artus CMV QS-RGQ Kit Håndbok

Transkript

1 Desember 2010 artus CMV QS-RGQ Kit Håndbok Versjon 1 24 Kvantitativ in vitro-diagnostikk Til bruk med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter NO QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R NO Sample & Assay Technologies

2 Prøve- og analyseteknologi QIAGEN er den ledende leverandøren av innovativ prøve- og analyseteknologi ved å gjøre det mulig å isolere og påvise innhold i enhver biologisk prøve. Våre avanserte høykvalitetsprodukter og tjenester sikrer suksessen fra prøve til resultat. QIAGEN setter standardene i: Rensing av DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser microrna-forskning og RNAi Automatisering av prøve- og analyseteknologi Vårt mål er å gjøre det mulig for deg å oppnå enestående suksess og gjennombrudd. For mer informasjon besøk

3 Innhold Pakkens innhold 5 Symboler 5 Lagring 6 Tilsiktet bruk 6 Begrenset bruk av produktet 6 Teknisk assistanse 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Kvalitetskontroll 8 Innledning 9 Prinsipp 9 Patogeninformasjon 9 Ytelsesegenskaper 10 Arbeidsflyt 18 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for 23 Viktig opplysninger 25 Generelle forholdsregler 25 Prøvetaking, oppbevaring og transport 25 Komme i gang på QIAsymphony SP/AS-instrumentene 27 Klargjøring av prøvematerialer 29 Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandinger for plasmaprøver 30 Bruke en intern kontroll 30 Analysekontrollsett og analyseparametersett 31 Fleranalysekjøringer 32 Resultater for nukleinsyrer 32 Oppbevaring av nukleinsyrer 33 Stille inn terskelen for PCR-analysen 33 Kvantitering 33 Protokoller DNA-isolering på QIAsymphony SP 34 Analyseoppsett på QIAsymphony AS 42 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010 3

4 PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q 48 Feilsøkingsveiledning 59 Henvisninger 64 Bestillingsinformasjon 65 4 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

5 Pakkens innhold artus CMV QS-RGQ-settet (24) Katalognr Antall reaksjoner 24 Blått CMV RG Master 3 x 300 μl Gult CMV Mg-Sol* 600 μl Rød CMV QS 1 (1 x 10 4 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 2 (1 x 10 3 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 3 (1 x 10 2 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 4 (1 x 10 1 kopier/μl) 200 μl Grønn CMV IC 1000 μl Hvitt Vann (PCR-klasse) 1000 μl Håndbok 1 * Magnesiumløsning. Kvantiteringsstandard. Intern kontroll. Symboler <N> Inneholder nok reagens til <N> tester Brukes innen In vitro-diagnostisk medisinsk enhet Katalognumre Lotnummer Materialenummer Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010 5

6 Komponenter Inneholder Nummer Temperaturbegrensninger Lovlig produsent Se bruksanvisning Viktig merknad Lagring Komponentene i artus CMV QS-RGQ-settet skal oppbevares ved 20 C og er stabile inntil utløpsdatoen som er angitt på etiketten. Gjentatt opptining og frysing (>2 x) skal unngås, da dette kan redusere analyseytelsen. Tilsiktet bruk artus CMV QS-RGQ-settet er en in vitro-nukleinsyreforsterkningstest for kvantifiseringen av cytomegalovirus (CMV)-DNA i humant EDTA-plasma eller humant EDTA-fullblod. Dette diagnostiske testsettet bruker polymerasekjedereaksjonen (PCR) og er konfigurert til bruk med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter. artus CMV QSRGQ-settet er beregnet til bruk i sammenheng med klinisk presentasjon og andre laboratoriemarkører for sykdomsprognose. Begrenset bruk av produktet Alle reagenser kan utelukkende brukes i in vitro-diagnostikk. Produktet skal kun brukes av personale som er spesielt instruert og opplært i in vitro-diagnostiske prosedyrer (EN375). Strengt samsvar med brukerhåndboken kreves for optimale PCR-resultater. Det er viktig å være oppmerksom på utløpsdatoer som er trykket på boksen og etikettene på alle komponentene. Bruk ikke komponenter med utløpt dato. 6 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

7 Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innen de høyst konserverte regionene av virusgenomet som er dekket av settets primere og/eller probe føre til underkvantifisering eller at tilstedeværelsen av viruset ikke oppdages i disse tilfellene. Validiteten og ytelsen til analysedesignen revideres med regelmessige intervaller. Teknisk assistanse Hos QIAGEN er vi stolte av kvaliteten og tilgjengeligheten av vår tekniske støtte. Våre tekniske serviceavdelinger er bemannet av erfarne vitenskapsfolk med omfattende praktisk og teoretisk ekspertise i prøve- og analyseteknologi og bruken av QIAGEN-produkter. Hvis du har noen spørsmål eller opplever vanskeligheter med artus CMV QS-RGQ-settet eller QIAGEN-produkter generelt sett, vennligst ikke nøl med å ta kontakt med oss. QIAGEN-kunder er en større informasjonskilde vedrørende avansert eller spesialisert bruk av produktene våre. Denne informasjonen er nyttig for andre forskere, samt for forskerne ved QIAGEN. Vi oppmuntrer deg derfor til å ta kontakt med oss hvis du har forslag om produktets ytelse eller nye bruksområder og teknikker. For teknisk assistanse og mer informasjon vennligst se vårt tekniske supportsenter på eller ring én av QIAGENs tekniske serviceavdelinger eller lokale distributører (se bak på omslaget eller besøk Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du finne, vise og skrive ut MSDS for hvert QIAGEN-sett og settkomponent. For sikkerhetsinformasjon for the QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet se håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. For sikkerhetsinformasjon for the QIAsymphony DNA Mini-settet se håndboken for QIAsymphony DNA. For sikkerhetsinformasjon om instrumentene se den relevante brukerhåndboken for instrumentene. Kast prøve- og analyseavfall ifølge de lokale sikkerhetsforskriftene. 24-timers nødsinformasjon Medisinsk nødsinformasjon på engelsk, fransk og tysk kan skaffes 24 timer i døgnet fra: Poison Information Center Mainz, Tyskland Tlf.: Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010 7

8 Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs ISO-sertifiserte kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti med artus CMV QS-RGQ-sett mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. 8 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

