artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok

Transkript

1 Desember 2010 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok Versjon 1 24 Kvantitativ in vitro-diagnostikk Til bruk med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter NO QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R NO Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyseteknologi QIAGEN er den ledende leverandøren av innovativ prøve- og analyseteknologi ved å gjøre det mulig å isolere og påvise innhold i enhver biologisk prøve. Våre avanserte høykvalitetsprodukter og tjenester sikrer suksessen fra prøve til resultat. QIAGEN setter standardene i: Rensing av DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser microrna-forskning og RNAi Automatisering av prøve- og analyseteknologi Vårt mål er å gjøre det mulig for deg å oppnå enestående suksess og gjennombrudd. For mer informasjon besøk

3 Innhold Pakkens innhold 5 Symboler 5 Lagring 6 Tilsiktet bruk 6 Begrenset bruk av produktet 6 Kvalitetskontroll 7 Teknisk assistanse 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Innledning 8 Prinsipp 8 Patogeninformasjon 8 Ytelsesegenskaper 9 Arbeidsflyt 14 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for 19 Viktig opplysninger 21 Generelle forholdsregler 21 Prøvetaking, oppbevaring og transport 21 Komme i gang på QIAsymphony SP/AS-instrumentene 23 Klargjøring av prøvematerialer 25 Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandinger for plasmaprøver 26 Bruke en intern kontroll 26 Analysekontrollsett og analyseparametersett 27 Fleranalysekjøringer 28 Resultater for nukleinsyrer 29 Oppbevaring av nukleinsyrer 29 Stille inn terskelen for PCR-analysen 29 Kvantitering 29 Protokoller DNA-isolering på QIAsymphony SP 31 Analyseoppsett på QIAsymphony AS 38 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010 3

4 PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q 44 Feilsøkingsveiledning 55 Henvisninger 60 Bestillingsinformasjon 61 4 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

5 Pakkens innhold artus EBV QS-RGQ-settet (24) Katalognr Antall reaksjoner 24 Blått EBV RG Master 3 x 360 μl Rød EBV RG QS 1* (5 x 10 4 kopier/μl) 200 μl Rød EBV RG QS 2* (5 x 10 3 kopier/μl) 200 μl Rød EBV RG QS 3* (5 x 10 2 kopier/μl) 200 μl Rød EBV RG QS 4* (5 x 10 1 kopier/μl) 200 μl Grønn EBV RG IC 1000 μl Hvitt Vann (PCR-klasse) 1000 μl Håndbok 1 * Kvantiteringsstandard. Intern kontroll. Symboler <N> Inneholder nok reagens til <N> tester Brukes innen In vitro-diagnostisk medisinsk enhet Katalognumre Lotnummer Materialenummer Komponenter Inneholder artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010 5

6 Nummer Temperaturbegrensninger Lovlig produsent Se bruksanvisning Viktig merknad Lagring Komponentene i artus EBV QS-RGQ-settet skal oppbevares ved 20 C og er stabile inntil utløpsdatoen som er angitt på etiketten. Gjentatt opptining og frysing (>2 x) skal unngås, da dette kan redusere analyseytelsen. Tilsiktet bruk artus EBV QS-RGQ-settet er en in vitro-nukleinsyreforsterkningstest for kvantifiseringen av Epstein-Barr-virus (EBV)-DNA. Dette diagnostiske testsettet bruker polymerasekjedereaksjonen (PCR) og er konfigurert til bruk med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter. artus EBV QS-RGQ-settet er beregnet til bruk i sammenheng med klinisk presentasjon og andre laboratoriemarkører for sykdomsprognose. Begrenset bruk av produktet Alle reagenser kan utelukkende brukes i in vitro-diagnostikk. Produktet skal kun brukes av personale som er spesielt instruert og opplært i in vitro-diagnostiske prosedyrer (EN375). Strengt samsvar med brukerhåndboken kreves for optimale PCR-resultater. Det er viktig å være oppmerksom på utløpsdatoer som er trykket på boksen og etikettene på alle komponentene. Bruk ikke komponenter med utløpt dato. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innen de høyst konserverte regionene av virusgenomet som er dekket av settets primere og/eller probe føre til underkvantifisering eller at tilstedeværelsen av viruset ikke oppdages i disse tilfellene. Validiteten og ytelsen til analysedesignen revideres med regelmessige intervaller. 6 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

7 Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs ISO-sertifiserte kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti med artus EBV QS-RQG-sett mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. Teknisk assistanse Hos QIAGEN er vi stolte av kvaliteten og tilgjengeligheten av vår tekniske støtte. Våre tekniske serviceavdelinger er bemannet av erfarne vitenskapsfolk med omfattende praktisk og teoretisk ekspertise i prøve- og analyseteknologi og bruken av QIAGEN-produkter. Hvis du har noen spørsmål eller opplever vanskeligheter med artus EBV QS-RGQ-settet eller QIAGEN-produkter generelt sett, vennligst ikke nøl med å ta kontakt med oss. QIAGEN-kunder er en større informasjonskilde vedrørende avansert eller spesialisert bruk av produktene våre. Denne informasjonen er nyttig for andre forskere, samt for forskerne ved QIAGEN. Vi oppmuntrer deg derfor til å ta kontakt med oss hvis du har forslag om produktets ytelse eller nye bruksområder og teknikker. For teknisk assistanse og mer informasjon vennligst se vårt tekniske supportsenter på eller ring én av QIAGENs tekniske serviceavdelinger eller lokale distributører (se bak på omslaget eller besøk Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du finne, vise og skrive ut MSDS for hvert QIAGEN-sett og settkomponent. For sikkerhetsinformasjon for the QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet se håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. For sikkerhetsinformasjon for the QIAsymphony DNA Mini-settet se håndboken for QIAsymphony DNA. For sikkerhetsinformasjon om instrumentene se den relevante brukerhåndboken for instrumentene. Kast prøve- og analyseavfall ifølge de lokale sikkerhetsforskriftene. 24-timers nødsinformasjon Medisinsk nødsinformasjon på engelsk, fransk og tysk kan skaffes 24 timer i døgnet fra: Poison Information Center Mainz, Tyskland Tlf.: artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010 7

8 Innledning artus EBV QS-RGQ-settet utgjør et bruksklart system for påvisning av EBV-DNA ved bruk av en polymerasekjedereaksjon (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumenter med prøveklargjøring og analyseoppsett ved bruk av QIAsymphony SP/ASinstrumenter. EBV RG Master inneholder reagenser og enzymes for den spesifikke forsterkningen av en 97 bp-region av EBV-genomet og for direkte påvisning av det spesifikke amplikonet i den fluorescerende kanalens Cycling Green for RotorGene Q. I tillegg inneholder artus EBV QS-RGQ-settet et sekundært heterologt forsterkningssystem for å identifisere mulig PCR-hemming. Dette påvises som en intern kontroll (IC) i den fluorescerende kanalen Cycling Yellow for Rotor- Gene Q. Påvisningsgrensen for den analytiske EBV PCR er ikke redusert. Eksterne positive kontroller (EBV RG QS 1 4) forsynes, noe som gjør det mulig med bestemmelse av mengden virus-dna. For mer informasjon se Kvantitering på side 29. Prinsipp Patogenpåvisning med polymerasekjedereaksjon (PCR) er basert på forsterkningen av spesifikke regioner av patogengenomet. I sanntids PCR påvises det forsterkede produktet via fluorescerende farger. Disse er vanligvis forbundet med oligonukleotidprober som bindes spesifikt til det forsterkede produktet. Overvåkning av de fluorescerende intensitetene i løpet av PCRkjøringen (f.eks. i sanntid) gjør det mulig med påvisning og kvantifisering av det akkumulerende produktet uten å måtte åpne reaksjonsrørene på nytt etter PCRkjøringen.* Patogeninformasjon Overføringen av Epstein-Barr-viruset (EBV) skjer oralt, hovedsakelig via kontaminert spytt. Generelt sett er infeksjon av EBV, spesielt hvis det skjer i barndommen, asymptomatisk. Det kliniske tegnet på en akutt infeksjon er infektiøs monomukleose i forbindelse med feber, tretthet og angina, samt inflammasjon av lymfeknutene og milten. I noen pasienter kommer disse symptomene tilbake igjen kronisk. Alvorlige former av EBV-infeksjonen kan ses i immunodefisiente pasienter og personer med T-celledefekter. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

9 Ytelsesegenskaper Analytisk følsomhet plasma Den analytiske deteksjonsgrensen med hensyn til rensingen (følsomhetsgrense) ble vurdert for artus EBV QS-RGQ-settet ved bruk av EBV-positive kliniske prøver i kombinasjon med ekstraheringen på QIAsymphony SP. For plasma ble den analytiske følsomheten med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet bestemt ved bruk av en dilusjonsserie av EBVvirusmateriale fra 3160 til nominelt 1 EBV kopi/ml tilsatt i kliniske plasmaprøver. Disse ble utsatt for DNA-ekstrahering ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet i kombinasjon med Cellfree1000-protokollen (ekstraheringsvolum: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av de 10 fortynningene ble analysert med artus EBV QS-RGQ-settet på 4 ulike måter i 4 kjøringer med 8 replikater i hver. Resultatene ble bestemt av en probitanalyse. En grafisk illustrasjon av probitanalysen vises i figur 1. Den analytiske påvisningsgrensen med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet i kombinasjon med Rotor-Gene Q er 157 kopier/ml (p = 0,05). Dette betyr at det er en sannsynlighet på 95 % for at 157 kopier/ml vil bli påvist % Proporsjoner Proportions ,20 ~ ~ copies/ml kopier/ml (95%) (95 %) ( ( copies/ml) kopier/ml) log (dose) Figur 1. Probit-analyse: Plasma, EBV (Rotor-Gene Q). Analytisk følsomhet med hensyn til rensingen (plasma, ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet) av artus EBV QS-RGQ-settet på Rotor-Gene Q. Spesifisitet plasma Spesifiteten til artus EBV QS-RGQ-settet er først og fremst sikret gjennom valget av primere og prober, samt valget av strenge reaksjonsbetingelser. Primere og artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010 9

10 prober ble kontrollert for mulige homologier for alle sekvenser som er utgitt i genbanker etter sekvenssammenligningsanalyse. Påvisningsevnen for alle relevante genotyper har dermed blitt sikret. Videre ble spesifiteten validert med 30 ulike EBV-negative plasmaprøver. Disse genererte ikke noen signaler med de EBV-spesifikke primerne og probene, som er inkludert i EBV RG Master. En potensiell kryssreaktivitet for artus EBV QS-RGQ-settet ble testet ved bruk av kontrollgruppen som er opplistet i tabell 1 (nedenfor). Ingen av de testede patogenene har vært reaktive. Ingen kr yssreaktiviteter vistes med blandede infeksjoner. Tabell 1. Testing av spesifisiteten til settet med potensielt kryssreaktive patogener Kontrollgruppe Humant herpesvirus 1 (herpes simplex-virus 1) Humant herpesvirus 2 (herpes simplex-virus 2) Humant herpesvirus 3 (varicella-zoster-virus) Humant herpesvirus 5 (cytomegalovirus) EBV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Yellow) Humant T-celleleukemivirus 1 + Humant T-celleleukemivirus 2 + Lineært område plasma Det lineære området med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet ble bestemt ved å analysere en fortynningsserie av EBV-virusmateriale som strekker seg fra 1,00 x 10 7 kopier/ml til 1,00 x 10 2 kopier/ml i plasma. Rensingen ble utført i replikater (n = 4 for konsentrasjoner 1,00 x 10 6 kopies/ml; n = 8 for konsentrasjoner <1,00 x 10 6 kopier/ml) ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett i kombinasjon med Cellfree1000-protokollen (ekstraheringsvolum: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av prøvene ble analysert ved bruk av artus EBV QS-RGQ-settet. Det lineære området med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet har blitt fastsatt til å dekke 10 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

