PARASITTAR I DRIKKEVATN GENOTYPING OG OVERLEVINGSEVNA

Transkript

1 PARASITTAR I DRIKKEVATN GENOTYPING OG OVERLEVINGSEVNA Forfattarar: Lucy Robertson og Bjørn Gjerde. Noregs Veterinærhøyskole Det gjennomførte prosjektet hadde delstudiar: (a) utvikling av (teknisk) kompetanse i genotyping av Cryptosporidium og Giardia; og (b) undersøking av overlevingsevna til Cryptosporidium-oocyster og Giardia-cyster i eit terrestrisk miljø gjennom den norske vinteren. Sidan dette er nokså ulike tema, har ein for å letta forståinga først omtala alt som gjeld Materiale og metodar, Resultat og Diskusjon for den førstnemnde delstudien, og så gjort tilsvarande for den sistnemnde delstudien. I det avsluttande kapitlet, Konklusjonar, er begge delstudiane igjen omtala under eitt. Dei etterfølgjande avsnitta om materiale og metodar og resultat er gjort relativt kortfatta. Samandrag I perioden frå juli 2001 til juni 2002 blei delar av epidemiologien til Cryptosporidium- og Giardia-infeksjonar i Noreg undersøkt gjennom to parallelle delstudiar ved Seksjon for parasittologi, Norges veterinærhøgskole. I den eine delstudien bygde ein opp kompetanse i genotyping av Cryptosporidium og Giardia ved å gjennomføra forsøk på genotyping av isolat av parasittane frå norske husdyr etter tidlegare publiserte metodar. Det blei gjennomført vellukka genotyping av Cryptosporidium-isolat frå hund og storfe, medan genotyping av ulike Giardia-isolat ikkje let seg gjennomføra fordi ein ikkje greidde å isolera tilstrekkeleg med DNA frå parasittane. Prosjektet har lagt eit godt grunnlag for å kunna ta i bruk genotyping av Cryptosporidium og Giardia som eit reiskap for å oppspora smittekjelder for dei to parasittane i norske drikkevasskjelder. I den andre delstudien blei overvintringsevna til Cryptosporidium-oocyster og Giardia-cyster i eit terrestrisk miljø undersøkt tre ulike stader i Noreg. Parasittar i spesielle behaldarar blei utplassert i øvre jordlag i Akershus, Hordaland og Nord-Trøndelag i slutten av oktober 2001, og behaldarane undersøkt for overlevande parasittar etter 5-10 dagar, etter ca. 70 dagar (januar) og etter ca. 150 dagar (april). Ytterlegare behaldarar blei utplassert i Akershus i desember og mars og undersøkt fram til april. Det blei berre påvist levande parasittar ved den første prøvetakinga få dagar etter utplasseringa, og prosentdelen levande parasittar var då sterkt redusert. I behaldarar som blei undersøkt i januar og april, og som vekselvis hadde blitt eksponert for kuldegrader og varmegrader, hadde dei fleste oocyster og cyster gått til grunne, truleg fordi dei blei rivne sund av repeterande frysing og tining. Det blei ikkje påvist skilnader i overlevinga av parasittane mellom dei tre geografiske lokalitetane, men mindre skilnader treng ikkje ha blitt fanga opp på grunn av få prøvetakingar. I kontrollprøvar lagra i ulike medium i kjøleskåp syntest Cryptosporidium-oocyster ha noko betre overlevingsevne enn Giardia-cyster (minst 150 dagar mot minst 70 dagar i destillert vatn). Resultata tyder på at dei fleste Cryptosporidium-oocyster og Giardia-cyster som om vinteren ligg i eit terrestrisk miljø med kuldeperiodar, vil gå til grunne. Potensielt infektive parasittar i overflatevatn ser såleis vesentleg ut til å stamma frå parasittar som blir produsert i sommarhalvåret og som når fram til drikkevasskjeldene innan kulda set inn om hausten. Men det er mogeleg at infektive oocyster og cyster som når drikkevasskjeldene i sommarhalvåret, kan overleva i lang tid ved dei moderate og relativt stabile temperaturane i det akvatiske miljøet. Dette er det viktig å få undersøkt nærare ved framtidig forsking.

