CMVIgMELA Test PKS medac Norsk 0123 110PKSVPN/010512
PRODUSENT medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUSJON medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Phone: ++49/ 4103/ 8006351 Fax: ++49/ 4103/ 8006359 TINGE ADDRESS Telefon: ++49/ 4103/ 8006111 Fax: ++49/ 4103/ 8006113 110PKSVPN/010512
CMVIgMELA Test PKS medac Enzym immunoassay (EIA) med PipettingControlSystem for påvisning av IgM antistoff mot cytomegalovirus (CMV) Cat. no.: 110PKS BARE FOR IN VITRO DIAGNOSTISK BRUK INNLEDNING Cytomegalovirus (CMV) tilhører den human patologiske Herpesvirus familien som er karakterisert ved en dobbelttrådet heliks DNA genom. Det er karakteristisk for disse virus at de persisterer latent i organismen etter primær infeksjon. Reaktivering av viruset kan derfor forekomme under visse omstendigheter. CMV infeksjoner hos immunokompetente personer er normalt symptomfrie. Hos personer som er immunsuppremerte (f. eks. transplantasjons pasienter, HIV positive, cancer pasienter og nyfødte) er en rekke alvorlige symptomer observert. CMV er en av de mest frekvente patogener ved prenatale infeksjoner og kan forårsake en rekke alvorlige sykdommer, inklusive senskader hos barn som er født uten symptomer. CMVIgMELA Test PKS medac kan anvendes for påvisning av spesifikt CMV IgM antistoff i serum prøver. Akutt CMV infeksjon kan diagnostiseres ved påvisning av IgM antistoff. Det må imidlertid taes med i betraktningen at IgM antistoff ikke alltid dannes. Hos immunosuppremerte pasienter kan f. eks. CMV IgM antistoff sjelden påvises ved reaktivering og reinfeksjon. 110PKSVPN/010512 1
TESTPRINSIPP Platen er coatet med antihuman IgM immunoglobulin. Selektivt bundet til brønnene. Det CMVspesifikke IgM antistoffet bindes til peroxidasemerket CMV antigen (AG = antigen, P = peroxidase). Inkubering med TMBsubstrat (*). Reaksjonen stoppes ved tilsetning av svovelsyre. Absorbsjonen leses så fotometrisk. Testens fordeler Ingen uspesifikke reaksjoner og ingen falske positive resultater forårsaket av reumatisk faktor. Ingen blokkering av IgM antistoff ved høye IgG titer. Pipette kontroll systemet gir visuell overvåkning av hvert pipetterings steg ved farge endringer. De brytbare mikrobrønn stripsene gir effektiv utnyttelse av testen. Mulighet for automatisering på åpne ELISA systemer. 110PKSVPN/010512 2
KIT INNHOLD Cat. no.: 110PKS 1. MTP Mikroplate: 12 x 8 brønner (merket med CMM, med ramme og tørremiddel vakuum forseglet i en aluminium pose), brytbare, U formet, coated med geit antihuman IgM immunoglobulin, BSA og ph indikator, ferdig til bruk. 2. CONTROL Negativ kontroll: 1 ampulle med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, inneholder BSA, fenol, ProClin TM 300 og gentamycine sulfat. 3. CONTROL + Positiv kontroll: 1 ampulle med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, inneholder BSA, fenol, ProClin TM 300 og gentamycine sulfat. 4. WB Vaskebuffer: 1 flaske med 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, inneholder ProClin TM 300. 5. VIRDIL Prøve fortynning: 1 flaske med 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, ferdig til bruk, inneholder ProClin TM 300. 6. ANTIGEN CMVIgMELA (Enzym merket antigen): 2 ampuller med 5,0 ml i hver, lyophilised, inneholder FCS, farget rødt, HRPkonjugert. 7. TMB TMBsubstrat: 1 ampulle med 10 ml, ferdig til bruk. 8. STOP Stopp løsning: 2 ampuller med 11 ml i hver, 0,5 M svovel syre (H 2 SO 4 ), ferdig til bruk. 110PKSVPN/010512 3
1. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Materiale/Reagens State Lagring Stabilitet Test kit uåpnet 2...8 C Inntil utløpsdato Mikroplate åpnet 2...8 C i 6 uker pose med tørremiddel Kontroller åpnet 2...8 C 6 uker Vaskebuffer fortynnet 2...8 C 6 uker Prøve fortynning åpnet 2...8 C 6 uker CMVIgMELA rekonstituert 2...8 C 5 dager 18 C * 6 uker TMBsubstrat åpnet 2...8 C 6 uker Stopp løsning åpnet 2...8 C inntil utløpsdato * Aliquoter må ikke fryses igjen etter å ha vært tint en gang. Ikke bruk reagenser etter utløpsdatoen. 2. UTSTYR SOM ER NØDVENDIG, MEN SOM IKKE FØLGER MED I KITET 2.1. Destillert vann. Bruk av deionisert vann kan forstyrre test prosedyren. 2.2. Justerbare mikropipetter. 2.3. Rene glass eller plastikk beholdere til fortynning av vaskebuffer og prøver. 2.4. Passende utstyr for mikroplate vasking (f. eks multistepper eller ELISA vasker). 2.5. Inkubator for 37 C. 2.6. Mikroplate avleser med filtre for 450 nm og 620 650 nm. 3. TILLAGING AV REAGENSER Alle kit komponenter må få romtemperatur før bruk. Beregn det nødvendige antall brønner som trenges. 3.1. Mikroplate Aluminium posen må forsegles helt tett igjen etter hver gang det taes ut brønner. Oppbevaring og stabilitet til brønnene er nevnt i avsnitt 1. 110PKSVPN/010512 4
NB: Mikroplate brønnene har en lys grønn farge. Eventuell forekomst av grønnlige brune farge på innsiden av brønnene skyldes produksjons prosessen og har ingen innvirkning på testens egenskaper. 3.2. Vaskebuffer Bland en del vaskebuffer (10x) med ni deler destillert vann(f. eks. 50 ml vaskebuffer (10x) med 450 ml vann). 10 ml vaskebuffer rekker til åtte brønner. Krystaller i vaskebufferen (10x) må løses opp ved oppvarming (maks. 37 C) og/eller risting ved romtemperatur. 3.3. CMVIgMELA Rekonstituer det frysetørrete CMVIgMELA med 5,0 ml prøve fortynning (for hver ampulle). Bland forsiktig, pass på at de partiklene som er ved korken også blir oppløst. Etter rekonstituering har CMVIgMELA fått en rød farge og er klar til bruk. Ikke bland test spesifikke reagenser (mikroplate, kontroller, CMVIgM ELA) fra forskjellige lot nr. Prøve fortynning, vaskebuffer, TMBsubstrat og stopp løsning kan benyttes i all de virologiske ELISA kit til medac. Reagenser fra andre produsenter kan ikke brukes. Gyldige og reproduserbare resultater kan bare oppnåes hvis prosedyren er fulgt nøyaktig. 4. PRØVER 4.1. Testen er for serumprøver. Pasientprøvene kan oppbevares i 7 dager ved 28 C. For lengre oppbevaring må prøvene fryses ved 20 C. Unngå gjentatte tining og frysing av prøvene. 4.2. Forbehandling av sera f. eks. inaktivering er ikke nødvendig. De må imidlertid ikke være kontaminert med mikroorganismer eller inneholde røde blodlegemer. 4.3. Sera skal fortynnes 1:100 med prøve fortynning. De kan fortynnes ytterligere for titer bestemmelse. 110PKSVPN/010512 5
5.A. TEST PROSEDYRE 5.1. Klipp opp aluminium posen overfor zip låsen og ta ut det nødvendige antall mikroplate brønner (se 3.1.). Mikroplate brønnene er ferdig til bruk og behøver ikke pre vaskes. 5.2. La brønn A1 være tom for blank avlesning (se 6.A.). Tilsett 50 μl av hver fortynnet prøve samt negative og positive kontroll i duplikat til brønnene. Etter pipettering av prøvene (ph nøytral eller basisk væske) vil brønnene bli blå. Manglende fargeendring i en brønn indikerer at ikke har blitt tilsatt prøve eller kontroll. Hvis nødvendig kan mikroplate brønnene oppbevares ved romtemperatur i et fuktighets kammer i opptil 30 minutter eller ved 2 8 C i opptil 60 minutter før videre prosedyre. 