9 Innledning artus CMV QS-RGQ-settet utgjør et bruksklart system for påvisning av CMV- DNA ved bruk av en polymerasekjedereaksjon (PCR) på Rotor-Gene Q- instrumenter med prøveklargjøring og analyseoppsett ved bruk av QIAsymphony SP/AS-instrumenter. CMV RG Master inneholder reagenser og enzymes for den spesifikke forsterkningen av en 105 bp-region av CMVgenomet og for direkte påvisning av det spesifikke amplikonet i den fluorescerende kanalens Cycling Green for Rotor-Gene Q. I tillegg inneholder artus CMV QS-RGQ-settet et sekundært heterologt forsterkningssystem for å identifisere mulig PCR-hemming. Dette påvises som en intern kontroll (IC) i den fluorescerende kanalen Cycling Yellow for Rotor- Gene Q. Påvisningsgrensen for den analytiske CMV PCR er ikke redusert. Eksterne positive kontroller (CMV QS 1 4) forsynes, noe som gjør det mulig med bestemmelse av mengden virus-dna. For mer informasjon se Kvantitering på side 33. Prinsipp Patogenpåvisning med polymerasekjedereaksjon (PCR) er basert på forsterkningen av spesifikke regioner av patogengenomet. I sanntids PCR påvises det forsterkede produktet via fluorescerende farger. Disse er vanligvis forbundet med oligonukleotidprober som bindes spesifikt til det forsterkede produktet. Overvåkning av de fluorescerende intensitetene i løpet av PCRkjøringen (f.eks. i sanntid) gjør det mulig med påvisning og kvantifisering av det akkumulerende produktet uten å måtte åpne reaksjonsrørene på nytt etter PCRkjøringen.* Patogeninformasjon Det humane cytomegaloviruset (CMV) finnes i infiserte personer i blodet, vevet og nesten all sekresjon. Overføringen kan være oral, seksuell, via blodoverføring eller organtransplantasjon, intrauterint eller perinatalt. Infeksjon med CMV fører ofte til en asymptomatisk infeksjon etterfulgt av en livslang vedvarenhet av viruset i kroppen. Hvis symptomene oppstår, hos tenåringer eller voksne, ligner de symptomene på mononukleose med feber, svak hepatitt og generell nedsatt allmenntilstand. Alvorlige løp av CMV-infeksjon har blitt observert spesielt hos de som er infisert intrauterint og hos pasienter med nedsatt immunforsvar. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010 9

10 Ytelsesegenskaper Analytisk følsomhet plasma Den analytiske deteksjonsgrensen med hensyn til rensingen (følsomhetsgrense) ble vurdert for artus CMV QS-RGQ-settet ved bruk av CMV-positive kliniske prøver i kombinasjon med ekstraheringen på QIAsymphony SP. For plasma ble den analytiske følsomheten med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet bestemt ved bruk av en dilusjonsserie av CMVvirusmateriale fra 1000 til nominelt 0,316 CMV kopier/ml tilsatt i kliniske plasmaprøver. Disse ble utsatt for DNA-ekstrahering ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet i kombinasjon med Cellfree1000-protokollen (ekstraheringsvolum: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av de 10 fortynningene ble analysert med artus CMV QS-RGQ-settet på 4 ulike måter i 4 kjøringer med 8 replikater i hver. Resultatene ble bestemt av en probitanalyse. En grafisk illustrasjon av probitanalysen vises i figur 1. Den analytiske påvisningsgrensen med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet i kombinasjon med Rotor-Gene Q er 42,5 kopier/ml (p = 0,05). Dette betyr at det er en sannsynlighet på 95 % for at 42,5 kopier/ml vil bli påvist % Proporsjoner Proportions ,63 ~ ~ ,5 copies/ml kopier/ml (95%) %) ( (29,4 70,2 copies/ml) kopier/ml) log (dose) Figur 1 Probitanalyse: Plasma, CMV (Rotor-Gene Q).Analy tisk følsomhet med hensyn til rensingen (plasma, ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet) av artus CMV QS-RGQ-settet på Rotor-Gene Q. Spesifisitet plasma Spesifiteten til artus CMV QS-RGQ -settet er først og fremst sikret gjennom valget av primere og prober, samt valget av strenge reaksjonsbetingelser. 10 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

11 Primere og prober ble kontrollert for mulige homologier for alle sekvenser som er utgitt i genbanker etter sekvenssammenligningsanalyse. Påvisningsevnen for alle relevante genotyper har dermed blitt sikret. Videre ble spesifiteten validert med 100 ulike CMV-negative plasmaprøver. Disse genererte ikke noen signaler med de CMV-spesifikke primerne og probene, som er inkludert i CMV RG Master. En potensiell kryssreaktivitet for artus CMV QS-RGQ-settet ble testet ved bruk av kontrollgruppen som er opplistet i tabell 1 (nedenfor). Ingen av de testede patogenene har vært reaktive. Ingen kryssreaktiviteter vistes med blandede infeksjoner. Tabell 1. Testing av spesifisiteten til settet med potensielt kryssreaktive patogener Kontrollgruppe Humant herpesvirus 1 (Herpes simplex-virus 1) Humant herpesvirus 2 (Herpes simplex-virus 2) Humant herpesvirus 3 (Varicella-zoster-virus) Humant herpesvirus 4 (Epstein-Barr-virus) CMV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Yellow) Humant herpesvirus 6A + Humant herpesvirus 6B + Humant herpesvirus 7 + Humant herpesvirus 8 (Kaposis sarkomtilknyttet herpesvirus) + Hepatitt A-virus + Hepatitt B-virus + Hepatitt C-virus + Humant immunsviktvirus 1 + Tabell fortsettes på neste side Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

12 Tabell 1. Fortsettelse Kontrollgruppe CMV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Yellow) Humant T-celleleukemivirus 1 + Humant T-celleleukemivirus 2 + Vestnilvirus + Enterovirus + Parvovirus B19 + Lineært område plasma Det lineære området med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet ble bestemt ved å analysere en fortynningsserie av CMV-virusmateriale som strekker seg fra 1,00 x 10 8 kopier/ml til 3,16 x 10 1 kopier/ml i plasma. Rensingen ble utført i replikater (n = 4 for konsentrasjoner 1,00 x 10 7 kopies/ml; n = 8 for konsentrasjoner <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett i kombinasjon med Cellfree1000 -protokollen (ekstraheringsvolum: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av prøvene ble analysert ved bruk av artus CMV QS-RGQ-settet. Det lineære området med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet har blitt fastsatt til å dekke konsentrasjoner fra 7,94 x 10 1 kopier/ml til 1,00 x 10 8 kopier/ml for plasma (figur 2, side 13). Robusthet plasma Verifiseringen av robustheten gjør det mulig å fastsette den totale feilraten for artus CMV QS-RGQ-settet. For å verifisere robustheten ble 100 CMV-negative plasmaprøver tilsatt med 130 kopier/ml av CMV (omtrent tredobbelt konsentrasjon av den analytiske følsomhetsgrensen). After extraction using the QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett in combination with the Cellfree1000_DSP Protokoll for Plasma (extraction volume: 1 ml, elusjonsvolum: 60 μl), ble disse prøvene analysert med artus CMV QS-RGQsettet. I tillegg ble robustheten for den interne kontrollen vurdert ved rensing og analyse av de 100 tilsatte plasmaprøvene. Inhiberinger ble ikke observert. Dermed er robustheten til artus CMV QS-RGQ-settet 99 %. 12 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

