Diagnostikk av parasittinfeksjonar

Transkript

1 Kompendium i veterinærmedisinsk parasittologi Diagnostikk av parasittinfeksjonar av Bjørn Gjerde 4. utgåve Føreord Del 1 av dette kompendiet gjev eit oversyn over dei mest sentrale, klassiske metodane for diagnostikk av parasittinfeksjonar basert på morfologiske kjenneteikn og mikroskopi. Somme av desse metodane vil bli gjennomgått på kurset, og vil seinare kunna nyttast i klinisk praksis og kjøtkontroll. Sjølv om ein ikkje vil utføra metodane i eigen praksis, er det viktig å kjenna til aktuelle undersøkingsmetodar for ulike parasittgrupper for å kunna ta ut adekvat materiale for innsending til diagnostiske laboratorium. Det er likevel å vona at dette kompendiet, saman med sjølve kurset i parasittologi, skal medverka til at den enkelte veterinær sjølv blir i stand til å identifisera dei vanlegaste parasittane, særleg ektoparasittane, hos våre husdyr. I Del 2 av kompendiet er det figurar av mange av dei viktigaste parasittane i norsk veterinærmedisin. Figurar av vaksne stadium og somme larvestadium er ordna etter parasittane si systematiske plassering. For kvar parasittgruppe er det også ein kort omtale av viktige kjenneteikn. I tillegg er det figurar av ulike overføringsstadium i feces (cyster, oocyster, egg, larver) ordna etter dyreslag. Alle desse figurane vil kunna vera til nytte ved seinare diagnostisk arbeid. Det gjeld særleg for figurane over parasittegg og ektoparasittar. Figurane skal også vera til hjelp under gjennomgangen av ulike parasittar under kurset og ved lesing av andre kompendium i faget. Dei fleste figurane i kompendiet byggjer på publiserte figurar i ulike bøker og tidsskriftartiklar. Originalfigurane er blitt scanna inn og er deretter blitt omarbeidd i større eller mindre grad. Element frå figurar frå ulike kjelder er også blitt kombinerte til nye figurar. Opplysingar om kjeldene til dei ulike figurane i kompendiet kan ein få hos forfattaren. Oslo, 2011 Bjørn Gjerde Bjørn Gjerde

2 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) ii Innhaldsliste DEL 1: DIAGNOSTISKE METODAR... 1 Diagnostikk av parasittinfeksjonar hos levande dyr.. 1 Undersøking av feces for parasittar... 1 Undersøking for magetarmparasittar... 3 Kvalitative metodar... 3 Kvantitative metodar... 5 Larvekultur... 8 Undersøking for leverikteegg... 9 Undersøking for lungeorm... 9 Undersøking for blodparasittar Undersøking for ektoparasittar Undersøking med serologiske metodar Undersøking ved hjelp av blodparametrar Påvising av protozoar ved dyrking Undersøking av daude dyr for parasittar Oversyn over parasittologiske metodar Parasittundersøkingar i offentleg kjøtkontroll DEL 2: MORFOLOGISKE KJENNETEIKN Protozoa Monogenea Trematoda Cestoda Nematoda Strongylida Trichostrongyloidea Strongyloidea Metastrongyloidea Rhabditida Ascaridida Oxyurida Enoplida Arthropoda Acari Metastigmata Mesostigmata Prostigmata Astigmata Insecta Mallophaga Anoplura Heteroptera Diptera Siphonaptera Crustacea Parasittstadium i feces hos husdyr Hos storfe og småfe Hos hest Hos hund og katt Hos gris INNSENDAREN Det lyser i fine klinikkar av skinande ljos mang ein kveld, når dyrlegar ivrige kikkar etter småkryp i smådyras fell. Og glade som barn dei ropar når eitkvart i pelsen dei finn, og nøgd' med seg sjølv' dei det sopar ned i posen og sender det inn. Dei sender det inn til lab'en, til lab'en i Oslo by, for der veit dei meir om skabben enn ein dyrlege ung og ny. Ja, der veit dei meir enn ein stakkar om småkryp i hud og hår, og om runde og flate makkar, som på hunden og katten går. Men Passopp og Pus er kan hende mindre glad' for å vente på svar på den prøven som dyrlegen sende, med rekning til matmor og far Bjørn Gjerde Copyright Bjørn Gjerde Den skriftlege og elektroniske (PDF) versjonen av dette kompendiet er kun til personleg bruk. Det er forbode å kopiera (digitalt eller mekanisk) heile kompendiet eller delar av kompendiet for vidareformidling til andre utan løyve frå forfattaren.

3 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 1 DEL 1: DIAGNOSTISKE METODAR Ei rekkje ulike metodar blir nytta når ein skal påvisa (diagnostisera) parasittinfeksjonar hos våre husdyr, eller når ein ynskjer å studera parasittane sin morfologi, biologi, epidemiologi og toleranse mot ulike antiparasittære medikament. Metodane vil kunna variera etter kva parasitt og utviklingsstadium av parasitten ein leiter etter, og om ein har med levande eller daude vertsdyr å gjera. I det følgjande vil ein hovudsakleg omtala metodar som ein kan ha nytte av i klinisk praksis eller i utøving av offentleg kjøtkontroll. Somme av dei mest sentrale metodane er nokså detaljert omtala. Meir avanserte metodar, som vanlegvis berre blir utførte ved spesiallaboratorium, er berre kort nemnde. Dette gjeld m.a. molekylærbiologiske metodar for påvising og identifikasjon av parasittar, som i dei seinare åra i stigande grad er blitt tekne i bruk også i rutinediagnostikk av parasittinfeksjonar. I mange tilfelle er molekylære metodar, spesielt identifikasjon av spesifikke DNA-sekvensar ved hjelp av DNAisolering, PCR og sekvensering, heilt nødvendig for å stilla ein sikker artsdiagnose på grunn av at fleire arter kan vera heilt like morfologisk. Det er vesentlege skilnader i diagnostikk av parasittære infeksjonar, spesielt av endoparasittar, mellom respektive levande og daude dyr. Dette vil difor bli omtala kvar for seg. DIAGNOSTIKK AV PARASITTINFEKSJONAR HOS LEVANDE DYR Hos levande dyr er det berre ektoparasittane som lever på kroppsoverflata, som ein relativt lett kan påvisa, kvantifisera og identifisera. Endoparasittane er derimot lite tilgjengelege, men dei fleste av dei mange artene som lever i mage-tarmkanalen, levra og luftvegane gjev livsteikn frå seg ved å senda ulike spreiingsstadium (cyster, oocyster, egg, larver) ut med avføringa til verten. Undersøking av feces for slike stadium står difor sentralt i diagnostikken av denne type endoparasittar hos levande dyr. Parasittar som lever i blodet, kan også relativt lett påvisast gjennom undersøking av blodceller eller serum. Direkte påvising av vevsparasittar, t.d. trikinar, er derimot vanskeleg hos levande dyr, men kan av og til lukkast gjennom uttak av ein biopsi. Ei rekkje parasittinfeksjonar, både med endo- og ektoparasittar, kan også påvisast indirekte gjennom bruk av serologiske metodar. I tabellen nedanfor er det gjeve eit grovt oversyn over korleis ein kan påvisa ulike typar endo- og ektoparasittar. Tabell 1.1: Oversyn over tradisjonelle metodar for påvising av infeksjon med ulike typar endo- og ektoparasittar hos levande dyr. Mange parasittar kan i dag også påvisast og identifiserast nøyaktig med molekylære metodar, spesielt karakterisering av utvalde DNA-segment (genotyping). I mage-tarmkanalen Vesentleg ved mikroskopisk påvising av spreiingsstadium i feces; av og til funn av makroskopisk synlege helmintar i feces. Enkelte arter indirekte ved serologi. Endoparasittar Ektoparasittar I gallegangane I luftvegane I blod I vev I hårlag/fjørham, epidermis, hårfolliklar i levra Mikroskopisk påvising av egg (oocyster) i feces. Vesentleg mikroskopisk påvising av egg eller L 1 i feces; av og til i bronkialslim. Enkelte arter indirekte ved serologi. Mikroskopisk påvising i blodceller eller serum. Enkelte arter indirekte ved serologi. Av og til mikroskopisk ved biopsi. Enkelte arter indirekte ved serologi. Makroskopisk lett synlege grupper (flått, hønsemidd, lus, lusfluger, lopper) ved direkte inspeksjon, men helst verifisering av funn med (stereo)mikroskop; andre arter helst ved mikroskopi av materiale frå tapeprøve (Cheyletiella), hudskrap (skabbmidd) eller øyresvaber (Otodectes). Enkelte arter indirekte ved serologi. Undersøking av feces for parasittar Dei fleste aktuelle helmintane hos våre husdyr lever som kjønnsmodne i magetarmkanalen, levra eller lungene. Desse organismane kan vanlegvis ikkje påvisast direkte på levande dyr, men dei sender ut overføringsstadium i form av egg eller larver, som så kan påvisast i feces hos dei infiserte dyra. Ulike fecesundersøkingar har difor ein sentral plass i rutinediagnostikk av helmintinfeksjonar hos levande dyr. Desse undersøkingane gjev likevel eit ufullstendig bilete av parasittstatusen til dyret, sidan ein ikkje kan påvisa førekomst av ikkje-kjønnsmodne stadium (tidleg infeksjon), og sidan det ikkje alltid er nokon klar samanheng mellom egg-/larvemengder i feces og talet på kjønnsmodne helmintar i dyret. Helmintar som lever utanfor fordøyingskanalen og luftvegane kan heller ikkje påvisast. Først når dyret er daudt, og ein kan undersøkja dei ulike organa systematisk for helmintar (og andre parasittar), kan ein danna seg eit påliteleg

4 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 2 bilete av kor sterkt dyret er blitt parasittert. Også dei fleste eincella parasittane hos våre husdyr held til i magetarmkanalen, og sender ut resistente overføringsstadium (cyster, oocyster) med avføringa til dyra. Dette gjeld einvertsparasittar som Giardia, Balantidium, Cryptosporidium, Eimeria og Isospora og tovertsparasittar som Toxoplasma gondii og Sarcocystis (oocyster frå endeverten). Som for helmintane, vil desse overføringsstadia først bli danna og skilde ut frå eit par dagar til eit par veker etter infeksjon, slik at ein ikkje vil kunna oppdaga ein tidleg infeksjon ved hjelp av fecesprøvar. Ein brukar mange av dei same metodane for påvising av oocyster og cyster av protozoar som for påvising av helmintegg. Ein vesentleg skilnad ligg i den avsluttande mikroskoperinga. På grunn av at protozostrukturane (cyster, oocyster) er langt mindre enn helmintegg, må ein bruka større objektivforstørring (minst 10x objektiv mot 2-5x) for å påvisa dei førstnemnde. På grunn av desse skilnadene i storleik kan det vera naudsynt først å undersøkja prøven for helmintegg og dei største protozoane, og så føreta supplerande undersøkingar for å leita etter dei minste protozostrukturane. Uttak, emballering og innsending av fecesprøvar For at ein skal få mest mogeleg korrekt informasjon ut av ei undersøking av fecesprøvar, er det viktig at prøvane blir tekne ut, lagra og eventuelt innsende til eit laboratorium på ein adekvat måte. Fecesprøvar bør takast ut rektalt frå dyret, eventuelt kan ein ta prøvar frå nyleg avsett avføring på bakken eller golvet. I siste tilfelle bør ein ta materiale som ikkje har vore i direkte kontakt med underlaget (jord, strø), slik at ein unngår at prøvane er blitt kontaminerte med frittlevande nematodar. Kor mange dyr ein skal ta prøvar frå, vil vera avhengig av føremålet med undersøkinga (undersøkingar av enkeltindivid, flokkar/- buskapar, kartlegging av førekomsten i større populasjonar). Når ein skal ta ut fecesprøvar rektalt fra hest og storfe (med unnatak av kalv), kan ein nytta ein lang rektaliseringshanske. Når ein tek prøvar frå sau, geit og gris (med unntak av yngre dyr), kan ein nytta ein kort eingongs plast- eller latekshanske. Ein påfører hansken litt glidemiddel, helst av den typen som blir nytta ved fødselshjelp, eventuelt litt spytt. Parafin er ueigna fordi oljedropane skapar problem med å finna egg og oocyster under mikroskoperinga. Ved prøveuttaket fører ein 1-2 fingrar eller heile handa inn i rektum, og tek med seg litt feces ut att. Ein vrengjer deretter hansken, slik at fecesprøven blir liggjande inni han, og noterer individnummeret til dyret eller tilsvarende data, med ein vassfast tusj på utsida av den vrengde hansken. Dei lange rektaliseringshanskane kan ein knyta att, medan ein kan lukka dei korte hanskane ved å rulla dei saman etter at tusjskrifta har turka. Er avføringa svært tuntflytande, bør dei korte hanskane leggjast enkeltvis inni ein plastpose med lynlås. Ein bør klemma ut så mykje luft som mogeleg før hansken blir knytt igjen Fig Røyr for uttak av fecesprøvar frå ungdyr. eller rulla saman, sidan lite luft (anaerobe tilhøve) vil hemma eller heilt hindra embryonering av helmintegg og forseinka klekkinga. Når ein skal ta ut fecesprøvar rektalt hos ungdyr av storfe, sau, geit og gris, kan ein bruka sentrifugerøyr i plast som ein har skore ein opning i botnen på. Denne opninga skjer ein på skrå med kniv, slik som vist i figur 1.1. Den skarpe og skjerande snittflata bør avrundast, t.d. ved å smelta plasten forsiktig over ei flamme. Diameteren på røyra må avpassast etter alderen og storleiken på dei dyra ein skal ta prøvar av. Ein plasserer det avskorne røyret med den øvre enden halvvegs inn i ein opna plastpose med lynlås. Motsett halvdel av røyret blir smurd inn med eit glidemiddel, og blir deretter ført med lett roterande rørsler varsamt inn i rektum av dyret med opninga vendt dorsalt. Er feces pelletert, vil fecesperlene trilla gjennom røyret og ned i posen, er konsistensen tuntflytande, vil feces renna gjennom røyret og ned i posen, og er konsistensen pastøs, vil sjølve røyret bli meir eller mindre fylt med feces. I dei to fyrste tilfella kan ein straks ta bort det brukte røyret; i siste tilfelle kan ein leggja heile røyret med feces i posen. Ein lukkar så posen og skriv dyret sitt individnummer eller namn med tusjpenn utanpå. Er feces svært tuntflytande, kan det vera lurt å leggja den lukka posen med feces oppi ein ny pose med lynlås, og så lukka denne. Frå speddyr kan ein få ut litt feces ved hjelp av ein svaber av same type som blir nytta til å ta ut mikrobiologiske prøvar, eller ein kan nytta ein bomullsspinne (Q-tips). Men slike svaberprøvar er ofte vanskelege å undersøkja vidare. Eit alternativ er å nytta ein glasstav for å ta ut litt feces. Fecesprøvar frå speddyr er mest aktuelle ved ulike protozo-infeksjonar, som kryptosporidiose og koksidiose. Tek ein ut fleire prøvar, kan ein samla alle prøvehanskane/-posane i ein større plastpose. Dersom fecesprøvane ikkje skal undersøkjast innan få timar etter prøveuttak, bør dei plasserast i kjøleskap eller i kjølebag med kjøleelement så fort som mogeleg etter uttaket. Skal prøvane sendast inn til eit laboratorium, legg ein dei i ein behaldar av slagfast plast som blir lukka med eit tett lokk. Det er svært viktig at fecesprøvar (og andre biologiske prøvar) blir emballerte forsvarleg før framsending i posten, slik at pakkane ikkje luktar eller potensielt smittefarleg materiale lek ut. Om sommaren kan temperaturen i prøvane bli så høg under framsendinga at nematodeegga klekkjer eller lungeormlarver døyr (larver av Dictyocaulus viviparus døyr ved temperaturar over 20 o C) før prøvane kan bli undersøkte ved laboratoriet. Det kan då vera aktuelt å senda prøvane i ein boks av isopor saman med eit kjøleelement.