11 konsentrasjoner fra 3,16 x 10 2 kopier/ml til 1,00 x 10 7 kopier/ml for plasma (figur 2). 10 log log 10 beregnet konsentrasjon (kopier/ml) 10 estimated concentration (copies/ml) y y = x 1,0528x ,1729 R 22 = , log log 10 nominell 10 nominal konsentrasjon concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 2. Lineært område for artus EBV QS-RGQ-sett (plasma). Kalkulering av det lineære området. Den rette linjen ble bestemt ved en lineær regresjon av log 10 -kalkulerte konsentrasjoner med log 10 nominelle konsentrasjoner. Ligningen til regresjonslinjen er inkludert på figuren. Robusthet plasma Verifiseringen av robustheten gjør det mulig å fastsette den totale feilraten for artus EBV QS-RGQ-settet. For å verifisere robustheten ble 30 EBV-negative plasmaprøver tilsatt med 500 kopier/ml av EBV (omtrent tredobbelt konsentrasjon av den analytiske følsomhetsgrensen). Etter ekstraheringen ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet i kombinasjon med Cellfree1000_DSP-protokollen (ekstraheringsvolum: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl), ble disse prøvene analysert med artus EBV QS-RGQ-settet. I tillegg ble robustheten for den interne kontrollen vurdert ved rensing og analyse av de 30 tilsatte plasmaprøvene. Inhiberinger ble ikke observert. Dermed er robustheten til artus EBV QS-RGQ-settet 99%. Analytisk følsomhet fullblod For fullblod ble den analytiske følsomheten med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet bestemt ved bruk av en fortynningsserie av EBVvirusmateriale fra 3160 til nominelt 3,16 EBV kopier/ml tilsatt i humane fullblodsprøver. Disse ble utsatt for DNA-ekstrahering ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med VirusBlood200-protokollen artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

12 (ekstraheringsvolum: 200 μl, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av de 10 fortynningene ble analysert med artus EBV QS-RGQ-settet på 3 ulike måter i 3 kjøringer med 11 replikater i hver. Resultatene ble bestemt av en probitanalyse. En grafisk illustrasjon av probitanalysen vises i figur 3. Den analytiske påvisningsgrensen med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet i kombinasjon med Rotor-Gene Q er 288,42 kopier/ml (p = 0,05). Dette betyr at det er en sannsynlighet på 95 % for at 288,42 kopier/ml vil bli påvist % Proporsjoner Proportions ,46002 ~ ,42 copies/ml kopier/ml (95%) %) (169,53 ( ,95 kopier/ml) copies/ml) log (dose) Figur 3. Probit-analyse: Fullblod, EBV (Rotor-Gene Q). Analytisk følsomhet med hensyn til rensingen (fullblod, ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet) av artus EBV QS-RGQ-settet på Rotor-Gene Q. Spesifisitet fullblod Spesifiteten til artus EBV QS-RGQ-settet er først og fremst sikret gjennom valget av primere og prober, samt valget av strenge reaksjonsbetingelser. Primere og prober ble kontrollert for mulige homologier for alle sekvenser som er utgitt i genbanker etter sekvenssammenligningsanalyse. Påvisningsevnen for alle relevante genotyper har dermed blitt sikret. Videre ble spesifiteten validert med 30 ulike EBV-negative helblodprøver. Disse genererte ikke noen signaler med de EBV-spesifikke primerne og probene, som er inkludert i EBV RG Master. En potensiell kryssreaktivitet for artus EBV QS-RGQ-settet ble testet ved bruk av kontrollgruppen som er opplistet i tabell 1 (se side 10). Ingen av de testede patogenene har vært reaktive. Ingen kr yssreaktiviteter vistes med blandede infeksjoner. 12 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

13 Lineært område fullblod Det lineære området med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet ble bestemt ved å analysere en fortynningsserie av EBV-virusmateriale som strekker seg fra 5,00 x 10 7 kopier/ml til 1,00 x 10 2 kopier/ml i helblod. Rensingen ble utført i replikater (n = 4 for konsentrasjoner 1,00 x 10 7 kopies/ml; n = 8 for konsentrasjoner <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved bruk av QIAsymphony DNA Minisettet i kombinasjon med VirusBlood200-protokollen (ekstraheringsvolum: 200 μl, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av prøvene ble analysert ved bruk av artus EBV QS-RGQ-settet. Det lineære området med hensyn til rensingen av artus EBV QS-RGQ-settet har blitt fastsatt til å dekke konsentrasjoner fra 1,00 x 10 3 kopier/ml til 5,00 x 10 7 kopier/ml for fullblod (figur 4). 10 log log 10 beregnet konsentrasjon (kopier/ml) 10 estimated concentration (copies/ml) y y = x 1,0261x ,0477 R 2 R 2 = , log 10 log nominell 10 nominal konsentrasjon concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 4. Lineært område for artus EBV QS-RGQ-settet (fullblod). Kalkulering av det lineære området. Den rette linjen ble bestemt ved en lineær regresjon av log 10 -kalkulerte konsentrasjoner med log 10 nominelle konsentrasjoner. Ligningen til regresjonslinjen er inkludert på figuren. Robusthet fullblod Verifiseringen av robustheten gjør det mulig å fastsette den totale feilraten for artus EBV QS-RGQ-settet. For å verifisere robustheten ble 30 EBV-negative helblodprøver tilsatt med 750 kopier/ml av EBV (omtrent tredobbelt konsentrasjon av den analytiske følsomhetsgrensen). Etter ekstraheringen ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med VirusBlood200- protokollen (ekstraheringsvolum: 200 μl, elusjonsvolum: 60 μl), ble disse prøvene analysert med artus EBV QS-RGQ-settet. I tillegg ble robustheten for den interne kontrollen vurdert ved rensing og analyse av de 30 tilsatte artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

14 fullblodprøvene. Inhiberinger ble ikke observert. Dermed er robustheten til artus EBV QS-RGQ-settet 99%. Reproduserbarhet Reproduserbarhetsdata gjør det mulig med en regelmessig ytelsesvurdering av artus EBV QS-RGQ-settet samt en effektivitetssammenligning med andre produkter. Disse dataene oppnås gjennom deltakelsen i etablerte ferdighetsprogrammer. Krysskontaminering Fravær av krysskontaminering mellom prøver for hele arbeidsflyten ble bevist av korrekt påvisning av alle kjent positive og negative prøver i vekslende posisjoner (sjakkbrettmønster) for et representerende artus QS-RGQ-system. Arbeidsflyt QIAsymphony RGQ-arbeidsflyten starter med rensing av nukleinsyrer fra humane plasma- eller fullblodsprøver på QIAsymphony SP-instrumentet. Eluatene, som inneholder rensede nukleinsyrer, fra prøveklargjøringsprosedyren overføres til QIAsymphony AS-modulen, som deretter utfører analyseoppsett (figur 5). Analysene overføres deretter til Rotor- Gene Q for PCR og dataanalyse (figur 6). En arbeidsflytoversikt finnes på side For mer informasjon se de detaljerte protokollene i denne håndboken (side 31, 38, og 44). 14 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

15 Figur 5. Walkaway-automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrumenter. Prøver, reagenser og forbruksvarer lastes i de relevante skuffene. Prøveklargjøring og analyseoppsett automatiseres deretter fullstendig på QIAsymphony SP/AS-instrumentene. Figur 6. Overføring av prøvene til Rotor-Gene Q. Etter prøveklargjøring og analyseoppsett lastes reaksjonene i den 72-brønns rotoren for Rotor-Gene Q for sanntids PCR-analyse. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

16 Oversikt over QIAsymphony RGQ-arbeidsflyten QIAsymphony SP Last Waste (Avfall)-skuffen. Plasser elusjonsstativet inn i Eluate (Eluat)-skuffen. Uavhengig operasjon Integrert operasjon Plasser elusjonsstativet på åpning 1. Plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning 1. Last Reagents and Consumables (Reagenser og forbruksvarer)- skuffen. Last Sample (Prøve)-skuffen. Definer en kjøring/omgang ved bruk av brukergrensesnittet for prøveklargjøringen. Start protokollen. Når prøveprosesseringen er fullstendig skal elusjonsstativet enten fjernes manuelt fra skuffen Eluate (uavhengig operasjon) eller utfør direkte overføring av elusjonsstativet til QIAsymphony AS via overføringsmodulen (integrert operasjon). Uavhengig operasjon Integrert operasjon Fjern eluatåpningsoppgaven på berøringsskjermen, åpne deretter skuffen Eluate og fjern elusjonsstativet manuelt. Trykk på Transfer (Overfør) for å overføre elusjonsstativet fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS. Last ned QIAsymphony SP-resultatfilen. 16 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

17 QIAsymphony AS Bytt til grensesnittet for analyseoppsett på berøringsskjermen. Starte analysedefinisjonsprosessen. Uavhengig operasjon Integrert operasjon Trykk New (Ny). En melding vil vises og spørre om du skal bruke elusjonsstativet som et prøvestativ. Trykk på Yes for å bekrefte. Definer en analysekjøring. Skjermen som vises på berøringsskjermen vil lede deg trinn-for-trinn gjennom analysedefinisjonsprosessen. Last skuffen Eluate and Reagents (Eluat og reagenser) og Assays (Analyser) med de riktige prøvene, reagensene og forbruksvarene. For detajert lasteinformasjon se skjermbildet Loading Information (Laster informasjon). Trykk alternativt Queue (Kø) og last ned lasteinformasjonsfilen. Start analysekjøringen. Etter at kjøringen er ferdig, ta ut analysene. For å gjøre dette trykker du på Remove (Fjern) og tar deretter manuelt ut analysestativet (eller - stativene) fra skuffen Assays. Overfør analysestativet (eller -stativene) til Rotor-Gene Q. Last ned QIAsymphony AS-resultatfilen og cycler-filen. Overfør cycler-filen til Rotor-Gene Q. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

18 Rotor-Gene Q Velg eller opprett en temperaturprofil. Klikk på Start Run (Start kjøring). Analyser resultatene etter at kjøringen er ferdig. Vedlikehold Utfør de aktuelle vedlikeholdsprosedyrene for QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q ifølge brukerhåndbøkene for instrumentene. Se avsnitt 8 i brukerhåndboken for QIAsymphony SP/AS Generell beskrivelse og avsnitt 9 i brukerhåndboken for Rotor-Gene Q for mer detaljer om nødvendige daglige, regelmessige og ukentlige vedlikeholdsprosedyrer. 18 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