13 10 log 10 beregnet konsentrasjon (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = x y = 1,0521x 0,3653 R 2 = R 2 0,9991 = log log 10 nominal concentration (copies/ml) 10 nominell konsentrasjon (kopier/ml) Figur 2. Lineært område for artus CMV QS-RGQ-settet (plasma). Kalkulering av det lineære området. Den rette linjen ble bestemt ved en lineær regresjon av log 10 -kalkulerte konsentrasjoner med log 10 nominelle konsentrasjoner. Ligningen til regresjonslinjen er inkludert på figuren. Analytisk følsomhet fullblod Den analytiske deteksjonsgrensen med hensyn til rensingen (følsomhetsgrense) ble vurdert for artus CMV QS-RGQ-settet ved bruk av CMV-positive kliniske prøver i kombinasjon med ekstraheringen på QIAsymphony SP. For fullblod ble den analytiske følsomheten med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet bestemt ved bruk av en fortynningsserie av CMVvirusmateriale fra 1000 til nominelt 3,16 CMV kopier/ml tilsatt i humane fullblodsprøver. Disse ble utsatt for DNA-ekstrahering ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med VirusBlood200-protokollen (ekstraheringsvolum: 200 μl, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av de 8 fortynningene ble analysert med artus CMV QS-RGQ-settet på 3 ulike måter i 6 kjøringer med 11 replikater i hver. Resultatene ble bestemt av en probitanalyse. En grafisk illustrasjon av probitanalysen vises i figur 3. Den analytiske påvisningsgrensen med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet i kombinasjon med Rotor-Gene Q er 164,55 kopier/ml (p = 0,05). Dette betyr at det er en sannsynlighet på 95 % for at 164,55 kopier/ml vil bli påvist. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

14 1.0 95% 0.8 Proporsjoner Proportions ,21631 ~ ,55 copies/ml kopier/ml (95%) %) (82,01 ( ,34 kopier/ml) copies/ml) log (dose) Figur 3. Probitanalyse: Fullblod, CMV (Rotor-Gene Q).Analytisk følsomhet med hensyn til rensingen (fullblod, ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet) av artus CMV QS-RGQ-settet på Rotor-Gene Q. Spesifisitet fullblod Spesifiteten til artus CMV QS-RGQ -settet er først og fremst sikret gjennom valget av primere og prober, samt valget av strenge reaksjonsbetingelser. Primere og prober ble kontrollert for mulige homologier for alle sekvenser som er utgitt i genbanker etter sekvenssammenligningsanalyse. Påvisningsevnen for alle relevante genotyper har dermed blitt sikret. Videre ble spesifiteten validert med 100 ulike CMV-negative helblodprøver. Disse genererte ikke noen signaler med de CMV-spesifikke primerne og probene, som er inkludert i CMV RG Master. En potensiell kryssreaktivitet for artus CMV QS-RGQ-settet ble testet ved bruk av kontrollgruppen som er opplistet i tabell 1 (se side 11). Ingen av de testede patogenene har vært reaktive. Ingen kr yssreaktiviteter vistes med blandede infeksjoner. Lineært område fullblod Det lineære området med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet ble bestemt ved å analysere en fortynningsserie av CMV-virusmateriale som strekker seg fra 5,00 x 10 7 til 1,00 x 10 2 i fullblod. Rensingen ble utført i replikater (n = 4 for konsentrasjoner 1,00 x 10 7 kopies/ml; n = 8 for konsentrasjoner <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved bruk av QIAsymphony DNA Minisettet i kombinasjon med VirusBlood200-protokollen (ekstraheringsvolum: 14 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

15 200 μl, elusjonsvolum: 60 μl). Hver av prøvene ble analysert ved bruk av artus CMV QS-RGQ-settet. Det lineære området med hensyn til rensingen av artus CMV QS-RGQ-settet har blitt fastsatt til å dekke konsentrasjoner fra 1,00 x 10 3 ko pier/ml til 5,00 x 10 7 kopier/ml for fullblod (figur 4). log 10 beregnet konsentrasjon (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = x 1,0514x ,2366 R 22 = 0, log 10 nominal nominell concentration konsentrasjon (copies/ml) (kopier/ml) Figur 4. Lineært område for artus CMV QS-RGQ-settet (fullblod).kalkulering av det lineære området. Den rette linjen ble bestemt ved en lineær regresjon av log 10 -kalkulerte konsentrasjoner med log 10 nominelle konsentrasjoner. Ligningen til regresjonslinjen er inkludert på figuren. Robusthet fullblod Verifiseringen av robustheten gjør det mulig å fastsette den totale feilraten for artus CMV QS-RGQ-settet. For å verifisere robustheten ble 100 CMV-negative fullblodprøver tilsatt med 500 kopier/ml av CMV (omtrent tredobbelt konsentrasjon av den analytiske følsomhetsgrensen). Etter ekstrahering ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med VirusBlood200- protokollen for fullblod, ble disse prøvene analysert med artus CMV QS-RGQsettet. I tillegg ble robustheten for den interne kontrollen vurdert ved rensing og analyse av de 100 tilsatte fullblodprøvene. Inhiberinger ble ikke observert. Dermed er robustheten til artus CMV QS-RGQ-settet 99%. Nøyaktighet Nøyaktighetsdata for artus CMV QS-RGQ-settet gjør det mulig å bestemme den totale variansen til analysen. Den totale variasjonen omfatter intraanalysevariabilitet (variabilitet for flere resultater av prøver med samme konsentrasjon innenfor ett eksperiment), inter-analysevariabilitet (variabilitet for Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

16 flere resultater som er generert på ulike instrumenter av samme type, men av ulike operatører på ett laboratorium) og inter-batchvariabilitet (variabilitet for flere resultater av analysen ved bruk av ulike batcher). Den data som ble oppnådd ble brukt til å bestemme standardavvik, varians og koeffisient for variasjonen for den patogenspesifikke og den interne kontroll-pcr. Analytisk presisjonsdata for artus CMV QS-RGQ-settet (uten å ta hensyn til rensingen) ble innsamlet ved bruk av kvantifiseringsstandarden for den laveste konsentrasjon (QS 4; 10 kopier/μl). Testingen ble utført med 8 replikater. Nøyaktighetsdata ble kalkulert på grunnlag av C T -verdiene for forsterkningskurvene (C T :Terskelsyklus, se tabell 2 nedenfor). I tillegg ble nøyaktighetsdata for kvantitative resultater i kopier/μl bestemt ved bruk av tilsvarende C T -verdier (tabell 3, side 18). Basert på disse resultatene er den helhetlige statistiske spredningen av enhver gitt prøve med den nevnte konsentrasjonen 1,21 % (C T ) eller 14,38 % (konsentrasjon) og 1,93 % (C T ) for påvisningen av den interne kontrollen. Disse verdiene er basert på totaliteten for alle de enkelte verdiene for de bestemte variabilitetene. 16 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