5 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 3 Når fecesprøvar blir sende inn til eit laboratorium, bør følgjande opplysningar vera med: Namn og adresse til dyreeigaren og innsendaren, dato for prøveuttaket, identiteten (nr, namn), alder, rase og kjønn til dyret/- dyra, opplysningar om driftstilhøva (oppstalling inne i fjøs/ute på beite, på bås/i binge saman med andre, beitetilhøve, utsleppsdato, dyretettleik o.l.), eventuelle symptom, og kva ein ønskjer prøven/prøvane undersøkt for (mistanke om spesielle parasittar). Undersøking av feces for egg og oo/cyster av magetarmparasittar Ei lang rekkje protozoar, bendelormar og rundormar er parasittar i magetarmkanalen hos våre husdyr. Dei fleste husdyra kan ha representantar for alle desse gruppene, men vi finn ikkje bendelorm hos høns og gris her i landet. Desse parasittane kan skada mage-tarmkanalen i større eller mindre grad, slik at fôropptak og nedbryting og oppsuging av næringsstoff og væske blir redusert. Blodsugande arter fører til blodtap og anemi. Infeksjonen kan vera subklinisk eller klinisk med unormal avføring og diaré. Den skadelege effekten er avhengig av type og mengde parasittar. I klinisk praksis er det ofte viktig å finna ut om og i kor sterk grad dyra er smitta av ulike magetarmparasittar for å kunna stilla korrekt diagnose og gje korrekt behandling, eller for å kunna setja inn adekvate førebyggjande tiltak. Undersøking av fecesprøver for egg og oo/cyster er blant dei viktigaste hjelpemidla vi har til finna ut dette. Dei metodane som blir nytta ved fecesundersøking kan vera kvalitative (påvising av førekomst/ikkje førekomst av ulike typar egg og oo/cyster, eller kvantitative (fastsetjing av talet på egg og oo/cyster pr. gram feces). Kvantitative undersøkingar blir mest nytta for egg av rundorm (såkalla eggteljing). Påvising av parasittstrukturane skjer ved hjelp av lysmikroskop, eventuelt eit godt stereomikroskop. Ved mikroskoperinga er det høveleg å nytta x totalforstørring (objektiv: 4-10x + okular: 10x) for å finna helmintegg (dei fleste egga er μm store). Dei med lite erfaring, bør bruka 100x forstørring (10x objektiv). For å finna koksidieoocyster (Eimeria, Isospora; dei fleste oocystene er μm store) er x forstørring høveleg, og for Cryptosporidiumoocyster (5 μm) og Giardia-cyster (8-12 μm) x forstørring (20-40x objektiv). Før ein går i gang med den mikroskopiske undersøkinga, bør ein merka seg konsistens og farge av fecesprøven, og om det er slim eller blod på han. Fecesprøvane bør også inspiserast for førekomst av bendelormledd, slik at eventuelle ledd kan undersøkjast nærare. Dette gjeld spesielt for prøvar frå hund og katt. Identifisering av helmintegg: Helmintegg som blir påvist med kvalitative eller kvantitative metodar blir vidare identifisert på grunnlag av storleik og form; farge, tjukn og struktur (glatt, ru) på skalet; og grad av embryonering (ei celle; få/mange kløyvingsceller, larve). Somme egg er artstypiske (t.d. Nematodirus battus), andre eggtypar er felles for fleire/alle arter i ei slekt (t.d. Trichuris), og andre er felles for mange arter i fleire slekter/familiar (strongylide-egg). Til hjelp ved identifiseringa nyttar ein skjematiske figurar og/eller bilete av egg hos ulike dyreslag. Det er ein fordel om mikroskopet har utstyr for måling av storleiken av ulike strukturar i preparata. Artsidentifisering av oocyster: Ofte kan det vera av interesse å artsidentifisera dei oocystene ein finn i feces, for å få vita om oocystene tilhøyrer patogene arter. Hos somme husdyr har oocystene til dei patogene artene såpass karakteristisk morfologi at dei kan identifiserast på grunnlag av storleik, form, farge og veggstruktur av dei usporulerte oocystene. Dermed vil ein raskt kunna få ein indikasjon på om eventuell sjukdom skuldast koksidiar. Men for å få ei meir påliteleg identifisering av alle arter i prøven er det naudsynt å nytta sporulerte oocyster. Fersk feces må då inkuberast i nokre dagar ved romtemperatur til oocystene har sporulert. Det er vanleg å tilsetja ei oppløysing som hemmar vekst av bakteriar og sopp under inkuberinga. Mykje brukt til dette førmålet er 2,5% kaliumdikromat-oppløysing. Etter sporuleringa identifiserer ein oocystene på grunnlag av deira storleik, form, farge og veggstruktur; på grunnlag av tal, storleik og form på sporocystene; storleiken av sporozoitane; og på førekomst av restlekamar i oocystene og sporocystene. Fleire av Eimeria-artene hos høns har så like oocyster at det er uråd å skilja dei sikkert frå kvarandre berre på grunnlag av morfologien. Dei seinare åra er PCR-baserte molekylærbiologiske metodar blitt tekne i bruk for å skilja desse artene og andre morfologisk identiske protozostrukturar i feces (Giardia-cyster, Cryptosporidium-oocyster). 1. Kvalitative metodar Føremålet med dei kvalitative metodane er å sjå om dyret er smitta med ulike typar parasittar. Men dei kvalitative metodane vil også kunna gje ein viss indikasjon om kor sterkt dyret er smitta, sidan ein også vil kunna sjå om det er få, moderate mengder eller store mengder med parasittstadium i prøvane Nativpreparat Ved denne metoden blir ein liten porsjon feces rørt ut i ein drope vatn på eit objektglas (Fig. 1.2a og b), eit dekkglas blir lagt på (Fig. 1.2c), og preparatet blir undersøkt med mikroskop. Når ein nyttar nativpreparat, får ein berre undersøkt ein liten porsjon feces på kvart objektglas. Dersom det er få egg eller oo/cyster i feces, vil det vera små sjansar for å treffa på desse i det vesle fecesvolumet ein undersøkjer. Dei parasittære strukturane, spesielt cyster og oocyster, vil også vera vanskelege å oppdaga fordi dei opptrer saman med talrike fecespartiklar av varierande storleik. Det må difor vera ganske mange egg, cyster eller oocyster i Figur 1.2: Tillaging av eit nativpreparat.

6 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 4 prøven for at ein skal kunna påvisa ein infeksjon sikkert med denne metoden. Bruk av nativpreparat er særleg aktuelt ved mistanke om kryptosporidiose eller koksidiose, då det gjerne vil finnast store mengder med oocyster i feces ved desse tilstandane. Levande trofozoitar (vegetative stadium) av Giardia, trichomonadide flagellatar, amøbar og ciliatar kan av og til påvisast i nativpreparat. Ein rører då ut litt fersk feces i ein drope fysiologisk koksaltoppløysing på eit objektglas, legg på eit dekkglas og mikroskoperer med 20-40x objektiv. Det er særleg ved diarétilstandar ein kan finna desse stadia i feces, men dei går fort til grunne utanfor verten Ufikserte, farga fecesutstryk Metoden blir ein del brukt for påvising av Giardiacyster. Litt feces blir rørt ut i ein drope fortynna Lugolløysing på eit objektglas, dekkglas blir lagt over og preparatet mikroskopert med 20x/40x objektiv. Jod i Lugol-løysinga vil farga cystene gulbrune og ein del av dei indre strukturane til dei to trofozoitane inni cystene blir også synlege, slik at cystene lettare kan skiljast frå andre fecespartiklar Fikserte, farga fecesutstryk Metoden blir vesentleg brukt for påvising av visse protozoar, og var tidlegare mykje brukt ved undersøking av feces for kryptosporidieoocyster. Ein rører ut litt feces i ein drope vatn på eit objektglas, og fordeler suspensjonen jamnt utover objektglaset med ein glastav. Ein let så utstryket luftturka, før ein fikserer det i metanol. Utstryket kan deretter fargast med ein eigna fargemetode Konsentrasjonsmetodar For å auka sjansane for påvising av egg og oo/cyster, må ein undersøkja ei større fecesmengde. Dette kan ein sjølvsagt gjera ved å undersøkja mange nativpreparat, men det er tidkrevande og upraktisk. I staden brukar ein metodar som konsentrerer, eller samlar, dei fleste egga (oocystene, cystene) frå eit relativt stort volum av feces, i eit mykje mindre volum, som reint praktisk let seg undersøkja med mikroskop. Samtidig blir egga (oocystene, cystene) separert frå mange av dei andre partiklane i feces, slik at dei blir lettare å oppdaga og kvantifisera. Dei aktuelle konsentrasjonsmetodane baserer seg på at egga (oocystene, cystene) søkk til botnen (sedimenterer) i væsker med lågare spesifikk vekt enn dei sjølv har, t.d. i vatn med spesifikk vekt ca. 1,000, medan dei flyt opp og held seg flytande (floterer) i væsker med høgare spesifikk vekt enn deira eiga, dvs. i ulike saltog/eller sukkeroppløysingar, som bli kalla flotasjonsvæsker. Fecespartiklar med ei anna spesifikk vekt enn egga (oo/cystene) vil sedimentera og flotera på ein annan måte enn egga (oo/cystene), og vil dermed kunna separerast frå desse. Dersom ein fecesprøve blir rørt ut i vatn, vil fecespartiklar med ei lågare spesifikk vekt enn egga og oo/cystene, sedimentera saktare enn desse, eller halda seg svevande i vatnet. Desse partiklane blir fjerna saman med supernatanten etter sedimentering eller sentrifugering. Blir derimot fecesprøven rørt ut i ei flotasjonsvæske med høgare spesifikk vekt enn egga (oo/cystene), vil dei parasittære strukturane flyta opp saman med lette partiklar, medan fecespartikler med høgare spesifikk vekt enn flotasjonvæska vil søkkja til botnen. Det ideelle er difor å nytta flotasjonsvæsker med akkurat passeleg spesifikk vekt i høve til dei strukturane ein leitar etter, slik at flest mogeleg av dei tyngre fecespartiklane ikkje floterer saman med egga (oo/cystene), men søkk til botnen. Ved å sentrifugera prøvane påskundar ein sedimenteringa og sparer tid. Flotasjonsvæskene er osmotisk aktive og trekkjer væske ut av egg og oo/cyster, slik at desse strukturane etter kvart blir deformerte og ugjenkjennelege og til slutt kollapsar heilt og søkk ned i væska. Kor raskt denne deformeringa skjer, varierer frå nokre få minutt til ca. ein halvtime, avhengig av flotasjonsvæske og parasitt. Etter tillaging av flotasjonspreparat må ein venta lenge nok til at egga (oo/cystene) rekk å flotera til øvste sjikt, men ikkje så lenge at dei kollapsar og søkk ned att. Ventetida er avhengig av preparatet, sidan strukturane sjølvsagt floterer raskare til topps i eit 0,5 mm tunt sjikt av flotasjonsvæske på eit objektglas enn i ei 15 cm høg væskesøyle i eit sentrifugerøyr i eit stativ. Mange av flotasjonsvæskene er metta oppløysingar av salt og/eller sukker. I opne behaldarar eller på eit objektglas (på eit varmt objektbord) vil vatnet gradvis fordampa, og salt og/eller sukker vil fellast ut att. Desse salt- og sukkerkrystallane vil kunna skapa problem med å finna dei parasittære strukturane, slik at ein bør få undersøkt flotasjonspreparata relativt raskt før dei har tørka for mykje ut Flotasjon Feces blir rørt ut i ei sukker- eller saltoppløysing (flotasjonsvæske) som har høgare spesifikk vekt enn egga (oocystene, cystene). Suspensjonen står i min. i eit sentrifugerøyr i eit stativ, eller blir sentrifugert ved 1500 omdreiingar/min. i 2-3 min. Egga (oo/cystene) vil då flyta opp og liggja i øvste væskesjikt. Dei vil då følgja med om ein overfører nokre dropar væske frå dette sjiktet med ein glasstav eller ei podenål til eit objektglas. Ein legg eit dekkglas over væska på objektglaset, og undersøkjer preparatet under mikroskop. På objektglaset vil egga (oo/cystene) også flyta opp til dei blir stansa av dekkglaset, slik at ein må fokusera mikroskopet på sjiktet rett under dekkglaset. Ein kan også fylla sentrifugerøyret til litt over toppen med flotasjonsvæske og leggja eit dekkglas på toppen av røyret. Etter at det har stått slik i min, overfører ein dekkglaset med ein drope flotasjonsvæske hangande på undersida, til objektglaset. Ein kan også røra ut litt feces direkte i nokre dropar flotasjonsvæske på eit objektglas ved hjelp av ein glasstav, for så å leggja på eit dekkglas og undersøkja preparatet med mikroskop. Dette liknar undersøking av nativpreparat, men eventuelle egg og oo/cyster vil no