19 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. Pipetter (justerbare)* og sterile pipettspisser med filtre Vorteks-blander* Arbeidsbenksentrifuge* med rotor for 2 ml reaksjonsrør, evne til sentrifugering ved 6800 x g For prøveklargjøring QIAsymphony SP-instrument (kat.nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett (kat.nr ) for plasmaprøver eller QIAsymphony DNA Mini-sett (kat.nr ) for fullblodprøver Adaptere for QIAsymphony SP: Elution Microtube Rack QS (kjøleadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ) Rørinnlegg 3B (innlegg, 2,0ml v2, prøvevogn (24), Qsym, kat.nr ) Forbruksvarer for QIAsymphony SP: Prøveklargjøringspatroner, 8-brønns (kat.nr ) 8-stangsdeksler (kat.nr ) Filterspisser, 1500 μl (kat.nr ) Filterspisser, 200 μl (kat.nr ) Elusjonsmikrorør CL (kat.nr ) Spissavfallsposer (kat.nr ) Mikrorør 2,0 ml type H eller mikrorør 2,0 ml type I (Sarstedt, kat.nr og , for bruk med prøver og interne kontroller * Pass på at instrumentene er sjekket og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

20 For analyseoppsett QIAsymphony AS-instrument (kat.nr )* Adaptere og reagensholdere for QIAsymphony AS: Reagensholder 1 QS (kjøleadapter, reagensholder 1, Qsym, kat.nr ) Reagensholder 2 QS (kjøleadapter, reagensholder 2, Qsym, kat.nr ) RG-strimmelrør 72 QS (kjøleadapter, RG-strimmelrør 72, Qsym, kat.nr ) Forbruksvarer for QIAsymphony AS: Strimmelrør og lokk, 0,1 ml (kat.nr ) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller mikrorør 2,0 ml type I (Sarstedt, kat.nr , Rør, konisk, 5 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller rør med flat base fra PP (Sarstedt, kat.nr , Reagensflasker, 30 ml, Qsym AS (kat. nr ) Elusjonsmikrorør CL (kat.nr ) Filterspisser, 1500 μl (kat.nr ) Filterspisser, 200 μl (kat.nr ) Filterspisser, 50 μl (kat.nr ) Spissavfallsposer (kat.nr ) For PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument* Rotor-Gene Q programvareversjon 2.02 eller høyere * Pass på at instrumentene er sjekket og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. Vennligst spør om tilgjengelighet. 20 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

21 Viktig opplysninger Generelle forholdsregler Vær alltid oppmerksom på følgende: Bruk sterile pipettspisser med filtre. I løpet av manuelle trinn skal rørene holdes lukket når det er mulig for å unngå kontaminering. Tin opp alle komponentene grundig ved romtemperatur (15 25 C) før du begynner en analyse. Når de er opptinet, bland komponentene (ved å pipettere flere ganger opp og ned eller ved å utføre pulsvortex) og sentrifuger kort. Sikre at det ikke finnes skum eller bobler i reagensrørene. Ikke bland komponentene fra sett med ulike lotsnumre. Forsikre deg om at de nødvendige adapterne er forhåndkjølt til 2 8 C. Arbeid hurtig og hold PCR-reagensene på is eller i kjøleblokken før lasting. Fortsett kontinuerlig fra én del av arbeidsflyten til neste. Ikke overskrid én time overføringstid mellom hver modul (QIAsymphony SP til QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q). Prøvetaking, oppbevaring og transport Alle prøver må behandles som potensielt infeksjonsmateriale. Kun de følgende prøvematerialene er tillatte, og for disse må følgende regler og spesielle instruksjoner vedrørende samling, transport og oppbevaring overholdes strengt. Den interne valideringen av artus EBV QS-RGQ-settet har blitt utført ved bruk av humant EDTA-plasmaprøver og humane EDTA-fullblodprøver. Andre prøvematerialer har ikke blitt validert. Bruk kun det anbefalte DNAisolasjonssett (se Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 31) for prøveklargjøring. Ved bruk av visse prøvematerialer må spesielle instruksjoner vedrørende samling, transport og oppbevaring overholdes strengt. Prøvetaking Hver blodprøvetaking forårsaker en skade på blodkar (arterier, vener, kapillærer). Det skal kun brukes ufarlig og sterilt materiale. For blodprøvetaking er egnede forbruksvarer tilgjengelige. For venepunkturer skal det ikke brukes for fine kapillærnåler. Venøs blodprøvetaking skal kun utføres på de egnede artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

22 delene av albuen, nedre arm eller på håndens bakside. Blodet på trekkes ut med standard prøvetakingsrør (rød hette, Sarstedt eller tilsvarende rør fra en annen produsent). Det skal tas et volum på 5 10 ml EDTA-blod. Rør skal blandes over hodet rett etter prøvetakingen (8x, ikke rist). Prøver fra hepariniserte personer må ikke brukes (se Forstyrrende substanser plasma og Forstyrrende substanser fullblod nedenfor). Oppbevaring av prøver For plasma skal fullblod separeres i plasma og cellekomponenter ved sentrifugering i 20 minutter ved x g innen 6 timer. Det isolerte plasmaet må overføres til sterile polypropylenrør. Analysefølsomheten kan reduseres hvis du fryser prøver som rutine eller lagrer dem over lengre tid. Transport av prøver Prøvematerialer skal transporteres i en uknuselig transportbeholder som prinsipp. Dermed kan en potensiell infeksjonsfare på grunn av en prøvelekkasje unngås. Prøvene skal transporteres ved å følge de lokale og nasjonale instruksjonene for transport av sykdomsfremkallende materiale.* Prøvene skal sendes innen 6 timer. Det anbefales ikke å oppbevare prøvene der de har blitt tatt. Det er mulig å sende prøvene med post ved å følge de lovfestede instruksjonene for transport av sykdomsfremkallene materiale. Vi anbefaler prøvetransport via kurér. Blodprøvene skal sendes nedkjølt (2 8 C) og det separerte plasmaet dypfrossent ( 15 til 30 C). Forstyrrende substanser plasma Forhøyede nivåer av albumin ( 4 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) og and lipider ( 1 g/dl triglycerid) og hemolytiske prøver ( 2 g/dl hemoglobin) har ingen innvirkning på systemet. Heparin påvirker PCR. Prøver som har blitt tatt i rør som inneholder heparin som antikoagulant, skal ikke brukes. Og prøver fra hepariniserte pasienter skal ikke brukes. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 22 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

23 Forstyrrende substanser fullblod Forhøyede nivåer av bilirubin ( 30 mg/dl), lipider ( 1 g/dl triglycerid) og humant genom-dna ( 3 μg/ml) har ingen innvirkning på systemet. Heparin påvirker PCR. Prøver som har blitt tatt i rør som inneholder heparin som antikoagulant, skal ikke brukes. Og prøver fra hepariniserte pasienter skal ikke brukes. Komme i gang på QIAsymphony SP/AS-instrumentene Lukk alle skuffer og lokk. Slå på QIAsymphony SP/AS-instrumentene og vent inntil skjermen Sample Preparation (Prøveklargjøring) vises og initialiseringsprosedyren er fullført. Logg inn på instrumentet (skuffer vil låses opp). Laste reagenspatroner (RC) inn i Reagents and Consumables -skuffen Reagenser for rensing av nukleinsyrer finnes i en innovativ reagenspatron (RC) (se figur 7). Hvert kar i reagenspatronen (RC) inneholder en spesiell reagens, slik som magnetiske partikler, lysebuffer, vaskebuffer eller elusjonsbuffer. Delvis brukte reagenspatroner (RC) kan lukkes igjen med gjenbrukbare tetningsstrimler for senere bruk, noe som forhindrer oppsamling av avfall på grunn av resterende reagenser på slutten av renseprosedyren. Stikklokk (PL) Enzymstativ (ER) Gjenbrukstetningsstrimmel Magnetpartikkelkar Åpning for skruelokk fra enzymrør Ramme med reagenskar Reagenspatron Figur 7. QIAsymphony reagenspatron (RC). Reagenspatronen (RC) inneholder alle reagenser som kreves for renseprosedyren. Før prosedyren startes, se til at de magnetiske partiklene er helt resuspendert. Fjern den magnetiske partikkelen gjennom reagenspatronens ramme, roter grundig i minst 3 minutter og sett den på plass i reagenspatronrammen før første bruk. Plasser reagenspatronen (RC) i reagenspatronholderen. Plasser enzymstativet (ER) i reagenspatronholderen. Før bruk av en reagenspatron (RC) for første gang, plasser stikklokket (PL) oppå reagenspatronen (RC) (figur 8). artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

24 Stikklokket (PL) er skarpt. Vær forsiktig ved plassering på reagenspatronen (RC). Se til å plassere stikklokket (PL) på reagenspatronen (RC) i riktig retning. Etter at den magnetiske partikkelens kardeksel er fjernet og enzymstativrørene er åpnet (skruehettene kan lagres i tilegnede åpninger, se figur 7), lastes reagenspatronen (RC) deretter inn i skuffen Reagents and Consumables. Stikklokk (PL) Figur 8. Enkelt arbeidsbenkoppsett med reagenspatroner (RC). Delvis brukte reagenspatroner (RC) kan lagres inntil det er behov for dem igjen, se Lagring (Oppbevaring) i håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen eller håndboken for QIAsymphony DNA. Laste plastdeler inn i Reagents and Consumables -skuffen Prøveklargjøringspatroner, 8-stangdeksler (begge forhåndsoppsatt i enhetsbokser) og engangs filtertupper (200 μl tupper gitt i blå stativer, 1500 μl tupper gitt i svarte stativer) lastes inn i Reagents and Consumables -skuffen. Se til at dekslene på enhetsboksene fjernes før lasting av enheten inn i Reagents and Consumables -skuffen. Tupper har filtre for å bidra til å forhindre krysskontaminering. Tuppstativåpninger på QIAsymphony SP-arbeidsbenken kan fylles med begge tuppstativtyper. QIAsymphony SP vil identifisere typen tupper som lastes under inventarskanningen. Ikke fyll på tuppstativer eller enhetsesker for prøveklargjøringspatroner eller 8-stangdeksler manuelt før en ny protokollkjøring startes. QIAsymphony SP kan bruke delvis brukte tuppstativer og enhetsesker. 24 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