17 Tabell 2. Nøyaktighetsdata på grunnlag av C T -verdiene Intraanalysevariabilitet: CMV QS 4 Intraanalysevariabilitet: Intern kontroll Interanalysevariabilitet: CMV QS 4 Interanalysevariabilitet: Intern kontroll Inter-batchvariabilitet: CMV QS 4 Inter-batchvariabilitet: Intern kontroll Total Varians: CMV QS 4 Total Varians: Intern kontroll Standardavvik Varians Koeffisient for variasjon (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

18 Tabell 3. Nøyaktighetsdata på grunnlag av kvantitative resultater (i kopier/μl) Intraanalysevariabilitet: CMV QS 4 Interanalysevariabilitet: CMV QS 4 Inter-batchvariabilitet: CMV QS 4 Total Varians: CMV QS 4 Standardavvik Varians Koeffisient for variasjon (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Reproduserbarhet Reproduserbarhetsdata gjør det mulig med en regelmessig ytelsesvurdering av artus CMV QS-RGQ-settet samt en effektivitetssammenligning med andre produkter. Disse dataene oppnås gjennom deltakelsen i etablerte ferdighetsprogrammer. Krysskontaminering Fravær av krysskontaminering mellom prøver for hele arbeidsflyten ble bevist av korrekt påvisning av alle kjent positive og negative prøver i vekslende posisjoner (sjakkbrettmønster) for et representerende artus QS-RGQ-system. Arbeidsflyt QIAsymphony RGQ-arbeidsflyten starter med rensing av nukleinsyrer fra humane plasma- eller fullblodsprøver på QIAsymphony SP-instrumentet. Eluatene, som inneholder rensede nukleinsyrer, fra prøveklargjøringsprosedyren overføres til QIAsymphony AS-modulen, som deretter utfører analyseoppsett (figur 5). Analysene overføres deretter til Rotor- Gene Q for PCR og dataanalyse (figur 6). En arbeidsflytoversikt finnes på side For mer informasjon se de detaljerte protokollene i denne håndboken (side 34, 42, og 48). 18 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

19 Figur 5. Walkaway-automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrumenter. Prøver, reagenser og forbruksvarer lastes i de relevante skuffene. Prøveklargjøring og analyseoppsett automatiseres deretter fullstendig på QIAsymphony SP/AS-instrumentene. Figur 6. Overføring av prøvene til Rotor-Gene Q. Etter prøveklargjøring og analyseoppsett lastes reaksjonene i den 72-brønns rotoren for Rotor-Gene Q for sanntids PCR-analyse. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

20 Oversikt over QIAsymphony RGQ-arbeidsflyten QIAsymphony SP Last Waste (Avfall)-skuffen. Plasser elusjonsstativet inn i Eluate (Eluat)-skuffen. Uavhengig operasjon Integrert operasjon Plasser elusjonsstativet på åpning 1. Plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning 1. Last Reagents and Consumables (Reagenser og forbruksvarer)- skuffen. Last Sample (Prøve)-skuffen. Definer en kjøring/omgang ved bruk av brukergrensesnittet for prøveklargjøringen. Start protokollen. Når prøveprosesseringen er fullstendig skal elusjonsstativet enten fjernes manuelt fra skuffen Eluate (uavhengig operasjon) eller utfør direkte overføring av elusjonsstativet til QIAsymphony AS via overføringsmodulen (integrert operasjon). Uavhengig operasjon Integrert operasjon Fjern eluatåpningsoppgaven på berøringsskjermen, åpne deretter skuffen Eluate og fjern elusjonsstativet manuelt. Trykk på Transfer (Overfør) for å overføre elusjonsstativet fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS. Last ned QIAsymphony SP-resultatfilen. 20 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

21 QIAsymphony AS Bytt til grensesnittet for analyseoppsett på berøringsskjermen. Starte analysedefinisjonsprosessen. Uavhengig operasjon Integrert operasjon Trykk New (Ny). En melding vil vises og spørre om du skal bruke elusjonsstativet som et prøvestativ. Trykk på Yes for å bekrefte. Definer en analysekjøring. Skjermen som vises på berøringsskjermen vil lede deg trinn-for-trinn gjennom analysedefinisjonsprosessen. Last skuffen Eluate and Reagents (Eluat og reagenser) og Assays (Analyser) med de riktige prøvene, reagensene og forbruksvarene. For detajert lasteinformasjon se skjermbildet Loading Information (Laster informasjon). Trykk alternativt Queue (Kø) og last ned lasteinformasjonsfilen. Start analysekjøringen. Etter at kjøringen er ferdig, ta ut analysene. For å gjøre dette trykker du på Remove (Fjern) og tar deretter manuelt ut analysestativet (eller - stativene) fra skuffen Assays. Overfør analysestativet (eller -stativene) til Rotor-Gene Q. Last ned QIAsymphony AS-resultatfilen og cycler-filen. Overfør cycler-filen til Rotor-Gene Q. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

22 Rotor-Gene Q Velg eller opprett en temperaturprofil. Klikk på Start Run (Start kjøring). Analyser resultatene etter at kjøringen er ferdig. Vedlikehold Utfør de aktuelle vedlikeholdsprosedyrene for QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q ifølge brukerhåndbøkene for instrumentene. Se avsnitt 8 i brukerhåndboken for QIAsymphony SP/AS Generell beskrivelse og avsnitt 9 i brukerhåndboken for Rotor-Gene Q for mer detaljer om nødvendige daglige, regelmessige og ukentlige vedlikeholdsprosedyrer. 22 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