7 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 5 flyta opp og finnast i sjiktet like under dekkglaset. Ved bruk av sukkerhaldige flotasjonsvæsker vil m.a. Giardia-cyster og Cryptosporidium-oocyster få eit rosa fargeskjær, og desse strukturane vil relativt lett kunna påvisast. Denne enkle metoden er difor svært nyttig for påvising av infeksjonar med desse parasittane. Metoden er også grei å bruka når ein har svært lite fecesmateriale til disposisjon. Flotasjonsvæsker for helmintegg, oocyster og cyster I det følgjande er oppskrifter og bruksområde for ein del vanleg brukte flotasjonsvæsker førte opp. Dei fleste oppskriftene seier kor mykje salt eller sukker som skal løysast i 1 liter vatn. Sluttvolumet kan då bli opptil 2 liter. Ein kan sjølvsagt laga mindre volum og tilpassa salt- og sukkermengderne etter dette. Andre oppskrifter seier kor mykje salt/sukker og vatn som trengst for å få eit sluttvolum på 1 liter flotasjonsvæske. For å letta oppløysinga, blir salt eller sukker rørt ut i oppvarma vatn. Metta NaCl-oppløysing: Denne flotasjonsvæska har spesifikk vekt 1,180-1,200. Ein lagar henne ved å tilsetja ca. 400 g NaCl til 1 liter vatn. Dette er den vanlegaste flotasjonsvæska, særleg ved fecesundersøkingar av drøvtyggjarar og hest, og ho er billeg (nyttar vanleg koksalt kjøpt i butikken). Denne oppløysinga floterer strongylide-egg (Strongyloidea, Trichostrongyloidea), egg av Strongyloides og Oxyuris, egg av bendelormane Moniezia og Anoplocephala, og cyster, sporocyster og oocyster til dei fleste protozoane. Ho er ikkje tilstrekkeleg effektiv mot andre cestodar enn Moniezia og Anoplocephala, eller mot egg av spolormar (Ascarididae), Trichuris og Capillaria. ZnCl 2 -NaCl-oppløysing: Spesifikk vekt er 1,3. Ho blir laga ved å tilsetja 275 g ZnCl 2 og 262 g NaCl til 1 liter vatn. Denne flotasjonsvæska er svært god til fecesundersøkingar hos hund, katt og gris. Ho floterer dei fleste eggtypar, bortsett frå ikte-egg, og gjer liten skade på egg og larver. Metta sukrose-oppløysing: Spesifikk vekt er 1,28. Ho blir laga ved å løysa opp 1300 gram sukker i 1 liter vatn. Ein tilset også 10 ml konsentrert formalin for å hindra oppvekst av sopp. Oppløysinga kan nyttast for å påvisa egg, oocyster og cyster hos både drøvtyggjarar og einmaga dyr. Oppløysinga er meir viskøs enn saltoppløysingar, slik at det t.d. er lettare å få ein drope til å hanga fast på ein glasstav eller under eit dekkglas når ein skal overføra litt flotasjonsvæske til eit objektglas (sjå nedanfor). Egg og oo/cyster floterer saktare i den viskøse sukkeroppløysinga enn i reine saltoppløysingar. NaNO 3 -oppløysing: Mest brukt er ei oppløysing med spesifikk vekt 1,2, som blir laga ved å tilsetja 350 gram natriumnitrat til 1 liter vatn. Denne oppløysinga har dei same flotasjonseigenskapane som metta NaCloppløysing. Metta MgSO 4 -oppløysing: Spesifikk vekt er 1,250. Ho blir laga ved å tilsetja 920 g MgSO 4 til 1 liter vatn. Ho er mest brukt til fecesprøvar frå hund, katt og gris. Ho floterer egg av spolorm, Trichuris og cestodar, men skadar egg og larver av nokre arter. HgJ 2 -KJ-oppløysing: Spesifikk vekt er 1,440. Ho blir laga ved å tilsetja 375 g kvikksølvjodid og 278 g kaliumjodid til 1 liter vatn. Ho blir brukt til påvising av egg av Dicrocoelium dendriticum. Ho kan også brukast til påvising av egg av Fasciola hepatica, men sedimenteringsmetodar er betre til påvising av Fasciola-egga Sedimentasjon Feces blir rørt ut i vatn, og grove partiklar blir silt frå. Suspensjonen står ei stund til sedimentering, supernatanten blir så sogen eller helt av, og botnfall (med eventuelle egg eller oocyster) blir mikroskopert. Metoden blir mest nytta for Fasciola-egg, som har høg spesifikk vekt, og som lett blir deformerte i dei flotasjonsvæskene med høg spesifikk vekt som må til for å få egga til å flyta opp (sjå seinare). Oocystene til Eimeria leuckarti hos hest har også så høg spesifikk vekt at dei ikkje flyt opp i dei flotasjonsvæskene som ein vanlegvis nyttar til fecesundersøkingar hos dette dyreslaget, og desse oocystene blir difor påvist etter sedimentering i vatn. 2. Kvantitative metodar Kvantitative metodar blir nytta for å fastsetja talet på egg og oocyster pr. gram feces, forkorta til respektive EPG og OPG. Sidan ein tel kor mange egg (oocyster) det er i ein viss del av prøven, blir desse metodane gjerne kalla for eggteljing eller oocysteteljing. Som ved dei kvalitative metodane, gjer ein seg nytte av at egga og oo/cystene sedimenterer i vatn og flyt opp i flotasjonsvæsker med høg nok spesifikk vekt. Kvantitative sedimenteringsmetodar blir sjeldan nytta for magetarmparasittar (av og til for Eimeria leuckarti hos hest), men blir ein del nytta for egg av leverikter (sjå seinare) Flotering og teljing av parasittegg (oocyster) i teljekammer Det finst i dag fleire typar teljekammer på marknaden, men det eldste og best kjente av dei er det såkalla McMaster-teljekammeret, som blei oppfunne og produsert av McMaster-laboratoriet i Australia. På grunn av dette blir eggteljing ved hjelp av teljekammer ofte kalla McMaster-metoden. Eit slikt teljekammer er oppbygt av to parallelle glasplater av omlag same storleik som eit vanleg objektglas (Figur 1.3). Den øvre glasplata er litt smalare enn den nedre. Mellom dei to glasplatene ligg tre korte og 0,15 cm tjukke glasplater, som deler rommet mellom øvre og nedre glasplate inn i to kammer. Kvart av desse kamra rommar 0,5 ml væske når dei er heilt fylte. På øvre glasplate er det rita inn to kvadratiske felt på 1 cm x 1 cm = 1 cm 2. Desse rutene er inndelt i fleire mindre rektangulære felt for å letta teljinga. Sidan avstanden mellom glasplatene er 0,15 cm, vil kvar rute avgrensa eit væskevolum på 1 cm x 1 cm x 0,15 cm = 0,15 cm 3 = 0,15 ml når kammeret er fylt.

8 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 6 Fig Eit McMaster-teljekammer. Ein fyller rommet mellom dei to glasplatene med suspensjonen av feces og flotasjonsvæske ved hjelp av ei pipette. Egg og koksidieoocyster vil flyta opp, og ligg etter kort tid (2-3 min.) like under øvre glasplate. Ein fokuserer mikroskop eller lupe like under øvre glasplate (slik at ein kan sjå hjelpestrekane i øvre glasplate) og tel alle egg (oocyster) innanfor dei to 1 cm 2 store rutene. Ein har då telt alle egg (oocyster) som var i eit volum på 0,30 cm 3 (0,3 ml). Den øvre glasplata i teljekammeret er så tjukk at ein ved mikroskoperinga maksimalt kan nytta 10x objektiv, vanlegvis nyttar ein berre 4-5x objektiv. Forsøk på bruk av 20x objektiv eller meir endar ofte med knust teljekammer og/eller objektiv! Bruk av opptil 10x objektiv er tilstrekkeleg for påvising av helmintegg og dei fleste koksidieoocyster (Eimeria, Isospora), men er ikkje tilstrekkeleg for påvising av Giardia-cyster og kryptosporidieoocyster. Ved kvantitativ undersøking blandar ein altså ut ei kjend mengde feces (2 gram) med flotasjonsvæske (58 ml) til ein homogen suspensjon med eit kjent volum (60 ml) [alternativt 3 gram feces i 87 ml vatn]. Alle parasittegga som fanst i 2 gram feces, vil då finnast i 60 ml suspensjon, dvs. at talet på egg i 1 gram feces (=EPG) er lik talet på egg i 30 ml fecessuspensjon. Ved hjelp av eit McMaster-teljekammer tel ein alle egga innanfor dei to kvadratiske rutene, dvs i 0,30 ml av suspensjonen, og ved å multiplisera dette talet med 100 får ein talet på egg pr. gram feces (0,30 ml x 100 = 30 ml ). Minste påvisbare mengde i teljekammeret er eitt egg, som altså tilsvarar 100 egg pr. gram feces. Dette medfører at det må vera minst 100 egg per gram feces for at ein skal påvisa ein infeksjon ved denne varianten av metoden (sensitiviteten er 100 EPG). Dersom ein tel alle egg innanfor dei fire rutene i to teljekammer, dvs. i 0,6 ml, multipliserer ein eggtalet med 50 for å få talet på egg pr. gram. Minste påvisbare mengde tilsvarar då 50 EPG. Ved å endra på høvet mellom feces og flotasjonsvæske og/eller volum ein undersøkjer i teljekammeret kan ein altså endra på sensitiviteten til metoden (nedre grense for påvising av infeksjon). I nyare utgåver av teljekammera er volumet ein undersøkjer, blitt auka for å auka sensitiviteten. Til dømes har Whitlock universalkammer fire kammer mellom dei to glasplatene og fire teljefelt. Kvart kammer rommer 0,5 ml suspensjon, slik at ein totalt tel alle egg i 2 ml suspensjon. I ein vanleg variant av metoden rører ein ut 3 gram feces i 57 ml flotasjonsvæske, slik at ein får 60 ml suspensjon (20 ml for kvart gram; 2 ml for 0,1 gram). Eitt påvist egg tilsvarar dermed 10 EPG, slik at minste påvisbare mengde med denne varianten av metoden blir 10 egg pr. gram feces. Før undersøkinga i teljekammeret må feces rørast godt ut til ein homogen suspensjon, slik at eventuelle egg er mest mogeleg jamnt fordelte i suspensjonen når teljekammeret blir fylt. Feces kan rørast direkte ut i flotasjonsvæska, eller ein kan først røra feces ut i vatn, som så blir erstatta av flotasjonvæske etter sentrifugering eller sedimentering. Det er også vanleg å sila den utrørte suspensjonen av feces i vatn eller av feces i flotasjonsvæske gjennom ein sil for å fjerna grove fecespartiklar. Teljekammer, silar og anna utstyr som er i kontakt med feces, må spylast grundig mellom kvar prøve for å hindra krysskontaminering mellom prøvane, noko som kan føra til falske positive prøvar. Ved koksidioseutbrot er det gjerne så mange oocyster i feces at det er naudsynt å fortynna fecessuspensjonen før teljing i teljekammer. Ein undersøkjer først ein ufortynna suspensjon og tel eventuelle helmintegg. Deretter fortynner ein den opphavelege fecessuspensjonen 1:10 eller 1:100 med flotasjonsvæska (1 ml av den opphavelege suspensjonen til 9 ml eller 99 ml flotasjonsvæske) og fyller teljekammeret med denne. Ein må hugsa på å blanda den opphavelege suspensjonen godt før ein tek ut suspensjon til fortynning. Dei påviste oocystala må då multipliserast med fortynningsfaktoren (10 eller 100) for å få talet på oocyster pr. gram Utrøring av feces direkte i flotasjonsvæska Ved mange laboratorium rører ein feces direkte ut i den flotasjonsvæska ein skal nytta. Deretter siler ein suspensjonen og fyller teljekammeret. Følgjande metode kan utførast med enkelt eingongsutstyr, bortsett frå sjølve teljekammeret og mikroskopet (Figur 1.4). Utstyr: To eingongs drikkebeger, det eine med utklipt botn, teskjei, eit stykke gas, pipette med gummismokk, 58 ml konsentrert NaCl-oppløysing (eller anna flotasjonsvæske), teljekammer. Utføring: Ein rører ut 2 g feces i 58 ml saltoppløysing i det eine begeret ved først å tilsetja litt av saltoppløysinga og røra godt til det blir ei homogen blanding. Deretter fortynner ein med resten av saltoppløysinga. Når alt er godt utrørt, legg ein eit stykke gas utanpå botnen på det avklipte begeret, og trykkjer dettened i begeret med fecessuspensjonen. Ein får dermed silt suspensjonen og fjerna dei grove fecespartiklane. Ein rører godt i den silte suspensjonen med teskjeia, og fyller deretter straks pipetta, medan egga framleis er jamnt fordelte i suspensjonen, og ikkje har flotert. Ein fyller eitt av romma i teljekammeret, rører på ny i suspensjonen, og fyller pipetta og det andre rommet i teljekammeret. Ein let kammeret stå i 1-2