25 Laste Waste -skuffen Prøveklargjøringspatroner og 8-stangdeksler som brukes under en kjøring er forhåndsplassert i tomme enhetsesker i Waste -skuffen. Se til at Waste - skuffen inneholder tilstrekkelig med tomme enhetsesker for plastavfall som genereres under protokollkjøringen. Se til at dekslene på enhetsboksene fjernes før lasting av enheten inn i Waste -skuffen. Hvis du bruker 8-stangdekselesker til å samle brukte prøveklargjøringspatroner og 8-stangdeksler, sikre at eskeavstandsstykket har blitt fjernet. En pose for brukte filtertupper må festes til frontsiden av Waste -skuffen. Tilstedeværelsen av en tuppdeponeringspose kontrolleres ikke av systemet. Kontroller at tuppdeponeringsposen sitter ordentlig fast før en protokollkjøring startes. For mer informasjon se brukerhåndbøkene som medfølger instrumentet. Tøm tupposen etter at maksimalt 96 prøver har blitt behandlet for å unngå tuppfastkjøring. En avfallsbeholder samler væskeavfall som genereres under renseprosedyren. Waste -skuffen kan kun lukkes hvis avfallsbeholderen er på plass. Bortskaff væskeavfallet ifølge de lokale sikkerhets- og miljøforskriftene. Ikke autoklaver den fylte avfallsflasken. Tøm avfallsflasken etter at maksimalt 96 prøver har blitt behandlet. Laste Eluate -skuffen Laste det nødvendige elusjonsstativet inn i Eluate -skuffen. Bruk Elution slot 1 (Elusjonsåpning 1) med tilhørende kjøleadapter. For integrert operasjon plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning 1. Inventarskanning Før du starter en kjøring kontrollerer instrumentet at det er lastet en tilstrekkelig mengde forbruksvarer for de ventende omgangene i de tilhørende skuffene. Klargjøring av prøvematerialer QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet egner seg til bruk med humane plasmaprøver, og QIAsymphony DNA Mini-settet egner seg til bruk med humane fullblodprøver. Forhindre dannelse av skum i eller på prøvene. Prøver skal ekvilibreres til romtemperatur (15 25 C) før kjøringen startes. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

26 Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver Bærer-RNA (CARRIER) må brukes ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet. For å klargjøre bærer-rna-lagerløsningen (CARRIER), tilfør 1350 μl Buffer AVE (AVE) (leveres i 2 ml flasker) til røret som inneholder 1350 μg lyofilisert bærer- RNA (CARRIER) for å oppnå en løsning på 1 μg/μl. Oppløs bærer-rna (CARRIER) grundig, del den inn i alikvoter med praktisk størrelse og oppbevar ved 2 8 C i inntil 2 uker. Kalkulere mengden av bærer-rna-blanding (CARRIER) per rør Minste mengde av bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding må inkludere tilstrekkelig ekstra mengde for å ta vurdering for væsketap i løpet av pipettering og fordampning. Se tabell 2 for volumer som skal brukes til analyse med artus EBV QS-RGQ-settet. Rør som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- og interne kontrollblandinger er plassert i en rørbærer. Rørbæreren som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding(er) er plassert i åpning A på prøveskuffen. Inntil 8 rør av blandingen kan brukes per omgang og opptil 24 rør kan brukes per kjøring av 4 omganger. Bruke en intern kontroll En intern kontroll (EBV RG IC) leveres med artus EBV QS-RGQ-settet. Dette gjør det mulig for brukeren å både kontrollere DNA-isolasjonsprosedyren og kontrollere for mulig PCR-inhibering. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kjøring på Rotor-Gene Q (se Fleranalysekjøringer, på side 28), bruk CMV IC, som er inkludert i artus CMV QS-RGQ-settet (QIAGEN kat.nr ), for alle prøver og ikke EBV RG IC. Den samme CMV IC skal også brukes til analyseoppsett av PCRkontrollene (trinn 13 i analyseoppsettsprotokollen på side 40). Ikke bruk en CMV IC med et annet lotnummer. Bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet eller QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med artus EBV QS-RGQ-settet krever introduksjon av den interne kontrollen (EBV RG IC eller CMV IC) i renseprosedyren for å overvåke effektiviteten på prøveklargjøringen og downstream-analysen. For plasmaprøver må interne kontroller tilføres med bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding, og den totale mengden på den interne kontroll bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandingen forblir 120 μl. 26 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

27 For fullblodprøver må de interne kontrollene fortynnes i Buffer ATE. Et totalt volum på 60 μl intern kontrol Buffer ATE-blanding tilsettes per prøve. For denne applikasjonen tilsettes den interne kontrollen til isolasjonen slik som vist på tabell 2. Dette representerer tilsetting av intern kontroll til isolasjonen i et forhold på 0,1 μl per 1 μl elusjonsvolum. Vi anbefaler å klargjøre ferske blandinger for hver kjøring rett før bruk. Tabell 2. Klargjøring av intern kontrollbærer-rna (CARRIER) Plasmaprøver Fullblodprøver Komponent Volum (μl) Volum (μl) Lager bærer-rna (CARRIER) 5 0 Intern kontroll* 9 9 Buffer AVE Buffer ATE 0 51 Endelig volum per prøve (ekskludert dødvolum) Totalt volum for n prøver (n x 120) (n x 60) * Kalkuleringen av mengden intern kontroll er basert på de innledende elusjonsvolumene (90 μl). Ekstra tomt volum avhenger av typen prøverør som brukes. Ikke fyll mer enn 1,92 ml (tilsvarer maksimalt 13 eller 26 prøver; dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Intern kontrollblanding som tilsvarer 3 ekstra prøver (dvs. 360 μl) kreves (dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Intern kontrollblanding som tilsvarer 4 ekstra prøver (dvs. 480 μl) kreves (dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Analysekontrollsett og analyseparametersett Analysekontrollsett er kombinasjonen av en protokoll pluss ekstra parametre, slik som intern kontroll, for prøverensing på QIAsymphony SP. Et standard analysekontrollsett er forhåndsinstallert for hver protokoll. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

28 Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kjøring på Rotor-Gene Q (se Fleranalysekjøringer nedenfor), bruk riktig CM-analysekontrollsett for prøverensningen. Analyseparametersett er kombinasjonen av en analysedefinisjon med ekstra definerte parametre, slik som replikattelling og antall analysestandarder for analyseoppsett på QIAsymphony AS. Fleranalysekjøringer I noen tilfeller er det mulig å analysere én enkelt prøve for mer enn ett patogen i samme PCR innenfor QIASymphony RGQ-arbeidsflyten. Dette kalles en fleranalysekjøring. Flere krav må oppfylles for en fleranalysekjøring. artus EBV QS-RGQ-settet kan brukes med artus CMV QS-RGQ-settet (kat.nr ) i en fleranalysekjøring hvis de følgende kravene er oppfylt. Prøveklargjøring på QIAsymphony SP For rensingen av prøver som skal testes for CMV og EBV ved bruk av samme eluat, bruk CMV IC, som er inkludert i artus CMV QS-RGQ-settet, for alle prøver og ikke EBV RG IC. Bruk det passende CMV analysekontrollsettet for prøverensingen. Analyseoppsett på QIAsymphony AS For passende kvantifisering, samt gyldig informasjon som gis av den interne kontrollen, må den interne kontrollen for oppsett av begge analysene korrespondere med den som brukes for prøveklargjøringen (CMV IC). Bruk en CMV IC fra samme lot for både prøveklargjøring og analyseoppsett av PCRkontrollene (trinn 13 i analyseoppsettsprotokollen på side 40). Ikke bruk en CMV IC med et annet lotnummer. PCR på Rotor-Gene Q På grunn av forskjeller i fluorescensintensiteter ved bruk av 2 ulike analyser i en fleranalysekjøring, er det nødvendig å utføre en økningskalibrering for hvert artus påvisningssystem separat før PCR-kjøringen påbegynnes (trinn 8 15 i PCR-protokollen, side 48 51). 28 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

29 Resultater for nukleinsyrer Eluater som er klargjort med bærer-rna (CARRIER) kan inneholde mye mer bærer-rna (CARRIER) enn målnukleinsyrer. Vi anbefaler bruk av kvantitative amplifiseringsmetoder for å bestemme resultater. Oppbevaring av nukleinsyrer For kortsiktig oppbevaring på opptil 24 timer, anbefaler vi å oppbevare rensede nukleinsyrer ved 2 8 ºC. For langsiktig oppbevaring på over 24 timer, anbefaler vi at oppbevaringen skjer ved 20 ºC. Stille inn terskelen for PCR-analysen De optimale terskelinnstillingene for en gitt kombinasjon av Rotor-Gene Q- instrumentet og artus QS-RGQ-settet skal stilles inn empirisk ved å teste hver enkelt kombinasjon siden det er en relativ verdi avhengig av den helhetlige diagnostiske arbeidsflyten. Som et startpunkt kan terskelen stilles inn ved en foreløpig verdi på 0,04 for analysen av den første PCR-kjøringen, men denne verdien skal fininnstilles i en sammenlignbar analyse av de neste kjøringene i arbeidsflyten. Terskelen skal stilles inn manuelt rett over bakgrunnssignalet for de negative kontrollene og de negative prøvene. Middelterskelverdien som kalkuleres fra disse eksperimentene vil mest sannsynlig fungere for flertallet av fremtidige kjøringer, men brukeren skal likevel gjennomgå den genererte terskelverdien ved regelmessige intervaller. Terskelverdien vil vanligvis ligge i området 0,03 0,05 og skal rundes av til maksimalt tre desimalplasser. Kvantitering Kvantiteringsstandardene (EBV RG QS 1 4) i artus EBV QS-RGQ-settet behandles som tidligere rensede prøver, og det samme volumet brukes (20 μl). For å opprette en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter skal alle 4 kvantiteringsstandardene brukes og defineres i dialogboksen Rediger prøver på Rotor-Gene Q-instrumentet som standarder med de spesifiserte konsentrasjonene (se instrumentets brukerhåndbok). Kvantiteringsstandardene defineres som kopier/μl. Den følgende ligningen må brukes for å konvertere de verdiene som fastsettes ved bruk av standardkurven til kopier/ml av prøvemateriale: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/μl) x innledende elusjonsvolum (90 μl)* Prøvevolum (ml) * Kalkuleringen er basert på de innledende elusjonsvolumene (90 μl). artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

30 Som en prinsippsak skal det innledende prøvevolumet oppgis i ligningen ovenfor. Dette må betraktes når prøvevolumet har blitt endret forut for nukleinsyreekstraheringen (f.eks. redusere volumet gjennom sentrifugering eller øking av volumet ved å legge til volumet som kreves for isolasjonen). 30 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

31 Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet (QIAGEN, kat.nr ) er validert for virus-dna-rensing fra humant plasma, og QIAsymphony DNA Minisettet (QIAGEN, kat.nr ) er validert for virus-dna-rensing fra humant fullblod for bruk med artus EBV QS-RGQ-settet. Generell informasjon om protokollene vises i tabell 3. Tabell 3. Generell protokollinformasjon Sett QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midisett QIAsymphony DNA Mini-sett Prøvemateriale Plasma Fullblod Prøvevolum (inkludert for stort volum) 1200 μl 300 μl Protokollnavn Cellfree1000_V4_DSP* VirusBlood200_V4* Standard analyse kontrollsett ACS_Cellfree1000_V4_ DSP artus EBV* Elusjonsvolum 60 μl 60 μl ACS_VirusBlood200_ V4_ artus_ebv* Nødvendig programvareversjon Versjon 3.1 eller høyere Versjon 3.5 eller høyere * V4 eller høyere, slik som det kreves av den brukte programvareversjonen. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, bruk riktig CMVanalysekontrollsett for prøverensing (ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV eller ACS_Virus_Blood200_V4_artus_CMV; V4 eller høyere). Viktige poeng før du starter Sørg for at du er kjent med driften av QIAsymphony SP/AS-instrumentene. Se brukerhåndbøkene som medfølger instrumentene for driftsinstruksjoner. Før prosedyren begynnes, les Viktig opplysninger side Før bruk av en reagenspatron (RC) for første gang, kontroller at bufrene QSL2 og QSB1i patronen (RC) ikke inneholder noen utfelling. Ved behov, flytt karene som inneholder bufrene QSL2 og QSB1 fra reagenspatronen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med ekstra risting for å løse opp utfellingen. Se til å sette på plass karene i de riktige posisjonene. Hvis artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

