardund, V. Lund & G. Kapperud. Detection of low numbers of pathogenic Yersinia enterocolitica in environmental water and sewage samples by a nested PCR assay. (Manuscript). 4. Waage, A. S. & H. Sørum. Application of an extra long PCR assay for detection of class 1 integrons and inserted antibiotic resistance gene cassettes in bacteria from environmental water and sewage samples. (Manuscript).