9 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 7 Fig Utføring av flotasjonsmetode med enkelt utstyr. minutt, før ein mikroskoperer og tel alle egga inni dei to rutene. Det funne eggtallet (i begge rutene) blir multiplisert med 100 for å få talet på egg per gram feces Utrøring av feces i vatn, sentrifugering; utrøring av botnfall i flotasjonsvæska Ved Parasittologisk lab., NVH, er det blitt nytta ein metode som kombinerer sedimentering og flotering. To (eller tre) gram feces blir homogenisert i 58 ml (87 ml) vatn i ein hurtigmiksar. Den homogeniserte suspensjonen blir silt gjennom ein spesiell metallsil med maskevidde 250 μm (60 mesh) ned i ei skål med helletut. Ein fyller eit sentrifugeglas nesten til randa med den silte suspensjonen, sentrifugerer ved 3000 omdreiingar/min i 3 min., og slår av supernatanten. Like før eggteljing slår eller ristar ein laus botnfallet og fyller sentrifugeglaset med flotasjonsvæske til same nivå som før sentrifugeringa. Deretter sørgjer ein for at botnfallet blir godt blanda med flotasjonsvæska ved å snu sentrifugeglaset roleg opp ned 8-10 gonger medan ein held for den opne enden av glaset med tommelen. Ein må ikkje rista glaset, sidan dette fører til sterk innblanding av luftbobler i suspensjonen, noko som påverkar floteringa og gjev problem ved teljinga. Etter å ha fått ein jamn suspensjon, blir noko av suspensjonen overført til eitt eller to teljekammer med ei pipette. Sentrifugeringa av prøven utrørt i vatn medfører ei forsert sedimentering av egga og oocystene, og når ein slår av supernatanten fjernar ein mange av dei lette fecespartiklane. Når vi så resuspenderer botnfallet i flotasjonsvæska, får vi ein mykje klarare suspensjon enn om vi hadde rørt feces direkte ut i flotasjonsvæska. Ein klarare suspensjon lettar påvisinga og teljinga av egg og oocyster etter floteringa i teljekammeret. Vurdering av egg- og oocystemengder i feces Når ein har undersøkt fecesprøven kvantitativt for egg og/eller oocyster, må ein føreta ei vurdering av dei funne eggtala og/eller oocystetala. Sjølv om prøven er negativ (ingen egg/oocyster), kan ein ikkje utelukka at dyret likevel er infisert. Det kan ha gått for kort tid frå smittetidspunktet, slik at utskiljinga av parasittar enno ikkje har starta. Egg av enkelte rundormar kan klekkja dersom det går for lang tid mellom uttak og undersøking av prøven, eller dersom prøven ligg for varmt fram til undersøking. Utklekte larver vil ikkje flotera på same måte som egga, og vil ikkje så lett bli oppdaga under eggteljinga. I svaret til dyreeigaren bør ein difor nøya seg med å konstatera at det ikkje blei påvist egg (oocyster) i den undersøkte prøven, og ikkje konkludera med at dyret var fri for parasittar. Dersom prøven er positiv, kan ein heller ikkje uten vidare slå fast at dyret er infisert med den parasitten ein har funne egg (oocyster) av. Uembryonerte og delvis embryonerte egg og usporulerte og delvis sporulerte oocyster vil kunna passera uendra gjennom fordøyingskanalen. Hos gris er koprofagi svært vanleg, og det vil difor ofte finnast spolormegg i feces frå smågrisar under 6-7 vekers alder, sjølv om prepatenstida for spolormen er 6-8 veker. I bingar med både spolorminfiserte og uinfiserte slaktegrisar, vil ofte dei uinfiserte dyra også skilja ut små mengder med egg. Ved førekomst av små mengder egg eller oocyster bør ein difor vurdera om dette kan skuldast koprofagi (egga eller oocystene er då tarmpassantar). Når dyra har få egg pr. gram avføring, tyder dette på ein lett infeksjon (få ormar i tarmen), moderate eggtal tyder på ein moderat infeksjon, medan høge eggtal tyder på ein sterk infeksjon. Men hoer av ulike arter har ulik evne til eggproduksjon (fekunditet), slik at grensene for kva som er få egg, moderate mengder med egg og mange egg per gram feces vil variera med parasittart/-gruppe og dyreart, slik som vist i Tabell 1.2. for egg av strongylidar og trichostrongylidar hos hest, storfe og sau. Tabell 1.2: Vurdering av mengde strongylide-egg hos ulike dyreslag. Husdyr Få Moderat Mange Hest < 500 epg epg > 1500 epg Storfe < 500 epg epg > 1000 epg Sau < 1000 epg epg > 2000 epg* * Ved infeksjon med Haemonchus contortus, som produserer mange egg, må eggtala vera >5000 for å bli rekna som høge.

10 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 8 Imunreaksjonar frå verten kan hemma ormane si eggutskiljing. Det totale volumet av feces vil også påverka talet på egg pr. gram (eggkonsentrasjonen). Eit lågt fôrinntak vil føra til redusert fecesvolum og større eggkonsentrasjon, medan diarétilstandar med voluminøs feces vil føra til lågare eggkonsentrasjon. Det er såleis ikkje alltid eit klart (lineært) samsvar mellom eggtala og talet på (vaksne) ormar i dyret, men om vi tolkar tala rett, får vi eit ganske bra inntrykk av infeksjonsgraden. Og eggteljing er ofte det einaste alternativet vi har til å få vita kor sterkt levande dyr er smitta, slik at vi eventuelt kan behandla dyra for å unngå klinisk sjukdom eller hindra produksjonstap. Vi får også vita i kor stor grad dyra medverkar til utsmitting av miljøet med egg. Sjølv om dyra ikkje er særleg plaga av parasittane, kan det likevel vera gunstig med medikamentell behandling for å redusera utskiljinga av egg. Kvantitativ undersøking med fastsetjing av mengde oocyster per gram feces (OPG) er først og fremst aktuelt ved Eimeria-infeksjonar hos storfe, sau, geit og kanin, og Isospora-infeksjonar hos hund, katt og gris. Hos desse dyreslaga må oocystetal under OPG karakteriserast som låge, tal mellom og OPG som middels høge, og oocystetal over OPG som høge. Det er ikkje uvanleg å finna oocystetal på over 1 mill. OPG hos dyr i den akutte fasen av ein førstegongsinfeksjon. Vurderinga av oocystetal kan vera vanskeleg, fordi det meste av oocysteutskiljinga skjer i løpet av nokre få dagar. Prøvar blir ofte først undersøkt etter at dyret har vore sjukt i ei stund, og då kan oocysteutskiljinga vera på retur. Men ved kraftige infeksjonar vil symptom kunna opptre før oocysteutskiljinga har kome skikkeleg i gang, og då vil heller ikkje oocystemengdene i feces vera av særleg verdi. Det er heller ikkje alltid noko godt samsvar mellom mengda av oocyster og graden av kliniske symptom. Dette skuldast dels at det ikkje er direkte samsvar mellom patogeniteten og reproduksjonsevna til dei enkelte artene. Ved mistanke om koksidioseutbrot i ein flokk, bør ein ta prøvar av fleire dyr for å auka sjansane for å finna dyr med (stor) oocysteutskiljing. Ein må også vurdera oocystetala ut frå alderen til dyret, smittetilhøva, og kor lang tid det har gått sidan beiteslepp (hos ungfe og lam). Etter kvart som dyra blir immune mot koksidiar, vil oocystetalet i feces gå ned. Larvekultur Mange arter i overfamiliane Trichostrongyloidea og Strongyloidea i ordenen Strongylida dannar svært like egg. Desse egga er tunnskala og inneheld få kløyvingsceller når dei blir skilde ut. Dei blir kalla (typiske) strongylide-egg. Vil ein vita kva slekter/arter i denne gruppa dyra er smitta av, er det naudsynt å la utviklinga gå vidare fram til det infektive L 3 -stadiet, som har ein arts- eller slektstypisk morfologi. Denne framdyrkinga av L 3 frå egga blir kalla larvekultur. Ein blandar då feces med torvstrø eller anna porøst materiale og inkuberer dette i varmeskap ved 27 C i 7 dagar. Ferdig utvikla L 3 kan så identifiserast til slekt og somme også til art. Er det nok larver i prøven, identifiserer ein gjerne 100 larver (dei 100 første ein finn). Ein får då eit representativt bilete av arts-/slektsfordelinga til larvene, samstundes som det er lett å rekna om tala til prosent. Den same prosentfordelinga blir så nytta for å estimera fordelinga av strongylide-egga på ulike slekter/arter. Dersom eggteljinga viste at sauen hadde 1000 strongylide-egg pr. gram og larvekulturen viste at 80% av larvene (L 3 ) tilhøyrte arta Haemoncus contortus, 15% slekta Ostertagia og 5% slekta Trichostrongylus, seier ein altså at sauen hadde 800 Haemonchus-egg, 150 Ostertagia-egg og 50 Trichostrongylusegg pr. gram. Dette blir stort sett korrekt sidan ein om lag like stor del av egga til dei ulike artene vil utvikla seg til L 3 under dei nemnde inkuberingstilhøva. Er det få larver i prøven, må ein differensiera dei ein finn, men resultatet blir ikkje like påliteleg. Larvekultur blir mest nytta i parasittundersøkingar av hest og drøvtyggjarar, sidan det er hos desse artene vi finn mest strongylide-egg. Metoden er nyttig når ein studerer effekten av anthelmintika på ulike arter, og i epidemiologiske studiar (t.d. over sesongmessige variasjoner i eggutskiljinga til ulike arter). Hos sau og geit er metoden også nyttig diagnostisk for å få stadfesta/avkrefta mistanke om haemonchose (basert på høge eggtal og/eller anemi). Hos hest er metoden aktuell for å finna ut om dyra er smitta av både Strongylus vulgaris og små strongylidar. Metode for larvekultivering Ein porsjon feces (10 gram eller meir) blir blanda med fuktig torvstrø i eit beger, og ei petriskål blir lagt over som lokk. Kulturen står så i varmeskap ved 27 o C i 7 dagar. Etter 7 dagar blir begeret fylt med vatn til randa, lokket blir lagt på att, og ein snur beger med lokk opp ned og fyller på med meir vatn i petriskåla. Ein legg ein fyrstikkbit eller spiker mellom randa av begeret og botnen av petriskåla, slik at det blir ei lita opning der larvene kan koma ut. Begeret står i nokre timar til larvene har krope ut av torvstrøet i begeret, og finst langs randa av petriskåla. Vatn med larver i blir deretter soge opp med ei pipette, og overført til eit sentrifugeglas [metoden for isolering av larvene frå larvekulturen er ein variant av Baermanns metode, så seinare]. Nokre dropar av denne væska blir overført til eit objektglas. Larvesuspensjonen blir tilsett ein drope fortynna Lugol for å drepa larvene. Eit dekkglas blir lagt over, og preparatet blir undersøkt i mikroskop med 10x objektiv. Larvene blir så identifisert til art eller slekt på grunnlag av morfologien. Ein nyttar m.a. larva si storleik og form (tjukk/tunn), talet og forma på tarmcellene og utsjånad av den ytre L 2 -kutikulaen (kutikulaskjeda), særleg lengd og form på halen, dvs. den delen av skjeda som strekkjer seg bakanfor bakre ende av larven. Denne delen kan vera kort eller lang og piskeliknande. Det er utarbeidd identifiseringsnøklar for infektive nematodelarver hos ulike dyreslag.

11 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 9 Påvising av leverikteegg i feces Egga til den vesle leverikta, Dicrocoelium dendriticum, og den store leverikta, Fasciola hepatica, kjem til tunntarmen med gallen og blir skilde ut med feces. Egga til begge leveriktene har høg spesifikk vekt, slik at dei ikkje floterer og let seg påvisa ved hjelp av dei flotasjonsvæskene som rutinemessig blir nytta til påvising og kvantifisering av egg og oo/cyster av parasittar i magetarmkanalen til dei aktuelle vertane (storfe, småfe). Flotasjon kan utførast med kvikksølvhaldige flotasjonsvæsker med høg spesifikk vekt, som HgJ 2 -KJ-oppløysing (spesifikk vekt 1,440), men dette blir lite nytta. I staden nyttar ein sedimentasjon i vatn for Fasciola hepatica-egg, og av og til også for Dicrocoelium-egg. Undersøkinga kan vera kvalitativ (påvising av egg) eller kvantitativ (egg pr. gram feces). På grunn av porsjonsvis tøming av gallen frå galleblæra, vil utskiljinga av iktegg vera uregelmessig. Resultatet frå ein enkelt prøve kan difor vera misvisande. Egg vil heller ikkje bli skilde ut dei første vekene etter infeksjon. Sedimentasjon Følgjande kvantitative metodar kan nyttast for ikte-egg, spesielt for Fasciola hepatica-egg. Framgangsmåte (Benedeks metode, modifisert av Six): Ein veg opp ein porsjon feces, som bør vera 5-10 g for storfefeces og ca. 3 g for småfefeces. Oppvegd porsjon blir rørt ut med vatn tilsett eit overflatespenningsreduserande middel (Tween), og suspensjonen blir silt gjennom ein sil med maskevidde 250 μm (60 mesh) ned i ei skål. Suspensjonen blir overført til eit spissglas (glas med form som ei omvend kjegle), som blir fylt ca. 10 cm opp (200 ml). Etter ca. 3 min vil egga ha sokke til botnen av spissglaset, medan større fecespartiklar framleis vil vera flytande/svevande, og væska (supernatanten) blir sogen av til det er att 2 cm. Spissglaset blir på ny fylt med vatn til ca. 10 cm væskehøgde, suspensjonen får sedimentera i 3 min, og væska blir sogen av til 2 cm er att. Denne prosessen blir teken opp att ytterlegare 1-2 gonger for å fjerna mest mogeleg av fecespartiklane. Etter siste avsuging (eller dekantering) blir botnfallet tilsett nokre dråpar 1% methylenblåttløysing. Plantedelane blir då blå, medan egga blir gule. Det farga botnfallet blir helt over i ei plan petriskål (6-8 cm diameter), og blir undersøkt med stereomikroskop ved 20x forstørring. Alle egga blir talde. Ved å dela talet på egg med vekta av undersøkt fecesporsjon, finn ein talet på egg pr. gram feces. Ved Parasittologisk lab., NVH, er det blitt nytta ein modifisert metode. Som overflatespenningsreduserande middel blir det nytta ei Zalo-løysing som er framstilt av 1-2 ml Zalo pr. liter vatn. Ved hjelp av ein hurtigmiksar som blir køyrt med liten fart, blir fecesprøven blanda ut i ml væske, som er samansett av ml reint vatn og ml Zalo-løysing. Den vesle tilsetjinga av Zalo gjer at fecespartiklane ikkje blir sitjande att høgt oppe på glasveggen i hurtigmiksarbehaldaren under homogeniseringa, utan at det blir noko særleg ekstra skumming. Den homogeniserte suspensjonen blir overført til eit spissglas, og ein gjennomfører same sedimenteringsprosedyre som nemnt ovanfor. I staden for metylenblått nyttar ein nokre dråpar Lugol eller jodtinktur til farging av botnfallet. Etter å ha stått nokre minutt, blir botnfallet avfarga med Na-thiosulfat til gulfargen er nesten borte. Ikte-egga er då brune og glinsande. Påvising av egg og larver av lungeorm i feces Lungeormane hos våre husdyr tilhøyrer overfamiliane Trichostrongyloidea og Metastrongyloidea i ordenen Strongylida og overfamilien Trichuroidea i ordenen Enoplida (Tabell 1.3). Dei har anten ein direkte livssyklus (Dictyocaulus spp., Oslerus osleri, Capillaria aerophila) eller ein indirekte livssyklus med mellomvert, som er meitemakk eller sniglar (alle i Metastrongyloidea med unntak av Oslerus osleri). Egg og L 1 frå lungeormane blir frakta opp luftvegane til svelget, der dei fleste blir svalde og kjem ut med feces. Elaphostrongylus-artene lever som vaksne på muskelfasciane, men sender egg med blodet til lungekapillæra, der dei klekkjer, slik at L 1 blir skilde ut via luftvegane. Bortsett frå Capillaria aerophila set artene fri embryonerte egg, og hos mange av artene klekkjer egga under ferda ut gjennom luftvegar og tarmkanal, slik at vi finn L 1 i feces. Egg av Dictyocaulus arnfieldi, Metastrongylus elongatus og Capillaria aerophila kan påvisast ved hjelp av dei same flotasjonsmetodane som ein nyttar for påvising av egg av magetarmparasittar hos dei aktuelle dyreslaga (sjå framanfor). Dette er arter som er svært sjeldne hos norske husdyr. L 1 av Oslerus osleri blir i liten grad skilde ut i feces, og må påvisast i trachealslim. Infeksjon med denne parasitten kan også påvisast ved endoskopi av dei karakteristiske knutane (koloniar av ormar) i trakealslimhinna nær bifurkaturen. Infeksjon med dei resterande artene av lungeorm blir diagnostisert gjennom påvising av L 1 i feces med den såkalla Baermann-metoden.