2 Summary Between July 2001 and June 2002, the Section of Parasitology at the Norwegian School of Veterinary Science carried out two studies on different aspects of the epidemiology of Cryptosporidium and Giardia infections in Norway. In one part of the project, skills in genotyping techniques were developed. Attempts were made to genotype isolates of Cryptosporidium and Giardia obtained from domestic animals, using published experimental protocols. Although this was largely unsuccessful for Giardia isolates, the experience gained was valuable. The genotyping approaches used for Cryptosporidium were more successful, and although further optimisation is necessary, these techniques could have immediate application to further study. In the second part of the project, the terrestrial survival of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts during Norwegian winter conditions was investigated. The parasites were inoculated into specially made semi-permeable survival chambers, which were placed in the upper soil layer in three different locations in eastern, western and central Norway, respectively. Control samples were kept in a refrigerator. The chambers were placed in the soil in late October, and samples were collected for viability assessment after 5-10 days, after about 70 days (January) and after about 150 days (April). Viable parasites were only detected on the first sampling occasion, and the viability of both parasites was already greatly reduced. At the later sampling occasions, very few oocysts and cysts could be recovered from the chambers placed in the environment. This was probably due to mechanical disintegration of the parasites caused by shear forces generated during freeze-thaw cycles, as the air temperature at these locations fluctuated repeatedly from above and below freezing point. The results strongly indicate that Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts shed or deposited between spring and autumn, and which are exposed to periods of sub-zero temperatures during winter, will not survive in the terrestrial environment, and by the following spring will be non-infectious. Parasites that reach the water sources during the warmer months of the year, may, however, survive in the aquatic environment for longer periods.

3 Bakgrunn Dei to zoonotiske tarmparasittane Cryptosporidium og Giardia tilhøyrer respektive sporozoane og flagellatane blant dei eincella organismane (protozoane), dvs. til to grupper med svært ulike eigenskapar når det gjeld morfologi og utvikling. Men dei to parasittane blir ofte omhandla under eitt på grunn av fellestrekk både når det gjeld epidemiologi og overføring, kva slag sjukdom dei framkallar og kva dei har å seia for folkehelsa. Den etterfølgjande generelle omtalen av desse parasittane er relativt kortfatta, sidan dei er blitt inngåande omtala i ein tidlegare SNT-rapport (Robertson og Gjerde, 2000). Der finn ein detaljerte opplysningar om sjølve parasittane, dei sjukdommane dei framkallar, om overføring til menneske, spesielt via drikkevatn, og om regelverk nasjonalt og internasjonalt når det gjeld overvaking av drikkevatn for førekomst av parasittane. Cryptosporidium Talet på Cryptosporidium-arter har endra seg dei seinare åra, dels som følgje av at ein har teke i bruk molekylærbiologiske metodar for å karakterisera morfologisk like isolat frå ulike vertar. For tida reknar ein med at det er minst 8 arter: C. parvum, C. muris, C. baileyi, C. meleagridis, C. andersoni, C. molnari, C. canis og C. felis. Av desse er C. parvum viktigast i humanmedisinen. Denne arta finst hos både menneske og talrike pattedyr. C. parvum omfattar minst tre genotypar. Den