32 reagenspatronen (RC) allerede er hullet, se til at karene er forseglet med gjenbrukstetningsstrimler og inkuber hele reagenspatronen (RC) i 30 minutter ved 37 C og rist av og til i et vannbad.* Prøv å unngå kraftig risting av reagenspatronen (RC), ellers kan det dannes skum, som kan føre til problemer med væskenivådeteksjon. Alle komponenter for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet har vist seg å være stabile om bord QIAsymphony SP/AS-instrumenter i minst den normale tiden som kreves for å behandle 96 prøver. Ting du skal gjøre før du starter Klargjør alle nødvendige blandinger, inkludert blandinger om inneholder bærer-rna (CARRIER) og interne kontroller rett før start. For mer informasjon, se Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver, side 26, og Bruke en intern kontroll, side 26. Se til at stikklokket (PL) plasseres på reagenspatronen (RC) og at lokket på magnetpartikkelkaret har blitt fjernet, eller ved bruk av en delvis brukt reagenspatron (RC), se til at gjenbrukstetningsstrimlene har blitt fjernet. Før prosedyren startes, se til at de magnetiske partiklene er helt resuspendert. Roter karet som inneholder de magnetiske partiklene kraftig i minst 3 minutter før første bruk. Før lasting av reagenspatronen (RC), fjern dekselet fra karet ved som inneholder de magnetiske partiklene, og åpne enzymrørene. Se til at enzymstativet har blitt ekvilibrert til romtemperatur (15 25 C). Se til at stikklokket (PL) plasseres på reagenspatronen (RC), eller ved bruk av en delvis brukt reagenspatron, se til at gjenbrukstetningsstrimlene har blitt fjernet. Hvis prøvene er strekkodet, orienter prøvene i rørbæreren slik at strekkodene vender mot strekkodeleseren innenfor Sample -skuffen på venstre side av QIAsymphony SP. Prosedyre 1. Lukk alle skuffer og hetter på QIAsymphony SP/AS-instrumentene. 2. Slå på instrumentene og vent inntil skjermen Sample Preparation vises og initialiseringsprosedyren er fullført. Strømbryteren befinner seg nederst i venstre hjørne på QIAsymphony SP. 3. Logg inn på instrumentene. * Pass på at instrumentene er sjekket, vedlikeholdt og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens instruksjoner. 32 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

33 4. Se til at Waste -skuffen er klargjort riktig (se tabell 4), og utfør en inventarskanning av Waste -skuffen, inkludert tupprennen og væskeavfall. Skift tuppdeponeringsposen ved behov. Tabell 4. Klargjøring av Waste -skuffen Enhetsboksholder 1 4 Avfallsposeholder Holder for væskeavfallsflaske Tomme enhetsbokser Bruke avfallsposer Tøm og installer væskeavfallsflasken 5. Laste det nødvendige elusjonsstativet inn i Eluate -skuffen. Bruk kun Elution slot 1 med tilhørende kjøleadapter (kjøleadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ). For integrert operasjon plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning Laste nødvendig(e) reagenspatron(er) (RC) og forbruksvarer inn i Reagents and Consumables -skuffen (se tabell 5 og 6). Antall filterspisser som gis kan være forskjellig fra det antallet som vises i berøringsskjermen, avhengig av innstillingene. Tabell 5. Klargjøre skuffen Reagents and Consumables RC-posisjon 1 og 2 Spisstativholder posisjon 1 4 Spisstativholder posisjon 5 18 Enhetsbokshold erposisjon 1 3 Enhetsbokshold er posisjon 4 Last 1 reagenspatron (RC) for opptil 48 plasmaprøver eller 2 nye reagenspatroner (RC) for opptil 96 plasmaprøver ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet Last 1 reagenspatron (RC) for opptil 96 fullblodprøver ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet Last tilstrekkelige stativer med engangsfiltertupper, 200 μl (se tabell 6) Last tilstrekkelige stativer med engangsfiltertupper, 1500 μl (se tabell 6) Last 3 enhetsbokser som inneholder prøveklargjøringspatroner Last 1 enhetsboks som inneholder 8- stangdeksler artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

34 Tabell 6. Nødvendig plastvare for 1 4 prøvekjøringer En omgang, 24 prøver* To omganger, 48 prøver* Tre omganger, 72 prøver* Plasmaprøver (QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett) Engangsfilterspisser, 200 μl Engangsfilterspisser, 1500 μl Prøveklargjøringspatroner Fire omganger, 96 prøver* stangdeksler Fullblodprøver (QIAsymphony DNA Mini-sett) Engangsfilterspisser, μl Engangsfilterspisser, 1500 μl Prøveklargjøringspatroner stangdeksler * Bruk av mer enn ett internt kontrollrør per omgang og utføring av mer enn én inventarskanning krever ekstra engangsfilterspisser. Det finnes 32 filterspisser/spisstativ. Antall nødvendige filterspisser inkluderer filterspisser for 1 inventarskanning per reagenspatron. Det finnes 28 prøveklargjøringspatroner/enhetsboks. Det finnes tolv 8-stangdeksler/enhetsboks. 7. Utfør en inventarskanning av Reagents and Consumables -skuffen 8. Plasser prøvene inn i den passende rørbæreren og last dem inn i Sample -skuffen (se tabell 7). 34 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

35 Tabell 7. Last prøver inn i Sample -skuffen Prøvetype Plasma Fullblod Prøvevolum (inkludert for stort volum) Prøverør 1200 μl 300 μl Mikrorør 2,0 ml type H eller mikrorør 2,0 ml type I (Sarstedt, kat.nr og ). Innlegg Rørinnlegg 3B (kat.nr ) 9. Plasser rør(ene) som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandingen (for plasmaprøver) eller Buffer ATE (for fullblodprøver), inkludert intern kontroll, inn i rørbæreren og last den inn i åpning A på Sample -skuffen. For mer informasjon, se Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver, side 26, og Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandinger for plasmaprøver, side 26. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kjøring på Rotor- Gene Q (se Fleranalysekjøringer, på side 28), bruk CMV IC, som er inkludert i artus CMV QS-RGQ-settet (QIAGEN kat.nr ), for alle prøver og ikke EBV RG IC. 10. Bruk berøringsskjermen og tast inn den nødvendige informasjonen for hver prøveomgang som skal behandles. Legg inn følgende informasjon: Prøveinformasjon Protokollen som skal kjøres (velg analysekontrollsett ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus EBV * for plasma eller ACS_VirusBlood200_V4_artus_EBV * for fullblod fra kategorien artus QS-RGQ ) Elusjonsvolum 60 μl (se tabell 8) og utgangsposisjon slot 1 (åpning 1) Røret (rørene) som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandingen (for plasmaprøver) eller Buffer ATE (for fullblodprøver), inkludert intern kontroll (velg IC-navnet ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus EBV * for plasma eller ACS_VirusBlood200_V4_artus_EBV * for fullblod) * V4 eller høyere, slik som det kreves av den brukte programvareversjonen. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, bruk riktig CMV ICnavn (ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV eller ACS_Virus_Blood200_V4_artus_CMV; V4 eller høyere). artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

36 Etter at informasjonen om omgangen har blitt tastet inn, endres statusen fra LOADED (LASTET) til QUEUED (VENTENDE). Straks etter at en omgang er satt på venting, vises knappen Run (Kjør). Tabell 8. Forhåndsvalgt elusjonsvolum Forhåndsvalgt elusjonsvolum (μl)* Innledende elusjonsvolum (μl) * Elusjonsvolumet som er forhåndsvalgt for prokollen. Dette er minimum tilgjengelig eluatvolum i det endelige elusjonsrøret. Det innledende volumet av elusjonsløsning som er nødvendig for å sikre at det faktiske eluatvolumet er det samme som det forhåndsvalgte volumet. 11. Trykk på knappen Run for å starte renseprosedyren. Alle behandlingstrinn er helautomatiserte. På slutten av protokollkjøringen endres statusen til omgangen fra RUNNING (KJØRER) til COMPLETED (FULLFØRT). 12. Når prøveprosesseringen er fullstendig skal elusjonsstativet enten fjernes manuelt fra skuffen Eluate (uavhengig operasjon) eller utfør direkte overføring av elusjonsstativet til QIAsymphony AS via overføringsmodulen (integrert operasjon). For uavhengig operasjon, fjern elusjonsstativet fra åpningen på berøringsskjermen og åpne deretter skuffen Eluate og ta ut elusjonsstativet manuelt. For integrert operasjon trykk på Transfer for å overføre elusjonsstativet fra åpning 1 på QIAsymphony SP til åpning 2 på QIAsymphony AS. Vi anbefaler å umiddelbart ( 60 min) fortsette med analyseoppsett på QIAsymphony AS etter at kjøringen er fullført. Avhengig av temperatur og fuktighet kan eluater som etterlates i QIAsymphony SP etter kjøringen er fullført utsettes for kondensering eller fordampning. For kortsiktig oppbevaring på opptil 24 timer, anbefaler vi å oppbevare rensede nukleinsyrer ved 2 8 ºC. For langsiktig oppbevaring på over 24 timer, anbefaler vi oppbevaring av nukleinsyrer ved 20 ºC. Resultatfiler genereres for hver elusjonsstativ. 36 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

37 13. Hvis en reagenspatron (RC) kun er delvis brukt, forsegle den med de medfølgende gjenbrukstetningsstrimlene og lukk rørene som inneholder proteinase K med skruehetter umiddelbart etter slutten av protokollkjøringen for å unngå fordampning. For mer informasjon om oppbevaring av delvis brukte reagenspatroner (RC), se Oppbevaring i håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen eller håndboken for QIAsymphony DNA. 14. Kast brukte prøverør, plater og avfall ifølge de lokale sikkerhetsreguleringene. Se håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen og håndboken for QIAsymphony DNA for sikkerhetsinformasjon. 15. Lukk instrumentskuffene og fortsett med analyseoppsett på QIAsymphony AS (side 38). 16. Rengjør QIAsymphony SP i løpet av analyseoppsettet på QIAsymphony AS eller senere. For integrert drift, rengjør allel instrumenter på slutten av den fullførte arbeidsflyten. Følg vedlikeholdsinstruksjonene i brukerhåndboken for QIAsymphony SP/AS Generell beskrivelse. Se til å utføre vedlikehold regelmessig for å minimere faren for krysskontaminering. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