12 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 10 Tabell 1.2: Oversyn over lungeormar hos norske husdyr og kva stadium som blir nytta for påvising av infeksjon hos levande dyr. Art Vert Diagnostisk stadium Førekomst i Norge TRICHOSTRONGYLOIDEA Dictyocaulus viviparus Dictyocaulus filaria Dictyocaulus eckerti Dictyocaulus arnfieldi METASTRONGYLOIDEA Metastrongylus elongatus Muellerius capillaris Protostrongylus spp. Cystocaulus sp. Elaphostrongylus rangiferi Elaphostrongylus cervi Crenosoma vulpis Aelurostrongylus abstrusus Oslerus (Filaroides) osleri Storfe Sau, geit Rein Hest, esel Gris Sau, geit Sau, geit Sau Rein, (småfe) Hjort, (småfe) Rev, hund Katt Hund L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces Embryonerte egg / (L 1 ) i feces Embryonerte egg i feces L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces L 1 i feces Embryonerte egg / L 1 i trachealslim Ein del utbreidd Ein del utbreidd Ein del utbreidd Vesentleg hos importert esel TRICHUROIDEA Capillaria aerophila Rev Uembryonerte egg i feces Vesentleg hos villrev Sjelden; krev uteliv (tilgang til meitemakk) Svært vanleg hos geit Ein del utbreidd Sett hos importert sau Vanleg hos tamrein; av og til hos småfe Vanleg hos hjort; av og til hos småfe Vesentleg hos villrev; av og til hos hund Påvist hos eit par kattar på Vestlandet Påvist hos nokre få norske (innfødde) hundar Isolering av levande nematodelarver med Baermann-metoden Baermann-metoden (Baermannisering) blir nytta for å isolera og konsentrera levande larver frå feces eller ulike vev. Metoden er basert på at levande nematodelarver er aktive og vil krypa ut av materiale som blir plassert i vatn. Ute i vatnet vil dei søkkja til botnen og bli konsentrerte der, slik at dei kan samlast opp og undersøkjast. Metoden blir særleg nytta for å isolera L 1 av lungeorm frå fersk feces eller L 3 av magetarmparasittar frå ferdiginkuberte larvekulturar (sjå tidlegare), men modifiserte utgåver av metoden blir også nytta for å isolera larver frå ulike vev (t.d. protostrongylide-larver frå lungevev). Ein mykje brukt variant av metoden er vist i Figur 1.5. Denne blir mellom anna nytta ved undersøking av fecesprøvar frå geit og sau for lungeormlarver. Ein nyttar ei plast- eller glastrekt som har ein kort slange med slangeklemme påkopla tuten. I nedre ende av slangen kan det også vera ei pipette for å letta avtappinga. Trekta blir festa i eit stativ. Ein legg ei lita rund nettingrist ned i trekta, og legg feces eller anna materialet oppå rista før ein fyller trekta nesten heilt full med vatn. Den vesle nettingrista skal hindra at utløpet av trekta blir tetta til av materiale frå prøven. Feces kan leggjast dirkte oppå nettingrista eller plasserast der inni ein pose av gas. Pelletert småfefeces blir vanlegvis lagt direkte oppå rista. Ved ein annan variant av metoden blir feces smurt utover eit stykke filterpapir, som deretter blir lagt på ei større nettingrist på toppen av trekta med den påsmurde sida vendt ned og i kontakt med vatnet i den heilt fylte trekta. Denne varianten blir særleg nytta for pastøs storfefeces. Ved å smørja feces utover eit filterpapir får larvene kortare veg å vandra ut i vatnet enn om dei ligg inni ein stor fecesklump i trekta. Undersøkinga for lungeormlarver kan vera kvalitativ eller kvantitativ. Ved kvantitativ undersøking veg ein opp ei kjent mengde feces (ca. 5 gram). Fecesprøven blir plassert i trekta med vatn, og står gjerne i timar (over natta). Larvene (L 1 ) vil krypa ut av feces og søkkja til botnen i trekta (ned i tuten). Ein opnar slangeklemma og tappar væska i botnen av trekta over i eit sentrifugeglas eller liknande. Nokre dropar av den uttappa væska blir så overførte til eit objektglas og mikroskopert for larver. Dette tek ein opp att til heile det avtappa volumet er blitt undersøkt. Påviste L 1 blir talde og identifiserte til art på grunnlag av morfologi. Ved kvantitativ undersøking dividerer ein det totale larvetalet av kvar art med vekta på undersøkt fecesprøve, og finn dermed larvekonsentrasjonen i feces, som gjerne blir uttrykt som talet på larver pr. 5 gram feces. Ved kvalitativ undersøking registrer ein berre kva slag lungeormlarver ein finn i fecesprøven. Ein treng då ikkje vega prøven. Fig Oppsett av utstyr ved ein mykje brukt variant av Baermann-metoden.

13 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 11 Påvising av parasittar i blodet Det er få parasittar som lever eller har overføringsstadium i blodet hos (innfødde) husdyr her i landet. Den viktigaste er protozoen Babesia divergens i erythrocyttane hos storfe. Ein annan blodprotozo, Leucocytozoon simondi, kan av og til finnast hos and og gås. Hos importerte dyr eller norske dyr som har vore utanlands, vil også andre arter kunna finnast. Dette gjeld særleg mikrofilariar (larver) av hjerteormen hos hund, Dirofilaria immitis, og mikrofilariar av dei nærskylde artene Dirofilaria repens og Dipetalonema reconditum, som lever som vaksne i subkutis. Babesia divergens og andre protozoar som lever i blodet (andre Babesia-arter, Theileria, Trypanosoma m.fl.) kan påvisast i Giemsa-farga blodutstryk. For å laga eit blodutstryk trengst ein drope kapillærblod. Huda bør vaskast grundig med 70% alkohol før punktering av blodkaret, for å hindra at blodet i prøven blir kontaminert. Bloddropen blir plassert i den eine enden på eit avfeitta objektglas. Ein lagar deretter eit utstryk ved å setja eit dekkglas eller enden av eit anna objektglas i spiss vinkel inntil dropen og så føra dekkglaset/objektglaset bortover objektglaset, slik at blodet blir spreidd utover i bakkant av dekkglaset/objektglaset (blodet skal dragast utover, ikkje skubbast utover). Etter at utstryket har tørka (ca. 20 min. i luft), bør det fikserast så snart som råd i metanol (5 min.). Det fikserte preparatet blir lufttørka og farga med Giemsas fargeløysing (Azur-Eosin-Metylenblått). Giemsa-farga preparat av protozoar blir som regel undersøkt med oljeimmersjonsobjektiv (100x). Eit dekkglas kan leggjast over preparatet før mikroskoperinga. Mikrofilariar av Dirofilaria immitis hos hund kan påvisast med fleire metodar. Ved bruk av nativpreparat blir ein drope EDTA-blod rørt ut i nokre dropar fysiologisk koksaltopplysing på eit objektglas. Eit dekkglas blir lagt over og preparatet mikroskopert for bevegelege mikrofilariar. Ved hematokritmetoden blir eit mikrohematokritrøyr fylt med EDTA- eller heparinblod og sentifugert. Røyret blir deretter undersøkt direkte under mikroskop for mikrofilariar, som vil vera konsentrerte i sjiktet like over leukocyttane (over buffy coat ). Med desse metodane vil ein infeksjon berre kunna påvisast ved relative høge konsentrasjonar av mikrofilariar i blodet. Andre metodar er difor baserte på konsentrering av mikrofilariane frå eit større blodvolum (1 ml), anten gjennom filtrering av blod gjennom eit mikrofilter påkopla ei eingongssprøyte (filter-testen) eller gjennom sentrifugering (modifisert Knott-test). I første tilfelle blir mikrofilteret, i andre tilfelle botnfallet, mikroskopert for mikrofilariar. Undersøking for mikrofilariar i blodet hos hund vil her i landet berre vera aktuelt for hundar som har vore utanlands og blitt smitta der. Undersøking av levande dyr for ektoparasittar Sidan ektoparasittane lever på kroppsoverflata, er infeksjon av dyra med desse parasittane mykje lettare å påvisa enn infeksjon med ulike endoparasittar. Diagnostikken er i stor grad basert på at ein på ulike måtar samlar opp dei aktive parasittstadia direkte frå kroppsoverflata og deretter identifiserer stadia makroskopisk eller ved hjelp av lupe, stereomikroskop eller mikroskop. Men direkte oppsamling (innfanging) av parasittane frå vertsdyra kan vera problematisk for enkelte temporære ektoparasittar, spesielt for flygande tovengja insekt (mygg, knott, sviknott, klegg, fluger), som raskt kan røma unna. Det kan også vera døgnvaraisjonar i aktiviteten til enkelte temporære parasittar, slik at det er få parasittar på dyra på dagtid når dei blir observerte av eigar eller undersøkte av veterinær. Dette gjeld m.a. for den raude hønsemidden (Dermanyssus gallinae) hos høns, og veggedyret (Cimex lectularius), som helst plagar menneske. Infeksjon eller plage med desse ektoparasittane kan verifiserast gjennom funn av parasittane i nærmiljøet til dei som blir plaga. Undersøking for flygande tovenger Ved inspeksjon/observasjon av dyra på ein viss avstand kan ein konstatera om dei er parasittert/plaga av respektive mygg, knott, sviknott, klegg eller fluger (kan vera vanskeleg å skilja mellom dei tre førstnemnde gruppene). For meir nøyaktig identifikasjon er det naudsynt å fanga eitt eller fleire eksemplar og studera dei under stereomikroskop. Desse flygande insekta kan samlast opp vha. spesielle insekthåvar, eller med tilsvarande provisoriske reiskapar, t.d. ein plastpose. Tovengja insekt bør helst avlivast med eter eller kloroform, eventuelt ved kortvarig nedfrysing, og sendast inn til laboratoriet i turr tilstand i høvelege behaldarar. Disse behaldarane bør vera så solide at insekta ikkje blir klemde sund og skada under innsendinga. Desse insekta bør ikkje avlivast med, eller sendast inn i, konserveringsvæsker (som t.d. alkohol), sidan slike væsker vil kunna skada viktige diagnostiske kjenneteikn. Undersøking for flått, fuglemidd, lus, lusfluger og lopper Undersøking av dyra for makroskopisk synlege parasittar på hudoverflata eller i pelsen/fjørene (flått, fuglemidd, lus, lusfluger og lopper) skjer ved nøye inspeksjon av delar av kroppsoverflata. Godt lys er viktig, og ein kan ha god hjelp av ei lupe. Flått (med unnatak av hannane) vil ofte vera fastsogne på tunnhuda stader på dyret. Lus finst særleg i hovudet og bakover nakke og rygg (der dyra ikkje får fjerna dei ved pellstell/fjørstell). Flått kan fjernast med ein hard pinsett; dei andre bevegelege ektoparasittane kan