eine av desse er relativt humanspesifikk, medan ein annan er zoonotisk og kan overførast frå dyr til menneske og omvendt. Livssyklusen til C. parvum (og dei andre Cryptosporidium-artene) er komplisert og omfattar ei ukjønna oppformeiring etterfylgt av kjønna utvikling med produksjon av infektive oocyster. Overføring skjer med oocyste-stadiet, som inneheld fire infektive organismar (sporozoitar). Etter peroral infeksjon blir desse organismane sette fri frå oocystene fremst i tarmkanalen. Dei trengjer deretter inn på overflata av epitelceller og tar til å formeira seg ukjønna. Etter få dagar får ein også ei kjønna utvikling med danning av store mengder med nye oocyster. Desse oocystene utviklar seg vidare inni verten, slik at dei allereie er infektive når dei blir skilde ut med avføringa. Giardia Flagellatar i slekta Giardia er parasittar i tarmen hos svært mange dyreslag. Basert på skilnader i morfologien til det aktive trofozoit-stadiet er slekta tidlegare blitt oppdelt i tre morfologiske hovudtypar, som til dels også har blitt kalla arter: G. intestinalis, G. agilis og G. muris. Av desse har arta G. intestinalis (= G. duodenalis = G. lamblia) eit svært breitt vertsspekter, og finst både hos menneske og mange pattedyr. Men denne arta eller morfologiske typen har etter kvart vist seg å omfatta mange genotypar med ulike vertsspekter. Livssyklusen til G. intestinalis omfattar berre to stadium. Overføring skjer med cystestadiet, som inneheld to infektive organismar (trofozoitar). Etter peroral infeksjon blir trofozoitane sette fri frå cystene fremst i tunntarmen. Dei festar seg (ekstracellulært) på overflata av epitelcellene og formeirar seg ukjønna ved stadige todelingar. Trofozoitar som blir førte bakover med tarminnhaldet til tjukktarmen, kapslar seg inn, deler seg i to og omdannar seg dermed til cyste-stadiet. Cystene blir skilde ut med avføringa og er infektive når dei forlet verten. Sjukdomssymptom og diagnose Det var først på midten av 1970-talet at ein blei klar over at Cryptosporidium parvum og Giardia intestinalis var to potensielt patogene parasittar hos menneske, og at dei kunne

4 framkalla både akutt og kronisk tarmsjukdom. Ved kryptosporidiose startar vanlegvis symptoma 3-6 dagar etter smitte, og oocyster kan påvisast i pasienten si avføring 3-30 dagar etter infeksjon. Ved giardiose er inkubasjonstida normalt 1-2 veker, og cyster kan vanlegvis påvisast i feces frå om lag 9 dagar etter smitte. Hovudsymptomet ved begge parasittinfeksjonane er diaré; i tillegg kan det vera varierande grader av generell sjukdomskjensle, feber, magesmerter, tapt matlyst og kvalme. Dei kliniske symptoma kan vara frå nokre få dagar til fleire veker. Begge parasittane kan også gje symptomfrie infeksjonar med moderat utskiljing av oocyster eller cyster. Diagnose av infeksjon skjer vanlegvis gjennom påvising av parasittane i avføringsprøvar. Ved kryptosporidiose er det tale om dei 4-6 µm store, runde oocystene, og ved giardiose om dei 8-12 µm store, ovale cystene, men av og til kan også trofozoitar påvisast. Diagnose av Giardiainfeksjon kan vera problematisk på grunn av uregelmessig utskiljing av cyster. Giardiainfeksjonar kan behandlast med brukbar effekt med visse kjemoterapeutika, m.a. metronidazol. Sjukdom pga. denne parasittane kan dermed lindrast og stoppast. Mot kryptosporidiose har ein derimot hittil ikkje funne noko kjemoterapeutikum med tilfredsstillande effekt. Hos immunsvekte personar kan såleis C. parvum gje ein langvarig og livstruande diarésjukdom. Overføring Dei fleste humane infeksjonar med C. parvum og G. intestinalis blir overførte via den fekalorale smittevegen, dvs. gjennom meir eller mindre