38 Protokoll: Analyseoppsett på QIAsymphony AS QIAsymphony AS utfører et analyseoppsett for reaksjoner. Prøver som er behandlet på QIAsymphony SP kan overføres automatisk til QIAsymphony AS (integrert operasjon). For ekstra fleksibilitet kan QIAsymphony SP og AS også opereres uavhengig.* Detaljer for analysen vises i tabell 9. Tabell 9. Analyseparametre ved bruk av artus EBV QS-RGQ-settet Prosessinformasjon Prøveinnmatingsmateriale Hovedblandevolum Malvolum Detaljer Eluat 30 μl 20 μl Antall reaksjoner 6 24 Kjøretid Nødvendig programvareversjon For 6 reaksjoner: Ca. 9 minutter For 72 reaksjoner: Ca. 35 minutter Versjon 3.1 eller høyere For analyseoppsett for EBV kan inntil 216 (9 x 24) analyser settes opp i én kjøring på QIAsymphony AS. Analyser ble kjørt med hver reaksjon unikt (ingen replikater) og hovedblandingen ble klargjort av instrumentet for en analysekjøring inkludert én mal, 4 analysestandarder og én ingen malkontroll (NTC). Viktige poeng før du starter Før prosedyren begynnes, les Viktig opplysninger side Reagensvolumene er optimalisert for 24 reaksjoner per sett per kjøring. Før hver bruk, må alle reagensene tines fullstendig, blandes (ved gjentatt opp og ned pipettering eller gjennom hurtig vortex) og sentrifugeres i minst 3 s ved 6800 x g. Unngå skumming av reagenser. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, se til at CMV IC, fra artus CMV QS-RGQ-settet ble brukt i renseprosessen. Bruk en CMV IC fra samme lot for både prøveklargjøring og analyseoppsett av PCR-kontrollene (trinn 0). Ikke bruk en CMV IC med et annet lotnummer. * QIAsymphony SP og AS forblir fysisk tilkoblet i løpet av den uavhengige operasjonen. 38 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

39 Eluater fra prøveklargjøringen og alle komponentene i artus EBV QS-RGQsettet har vist seg å være stabile om bord på instrumentet i minst den normale tiden som kreves for prøverensing for 96 prøver og analyseoppsett for 216 analyser, inkludert inntil 60 min overføringstid fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS og inntil 60 min. overføringstid fra QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q. Arbeid hurtig og hold PCR-reagensene på is eller i kjøleblokken før lasting. Prosedyre 1. Sett inn spissrennen. 2. Kast spissavfallsposen. 3. Sett inn en tom spissavfallspose. 4. Bytt til grensesnittet for analyseoppsett ved å trykke på knappen Switch (Bytt) i statuslinjen. 5. Starte analysedefinisjonsprosessen. For uavhengig drift trykk på New. For integrert drift vil en melding vises og spørre om du skal bruke elusjonsstativet som et prøvestativ. Trykk på Yes for å bekrefte. Skjermbildene på berøringsskjermen leder brukekren gjennom analysedefinisjonsprosessen trinn-for-trinn. 6. Tilordne prøvestativet til en Sample -åpning ved å velge stativfilen fra den respektive kjøringen på QIAsymphony SP. Hvis elusjonsstativet automatisk har blitt overført til QIAsymphony AS, vil stativfilen automatisk tilordnes og skjermbildet Sample Rack(s) (Prøvestativ(er)) for brukergrensesnittet for analyseoppsett vil allerede være utfylt. 7. Kontroller prøvestativ for prøve, EC+- og EC -posisjoner, prøve-ider og volumer. 8. Velg analyseparametersettet som skal brukes i kjøringen (se tabell 10). artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

40 Tabell 10. Analyseparametre ved bruk av artus EBV QS-RGQ-settet Utgivelsesinformasjon Kategori Analyseparametersett Detaljer artus QS-RGQ artus EBV QS-RGQ_V1* * V1 eller høyere, slik som det kreves av den brukte programvareversjonen. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme eluat i samme PCR, må både artus EBV QS-RGQ_V1 og artus CMV QS-RGQ_V1 analyseparametersettene (V1 eller høyere) tilordnes prøvene. 9. Tilordne analyseparametersett til prøver. Analyseparametersettet definerer parametrene for analyseoppsettet. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme eluat i samme PCR, må både artus EBV QS-RGQ_V1 og artus CMV QS-RGQ_V1 analyseparametersettene tilordnes prøvene. 10. Definer analysestativet (-stativene). På dette trinnet kan analysestativ(er) lastes på Analyse -åpningen(e) (se tabell 12). 11. Kontroller temperaturen på kjøleposisjonene. Når målkjøletemperaturene er nådd, vil åpningene vises i grønt. 12. Kombiner alle rørene på EBV RG Master i et enkelt sett i ett rør. Viskøse reagenser kan være vanskelige å håndtere med manuelle pipetter. Se til å overføre hele volumet til EBV RG Master til røret. 13. Fyll hvert reagensrør med det nødvendige volumet av riktig reagens ifølge lasteinformasjonen som gis av instrumentets programvare. Før hver bruk, må alle reagensene tines fullstendig, blandes (ved gjentatt opp og ned pipettering eller gjennom hurtig vortex) og sentrifugeres i minst 3 s ved 6800 x g. Unngå bobler eller skumming, da dette kan forårsake påvisningsfeil. Arbeid hurtig og hold PCR-komponenter på is eller i kjøleblokken før lasting. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, se til at CMV IC, fra artus CMV QS-RGQ-settet ble brukt i renseprosessen. Bruk en CMV IC fra samme lot for både prøveklargjøring og analyseoppsett av PCR-kontrollene. Ikke bruk en CMV IC med et annet lotnummer. V1 eller høyere, slik som det kreves av den brukte programvareversjonen. 40 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

41 14. Plasser reagensrørene, uten lokk inn i de passende posisjonene på de forhåndskjølte adapterne for reagenser (se tabell 11). Tabell 11. Forbruksvarer Forbruksvarer Strimmelrør og lokk, 0,1 ml (250) Rør, konisk, 2 ml, Qsym AS (500)* Rør, konisk, 5 ml, Qsym AS (500)* Reagensflasker, 30 ml, Qsym AS (50)* Elusjonsmikrorør CL (24 x 96) Navn på berøringsskjermen QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR For bruk med adapter/reagensholder RG strimmelrør 72 QS Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 QS Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 QS Reagensholder 2 QS Elution Microtube Rack QS * For hovedblandingskomponenter, systemklargjort hovedblander, analysestandarder og analysekontroller. Alternativt kan Sarstedt-rørene som beskrives på side 20 brukes. Suffikset (m) i beøringsskjermen indikerer at væskenivåkalkulasjoner for det respektive røret har blitt optimalisert for reagenser som danner en konkav meniscus. 15. Åpne skuffene Eluate and Reagents og Assays. 16. Last den klargjorte reagensadapteren inn i den passende åpningen. Oppgi en settstrekkode for analysen gjennom List view (Listevisning) for skjermen Loading Reagents (Laster reagenser). 17. Hvis ikke det er gjort allerede, plasser strimmelrørene inn i de forhåndskjølte RG-strimmelrørene 72 QS-adapter (se tabell 12) og plasser inn i passende åpning(er). artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

42 Tabell 12. Adaptere og reagensholdere Stativ- /reagensholder Nummer nødvendig* Navn Prøvestativ Elution Microtube Rack QS 1 Reagensholdere Reagensholder 1 QS 1 Analysestativer RG strimmelrør 72 QS 1 * Kalkulert for en analysekjøring med 72 reaksjoner. 18. Hvis elusjonsstativet ikke allerede har blitt overført til QIAsymphony AS (se trinn 12 i rensingsprotokollen på side 36), plasser Elution Microtubes CL i den forhåndskjølte Elution Microtube Rack QSadapteren (se tabell 12) og plasser den klargjorte adapteren inn i åpningen som indikert. For uavhengig operasjon, fjern elusjonsstativet fra åpningen på berøringsskjermen og åpne deretter skuffen Eluate og ta ut elusjonsstativet manuelt. 19. Last engangsfilterspisser inn i skuffene Eluate and Reagents og Assays ifølge det nødvendige antallet av hver spisstype (se tabell 13 og 14). Last spisstativene ved å starte med spissåpningene 1, 2 og 3 i skuffen Eluate and Reagents og last deretter spisstativene inn i spissåpningene 7, 8 og 9 i skuffen Assays. Tabell 13. Filterspisser Forbruksvarer Filterspisser, 1500 μl (1024) Filterspisser, 200 μl (1024) Filterspisser, 50 μl (1024) Navn på berøringsskjermen 1500 μl 200 μl 50 μl 42 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

43 Table 14. Forbruk av forbruksvarer* Antall for 24 Antall for 72 Forbruksvare reaksjoner reaksjoner Filterspisser, 1500 μl 4 5 Filterspisser, 200 μl 9 8 Filterspisser, 50 μl Spissavfallsposer 1 1 * Denne tabellen gir eksempler på forbruk av forbruksvarer for en analysekjøring med følgende spesifikasjoner: 19 eller 67 maler, 4 analysestandarder, én NTC (ingen malkontroll), prøver med intern kontroll (IC), hovedblanding klargjort av instrumentet. Filterspissforbruk kan påvirkes av noen prosesser på QIAsymphony AS (f.eks. væskenivåpåvisning). Større antall spisser kreves for en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR. 20. Lukk skuffene Eluate and Reagents og Assays. 21. Ved lukking av hver skuff trykk på Yes for å starte inventarskanningen for hver skuff. Inventarskanningen kontrollerer åpningene, adapterne, filterspissene og spissrennen. Korriger feil ved behov. 22. Trykk på Queue (Kø). Overvåkning av kjølingen starter. 23. Vent inntil målkjøletemperaturene nås. Når målkjøletemperaturene er nådd, vil åpningene vises i grønt. 24. Trykk på Run for å starte kjøringen. 25. Etter at kjøringen er ferdig, trykk på Remove i analyseoppsettskjermen Overview (Oversikt). Åpne skuffen Assays og last av analysestativet (-stativene). 26. Last ned resultat- og cycler-filene. 27. Gå videre til Protokoll: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q, side Utfør det regelmessige vedlikeholdet på QIAsymphony AS i løpet av PCR-kjøringen på Rotor-Gene Q eller senere. For integrert drift, rengjør allel instrumenter på slutten av den fullførte arbeidsflyten. Følg vedlikeholdsinstruksjonene i brukerhåndboken for QIAsymphony SP/AS Generell beskrivelse. Se til å utføre vedlikehold regelmessig for å minimere faren for krysskontaminering. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

44 Protokoll: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q Viktige poeng før du starter Før prosedyren begynnes, les Viktig opplysninger side Ta tid til å bli kjent med Rotor-Gene Q før du starter protokollen. Se instrumentets brukerhåndbok. Se til at alle 4 kvantiteringsstandardene samt minst én negativ kontroll (vann, PCR-klasse) er inkludert per PCR-kjøring. For å generere en standardkurve bruk alle 4 kvantiteringsstandarder som medfølger (EBV RG QS 1 4) for hver PCR-kjøring. Prosedyre 1. Lukk PCR-rørene og plasser dem i 72-brønnsrotoren til Rotor-Gene Q. Sørg for å overføre Rotor-Gene Q 4-strimmelrør i riktig orientering, slik at posisjonsindikasjonene til kjøleadapteren og rotoren samsvarer. Se til at låseringen (tilbehør for Rotor-Geneinstrumentet) plasseres oppå rotoren for å forhindre utilsiktet åpning av rørene i løpet av kjøringen. 2. Overfør cycler-filen fra QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q- datamaskinen. 3. For påvisning av EBV-DNA opprett en temperaturprofil i samsvar med følgende trinn. Stille inn de generelle analyseparametrene Figur 9 11 Innledende aktivering av varmstartsenzymet Figur 12 Forsterkning av DNA (touchdown-pcr) Figur 13 Justere fluorescenskanalfølsomheten Figur Starte kjøringen Figur 21 Alle spesifikasjoner henviser til Rotor-Gene Q-programvareversjon Vennligst finn ytterligere informasjon om programmering av Rotor-Gene Q- instrumentene i instrumentets brukerhåndbok. I illustrasjonene er disse innstillingene innrammet i fet svart. 44 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