23 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. Pipetter (justerbare)* og sterile pipettspisser med filtre Vorteks-blander* Arbeidsbenksentrifuge* med rotor for 2 ml reaksjonsrør, evne til sentrifugering ved 6800 x g For prøveklargjøring QIAsymphony SP-instrument (kat.nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett (kat.nr ) for plasmaprøver eller QIAsymphony DNA Mini-sett (kat.nr ) for fullblodprøver Adaptere for QIAsymphony SP: Elution Microtube Rack QS (kjøleadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ) Rørinnlegg 3B (innlegg, 2,0 ml v2, prøvevogn (24), Qsym, kat.nr ) Forbruksvarer for QIAsymphony SP: Prøveklargjøringspatroner, 8-brønns (kat.nr ) 8-stangsdeksler (kat.nr ) Filterspisser, 1500 μl (kat.nr ) Filterspisser, 200 μl (kat.nr ) Elusjonsmikrorør CL (kat.nr ) Spissavfallsposer (kat.nr ) Mikrorør 2,0 ml type H eller mikrorør 2,0 ml type I (Sarstedt, kat.nr og , for bruk med prøver og interne kontroller * Pass på at instrumentene er sjekket og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

24 For analyseoppsett QIAsymphony AS-instrument (kat.nr )* Adaptere og reagensholdere for QIAsymphony AS: Reagensholder 1 QS (kjøleadapter, reagensholder 1, Qsym, kat.nr ) Reagensholder 2 QS (kjøleadapter, reagensholder 2, Qsym, kat.nr ) RG-strimmelrør 72 QS (kjøleadapter, RG-strimmelrør 72, Qsym, kat.nr ) Forbruksvarer for QIAsymphony AS: Strimmelrør og lokk, 0,1 ml (kat.nr ) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller mikrorør 2,0 ml type I (Sarstedt, kat.nr , Rør, konisk, 5 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller rør med flat base fra PP (Sarstedt, kat.nr , Reagensflasker, 30 ml, Qsym AS (kat. nr ) Elusjonsmikrorør CL (kat.nr ) Filterspisser, 1500 μl (kat.nr ) Filterspisser, 200 μl (kat.nr ) Filterspisser, 50 μl (kat.nr ) Spissavfallsposer (kat.nr ) For PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument* Rotor-Gene Q programvareversjon 2.02 eller høyere * Pass på at instrumentene er sjekket og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. Vennligst spør om tilgjengelighet. 24 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

25 Viktig opplysninger Generelle forholdsregler Vær alltid oppmerksom på følgende: Bruk sterile pipettspisser med filtre. I løpet av manuelle trinn skal rørene holdes lukket når det er mulig for å unngå kontaminering. Tin opp alle komponentene grundig ved romtemperatur (15 25 C) før du begynner en analyse. Når de er opptinet, bland komponentene (ved å pipettere flere ganger opp og ned eller ved å utføre pulsvortex) og sentrifuger kort. Sikre at det ikke finnes skum eller bobler i reagensrørene. Ikke bland komponentene fra sett med ulike lotsnumre. Forsikre deg om at de nødvendige adapterne er forhåndkjølt til 2 8 C. Arbeid hurtig og hold PCR-reagensene på is eller i kjøleblokken før lasting. Fortsett kontinuerlig fra én del av arbeidsflyten til neste. Ikke overskrid én time overføringstid mellom hver modul (QIAsymphony SP til QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q). Prøvetaking, oppbevaring og transport Alle prøver må behandles som potensielt infeksjonsmateriale. Kun de følgende prøvematerialene er tillatte, og for disse må følgende regler og spesielle instruksjoner vedrørende samling, transport og oppbevaring overholdes strengt. Den interne valideringen av artus CMV QS-RGQ-settet har blitt utført ved bruk av humant EDTA-plasmaprøver og humane EDTA-fullblodprøver. Andre prøvematerialer har ikke blitt validert. Bruk kun det anbefalte DNAisolasjonssett (se Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 34) for prøveklargjøring. Ved bruk av visse prøvematerialer må spesielle instruksjoner vedrørende samling, transport og oppbevaring overholdes strengt. Prøvetaking Hver blodprøvetaking forårsaker en skade på blodkar (arterier, vener, kapillærer). Det skal kun brukes ufarlig og sterilt materiale. For blodprøvetaking er egnede forbruksvarer tilgjengelige. For venepunkturer skal det ikke brukes Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

26 for fine kapillærnåler. Venøs blodprøvetaking skal kun utføres på de egnede delene av albuen, nedre arm eller på håndens bakside. Blodet på trekkes ut med standard prøvetakingsrør (rød hette, Sarstedt eller tilsvarende rør fra en annen produsent). Det skal tas et volum på 5 10 ml EDTA-blod. Rør skal blandes over hodet rett etter prøvetakingen (8x, ikke rist). Prøver fra hepariniserte personer må ikke brukes (se Forstyrrende substanser plasma og Forstyrrende substanser fullblod nedenfor). Oppbevaring av prøver For plasma skal fullblod separeres i plasma og cellekomponenter ved sentrifugering i 20 minutter ved x g innen 6 timer. Det isolerte plasmaet må overføres til sterile polypropylenrør. Analysefølsomheten kan reduseres hvis du fryser prøver som rutine eller lagrer dem over lengre tid. Transport av prøver Prøvematerialer skal transporteres i en uknuselig transportbeholder som prinsipp. Dermed kan en potensiell infeksjonsfare på grunn av en prøvelekkasje unngås. Prøvene skal transporteres ved å følge de lokale og nasjonale instruksjonene for transport av sykdomsfremkallende materiale.* Prøvene skal sendes innen 6 timer. Det anbefales ikke å oppbevare prøvene der de har blitt tatt. Det er mulig å sende prøvene med post ved å følge de lovfestede instruksjonene for transport av sykdomsfremkallene materiale. Vi anbefaler prøvetransport via kurér. Blodprøvene skal sendes nedkjølt (2 8 C) og det separerte plasmaet dypfrossent ( 15 til 30 C). Forstyrrende substanser plasma Forhøyede nivåer av albumin ( 6 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) og and lipider ( 1 g/dl triglycerid) og hemolytiske prøver ( 2 g/dl hemoglobin) har ingen innvirkning på systemet. Heparin påvirker PCR. Prøver som har blitt tatt i rør som inneholder heparin som antikoagulant, skal ikke brukes. Og prøver fra hepariniserte pasienter skal ikke brukes. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 26 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