direkte kontakt med smitteførande avføring frå infiserte menneske eller dyr. Men begge parasittane er også godt tilpassa ei overføring via miljøet, spesielt via drikkevatn. Begge parasittane har ei sterk og langvarig ukjønna oppformeiring i tarmkanalen, noko som resulterer i utskiljing av kolossale mengder av oocyster og cyster frå infiserte individ. Dette fører igjen til ei sterk kontaminering av miljøet med desse infektive stadia gjennom avløpsvatn (kloakk), husdyrgjødsel og avføring frå ville pattedyr. Oocyster og cyster er dessutan nokså hardføre og kan overleva i veker til månader utanfor verten. Den infektive dosen for begge desse parasittane er svært låg, slik at inntak av berre nokre få oocyster eller cyster er tilstrekkeleg til å setja i gang ein infeksjon. Cryptosporidium-oocystene kan overleva dei fleste former for konvensjonell behandling av drikkevatn (klorering, UV-stråling, ozonering), og dei er så små at dei ikkje blir haldne tilbake av sandfilter eller mikrosilar. Dei noko større Giardia-cystene er det litt lettare å filtrera bort ved hjelp av sandfilter, og dei er heller ikkje like hardføre mot ulike former for desinfeksjon som Cryptosporidium-oocystene. Men det har likevel vore ei rekkje mindre vassborne utbrot av giardiose, spesielt der råvatnet i liten grad er blitt behandla. Vassverk som nyttar kjemisk felling kombinert med filtrering, vil kunna fjerna dei aller fleste Cryptosporidium-oocystene og Giardia-cystene frå råvatnet, så sant behandlinga fungerer optimalt. Vassverk som nyttar membranfiltrering vil heilt kunna fjerna desse parasittane. Kontaminering av drikkevasskjelder med Cryptosporidium-oocyster og/eller Giardia-cyster kan føra til at svært mange av dei tilhøyrande konsumentane blir smitta og sjuke. Dei siste 20 åra har det vore ei rekkje dokumenterte vassborne sjukdomsutbrot på grunn av dei to parasittane, der hundrevis og av og til tusenvis har blitt ramma. Det største utbrotet hittil skjedde i Milwaukee, USA i Her fekk ca personar kryptosporidiose. Mange av utbrota har skjedd trass i at vassverka har nytta ulike former for behandling av råvatnet med sikte på å drepa bakteriar og virus. Somme utbrot har også skuldast kontaminering av vatnet med avløpsvatn på distribusjonsnettet.

5 Førekomst i Noreg Dei humanmedisinske miljøa i Noreg har inntil nyleg hevda at infeksjonar med Cryptosporidium og Giardia har vore sjeldne (ikkje-endemiske) hos menneske og dyr her i landet. Men ei undersøking utført mellom juni 1998 og november 1999 viste at Cryptosporidiumoocyster og Giardia-cyster fanst i låge konsentrasjonar i råvatnet til mange norske drikkevasskjelder, og at dei to parasittane dermed måtte ha ei stor utbreiing blant folk og/eller dyr her i landet (Robertson og Gjerde, 2000). Desse funna indikerte også at menneske kunne bli smitta av desse parasittane via drikkevatn, sidan mange norske vassverk ikkje er i stand til å fjerna eller inaktivera dei infektive stadia i råvatnet. Vidare undersøkingar dei siste åra over førekomsten av Cryptosporidium og Giardia hos husdyr og ville hjortedyr i Noreg tyder på at desse parasittane er nokså vanlege i ulike dyrepopulasjonar (Hamnes, Robertson, Gjerde; upublisert). Nye problemstillingar Denne nye informasjonen har reist mange nye spørsmål når det gjeld epidemiologien til kryptosporidiose og giardiose i Noreg. I kva grad kjem Cryptosporidium-oocyster og Giardiacyster i drikkevasskjeldene frå respektive husdyr, ville dyr og menneske? Og kva har opphavet til parasittane vi finn i drikkevatn å seia for infektiviteten for menneske? Kor lenge kan dei infektive stadia overleva ute i miljøet her i landet, spesielt gjennom kuldeperiodar om