45 4. Åpne først Ny kjøringsveiviser -dialogboksen (figur 9). Kryss av i ruten Locking Ring Attached (Låsering vedlagt) og klikk på Next (Neste). Figur 9. Dialgboksen New Run Wizard (Ny kjøringsveiviser). 5. Velg 50 for PCR-reaksjonsvolumet og klikk på Next (figur 10). Figur 10. Stille inn de generelle analyseparametrene. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

46 6. Klikk på knappen Edit Profile (Rediger profil) i neste dialogboks New Run Wizard (figur 11) og programmer temperaturprofilen slik som vist på figur 11 13). Figur 11. Redigere profilen. Figur 12. Innledende aktivering av varmstartsenzymet. 46 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

47 Figur 13. Forsterkning av DNA. Se til å aktivere touchdown-funksjonen i 10 sykluser i glødingstrinnet. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

48 7. Påvisningsområdet for fluorescenskanalene må bestemmes ifølge fluorescensintensitetene i PCR-rørene. Klikk på Gain Optimisation (Øk optimalisering) i dialogboksen New Run Wizard (se figur 11) for å åpne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup (Automatisk økningsoptimaliseringsoppsett). Still kalibreringstemperaturen på 65 for å samsvare med glødningstemperaturen til forsterkningsprogrammet (figur 14). 8. Hvis du utfører analyseoppsett for en enkelt analyse, klikk på Start (figur 14) og fortsett direkte til trinn 16 på side 52. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, fortsett til trinn 8 for å justere den fluorescerende kanalens intensiteter manuelt. 1 2 Figur 14. Justere fluorescenskanalfølsomheten 48 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

49 9. Klikk på Edit (Rediger) (figur 15) for å redigere fluorescenskanalene. 1 Figur 15. Justere fluorescenskanalintensiteten manuelt for hver fluorescenskanal ved ulike rørposisjoner for ulike analyser (CMV og EBV). 10. Still inn rørposisjonen for et rør for første artus-analyse (dvs. CMV). Still inn førposisjonen for alle fluorescenskanaler og klikk på OK (figur 16). 1 2 Figur 16. Stille inn rørposisjon. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

50 11. Klikk på Start for å begynne økningsoptimaliseringen for første artus-analysen (figur 17). 1 Figur 17. Starte økningsoptimaliseringen. 50 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

51 12. Et nytt Running Auto-Gain Optimisation (Kjøre automatisk økningsoptimalisering)-vindu åpnes. Vent inntil Completed (Fullført) vises i dette vinduet (figur 18). Skriv ned de valgte økningsverdiene for begge kanaler og klikk på Close (Lukk) (figur 18) Figur 18. Økningsoptimalisering fullført. Merk økningsverdier (i dette tilfellet 1,33 for begge fluorescenskanaler). 13. Gjenta trinnene 8 12 for en rørposisjon for den andre artusanalysen (f.eks. EBV). 14. Klikk på Edit Gain (Rediger økning) for å redigere økningsverdiene manuelt (figur 19). 1 Figur 19. Redigere økningsverdiene manuelt. 15. Velg den laveste økningsverdien for Cycling Green som er notert i trinn 12 og oppgi denne verdien manuelt i vinduet Gain for Green artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

52 (Økning for grønn) (figur 20). Velg den laveste økningsverdien for Cycling Yellow som er notert i trinn 12 og oppgi denne verdien manuelt i vinduet Gain for Yellow (Økning for gul). 1 2 Figur 20. Legge inn de laveste økningsverdiene manuelt. 16. Økningsverdiene som fastsettes av kanalkalibreringen (eller tilordnes manuelt) lagres automatisk og listes opp i det siste menyvinduet for programmeringsprosedyren (figur 21). Klikk på Start Run (Start kjøring). Figur 21. Starte kjøringen 17. Etter å ha startet kjøringen, importer informasjonen fra cycler-filen ved å klikke på knappen ( Open (Åpne)) eller redigere prøvene manuelt. 18. Analyser dataene etter at kjøringen er ferdig. De følgende resultatene (18a, 18b, og 18c) er mulige. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV ble analysert i samme PCR, se til at prøvene ble analysert separat for CMV og EBV, med korresponderende kvantiteringsstandarder. Ikke definer standarder for ulike 52 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

53 artus PCR-systemer samtidig. Se håndboken for artus CMV QS-RGQ-settet for tolkning av CMV-analyseresultater. I tilfelle fluorescensen økes eller reduseres innledningsvis, må funksjonen Eliminate cycles before (Eliminer sykluser før) justeres opp til første signal. I bestemte tilfeller må funksjonen "Ignore first" (Ignorer første) justeres opp til 10 sykluser. Dette kan være nødvendig hvis baseline-justeringen ikke fører til en homogen baseline som dekker alle signaler, men har fluorescerende signaler spredt over et bredere område. Bruk av Ignore first -funksjonen vil gi pålitelige resultater, sammenlignbare med de med upåvirkede prøver. For teknisk assistanse og mer informasjon vennligst se vårt tekniske supportsenter på eller ring én av QIAGENs tekniske serviceavdelinger eller lokale distributører (se bak på omslaget eller besøk Eksempler på positive og negative PCR-reaksjoner finnes i figur 22 og figur a. Et signal påvises i fluorescenskanalen Cycling Green. Resultatet av analysen er positivt: Prøven inneholder EBV-DNA. I dette tilfellet er påvisningen av et signal i Cycling Yellow-kanalen dispenserbart, siden høye innledende konsentrasjoner av EBV-DNA (positivt signal i Cycling Green-kanalen) kan føre til et redusert eller fraværende fluorescerende signal fra den interne kontrollen i Cycling Yellow-kanalen (konkurranse). 18b. I fluorescenskanalen Cycling Green påvises ikke noe signal. Samtidig vises et signal fra den interne kontrollen i Cycling Yellowkanalen. I prøven er ikke noe EBV-DNA påviselig. Den kan betraktes som negativ. I tilfelle en negativ EBV PCR, utelukker det påviste signalet til den interne kontrollen muligheten for PCR-hemming. 18c. Ikke noe signal påvises i Cycling Green- eller Cycling Yellowkanalen. Det kan ikke konkluderes med noe resultat. Informasjon om feilkilder og løsningen for disse kan du finne i Feilsøkingsveiledning på side 55. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

54 Figur 22. Påvisning av kvantiteringsstandardene (EBV RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: Ingen malkontroll (negativ kontroll). Figur 23. Påvisning av den interne kontrollen (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow med samtidig forsterkning av kvantiteringsstandardene (EBV RG QS 1 4). NTC: Ingen malkontroll (negativ kontroll). 54 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

55 Feilsøkingsveiledning Denne feilsøkingsveiledningen kan være nyttig for å løse problemer som kan oppstå. For mer informasjon se også siden med ofte stilte spørsmål på vårt tekniske supportsenter: Forskerne ved QIAGENs tekniske tjenester er alltid klare til å besvare alle spørsmål du måtte ha enten om informasjonen og protokollene i denne håndboken eller prøve- og analyseteknologi (for kontaktinformasjon, se bak på omslaget eller besøk Generell håndtering Feilmelding vises på berøringsskjermen Kommentarer og forslag Hvis det vises en feilmelding under en protokollkjøring, se brukerhåndbøkene som medfølger instrumentene. Presipitat i reagenskaret på åpnet patron av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet eller QIAsymphony DNA Mini-settet a) Bufferfordampning For stor fordampning kan føre til økt saltkonsentrasjon eller reduserte alkoholkonsentrasjoner i bufrene. Kast reagenspatronen (RC). Se til å forsegle bufferkarene til delvis brukte reagenspatroner (RC) med gjenbrukstetningsstrimlene når de ikke brukes til rensing. b) Oppbevaring av reagenspatronen (RC) Oppbevaring av reagenspatron (RC) under 15 C kan føre til danning av utfellinger. Ved behov, flytt karene som inneholder bufrene QSL2 og QSB1 fra reagenspatronen (RC) og inkuber i vannbad* ved 37 C i 30 min. og rist av og til for å løse opp utfelling. Se til å sette på plass karene i de riktige posisjonene. Hvis reagenspatronen (RC) allerede er hullet, se til at karene er forseglet med gjenbrukstetningsstrimler og inkuber hele reagenspatronen (RC) i vannbad* ved 37 C i 30 min. og rist av og til. * Pass på at instrumentene er sjekket, vedlikeholdt og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens instruksjoner. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

56 Lave resultater for nukleinsyrer a) De magnetiske partiklene ble ikke helt resuspendert Kommentarer og forslag Før prosedyren startes, se til at de magnetiske partiklene er helt resuspendert. Roter i minst 3 min. før bruk. b) Frosne prøver ble ikke blandet tilstrekkelig etter opptining c) Bærer-RNA (CARRIER) ikke tilsatt d) Nedbrutte nukleinsyrer e) Ufullstendig prøvelysering f) Tilstopping av pipettetuppen på grunn av uoppløselig materiale Tin opp frosne prøver med mild omrøring for å sikre grundig blanding. Rekonstituer bærer-rna (CARRIER) i Buffer AVE (AVE) og bland med passende mengde av Buffer AVE (AVE), slik som beskrevet i Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver som starterpå side 26. Gjenta renseprosedyren med nye prøver. Prøvene ble oppbevart på feil måte eller utsatt for for mange fryse-tine-sykluser. Gjenta renseprosedyren med nye prøver. Kontroller at Buffer QSL2 og QSB1 ikke inneholder utfellinger før bruk. Ved behov, flytt karene som inneholder bufrene QSL1 og QSB1 fra reagenspatronen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med ekstra risting for å løse opp utfellingen. Hvis reagenspatronen (RC) allerede er hullet, se til at karene er forseglet med gjenbrukstetningsstrimler og inkuber hele reagenspatronen (RC) i 30 minutter ved 37 C og rist av og til i et vannbad.* Uoppløselig materiale ble ikke fjernet fra prøven før start av QIAsymphony renseprosedyren. For å fjerne uoppløselig materiale for virusapplikasjoner, sentrifuger prøven ved 3000 x g i 1 min. og overfør supernatanten til et nytt prøverør. * Pass på at instrumentene er sjekket, vedlikeholdt og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens instruksjoner. 56 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