27 Forstyrrende substanser fullblod Forhøyede nivåer av bilirubin ( 30 mg/dl), lipider ( 1 g/dl triglycerid) og humant genom-dna ( 3 μg/ml) har ingen innvirkning på systemet. Heparin påvirker PCR. Prøver som har blitt tatt i rør som inneholder heparin som antikoagulant, skal ikke brukes. Og prøver fra hepariniserte pasienter skal ikke brukes. Komme i gang på QIAsymphony SP/AS-instrumentene Lukk alle skuffer og lokk. Slå på QIAsymphony SP/AS-instrumentene og vent inntil skjermen "Sample Preparation" (Prøveklargjøring) vises og initialiseringsprosedyren er fullført. Logg inn på instrumentet (skuffer vil låses opp). Laste reagenspatroner (RC) inn i Reagents and Consumables -skuffen Reagenser for rensing av nukleinsyrer finnes i en innovativ reagenspatron (RC) (se figur 7). Hvert kar i reagenspatronen (RC) inneholder en spesiell reagens, slik som magnetiske partikler, lysebuffer, vaskebuffer eller elusjonsbuffer. Delvis brukte reagenspatroner (RC) kan lukkes igjen med gjenbrukbare tetningsstrimler for senere bruk, noe som forhindrer oppsamling av avfall på grunn av resterende reagenser på slutten av renseprosedyren. Stikklokk (PL) Gjenbrukstetningsstri mmel Enzymstativ (ER) Magnetpartikkelkar Åpning for skruelokk fra enzymrør Ramme med reagenskar Reagenspatron Figur 7. QIAsymphony reagenspatron (RC).Reagenspatronen (RC) inneholder alle reagenser som kreves for renseprosedyren. Før prosedyren startes, se til at de magnetiske partiklene er helt resuspendert. Fjern den magnetiske partikkelen gjennom reagenspatronens ramme, roter grundig i minst 3 minutter og sett den på plass i reagenspatronrammen før første bruk. Plasser reagenspatronen (RC) i reagenspatronholderen. Plasser enzymstativet (ER) i reagenspatronholderen. Før bruk av en reagenspatron (RC) for første gang, plasser stikklokket (PL) oppå reagenspatronen (RC) (figur 8). Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

28 Stikklokket (PL) er skarpt. Vær forsiktig ved plassering på reagenspatronen (RC). Se til å plassere stikklokket (PL) på reagenspatronen (RC) i riktig retning. Etter at den magnetiske partikkelens kardeksel er fjernet og enzymstativrørene er åpnet (skruehettene kan lagres i tilegnede åpninger, se figur 5), lastes reagenspatronen (RC) deretter inn i skuffen Reagents and Consumables. Stikklokket (PL) Figur 8. Enkelt arbeidsbenkoppsett med reagenspatroner (RC). Delvis brukte reagenspatroner (RC) kan lagres inntil det er behov for dem igjen, se Lagring (Oppbevaring) i håndboken for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen eller håndboken for QIAsymphony DNA. Laste plastdeler inn i Reagents and Consumables -skuffen Prøveklargjøringspatroner, 8-stangdeksler (begge forhåndsoppsatt i enhetsbokser) og engangs filtertupper (200 μl tupper gitt i blå stativer, 1500 μl tupper gitt i svarte stativer) lastes inn i Reagents and Consumables -skuffen. Se til at dekslene på enhetsboksene fjernes før lasting av enheten inn i Reagents and Consumables -skuffen. Tupper har filtre for å bidra til å forhindre krysskontaminering. Tuppstativåpninger på QIAsymphony SP-arbeidsbenken kan fylles med begge tuppstativtyper. QIAsymphony SP vil identifisere typen tupper som lastes under inventarskanningen. Ikke fyll på tuppstativer eller enhetsesker for prøveklargjøringspatroner eller 8-stangdeksler manuelt før en ny protokollkjøring startes. QIAsymphony SP kan bruke delvis brukte tuppstativer og enhetsesker. 28 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

29 Laste Waste -skuffen Prøveklargjøringspatroner og 8-stangdeksler som brukes under en kjøring er forhåndsplassert i tomme enhetsesker i Waste -skuffen. Se til at Waste - skuffen inneholder tilstrekkelig med tomme enhetsesker for plastavfall som genereres under protokollkjøringen. Se til at dekslene på enhetsboksene fjernes før lasting av enheten inn i Waste -skuffen. Hvis du bruker 8-stangdekselesker til å samle brukte prøveklargjøringspatroner og 8-stangdeksler, sikre at eskeavstandsstykket har blitt fjernet. En pose for brukte filtertupper må festes til frontsiden av Waste -skuffen. Tilstedeværelsen av en tuppdeponeringspose kontrolleres ikke av systemet. Kontroller at tuppdeponeringsposen sitter ordentlig fast før en protokollkjøring startes. For mer informasjon se brukerhåndbøkene som medfølger instrumentet. Tøm tupposen etter at maksimalt 96 prøver har blitt behandlet for å unngå tuppfastkjøring. En avfallsbeholder samler væskeavfall som genereres under renseprosedyren. Waste -skuffen kan kun lukkes hvis avfallsbeholderen er på plass. Bortskaff væskeavfallet ifølge de lokale sikkerhets- og miljøforskriftene. Ikke autoklaver den fylte avfallsflasken. Tøm avfallsflasken etter at maksimalt 96 prøver har blitt behandlet. Laste Eluate -skuffen Laste det nødvendige elusjonsstativet inn i Eluate -skuffen. Bruk Elution slot 1 (Elusjonsåpning 1) med tilhørende kjøleadapter.for integrert operasjon plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning 1. Inventarskanning Før du starter en kjøring kontrollerer instrumentet at det er lastet en tilstrekkelig mengde forbruksvarer for de ventende omgangene i de tilhørende skuffene. Klargjøring av prøvematerialer QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet egner seg til bruk med humane plasmaprøver, og QIAsymphony DNA Mini-settet egner seg til bruk med humane fullblodprøver. Forhindre dannelse av skum i eller på prøvene. Prøver skal ekvilibreres til romtemperatur (15 25 C) før kjøringen startes. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

30 Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver Bærer-RNA (CARRIER) må brukes ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet. For å klargjøre bærer-rna-lagerløsningen (CARRIER), tilfør 1350 μl Buffer AVE (AVE) (leveres i 2 ml flasker) til røret som inneholder 1350 μg lyofilisert bærer- RNA (CARRIER) for å oppnå en løsning på 1 μg/μl. Oppløs bærer-rna (CARRIER) grundig, del den inn i alikvoter med praktisk størrelse og oppbevar ved 2 8 C i inntil 2 uker. Kalkulere mengden av bærer-rna-blanding (CARRIER) per rør Minste mengde av bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding må inkludere tilstrekkelig ekstra mengde for å ta vurdering for væsketap i løpet av pipettering og fordampning. Se tabell 4 for volumer som skal brukes til analyse med artus CMV QS-RGQ-settet. Rør som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- og interne kontrollblandinger er plassert i en rørbærer. Rørbæreren som inneholder bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding(er) er plassert i åpning A på prøveskuffen. Inntil 8 rør av blandingen kan brukes per omgang og opptil 24 rør kan brukes per kjøring av 4 omganger. Bruke en intern kontroll En intern kontroll (CMV IC) leveres med artus CMV QS-RGQ-settet. Dette gjør det mulig for brukeren å både kontrollere DNA-isolasjonsprosedyren og kontrollere for mulig PCR-inhibering. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kjøring på Rotor-Gene Q (se Fleranalysekjøringer på side 32), bruk CMV IC for alle prøver og ikke EBV RG IC som er inkludert i artus EBV QS-RGQ-settet. Den samme CMV IC skal også brukes til analyseoppsett av PCR-kontrollene (trinn 13 i analyseoppsettsprotokollen på side 44). Bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet eller QIAsymphony DNA Mini-settet i kombinasjon med artus CMV QS-RGQ-settet krever introduksjon av den interne kontrollen (CMV IC) i renseprosedyren for å overvåke effektiviteten på prøveklargjøringen og downstream-analysen. For plasmaprøver må interne kontroller tilføres med bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding, og den totale mengden på den interne kontroll bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandingen forblir 120 μl. For fullblodprøver må de interne kontrollene fortynnes i Buffer ATE. Et totalt volum på 60 μl intern kontrol Buffer ATE-blanding tilsettes per prøve. 30 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