vinteren? Desse spørsmåla var bakgrunnen for dei undersøkingane som blir omtala i denne rapporten. Svar på desse spørsmåla er heilt avgjerande for å kunna vurdera kva funn av Cryptosporidium og Giardia i drikkevasskjeldene har å seia for folkehelsa og for å kunna setja inn effektive førebyggjande tiltak for å hindra smitte av menneske via drikkevatnet. Ved undersøkinga av norske drikkevasskjelder i fann ein Cryptosporidium og Giardia i mange prøvar, men i låge konsentrasjonar, 1-3 oocyster/cyster pr. 10 liter (Robertson og Gjerde, 2000). Men med den metoden som blei nytta i den nemnde undersøkinga var det uråd å fastslå infektiviteten til dei påviste parasittane for menneske. For at Cryptosporidium og Giardia skal kunna smitta menneske, må overføringsstadia for det første vera i live, og for det andre må dei tilhøyra ein genotype som er infektiv for menneske. Både Cryptosporidium parvum og Giardia intestinalis er som nemnt ovanfor blitt påvist hos både menneske og ei lang rekkje dyreslag. Parasittane hos menneske og dyr er heilt like mikroskopisk. Tidlegare var det nesten uråd å fastslå om det faktisk var dei same artene som fanst hos både dyr og menneske, sidan overføringsforsøk til menneske er vanskelege å utføra. Denne situasjonen har endra seg radikalt dei siste åra etter kvart som nye molekylærbiologiske metodar er blitt utvikla og deretter tekne i bruk for å identifisera ulike isolat av parasittane. Ved hjelp av desse nye metodane har ein funne at både Cryptosporidium parvum og Giardia intestinalis omfattar fleire genotypar med ulikt vertsspekter og dermed overføringsvegar i naturen. Cryptosporidium parvum omfattar minst tre genotypar: ein storfegenotype, ein human genotype, og ein hundegenotype. Storfegenotypen har eit breitt vertsspekter, som omfattar både menneske og mange pattedyr, inkludert alle våre huspattedyr. Denne genotypen ser ut til å vera zoonotisk. Den humane genotypen av C. parvum finst berre hos menneske, og er altså humanspesifikk. Hundegenotypen av C. parvum finst hovudsakleg hos hund, men er også påvist nokre få gonger hos menneske, og er blitt overført til storfe. Desse tre genotypane vil truleg i framtida bli definert som separate arter. Somme forskarar har alt skilt ut hundegenotypen som ei eiga art, som dei har gjeve namnet C. canis. Også artene C. felis (frå katt) og C. meleagridis (frå høns, kalkun) kan av og til smitta menneske. Oocystene til desse artene

6 er også svært like oocystene til C. parvum, slik at genotyping vil vera naudsynt for å stilla ein sikker artsdiagnose ved funn av kryptosporidieoocyster hos menneske. Når det gjeld Giardia intestinalis, omfattar denne arta minst sju genotypar: Genotype Vertsspekter Gruppe A menneske, storfe, sau, geit, hund, katt, bever m.fl. Gruppe B menneske, hund, bever, m.fl. Hund hund Katt katt Husdyr storfe, geit, sau, alpakka Rotte rotte Gnagar markmus, moskusrotte Gruppe A- og B-genotypen omfattar eigentleg to samlingar av fleire nærståande genotypar (på engelsk kalla Assemblage A and B), men er førebels ikkje blitt splitta opp i ytterlegare genotypar. Som vi ser har desse to genotypane eit breitt vertsspekter, som omfattar både menneske og pattedyr. Funn av den same genotypen hos både menneske og dyr er ein sterk indikasjon på at genotypen er zoonotisk, men ikkje eit endeleg prov på at så er tilfelle. Kvar av dei fem andre genotypane er hittil berre blitt påviste hos eitt eller nokre få dyreslag, og dei ser såleis ut til å vera relativt vertsspesifikke og ikkje i stand til å smitta menneske. Alle dei sju nemnde genotypane blir altså framleis klassifiserte som arta Giardia intestinalis, men denne arta omfattar tydelegvis fleire