57 Kommentarer og forslag QIAsymphony AS påviser utilstrekkelig Master Ikke alle EBV RG Master overført til røret Kombiner alle rørene på EBV RG Master i et enkelt sett i ett rør. Viskøse reagenser kan være vanskelige å håndtere med manuelle pipetter. Se til å overføre hele volumet til EBV RG Master til røret. For viskøse reagenser anbefaler vi å aspirere et ekstra volum på 5 % ved bruk av manuelle pipetter (f.eks. justere pipetten til 840 μl for et 800 μl volum). Alternativt, etter å ha dispensert væsken langsomt og utført en utblåsning ved målrørets vegg, fjern spissen fra væsken, frigjør pipettestempelet og vent i ytterligere 10 s. Restvæsken vil strømme ned i spissen og kan blåses ut ved å trykke pipettestempelet enda en gang. Bruken av PCR-klassefilterspissene som er merket som lav bevaring, kan forbedre væskegjenvinningen. Ikke noe signal med positive kontroller (EBV RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green a) Den valgte fluorescenskanalen for PCR-dataanalyse oppfyller ikke kravene i protokollen For dataanalyse velg den fluorescerende kanalen Cycling Green for den analytiske EBV PCR og den fluorescerende kanalen Cycling Yellow for intern kontroll-pcr. b) Ukorrekt programmering av temperaturprofilen til Rotor-Geneinstrumentet c) Feil konfigurasjon av PCR Sammenlign temperaturprofilen med protokollen. Se Protokoll: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q, side 44. Se til at analyseoppsettet ble utført på riktig måte og at det riktige analyseparametersettet ble brukt. Gjenta PCR ved behov. Se Protokoll: Analyseoppsett på QIAsymphony AS, side 38. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

58 d) Oppbevaringsforholdene for én eller flere settkomponenter overholdt ikke instruksjonene som ble gitt i Lagring (side 6) e) artus EBV QS-RGQsettet ble utløpt Kommentarer og forslag Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se settetiketten) på reagensene og bruk et nytt sett ved behov. Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se settetiketten) på reagensene og bruk et nytt sett ved behov. Svakt eller ikke noe signal på den interne kontrollen av en negativ prøve utsatt for rensing ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet eller QIAsymphony DNA Mini-settet i fluorescenskanalen Cycling Yellow og samtidig fravær av et signal i kanalen Cycling Green a) PCR-forholdene oppfyller ikke kravene i protokollen Kontroller PCR-forholdene (se ovenfor) og gjenta PCR med korrigerte innstillinger, ved behov. b) PCR var inhibert. c) DNA gikk tapt under ekstrahering Se til at du bruker den validerte isolasjonsmetoden (se Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 31) for prøveklargjøring. Et fraværende signal for den interne kontrollen kan indikere tapet av DNA i løpet av ekstraheringen. Se til at du bruker den validerte isolasjonsmetoden (se Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 31) for prøveklargjøring. Se også Lave resultater for nukleinsyrer ovenfor. d) Oppbevaringsforholdene for én eller flere settkomponenter overholdt ikke instruksjonene som ble gitt i Lagring (side 6) Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se settetiketten) på reagensene og bruk et nytt sett ved behov. 58 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

59 e) artus EBV QS-RGQsettet ble utløpt Kommentarer og forslag Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se settetiketten) på reagensene og bruk et nytt sett ved behov. Signaler med de negative kontrollene i fluorescenskanalen Cycling Green for den analytiske PCR a) Kontaminering oppsto i løpet av klargjøringen av PCR Gjenta PCR med nye reagenser i replikater. Hvis mulig, lukk PCR-rørene rett etter tilsetningen av prøven som skal testes. Se til at arbeidsplassen og instrumentene dekontamineres ved regelmessige intervaller. b) Kontaminering oppsto under ekstrahering Gjenta ekstraheringen og PCR for prøven som skal testes ved bruk av de nye reagensene. Se til at arbeidsplassen og instrumentene dekontamineres ved regelmessige intervaller. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

60 Henvisninger QIAGEN opprettholder en stor oppdatert online database med vitenskapelige kunngjøringer ved bruk av QIAGEN-produkter. Omfattende søkealternativer gjør at du kan finne de artiklene du har behov for, enten med enkelt nøkkelordsøk eller ved å spesifisere applikasjonen, forskningsområdet, tittelen osv. For en fullstendig liste over referanser, besøk QIAGENs referansedatabase online på eller ta kontakt med QIAGENs tekniske tjenester eller din lokale distributør. 60 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

61 Bestillingsinformasjon Produkt Innhold Kat.nr. artus EBV QS-RGQ Kit (24) For 24 reaksjoner: Master, 4 Kvantiteringsstandarder, Intern kontroll, Vann (PCR-klasse) QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett for automatisert rensing av virusnukleinsyrer eller bakterie- DNA fra 1 96 prøver QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) For opptil 96 klargjøringer på 1000 μl hver: Inkluderer 2 reagenspatroner og enzymstativer og tilbehør QIAsymphony DNA Mini-settet for automatisert rensing av DNA fra 1 96 prøver QIAsymphony DNA Mini Kit (192) QIAsymphony RGQ-system QIAsymphony RGQ, System For opptil 192 klargjøringer på 200 μl hver: Inkluderer 2 reagenspatroner og enzymstativer og tilbehør QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, nødvendig tilbehør og forbruksvarer, installasjon og opplæring QIAsymphony SP/AS-instrumenter og tilbehør QIAsymphony SP QIAsymphony prøveklargjøringsmodul, 1års garanti på deler og utførelse QIAsymphony AS QIAsymphony analyseoppsettsmodul, 1års garanti på deler og utførelse Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym Reuse Seal Set (20) 8-brønns prøveprepareringspatroner til bruk med QIAsymphony SP 8-stangdeksler til bruk med QIAsymphony SP Kjøleadapter for EMT-stativer; for bruk med QIAsymphony SP/AS-instrumenter (programvareversjon 3.1 eller høyere) Gjenbrukssett for forsegling av delvis brukte QIAsymphony reagenspatroner artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

62 Produkt Innhold Kat.nr. Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Sekundær røradapter (for 2 ml skruehetterør, rørinnlegg 3b) til bruk med QIAsymphony SP rørbærer Elusjonsmikrorør CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Reagent Bottles, 30 ml, Qsym AS (50) Filter-Tips, 1500 μl (1024) Filter-Tips, 200 μl (1024) Ikke-sterile polypropylenrør (0,85 ml maks. kapasitet, mindre enn 0,7 ml lagringskapasitet, 0,4 ml elusjonskapasitet); 2304 i stativer på 96; inkluderer hettestrimler Adapter for å holde 18 x 2 ml koniske rør og 6 x 5 ml koniske rør; for bruk med QIAsymphony SP/AS-instrumenter (programvareversjon 3.1 eller høyere) Adapter for å holde 18 x 2 ml koniske rør og 2 x 5 ml koniske rør og 2 x reagensflasker, 30 ml; for bruk med QIAsymphony SP/AS-instrumenter (programvareversjon 3.1 eller høyere) Adapter for å holde 18 strimler med 4 rør; for bruk med QIAsymphony SP/ASinstrumenter (programvareversjon 3.1 eller høyere) Koniske rør (2 ml) for å holde reagens; for bruk med QIAsymphony AS Koniske rør (5 ml) for å holde reagens; for bruk med QIAsymphony AS Reagensflasker (30 ml) med lokk; for bruk med QIAsymphony AS Engangs filterspisser, stativ: (8 x 128). Til bruk med QIAsymphony SP Engangs filterspisser, stativ: (8 x 128). Til bruk med QIAcube og QIAsymphony SP * * Filter-Tips, 50 μl (1024) Engangs filterspisser, stativ (8 x 128). Til bruk med QIAsymphony AS * Vennligst spør om tilgjengelighet. 62 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

63 Produkt Innhold Kat.nr. Tip Disposal Bags (15) Tuppdeponeringsposer til bruk med QIAsymphony SP/AS-instrumenter Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Sanntids PCR-cycler og High Resolution Melt-analysator med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, dyp rød) pluss HRMkanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, 1-års garanti på deler og utføring Sanntids PCR-cycler og High Resolution Melt-analysator med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, dyp rød) pluss HRMkanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, 1-års garanti på deler og utføring; inkluderer installasjon og opplæring Forespør Forespør Rotor-Gene Q 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Sanntids PCR-cycler og High Resolution Melt-analysator med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, dyp rød) pluss HRMkanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, 1-års garanti på deler og utføring Sanntids PCR-cycler og High Resolution Melt-analysator med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, dyp rød) pluss HRMkanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, 1-års garanti på deler og utføring; inkluderer installasjon og opplæring 250 strimler med 4 rør og lokk til 1000 reaksjoner 10 x 250 strimler med 4 rør og lokk til reaksjoner For oppdatert lisensinformasjon og produktspesifikke ansvarsfrasigelser, se den respektive QIAGEN setthåndboken eller brukerhåndboken. QIAGEN setthåndboker og brukerhåndbøker er tilgjengelige på eller kan forespørres fra QIAGENs tekniske tjenester eller din lokale distributør. artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

64 Denne siden er blank med hensikt 64 artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/2010

65 Denne siden er blank med hensikt artus EBV QS-RGQ Kit Håndbok 12/

66

67 Kjøpet av dette produktet gjør det mulig for kjøperen å bruke det til å utføre diagnostikktjenester for human in vitro-diagnostikk. Ingen generell patent eller annen lisens av noe annet slag enn denne spesifikke bruksrettigheten fra kjøpet garanteres. Varemerker: QIAGEN, QIAsymphony, artus, Rotor-Gene (QIAGEN Group). artus EBV QS-RGQ-settet er et CE-merket diagnostikksett ifølge det europeiske direktivet om in vitro-diagnostikk 98/79/EC. Ikke tilgjengelig i alle land. Begrenset lisensavtale Bruk av dette produktet innebærer at en kjøper eller bruker av artus EBV QS-RGQ-settet samtykker i følgende vilkår: 1. artus EBV QS-RGQ-settet kan brukes bare i samsvar med håndboken for artus EBV QS-RGQ-settet og til bruk bare med komponenter som er i pakken. QIAGEN gir ingen lisens i forhold til noen av sine opphavsrettslige produkter til å bruke eller innlemme vedlagte komponenter i dette settet med noen komponenter som ikke er inkludert i dette settet, med unntak av det som er beskrevet i håndboken for artus EBV QS-RGQsettet og flere protokoller som nå finnes på 2. QIAGEN gjør ingen garantier for at denne pakken og/eller bruksområdene ikke krenker rettighetene til tredjeparter bortsett fra tydelig uttrykte lisenser. 3. Dette settet og komponentene i det er lisensiert til engangsbruk og kan ikke brukes flere ganger, modifiseres eller selges på nytt. 4. QIAGEN frasier seg spesifikt andre lisenser, uttrykt eller antydet, bortsett fra det som er uttrykkelig oppgitt. 5. Kjøperen og brukeren av settet samtykker i å ikke la noen andre gjøre noe som kan føre til handlinger som er forbudt ovenfor. QIAGEN kan håndheve forbud i denne begrensede lisensavtalen i en hvilken som helst domstol, og skal få tilbake alle sine forskende og domstolskostnader, inkludert advokathonorarer, i noen handling for å håndheve denne begrensede lisensavtalen eller noen av sine immaterielle rettigheter i forhold til settet og/eller komponentene. For oppdaterte lisensvilkår se QIAGEN, alle rettigheter forbeholdt.

68 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) Sample & Assay Technologies