31 For denne applikasjonen tilsettes den interne kontrollen til isolasjonen slik som vist på tabell 4. Dette representerer tilsetting av intern kontroll til isolasjonen i et forhold på 0,1 μl per 1 μl elusjonsvolum. Vi anbefaler å klargjøre ferske blandinger for hver kjøring rett før bruk. Tabell 4. Klargjøring av intern kontrollbærer-rna (CARRIER) Plasmaprøver Fullblodprøver Komponent Volum (μl) Volum (μl) Lager bærer-rna (CARRIER) 5 0 Intern kontroll* 9 9 Buffer AVE Buffer ATE 0 51 Endelig volum per prøve (ekskludert dødvolum) Totalt volum for n prøver (n x 120) (n x 60) * Kalkuleringen av mengden intern kontroll er basert på de innledende elusjonsvolumene (90 μl). Ekstra tomt volum avhenger av typen prøverør som brukes. Ikke fyll mer enn 1,92 ml (tilsvarer maksimalt 13 eller 26 prøver; dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Intern kontrollblanding som tilsvarer 3 ekstra prøver (dvs. 360 μl) kreves (dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Intern kontrollblanding som tilsvarer 4 ekstra prøver (dvs. 240 μl) kreves (dette volumet er spesifikt for mikrorør 2,0 ml type H og mikrorør 2,0 ml type I, Sarstedt kat.nr og ). Analysekontrollsett og analyseparametersett Analysekontrollsett er kombinasjonen av en protokoll pluss ekstra parametre, slik som intern kontroll, for prøverensing på QIAsymphony SP. Et standard analysekontrollsett er forhåndsinstallert for hver protokoll. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kjøring på Rotor-Gene Q (se Fleranalysekjøringer nedenfor), bruk riktig CM-analysekontrollsett for prøverensningen. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

32 Analyseparametersett er kombinasjonen av en analysedefinisjon med ekstra definerte parametre, slik som replikattelling og antall analysestandarder for analyseoppsett på QIAsymphony AS. Fleranalysekjøringer I noen tilfeller er det mulig å analysere én enkelt prøve for mer enn ett patogen i samme PCR innenfor QIASymphony RGQ-arbeidsflyten. Dette kalles en fleranalysekjøring. Flere krav må oppfylles for en fleranalysekjøring. artus CMV QS-RGQ-settet kan brukes med artus EBV QS-RGQ-settet (kat.nr ) i en fleranalysekjøring hvis de følgende kravene er oppfylt. Prøveklargjøring på QIAsymphony SP For rensingen av prøver som skal testes for CMV og EBV ved bruk av samme eluat, bruk CMV IC for alla prøvene og ikke EBV RG IC som er inkludert i artus EBV QS-RGQ-settet. Bruk det passende CMV analysekontrollsettet for prøverensingen. Analyseoppsett på QIAsymphony AS For passende kvantifisering, samt gyldig informasjon som gis av den interne kontrollen, må den interne kontrollen for oppsett av begge analysene korrespondere med den som brukes for prøveklargjøringen (CMV IC). Bruk en CMV IC fra samme lot for både prøveklargjøring og analyseoppsett av PCRkontrollene (trinn 13 i analyseoppsettsprotokollen på side 44). Ikke bruk en CMV IC med et annet lotnummer. PCR på Rotor-Gene Q På grunn av forskjeller i fluorescensintensiteter ved bruk av 2 ulike analyser i en fleranalysekjøring, er det nødvendig å utføre en økningskalibrering for hvert artus påvisningssystem separat før PCR-kjøringen påbegynnes (trinn 9 15 i PCR-protokollen, side 53 55). Resultater for nukleinsyrer Eluater som er klargjort med bærer-rna (CARRIER) kan inneholde mye mer bærer-rna (CARRIER) enn målnukleinsyrer. Vi anbefaler bruk av kvantitative amplifiseringsmetoder for å bestemme resultater. 32 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

33 Oppbevaring av nukleinsyrer For kortsiktig oppbevaring på opptil 24 timer, anbefaler vi å oppbevare rensede nukleinsyrer ved 2 8 ºC. For langsiktig oppbevaring på over 24 timer, anbefaler vi at oppbevaringen skjer ved 20 ºC. Stille inn terskelen for PCR-analysen De optimale terskelinnstillingene for en gitt kombinasjon av Rotor-Gene Q- instrumentet og artus QS-RGQ-settet skal stilles inn empirisk ved å teste hver enkelt kombinasjon siden det er en relativ verdi avhengig av den helhetlige diagnostiske arbeidsflyten. Som et startpunkt kan terskelen stilles inn ved en foreløpig verdi på 0,04 for analysen av den første PCR-kjøringen, men denne verdien skal fininnstilles i en sammenlignbar analyse av de neste kjøringene i arbeidsflyten. Terskelen skal stilles inn manuelt rett over bakgrunnssignalet for de negative kontrollene og de negative prøvene. Middelterskelverdien som kalkuleres fra disse eksperimentene vil mest sannsynlig fungere for flertallet av fremtidige kjøringer, men brukeren skal likevel gjennomgå den genererte terskelverdien ved regelmessige intervaller. Terskelverdien vil vanligvis ligge i området 0,03 0,05 og skal rundes av til maksimalt tre desimalplasser. Kvantitering Kvantiteringsstandardene (CMV QS 1 4) i artus CMV QS-RGQ-settet behandles som tidligere rensede prøver, og det samme volumet brukes (20 μl). For å opprette en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter skal alle 4 kvantiteringsstandardene brukes og defineres i dialogboksen Rediger prøver på Rotor-Gene Q-instrumentet som standarder med de spesifiserte konsentrasjonene (se instrumentets brukerhåndbok). Kvantiteringsstandardene defineres som kopier/μl. Den følgende ligningen må brukes for å konvertere de verdiene som fastsettes ved bruk av standardkurven til kopier/ml av prøvemateriale: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/μl) x innledende elusjonsvolum (90 μl)* Prøvevolum (ml) Som en prinsippsak skal det innledende prøvevolumet oppgis i ligningen ovenfor. Dette må betraktes når prøvevolumet har blitt endret forut for nukleinsyreekstraheringen (f.eks. redusere volumet gjennom sentrifugering eller øking av volumet ved å legge til volumet som kreves for isolasjonen). * Kalkuleringen er basert på de innledende elusjonsvolumene (90 μl). Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