arter, slik at vi etter kvart truleg vil få ei oppdeling av denne i fleire nye arter. For begge parasittslekter gjeld altså at berre somme arter eller genotypar er infektive for menneske. Ved funn av Cryptosporidium-oocyster og Giardia-cyster i drikkevatn er det difor naudsynt å kunna fastslå kva genotype dei tilhøyrer, for å vita om dei er potensielt infektive for menneske. Nærare identifikasjon av parasittane til genotype vil også kunna gje ein indikasjon på kven det er som har kontaminert drikkevasskjelda (Glaberman et al., 2002). Førekomst av den humane genotypen av Cryptosporidium parvum vil såleis indikera kontaminering av drikkevasskjelda med human avføring (t.d. i avløpsvatn), medan både dyr og menneske kan vera årsak til førekomst av storfegenotypen i vatnet. Sidan det ikkje fanst kompetanse på genotyping av Cryptosporidium og Giardia her i landet frå før av, var eitt av hovudmåla med dette prosjektet å prøva å etablera slik basal kompetanse. Dette prøvde ein å oppnå ved å ta i bruk publiserte metodar for genotyping av parasittane på parasittisolat frå ulike dyreslag. Dermed ville grunnlaget vera lagt for å kunna ta i bruk desse metodane også på parasittar isolert frå miljøet, i første rekkje frå drikkevatn. Men det var utanfor ramma av dette prosjektet å fastslå kva slags genotypar av Cryptosporidium og Giardia vi hadde i norske drikkevasskjelder, og å finna ut kva rolle respektive dyr og menneske spela for kontamineringa av drikkevasskjeldene med desse parasittane. Eit anna sentralt tema når det gjeld epidemiologien til kryptosporidiose og giardiose i Noreg, er i kva grad overføringsstadia (oocyster, cyster) til desse parasittane er i stand til å overleva ute i miljøet under dei relativt tøffe klimatiske tilhøva vi har her i landet, spesielt gjennom vinterhalvåret. Mange tidlegare studiar og praktisk erfaring har vist at Cryptosporidiumoocystene og Giardia-cystene er relativt hardføre og langliva. Utan desse eigenskapane ville overføring via drikkevatn truleg hatt lite å seia som smitteveg for dei to parasittane (Smith et al., 1995). Det er tidlegare gjort fleire studiar over Cryptosporidium-oocystene si evne til å overleva ulike påkjenningar, som låge temperaturar og frysing (Robertson et al., 1992a; Fayer

7 og Nerad, 1996; Fayer et al., 1998; Walker et al., 2001), dehydrering og osmotisk stress (Jenkins et al., 1999; Walker et al., 2001) og andre (ukjende) faktorar i jord, avføring og vatn (Robertson et al., 1992a; Anguish og Ghiorse, 1997; Jenkins et al., 1997, Jenkins et al., 1999). Desse studiane har gjennomgåande vist at Cryptosporidium-oocystene er nokså resistente, men at eksponering for låge temperaturar, særleg over lengre tid og i kombinasjon med andre påkjenningar, reduserer overlevinga. Giardia-cystene si evne til å overleva ulike miljøpåkjenningar har ikkje blitt like grundig undersøkt som tilfellet er for Cryptosporidium-oocystene, men dei er vanlegvis blitt sett på som mindre hardføre enn dei sistnemnde strukturane. Nyare forsking tyder på at dette ikkje er ei heilt korrekt oppfatning, sidan enkelte påkjenningar synest å ha større skadeleg effekt på Cryptosporidium-oocyster enn på Giardia-cyster. Giardia-cyster synest såleis å vera meir resistente mot UV-stråling enn Cryptosporidium-oocyster (Campbell og Wallis, 2002). For å undersøkja overlevingsevna til Cryptosporidium-oocyster og Giardia-cyster i eit terrestrisk miljø, dvs. jord, gjennom den norske vinteren, blei det gjennomført feltstudiar på tre lokalitetar i Noreg vinteren Her blei parasittane eksponert for dei naturlege variasjonane i temperatur og væte. I tillegg blei oppfølgjande forsøk utført under laboratorietilhøve.