14 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 12 plukkast opp med ein mjuk pinsett eller ein fuktig pensel. For påvising av lus kan ein også klippa av nokre hårdottar, og undersøkja dette materialet med lupe eller stereomikroskop for lus og lusegg. Lus og lopper kan også samlast opp ved at ein støvsyg dyret, og undersøkjer det oppsogne materialet. Ein kan t.d. la eit lommetørkle plassert mellom to ledd av støvsugarrøyret fungera som oppsamlande filter. Ein kan også kjemma (delar av) dyret med ein fintanna kam (lusekam) for å få tak i lus, lopper og lusfluger. Støvsuging og kjemming er mest aktuelt ved undersøking av hund og katt. Den raude hønsemidden (Dermanyssus gallinae) gøymer seg på dagtid i stor grad i hønsehuset, men enkelte eksemplar kan også finnast på hønene. Hønene kan eventuelt undersøkjast for midd om kvelden/natta eller ein kan prøva å påvisa midden i reirmaterialet. Feller av bølgjepapp har vist seg å vera eit nyttig hjelpemiddel både for å påvisa førekomst av hønemidd og fastsetja graden av infeksjon i hønsehuset. Ved kvalitativ påvising set ein opp bitar av bølgjepapp i nærleiken av dei stadene der hønene held til om natta. Pappbitane står ute i hønsehuset i 1-2 døgn. Midden vil gøyma seg inni holroma i bølgjepappen på dagtid, og kan attfinnast der. Før undersøking av fellene bør dei frysast ned i nokre timar for å drepa midden. Ved kvantitativ undersøking let ein bølgjepappfeller av ein viss storleik stå på faste stader ei viss tid. Ein tek så ned fellene og tel alle midd inni dei. Ved å ta opp att dette på ulike tidspunkt kan ein følgja utviklinga av middepopulasjonen over tid. Alle dei nemnde ektoparasittane kan sendast inn til laboratoriet i levande live i ein tett behaldar, t.d. i eit blodprøveglas som blir lagt inni ein transportbehaldar av slagfast plast. Parasittane kan eventuelt avlivast før innsendinga gjennom nedfrysing eller i 70% alkohol. Undersøking for bremseegg Det kan vera aktuelt å undersøkja hest for førekomst av egg av magebremsen Gasterophilus intestinalis. Dei vaksne hobremsane er aktive frå slutten av juni til byrjinga av september og avset egga sine enkeltvis på hår på frambeina, bøgene og flankane. Egga er gulbrune, tilspissa og ca. 1,25 mm lange. Dei minner om sagflis, og vil kunna bli oppdaga ved nøye inspeksjon av pelsen på dei nemnde stadene. Undersøking for pelsmidd Pelsmidd (Cheyletiella) er berre så vidt synleg makroskopisk på hudoverflata, slik at infeksjon er svært vanskeleg å oppdaga berre ved inspeksjon av dyret (hund, katt, kanin). Infeksjon kan påvisast ved hjelp av limbandmetoden. Ein skil håra på dyret med to fingrar, og pressar ein bit av klart limband ned mot håra og hudoverflata med klebesida vendt ned. Limbandet blir deretter plassert på eit objektglas (med klebesida ned), og ein undersøkjer preparatet med mikroskop. Eit alternativ til denne metoden er støvsuging av dyret, oppklaring av oppsamla materiale i kalilut, og mikroskopisk undersøking av det oppklara materialet. Undersøking for øyremidd (Otodectes cynotis) hos hund, katt og farmrev Materiale (øyrevoks, skorper, sekret med eventuelle øyremiddar) blir teke ut frå ytre øyregang ved hjelp av ein bomullspinne (vattpinne), t.d. Q-tips. Bomullen kan fuktast med litt flytende parafin før pinnen blir ført varsamt inn i øyregangen med ei roterande rørsle. Dyra må haldast godt fikserte under uttaket av ein slik øyresvaberprøve, slik at ikkje ei brå rørsle av hovudet fører til perforasjon av trommehinna. Det kan vera naudsynt å sedera somme dyr før prøveuttaket. Materialet på bomullspinnen kan undersøkjast for midd under eit godt stereomikroskop, eller det kan overførast til ein drope parafin eller glycerin på eit objektglas og mikroskoperast. Middane er så vidt synlege makroskopisk, men sikker artsdiagnose kan berre skje ved hjelp av mikroskop. Dersom bomullspinnen blir lagra/sendt inn i eit tett glas- eller plastrøyr, vil middane ofte vandra over på innerveggen av røyret, der dei relativt lett kan påvisast under stereomikroskop utan å ta materialet ut av røyret. Middane kan så hentast ut av røyret vha. ei preparatnål. Ein føresetnad for at middane skal påvisast på denne måten er at røyret er gjennomsiktig, dvs. av glas eller klar plast. Undersøkjer ein berre materialet inni røyret, og ikkje sjølve røyret, kan ein risikera å stilla ein falsk negativ diagnose. Undersøking for hårsekkmidd og skabbmidd ved hjelp av hudskrap Dei fleste artene av hårsekkmidd (Demodex) lever i hårfolliklane, altså under hudoverflata. Skabbmidd i slektene Sarcoptes, Notoedres og Trixacarus lever i gangar i epidermis, medan skabbmidd i slektene Chorioptes og Psoroptes lever på hudoverflata, men er ofte meir eller mindre dekt av skorper. Infeksjon med desse artene blir i stor grad diagnostisert ved hjelp av mikroskopisk undersøking av hudskrap. Uttak av hudskrap: Ein tek hudskrapet med ei skarp skei eller ein skalpell. Skalpellbladet kan gjerne vera fukta i litt glycerin eller mineralolje, slik at materialet festar seg betre til det. Hudskrapet bør takast i utkanten av hudforandringane, og ein bør klippa bort eventuelle hår før ein tek skrapet. Ein bør unngå å få med skorper. Det kan vera lettare å få teke hudskrapet dersom ein lager ein hudfold mellom tommel og peikefinger og skrapar frå denne folden. Ein skal skrapa så djupt at lærhuda blir skadd og det oppstår små kapillærblødingar. Ein bør helst ta fleire skrap, anten frå den same eller frå ulike hudlesjonar på dyret. Ein kan samla opp materialet i eit reagensglas før ein undersøkjer det vidare sjølv, eller sender det inn til eit laboratorium. Ved demodikose hos storfe oppstår det små knutar i huda i tilknyting til infiserte hårfolliklar. Desse knutane er gjerne dekte av ei tunn skorpe. Ofte finn ein få midd i skrap frå overflata av knutane. For å påvisa midd kan det være naudsynt å punktera knuten med spissen av ein skalpell og pressa ut innhaldet, som gjerne er osteaktig. Her kan det vera store mengder med hårsekkmidd.

15 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 13 Undersøking av hudskrap: Ein kan undersøkja hudskrapet direkte i ei petriskål med eit stereomikroskop. Er ikkje hudskrapet for gammalt, vil middane vera i live og røra på seg. Skabbmidd vil då relativt lett kunna oppdagast, men ikkje hårsekkmidd (Demodex), som er for små. Denne direkte metoden er usikker når det er få midd i høve til mengda av det øvrige materialet (skorper, hår) i prøven. Dersom hudskrapet blir lagra eller sendt inn i eit glas- eller plastrøyr, vil skabbmiddane ofte vandra over på innerveggen av røyret og vil kunna påvisast der, slik som nemnt for øyremidd. Dersom ein ikkje finn midd ved direkte inspeksjon av hudskrapet med stereomikroskop, bør ein løysa opp mest mogeleg av det øvrige materialet i skrapet ved hjelp av lut, som oftast 10% kalilut (KOH), før ein leitar etter midd ved hjelp av stereomikroskop eller vanleg mikroskop. For ytterlegare å auke sjansane for påvising, kan ein prøva å konsentrera middane og separera dei frå anna materiale ved hjelp av flotasjon. Har ein lite materiale frå hudskrapet, blir dette lagt direkte på eit objektglas, og ein tilset litt 10% KOH (kalilut), og legg eit dekkglas over. Ein let så objektglaset liggja i eit par timar til luten har løyst opp keratinet i huda, slik at eventuelle middar er blitt synlige under mikroskop. Ein kan også påskunda oppløysingsprosessen ved å varma objektglaset varsamt opp over ein spritbrennar eller liknande. Har ein mykje materiale, samlar ein dette i eit sentrifugerør av glas og tilset nokre ml 10% KOH. Ein kan så la glaset stå eit par timar eller til neste dag, eller ein kan varma det forsiktig opp over ein spritbrennar for å påskunda prosessen. Når materialet er oppløyst, fyller ein sentrifugeglaset nesten opp med vatn og sentrifugerer, eller ein let det stå ei stund for å sedimentera. Ein syg så av supernatanten med ei pipette og fyller glaset heilt til topps med ei natriumklorid/- glukose-oppløysing. Denne flotasjonsvæska blir laga ved at ein til 300 gram glukose tilset metta NaCloppløysing (400 g NaCl per liter vatn) til eit endeleg volum på éin liter. På toppen av sentrifugeglaset legg ein eit dekkglas, og ein let dette stå slik i ca. 30 min. Ein overfører så dekkglaset (med dropen ned) til eit objektglas og mikroskoperer. Har ein mykje materiale, løyser ein det opp i kalilut i eit begerglas, før ein overfører det oppløyste materialet til eitt eller fleire sentrifugerøyr, tilset vatn og sentrifugerer, og til slutt floterer botnfallet i natriumklorid/glukose-oppløysing. Etter direkte påvising av levande (eller daude) middar i eit hudskrap ved hjelp av stereomikroskop, kan (bør) ein identifisera middane sikkert ved hjelp av mikroskop. Éin eller fleire middar kan då overførast med ei preparatnål frå hudskrapet (i petriskåla) til ein drope parafin (eller glycerin) på eit objektglas, eit dekkglas blir lagt over, og preparatet blir mikroskopert. Påvising av parasittinfeksjonar med serologiske metodar Dei seinare åra har serologiske metodar fått meir å seia innanfor parasittologisk diagnostikk etter kvart som det er blitt utvikla pålitelege testar for stadig nye parasittinfeksjonar. Når det gjeld husdyr, har serologiske metodar hittil hatt mest å seia for påvising av visse protozoinfeksjonar (spesielt toxoplasmose), men i det siste er det også utvikla metodar for påvising av visse helmintar (trikinose, cysticerkose) og arthropodar (Sarcoptes). På grunn av den meir komplekse oppbygginga av helmintane og arthropodane er det vanskelegare å isolerea aktuelle artsspesifikke antigen til bruk i serologisk testar frå desse organismane enn frå protozoane. Serologiske metodar er særleg nyttige, og gjerne også dei einaste tilgjengelege, for å påvisa infeksjon med vevsparasittar hos levande dyr (vevscystedannande koksidiar, muskeltrikinar, metacestodar av bendelorm (t.d. Taenia saginata hos storfe og echinococc-blærer hos ulike husdyr). Dei serologiske metodane tar anten sikte på å påvisa antistoff mot parasittane, eller sirkulerande antigen frå parasittane. Aktuelt prøvemateriale til dei serologiske testane er fullblod (inga tilsetjing av antikoagulerande stoff slik at ein kan skilja serum frå dei andre komponentane). Påvising av parasittinfeksjonar ved hjelp av blodparametrar Unormale verdiar av visse blodparametrar kan, i kombinasjon med andre funn, gje sterke indikasjonar på infeksjon med visse helmintar. Ved Ostertagiainfeksjon i løpen hos storfe og sau vil ein finna høge verdiar av pepsinogen i serum, ved Fasciola hepaticainfeksjon vil det vera høge nivå av visse leverenzym i serum, og ved Haemonchus contortus-infeksjon av sau vil ein finna låge hematokritverdiar (anemi). Hos storfe er pepsinogenundersøking aktuell både ved mistanke om sommarostertagiose i beiteperioden og ved mistanke om vinterostertagiose i vinterhalvåret. I siste tilfelle vil det ofte vera få egg å finna i feces.