34 Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet (QIAGEN, kat.nr ) er validert for virus-dna-rensing fra humant plasma, og QIAsymphony DNA Minisettet (QIAGEN, kat.nr ) er validert for virus-dna-rensing fra humant fullblod for bruk med artus CMV QS-RGQ-settet. Generell informasjon om protokollene vises i tabell 5. Tabell 5. Generell protokollinformasjon Sett QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-sett QIAsymphony DNA Mini-sett Prøvemateriale Plasma Fullblod Prøvevolum (inkludert for stort volum) 1200 μl 300 μl Protokollnavn Cellfree1000_V4_DSP* VirusBlood200_V4* Standard analyse kontrollsett ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV* Elusjonsvolum 60 μl 60 μl Nødvendig programvare versjon Versjon 3.1 eller høyere ACS_VirusBlood200_V4_ artus_cmv* Versjon 3.5 eller høyere * V4 eller høyere, slik som det kreves av den brukte programvareversjonen. For en fleranalysekjøring der både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, bruk riktig CMVanalysekontrollsett for prøverensing. Viktige poeng før du starter Sørg for at du er kjent med driften av QIAsymphony SP/AS-instrumentene. Se brukerhåndbøkene som medfølger instrumentene for driftsinstruksjoner. Før prosedyren begynnes, les Viktig opplysninger side Før bruk av en reagenspatron (RC) for første gang, kontroller at bufrene QSL2 og QSB1i patronen (RC) ikke inneholder noen utfelling. Ved behov, flytt karene som inneholder bufrene QSL2 og QSB1 fra reagenspatronen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med ekstra risting for å løse opp utfellingen. Se til å sette på plass karene i de riktige posisjonene. Hvis reagenspatronen (RC) allerede er hullet, se til at karene er forseglet med 34 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

35 gjenbrukstetningsstrimler og inkuber hele reagenspatronen (RC) i 30 minutter ved 37 C og rist av og til i et vannbad.* Prøv å unngå kraftig risting av reagenspatronen (RC), ellers kan det dannes skum, som kan føre til problemer med væskenivådeteksjon. Alle komponenter for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet har vist seg å være stabile om bord QIAsymphony SP/AS-instrumenter i minst den normale tiden som kreves for å behandle 96 prøver. Ting du skal gjøre før du starter Klargjør alle nødvendige blandinger, inkludert blandinger om inneholder bærer-rna (CARRIER) og interne kontroller rett før start. For mer informasjon, se Klargjøre bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandinger for plasmaprøver, side 30, og Bruke en intern kontroll, side 30. Se til at stikklokket (PL) plasseres på reagenspatronen (RC) og at lokket på magnetpartikkelkaret har blitt fjernet, eller ved bruk av en delvis brukt reagenspatron (RC), se til at gjenbrukstetningsstrimlene har blitt fjernet. Før prosedyren startes, se til at de magnetiske partiklene er helt resuspendert. Roter karet som inneholder de magnetiske partiklene kraftig i minst 3 minutter før første bruk. Før lasting av reagenspatronen (RC), fjern dekselet fra karet ved som inneholder de magnetiske partiklene, og åpne enzymrørene. Se til at enzymstativet har blitt ekvilibrert til romtemperatur (15 25 C). Se til at stikklokket (PL) plasseres på reagenspatronen (RC), eller ved bruk av en delvis brukt reagenspatron, se til at gjenbrukstetningsstrimlene har blitt fjernet. Hvis prøvene er strekkodet, orienter prøvene i rørbæreren slik at strekkodene vender mot strekkodeleseren innenfor Sample -skuffen på venstre side av QIAsymphony SP. Prosedyre 1. Lukk alle skuffer og hetter på QIAsymphony SP/AS-instrumentene. 2. Slå på instrumentene og vent inntil skjermen Sample Preparation vises og initialiseringsprosedyren er fullført. Strømbryteren befinner seg nederst i venstre hjørne på QIAsymphony SP. 3. Logg inn på instrumentene. * Pass på at instrumentene er sjekket, vedlikeholdt og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens instruksjoner. Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/

36 4. Se til at Waste -skuffen er klargjort riktig (se tabell 6), og utfør en inventarskanning av Waste -skuffen, inkludert tupprennen og væskeavfall. Skift tuppdeponeringsposen ved behov. Tabell 6. Klargjøring av Waste -skuffen Enhetsboksholder 1 4 Avfallsposeholder Holder for væskeavfallsflaske Tomme enhetsbokser Bruke avfallsposer Tøm og installer væskeavfallsflasken 5. Laste det nødvendige elusjonsstativet inn i Eluate -skuffen. Bruk kun Elution slot 1 med tilhørende kjøleadapter (kjøleadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ). For integrert operasjon plasser elusjonsstativet med adapteren, inkludert overføringsrammen på åpning Laste nødvendig(e) reagenspatron(er) (RC) og forbruksvarer inn i Reagents and Consumables -skuffen (se tabell 7 og 8). Antall filterspisser som gis kan være forskjellig fra det antallet som vises i berøringsskjermen, avhengig av innstillingene. 36 Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/2010

37 Tabell 7. Klargjøre skuffen Reagents and Consumables RC-posisjon 1 og 2 Spisstativholder posisjon 1 4 Spisstativholder posisjon 5 18 Enhetsboksholderposisjon 1 3 Enhetsboksholder posisjon 4 Last 1 reagenspatron (RC) for opptil 48 plasmaprøver eller 2 nye reagenspatroner (RC) for opptil 96 plasmaprøver ved bruk av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-settet Last 1 reagenspatron (RC) for opptil 96 fullblodprøver ved bruk av QIAsymphony DNA Mini-settet Last tilstrekkelige stativer med engangsfiltertupper, 200 μl (se tabell 8) Last tilstrekkelige stativer med engangsfiltertupper, 1500 μl (se tabell 8) Last 3 enhetsbokser som inneholder prøveklargjøringspatroner Last 1 enhetsboks som inneholder 8- stangdeksler Håndbok for artus CMV QS-RGQ-settet 12/