16 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 14 Påvising av protozoinfeksjonar ved dyrking av organismane in vitro Mange eincella parasittar kan no dyrkast in vitro. På denne måten kan ein få oppformeira parasittane for diagnostikk og nærare studiar. Ein kan t.d få testa effekten av ulike medikament. Vidare kan ein halda dei isolerte stammene av protozoane i live i lang tid utan bruk av forsøksdyr. Mange ekstracellulære protozoar let seg dyrka på cellefrie medium, t.d. flagellatane Trypanosoma, Giardia, Trichomonas, amøbar, og ciliaten Balantidium. Dei intracellulære protozoane, t.d. Toxoplasma gondii, må derimot dyrkast i cellekulturar. UNDERSØKING AV DAUDE DYR FOR PARASITTINFEKSJONAR Ved seksjon kan heile dyret undersøkjast grundig for førekomst av larvestadium og kjønnsmodne stadium av ulike helmintar og arthropodar og for ulike utviklingsstadium av protozoar. Ein undersøker fordøyingskanalen (vomikter, bendelormar, nematodar, bremselarver, protozoar), levra (juvenile og kjønnsmodne ikter, metacestodar, nematodelarver), lungene og luftvegane (metacestodar, larvale og kjønnsmodne nematodar, bremselarver, nasemidd), bryst- og bukhole (metacestodar, larvale og kjønnsmodne nematodar), subkutant og intermuskulært bindevev og ligament (nematodar, larver av hudbrems), muskulaturen (metacestodar, nematodelarver, vevscyster av Sarcocystis og Toxoplasma), blodkara (nematodelarver) og sentralnervesystemet (metacestodar, nematodar). Nokre parasittar kan påvisast ved direkte inspeksjon av organ, organinnhald og vev, medan andre parasittar berre kan påvisast ved hjelp av mikroskop. Dei seinare åra har molekylære metodar (m.a. sekvensanalysar) fått meir og meir å seia som eit supplement eller alternativ til tradisjonelle mikroskoiske metodar. Molekylære metodar er spesielt nyttige for å identifisera/skilja mellom arter som er meir eller mindre like morfologisk. Fordøyingskanalen På grunn av at nematodar og cestodar i fordøyingskanalen er svært vanlege og ofte kan påverka dyr si helse, er det spesielt viktig å føreta ei grundig parasittologisk undersøking av mage/løpe og tarm. Ved rutinemessig obduksjon er det sjeldan aktuelt å føreta ei fullstendig oppteljing og identifisering av nematodane og cestodane i mage/løpe og tarm, men ein bør gjennomføra ei såpass grundig undersøking at ein kan uttala seg om desse parasittane kan ha hatt noko å seia klinisk for det aktuelle dyret. Ut frå anamnesen bør ein kunna avgjera om fordøyingskanalen bør undersøkjast spesielt grundig med tanke på parasittåtak. Ved seksjon tek ein heile fordøyingskanalen ut av dyret, og legg han på golvet eller på eit undersøkingsbord. Deretter separerer ein løpe/magesekk og tarm frå krøset, og legg tarmen opp på ein oversiktleg måte. Samstundes undersøkjer ein om det er endringar i tarmveggen. Ein knyter av proksimalt og distalt på løpe/- magesekk og tunntarm med hyssing, og undersøkjer deretter løpe/magesekk, tunntarm og stortarm kvar for seg. Ein klipper opp organet og undersøkjer innhaldet og slimhinna for unormale tilhøve. Ein lagar slimhinneutstryk frå ulike avsnitt, og undersøkjer desse under mikroskop (spesielt viktig ved mistanke om protozoinfeksjonar, t.d. koksidiose). Utstryk av tarmslimhinna kan undersøkjast direkte, eller etter fortynning med nokre dropar fysiologisk koksaltoppløysing, for vegetative stadium og cyster av flagellatar, amøbar og ciliatar, og for utviklingsstadium og oocyster av koksidiar. Frå colon/rektum tek ein ut ein fecesprøve for vanleg eggteljing. Innhaldet i dei enkelte avsnitta blir samla opp i kvar si bøtte. Materiale som sit fast på slimhinna blir spylt forsiktig av med vatn. Det oppsamla materialet blir deretter helt porsjonsvis gjennom ein sil med diameter cm og maskevidde tilpassa dei nematodane ein ser etter. For å fanga opp vaksne nematodar i løpe/magesekk og tunntarm, nyttar ein sil med maskevidde μm. Vil ein også fanga opp larvestadia, må maskevidda ikkje vera større enn μm. For å fange opp dei større nematodane i stortarmen, er det tilstrekkeleg med ei maskevidde på μm. Det materialet som blir att i silen, blir spylt grundig med vatn og helt over i eit begerglas eller liknande. Når ein har silt alt materialet, undersøkjer ein det som er blitt fanga opp av silen i ei stor petriskål ved hjelp av lupe eller stereomikroskop. Med litt erfaring vil ein då raskt kunne slå fast om det er eit sterkt eller moderat nematodeåtak. Ein kan også føreta ei nøyaktig teljing av nematodene ved å fortynna alt materialet som blei fanga opp i silen i eit kjent væskevolum, og så telja (og identifisera) alle nematodane i ein representativ delprøve av dette. Totalteljing av nematodar og cestodar i fordøyingskanalen Følgjande metode er blitt nytta ved Parasittologisk lab., NVH, ved undersøking av løpe og tarm hos storfe og småfe. Metoden er særleg aktuell ved epidemiologiske studiar og ved studiar av effekten av ulike anthelmintika. 1. Teljing av nematodar i løpen a) Overflødig feitt blir fjerna frå utsida av løpen. Løpen blir klipt opp på langs. Innhaldet saman med skyljevatn blir samla opp i ei bøtte. Slimhinna blir spylt med ei fin vasstråle og gnidd grundig, slik at ho blir fri for fôrpartiklar og parasittar. Pass på at begge sidene av slimhinnefoldane blir reine. b) Løpeinnhaldet og skyljevatnet i bøtta blir tilsett formalin

17 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 15 til 10% (éin del konsentrert formalin til 9 delar suspensjon). Formalin kan eventuelt tilsetjast etter punkt (d). c) dersom løpeinnhaldet saman med skyljevatnet har eit volum på over 5 l (for storfe eventuelt 10 l), let ein innhaldet i bøtta stå nokre timer til sedimentering. Deretter tek ein ut væske frå det øvste laget i bøtta med ei ause og siler denne væska gjennom ein 400 mesh sil (poreåpning 37 μm). Ein tek ut væske til volumet er godt under 5 l (eller 10 l). d) Alt materiale i silen blir spylt tilbake i bøtta med vasstråle frå undersida av silen. e) Bøtta blir tilsett vatn til det endelege volumet av suspensjonen er 5 l (eller 10 l). f) Under grundig omrøring syg ein opp 50 ml (1/100) av suspensjonen i bøtta med ei fullpipette (100 ml dersom det totale volumet er 10 l). Dersom suspensjonen er svært uklar, kan ein sila denne gjennom ein 400 mesh sil. g) Heile det uttekne volumet blir undersøkt porsjonsvis i ei petriskål ved lupeforstørring, og alle nematodane i suspensjonen blir plukka ut med ei preparatnål, telt og artsbestemt (vanlegvis etter oppklaring i laktofenol og undersøking under mikroskop). h) Det totale talet på nematodar i løpen får ein ved å multiplisera det funne talet med Teljing av nematodelarver i løpeslimhinna For å kunna telja dei larvene som finst nede i slimhinna må ein først frigjera larvene frå det omkringliggjande vevet ved å fordøya bort dette med pepsin. a) Løpeslimhinna blir trekt eller skrapt laus frå det underliggjande vevet. Unngå å få med fett. b) Slimhinna blir vegd og lagt i eit begerglas. c) Ein tilset fordøyingsvæske etter vekt: 300 ml vatn, 5 ml kons. HCl og 2,5-3 g pepsin (Pepsin conc. 1:3000) pr. 100 gram løpeslimhinne. d) Begerglaset med løpeslimhinne og fordøyingsvæske blir sett i eit varmeskåp med temperatur 37 o C i 4-5 timar eller over natta. e) Ein avsluttar fordøyinga ved å tilsetja formalin til 10%. f) Suspensjonen av den fordøyde løpeslimhinna blir fortynna til eit volum på 1 l (eventuelt 2 l), og ein tek deretter ut 1/100 av denne suspensjonen for undersøking og teljing og identifisering av alle nematodelarver. 3. Teljing av nematodar/cestodar i tunntarmen a) Tunntarmen blir trekt (eller skoren) forsiktig ut av krøset. b) Den bakerste tredjedelen av tunntarmen blir kasta. c) Dei fremste to tredelane av tunntarmen blir delt opp i 1-2 m lange avsnitt, som så blir gjennomspylte med vatn ned i ei bøtte. d) Dei gjennomspylte delane blir klipte opp på langs, og slimhinna blir gnidd og skylt meir om nødvendig. e) Den vidare undersøkinga føregår som for løpeinnhald (punkt 1b-1h). f) Etter at ein har teke ut det nødvendige volumet (1/100) for teljing av nematodane, blir heile det resterande innhaldet i bøtta undersøkt (porsjonsvis) i eit flatt kar, og alle Bunostomum-ormar og Moniezia-scolices blir talde. 4) Teljing av nematodar i tjukktarmen (caecum og colon) a) Tjukktarmen blir skoren eller trekt laus frå krøset. b) Tarmen blir gjennomspylt, klipt opp på langs og skylt rein med vatn. Innhaldet og skyljevatnet blir samla opp i ei bøtte. c) Materialet i bøtta blir silt gjennom ein 40 mesh sil (maskevidde 420 μm) for å bli kvitt skite vatn. d) Materialet som blir att i silen blir undersøkt i eit flatt kar og samtlege nematodar blir talde og identifiserte. Levra Leveroverflata blir undersøkt makroskopisk for boregangar, parasittknutar og metacestodar. Galleblære og gallegangar blir klipte opp for påvising og oppsamling av leverikter (Dicrocoelium, Fasciola). Gallen kan også undersøkjast mikroskopisk for ikteegg. Levra kan skjerast i 1 cm tjukke skiver, som så blir pressa saman nede i ei stor petriskål med fysiologisk koksaltoppløysing. På denne måten kan ein også påvisa juvenile stadium av Fasciola hepatica. Lungene Luftvegane blir klipte opp og undersøkte for lungeorm. Delar av lungene kan klippast opp i mindre bitar og leggjast i ei trekt med vatn i (Baermannisering). Førstestadiumslarver av lungeorm vil vandra ut av vevet/- bronkiolane og søkkja ned i botnen av trekta. Dei kan så påvisast ved mikroskopi av denne væska. Undersøking for parasittar i veva Vevsstadium av helmintar Makroskopisk synlege vevsstadium av helmintar (cysticercar, echinococcblærer, vaksne nematodar) kan påvisast ved direkte inspeksjon av kadaveret (slakteskrotten) med tilhøyrande organ, eventuelt etter snitting i organa/vevet. Sistnemnde metode blir nytta ved undersøking for cysticerken (tinta) til Taenia saginata i storfemuskulatur (sjå seinare). Mikroskopiske (larve-)stadium av helmintar kan påvisast i histologiske snitt eller i ufiksert materiale. Ved mistanke om at små knutar i levra eller tarmslimhinna skuldast nematodelarver ("parasittknutar"), kan ein dissekera ut ein knute og klemma han sund under eit dekkglas på eit objektglas. Deretter kan ein mikroskopera innhaldet i knuten. Trikinar i skjelettmuskulaturen er ikkje makroskopisk synlege. Infeksjon kan påvisast anten ved hjelp av den tradisjonelle kompressoriemetoden eller etter fordøying av muskelvevet med pepsin (sjå seinare). I fyrste tilfelle blir larvene påvist direkte i muskulaturen, og i siste tilfelle etter at dei er blitt fordøyde fri frå innkapslinga i muskelcella ved hjelp av pepsin. Metodane er detaljert omtala i avsnittet om parasittar i kjøtkontrollen. Vevsfordøying blir også nytta for å frigjera Ostertagia-larver i løpeslimhinna hos storfe og småfe, slik at dei kan teljast (sjå framanfor). Fordøyingsmetodane er baserte på at nematodelarvene er resistente mot dei fordøyingsvæskene som blir nytta (pepsin eller trypsin), og ikkje blir skada av desse. Desse larvene blir utsette for dei same fordøyingsvæskene i magesekk/løpe og tunntarm ved naturleg infeksjon. Vevsstadium av protozoar Dei fleste vevsprotozoar er mikroskopiske og kan påvisast i fikserte, farga avtrykkspreparat og slimhinneutstryk, i histologiske preparat og i fordøyd vev. Nokre arter av Sarcocystis dannar makroskopisk synlege

18 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 16 vevscyster i muskulaturen, og desse kan påvisast ved direkte inspeksjon av muskulaturen. I avtrykkspreparat: Avtrykkspreparat blir laga ved at ein legg eit snitt i eit organ, snittflata blir forsiktig avturka med eit trekkpapir og deretter pressa mot eit objektglas. Slike preparat er blant anna aktuelle ved mistanke om akutt toxoplasmose. Avtrykkspreparat og slimhinneutstryk blir luftturka, fikserte i metanol og farga med Giemsa eller tilsvarande metode. I histologiske preparat: Materiale til histologisk undersøking bør takast ut så raskt som mogeleg etter at dyret har døydd. Dette gjeld spesielt materiale frå tarmslimhinna. Materialet blir vanlegvis fiksert i formalin, og snitta blir gjerne rutinemessig farga med hematoksylin og eosin (HE-snitt). Men i vanleg farga histologiske snitt kan mange protozoar vera vansklege å oppdaga, og det er endå vanskelegare, ofte uråd, å føreta ei sikker identifisering av dei i slike snitt. I dei seinare åra er det utvikla immunhistokjemiske metodar for ei rekkje protozoar, som har gjort påvisinga av dei i histologiske snitt både raskare og sikrare. Desse metodane baserer seg på at spesifikke antistoff mot vedkomande protozo lokaliserer og bind seg til protozoen i snittet, og deretter får ein fram ein fargereaksjon i tilknyting til desse antistoffa. Også fleircella parasittar kan identifiserast ved hjelp av immunhistokjemiske metodar. I fordøyd materiale: Når ein undersøkjer nokre få histologiske snitt, er det eit svært lite vevsvolum ein får gjennomsøkt, og ein moderat infeksjon kan dermed vera vanskeleg å oppdaga. For å auka sjansane for påvising, kan ein la ei større vevsmengde bli kunstig fordøyd ved hjelp av pepsin eller trypsin. Eventuelle protozoar vil då finnast i den resulterande suspensjonen, og denne kan reduserast i volum ved sentrifugering og fjerning av supernatanten. Det resterande volumet kan så undersøkjast med mikroskop eller inokulerast i eitt eller flere forsøksdyr (ofte mus), eller ein vevskultur. Ein let så eventuelle protozoar få oppformiera seg ei viss tid, før ein undersøkjer forsøksdyra eller vevskulturane for førekomst av parasitten. Denne metoden har tidlegare blitt mykje nytta i Toxoplasma-diagnostikken og forskinga. Påvising av ektoparasittar Ved seksjon må ein også sjå etter ektoparasittar ved ei grundig undersøking av hud og hårlag/fjørham. På daude dyr er det jo lettare å inspisera kroppsoverflata grundig og å ta ut tilstrekkeleg med materiale enn på levande dyr. Mange mobile ektoparasittar (lus, lopper, pelsmidd) prøver å forlata dyret når det døyr og kroppstemperaturen går ned. Dei vil ofte vandra ut i enden av håra og kan forlata dyret, slik at det er få eksemplar tilbake ved seksjon. Påvising av ektoparasittar på hud og gjeller hos fisk På overflata av huda og/eller gjellene hos oppdrettsfisk kan det finnast ei rekkje ektoparasittar. Det gjeld eincella parasittar som flagellatar, fastsitjande og mobile ciliatar, haptororm, iktelarver og krepsdyr, som Ichthyobodo necator, metacercariar av ikta Cryptocotyle lingua og ulike stadium av lakselusa, Lepeophtheirus salmonis. Dei eicella parasittane kan påvisast mikroskopisk i nativpreparat av skrap frå gjeller eller hud frå nyleg avliva fisk (< 10 min etter avlivinga). Ein skrapar med eit skalpellblad og overfører materialet til ein dråpe vatn (saltvatn eller ferskvatn etter miljøet fisken kjem frå) på eit objektglas, legg på dekkglas og mikroskoperer. Metacercariar av Cryptocotyle lingua blir kapsla inn av bindevev og melaninhaldige vertsceller, slik at det oppstår makroskopisk synlege svarte prikkar i huda (svartprikksjuke). Førekomst av metacercariar inni desse strukturane kan stadfestast ved mikroskopisk undersøking av nativpreparat av skrap, slik som nemnt ovanfor, men desse stadia kan også påvisat i fisk som har vore død ei stund. Dei tidlegaste parasittiske stadia av lakselusa (copepoditt, chalimus I-IV) er så små (0,7-2,3 mm) at dei vanskeleg let seg påvisa makroskopisk. Desse kan i staden påvisast ved mikroskopisk undersøking av skrap frå hudoverflata. Dei etterfølgjande stadia (preadult I og II, adulte) er synlege makroskopisk, men sikker identifikasjon bør skje ved hjelp av mikroskop. Oppsamling, fiksering og montering av helmintar Oppsamling Store nematodar, ikter og bendelormar kan fjernast frå sin naturlege tilhaldsstad ved hjelp av ein (mjuk) pinsett. Små og tunne nematodar kan lettast fiskast opp ved hjelp av ei preparatnål. Bendelormar, lever- og vomikter og større nematodar bør skyljast forsiktig i fysiologisk koksaltoppløysing eller vatn før dei blir fikserte. Makroskopiske helmintar (vaksne eller larvestadium) som er innleira i vev, må behandlast varsamt, og bør helst fripreparerast før dei blir fikserte. Alternativt må dei skjærast ut og fikserast saman med omkringliggjande vev. Fiksering og konservering Alle helmintar kan fikserast i 10% formalin (4% formaldehyd), eller i 70% etylalkohol. Dei kan også lagrast i same oppløysing. Formalinfikserte helmintar kan med fordel overførast til 70% alkohol etter eitt døgn. Alkohol til konservering bør tilsetjast 5-10% glycerin. Parasittane vil då halda seg bra i glycerinen dersom alkoholen skulle dampa bort gjennom utette korkar. Levande nematodar bør fikserast i varm (70 o C) 70% alkohol (hugs brannfaren; varm opp alkoholen på vassbad). Nematodane vil da strekkja seg ut under fikseringa. Dei kan også drepast i iseddik, og deretter straks overførast til 70% alkohol. Bendelormar bør leggjast i vatn inntil dei blir inaktive, og så fikserast i formalin eller alkohol. Cestodar og trematodar bør leggjast i lett press mellom to glasplater før fikseringsvæska blir tømd på. Dei bør liggja i press i nokre timar. Dersom ein ikkje gjer dette, vil parasittane lett krølla seg opp under fikseringa.

19 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 17 Preparering for mikroskopisk undersøking Nematodar blir klara opp (gjort gjennomsiktige) i laktofenol, som er samansett av 1 del fenol, 1 del mjølkesyre, 1 del glycerin og 1 del destillert vatn. Dei kan også klarast opp berre i glycerin. Dette kan ein gjera ved å leggja dei i 70% alkohol med 5-10% glycerin i, og så dampa av alkoholen. Etter oppklaringa kan nematodane monterast permanent i glyceringelatin. Trematodar og cestodar kan fargast med karmin, for å få fram indre strukturar. Etter farginga blir parasittane avvatna i ein alkoholserie med stigande konsentrasjon (70%, 80%, 90%, 96%, absolutt alkohol), oppklara i kreosot (best) eller xylen, og monterte i Canadabalsam på objektglas. Oversyn over parasittologiske undersøkingar PÅ LEVANDE DYR Direkte påvising av parasittane eller deira reproduksjonsprodukt (overføringsstadium) I fecesprøvar Fecesprøvar bør undersøkjast makroskopisk, særleg med tanke på påvising av bendelormledd. Av og til vil ein også finna utstøytte nematodar; lettast å oppdaga er dei store nematodane (spolormar). Oxyuridane (t.d. Oxyuris equi hos hest), som held til nær anus, vil også kunna finnast på/i feces. Ved mikroskopisk undersøking av fecesprøvar kan ein påvisa vegetative stadium av visse protozoar (t.d. Giardia-trofozoitar), men som oftast tek fecesundersøkingane sikte på å påvisa ulike reproduksjonsprodukt (overføringsstadium) frå parasittar som held til i magetarmkanalen, levra eller lungene. Desse reproduksjonsprodukta kan vera oocyster av koksidiar, cyster av flagellatar, amøber og ciliatar, egg frå trematodar, cestodar og nematodar, eller førstestadiumslarver av visse nematodar. Ein kan undersøkja ferske, ufarga, eller fikserte og farga fecesutstryk, men denne metoden er berre brukbar når det er mange parasittstadium. Vanlegvis må ein konsentrera stadia ved hjelp av flotasjon eller sedimentering (egg, oocyster, cyster) eller baermannisering (larver). I blodprøvar Endoparasittar som lever i blodet kan påvisast i blodutstryk etter uttak av blodprøvar frå dyra. Dette gjeld t.d. protozoar som trypanosomar og hemosporidiar (Babesia, Theileria), og visse nematodelarver (mikrofilariar). I hud og hårlag Makroskopiske ektoparasittar som fluger, lopper, lus og flått kan påvisast utan hjelpemiddel på huda eller i hårlaget, men særleg ved undersøking for lus vil ei lupe vera til god hjelp. Dei små middedyra som lever på/i huda kan påvisast i hår/hudskrap ved hjelp av stereomikroskop/lupe eller mikroskop. Indirekte påvising av parasittinfeksjon ved serologiske metodar Serologiske metodar har fått stadig meir å seia innanfor parasittologisk diagnostikk og forsking i seinare år. Det er etter kvart blitt utvikla pålitelege (sensitive og spesifikke) testar for mange viktige parasittinfeksjonar, spesielt hos menneske. Den raske utviklinga innan bioteknologi og genteknologi har medverka til dette. Dei serologiske metodane tar anten sikte på å påvisa antistoff mot parasittane eller sirkulerande antigen frå parasittane. PÅ DAUDE DYR Ved obduksjon blir alle organ undersøkte makroskopisk på ein systematisk måte: hud, hårlag, subcutis, muskulatur, sentralnervesystemet, serøse holrom, lunger og luftvegar, lever og fordøyingskanalen. Eventuelle parasittar blir identifisert på staden, eller etter nærare undersøking ved hjelp av lupe eller mikroskop. Mikroskopiske parasittar kan påvisast ved å undersøkja feces og tarminnhald, slimhinneutstryk, avtrykkspreparat av snittflater av organ, eller histologiske preparat. Immunhistokjemiske metodar har gjort det lettare å oppdaga og identifisera protozoar i fiksert materiale. Fordøyingskanalen: Fordøyingskanalen blir opna, og både slimhinna og innhaldet må undersøkjast makroskopisk og ved hjelp av lupe eller stereomikroskop. Teljing av alle parasittar (helmintar) kan utførast ved nøye gjennomsyn av heile innhaldet, eller i representative prøvar. I eksperimentell samanheng er totalteljing av nematodar og cestodar i fordøyingskanalen mykje brukt (t.d. ved epidemiologiske studiar av parasittmengda under ulike klimatiske tilhøve, ved ulike driftsopplegg, eller hos ulike aldersgrupper; og ved studiar av effekten av ulike anthelmintika). Men slik totalteljing kan også brukast diagnostisk for å vurdera om dyret var så sterkt smitta av nematodar/cestodar at desse var årsak til dei kliniske symptoma/dødsfallet. For påvising av protozoar undersøkjer ein organinnhaldet, slimhinneutstryk eller histologiske snitt ved hjelp av mikroskop. Sjølv om dei ulike parasittane i fordøyingskanalen kan påvisast direke ved obduksjon, kan det vera nyttig å ta ut ein fecesprøve frå colon eller rectum, og undersøkja denne for parasittegg, oocyster og cyster.

20 B. Gjerde: Diagnostikk av parasittinfeksjonar (4. utgåve; 2011) 18 Parasittundersøkingar i den offentlege kjøttkontrollen I kjøtkontrollen undersøkjer ein slakta også for parasittar og/eller parasittære forandringar. Det er hovudsakleg muskulatur, lever og lunger som blir undersøkt for dette. Føremålet er anten å hindra smitteoverføring til menneske (Taenia saginata, Trichinella) eller å hindra at patologisk forandra og uappetittleg slaktemateriale blir omsett. Det er "Instruks for kjøttkontrollen" av 25. mai 1994 (med seinare endringar), som gjev direktiv om kva parasittar som ein skal undersøkja for, og korleis dette skal gjerast (Kapittel I. Tilsyn og kontroll). Instruksen fortel til dels også kva ein skal føreta seg ved funn av ulike parasittar og/eller parasittforandringar (Kapittel III. Bedømmelsesregler). I Kapittel III, pkt er såleis parasittære sjukdommar som medfører total kassasjon oppførte. Dette gjeld generalisert makroskopisk synleg sarcosporidiose, generalisert cysticerkose og trikinose. Pkt. 14 omtalar endringar som medfører delvis kassasjon (dvs. kassasjon av det parasitterte organet/vevet). Under pkt heiter det at tilsynsveterinæren skal kassera "Organer og andre biprodukter med patologiske forandringer av infeksiøs, parasittær eller traumatisk årsak". Vurderinga av ulike funn er noko ufullstendig omtala i sjølve instruksen og er difor utdjupa i eit eige skriv, "Post mortem undersøkelse - bedømmelsestabell med koder" fastsatt av SNT 22. februar Punkt (PM kode) i denne bedømmelsestabellen omhandlar parasittar: (50) Trikinose - total kassasjon (51) Cysticercose - generalisert: total kassasjon; ikke generalisert: godkjenning med særlege betingelser etter innfrysing (52) Leverparasitter/parasittær leverskade - lokal kassasjon (53) Lungeparasitter - lokal kassasjon (54) Andre parasitter - lokal kassasjon (55) Sarkosporidiose - lokal eller total kassasjon etter utbredelsen; totalkassasjon ved makroskopisk synlig sarkosporidiose I kjøtkontrollen føretek ein berre spesielle undersøkingar for å påvisa infeksjonar med Taenia saginata (storfe) og Trichinella spiralis (gris, hest) [ikkje Toxoplasma gondii], medan dei andre parasittinfeksjonane og parasittære forandringane blir diagnostisert ved den generelle undersøkinga av organ og slakteskrott gjennom palpasjon og inspeksjon. Fordøyingskanalen blir ikkje rutinemessig undersøkt for parasittar. Ved den generelle inspeksjonen kan ein m.a. påvisa nematodar og bremselarver i subkutant og intermuskulært bindevev, Sarcocystis-cyster (sarkosporidiose) og cysticercar/tinter (av Taenia saginata, T. krabbei) i muskulatur, cysticercar (Taenia hydatigena) og Strongylus-larver subserøst i bukhola, parasittknutar, boregangar, cysticercar, hydatidecyster og strukturelle forandringar (t.d. gallegangshyperplasi pga. leverikter) i levra, og parsittknutar, hydatidecyster og strukturelle forandringar i lungene. Dei undersøkingane som har størst relevans for påvisning av parasittar hos ulike husdyr, er tekne med nedanfor (tala refererer til punkta i "Instruks for kjøttkontrollen"). Storfe over 6 veker (pkt. 4) Det blir skore snitt for tinter (cysticercer) av Taenia saginata i tyggemusklane og hjertet. Tyggemusklane (4.1.1): "..., det legges to parallelle snitt i den utvendige tyggemuskulatur og ett snitt i den innvendige tyggemuskulatur. Snittene legges parallelt med underkjevebenet og undersøkes for tinter". Hjertet (4.1.4): "..., i hjertet legges et lengdesnitt slik at hjertekamrene åpnes og skilleveggen gjennomskjæres og undersøkes for tinter". I bedømmelsestabellen står det at slaktet skal kasserast dersom det er generalisert cysticercose, men godkjennast under særlege vilkår (betinget godkjenning) dersom infeksjonen ikkje er generalisert. Framgangsmåten for å avgjera infeksjonsgraden er også oppført i tabellen (men det er ikkje presisert at det gjeld for storfe): "Finnes tinter i ett eller flere av de obligatoriske snitt, undersøkes tyggemuskulatur, hjerte og mellomgulv etter snitting i tynne skiver. Det legges håndflatestore snitt i lår-, bog- og overarmsmuskulatur. Finnes tinter i eit flertal av de store kroppsmuskelsnitt, foretas kassasjon. Forøvrig gis betinget godkjenning etter frysing ved -10 o C eller lavere i minst 10 døgn". Leverikter er ikkje nemnde spesielt, men inspeksjon av gallegangane har blant anna som føremål å avdekkja leverikteinfeksjon (4.1.6): "Inspeksjon og palpasjon av leveren og portallymfeknutane (Lnn. portales); det legges snitt på leverens bakside og under lobus caudatus for inspeksjon av de store galleganger,...". I bedømmelsestabellen er oppgitt at leverparasittar/- parasittær leveskade skal resultera i lokal kassasjon, dvs. kassasjon av levra. Sarkosporidiose vil til dels kunna påvisast ved inspeksjon av muskulaturen. Sau, geit, oppdretta hjortevilt og tamrein (pkt. 7) Lungene skal undersøkjast for å avdekkja infeksjon med lungeorm, eller andre unormale tilhøve (7.1.2). Funn av lungeparasittar medfører lokal kassasjon, dvs. kassasjon av lungene (pkt. 53 i bedømmelsestabellen). Levra med gallegangane skal undersøkjast på tilsvarande måte som hos storfe (7.1.5), for mellom anna å kunna påvisa infeksjon med leverikter. Påvising av leverparasittar/parasittær leverskade medfører lokal kassasjon. Sarkosporidiose vil kunna påvisast ved inspeksjon av muskulaturen. Svin og oppdretta villsvin (pkt. 6 og 9) Under pkt. 6. er det berre nemnt undersøking for cysticercose, dvs. tinter av Taenia solium, som hittil ikkje er blitt påvist i Noreg (pkt. 6.2): "Cysticercose. Ved mistanke foretas undersøkelse for cysticercose hos svin. Dette omfatter at alle frilagte muskelflater etterses, særlig lårmuskulatur, mellomgolvstapper,