5.3. Inkuber mikroplate brønnene i 60 min ( 5 min) ved 37 ( 1 C) i et fuktighetskammer eller forseglet med inkuberings dekk folie. 5.4. Rekonstituer CMVIgMELA (se 3.3.). 5.5. Etter inkubasjonen vaskes brønnene 3 ganger med 200 μl vaskebuffer per brønn. Pass på at brønnene blir fylt helt opp. Etter vaskingen bankes mikroplate brønnene mot et absorberende papir. Brønnene må ikke få tørke ut! Fortsett umiddelbart! 5.6. Tilsett CMVIgMELA (rødfarget) til hver brønn (unntatt A1). 50 μl ELA må pipetteres til brønnene hvis testen gjøres manuelt. Husk!: Hvis testen gjøres med automatisk utstyr må 60 μl ELA pipetteres til hver brønn på grunn av store fordampning i inkubasjons kammeret. Egnetheten til testen for automatisering er bekreftet under evalueringen av testen. Men vi anbefaler å kontrollere kompatibiliteten med det utstyret som laboratoriet bruker. 5.7. Inkuber igjen i 60 min ( 5 min) ved 37 o C ( 1 C) i et fuktighetskammer, eller forseglet med inkubasjons dekk folie. 5.8. Etter inkuberingen vaskes mikroplate brønnene igjen (se 5.5.). o C 110PKSVPN/010512 6
5.9. Tilsett 50 μl TMBsubstrat til hver brønn (også A1) og inkuber mørkt i 30 min ( 2 min) ved 37 o C ( 1 C) i et fuktighetskammer, eller forseglet med inkubasjons dekk folie. Positive prøver blir blå. 5.10. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 μl stopp løsning til hver brønn(også A1). Positive prøver blir gule. Tørk undersiden av mikroplate brønnene før de leses av i fotometeret og pass på at det ikke er luftbobler i brønnene. Avlesningen må gjørs innen 15 min etter tilsetning av stopp løsningen. 5.B. TABELL FOR TESTPROSEDYREN Negativ kontroll Positiv kontroll Prøve Blank (A1) Negativ kontroll 50 μl Positiv kontroll 50 μl Prøve 50 μl Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3 x med 200 μl vaskebuffer CMVIgMELA 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3 x med 200 μl vaskebuffer TMBsubstrat 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Inkuber i 30 min ved 37 o C i mørke Stopp løsning 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Fotometerisk avlesning ved 450 nm (ref. 620 650 nm) *) manuell/automatisk prosedyre (se 5.6.) 110PKSVPN/010512 7
6.A. BEREGNING AV RESULTATENE (VALIDERING) Avles OD verdier ved 450 nm (referanse bølgelengde 620 650 nm). Trekk OD verdien til blank brønnen (brønn A1) fra alle de andre OD verdiene. Gjennomsnitts OD verdi til den negative kontrollen må være < 0,100. Gjennomsnitts OD verdi til den positive kontrollen må være > 0,800. Cutoff = gjennomsnitt OD verdi til den negative kontrollen + 0,140 Grå sone = Cutoff 10 % Repeter kjøringen hvis resultatene ikke møter spesifikasjonen. 6.B. TOLKNING AV RESULTATENE Prøver med OD verdier under den laveste verdien til grå sonen er NEGATIVE. Prøver med OD verdier innenfor grå sonen er USIKRE. Disse bør retestes sammen med nye prøver som er tatt 14 dager senere for å se om det er titer endring. Prøver med OD verdier over den over øverste grensen til grå sonen er POSITIVE. Resultatene skal alltid tolkes sammen med kliniske data og andre diagnostiske parametere. Kryssreaksjoner forårsaket av antistoffer mot andre Herpesvirus kan ikke utelukkes i enkelttilfeller. Veldig høye lipidkonsentrasjoner i negative prøver kan forårsake falske positive resultater. Høyer konsentrasjoner av Hemoglobin eller bilirubin har ingen innvirkning på resultatene. 110PKSVPN/010512 8
7. TESTENS EGENSKAPER Vi fastslo følgende egenskaper under diagnostisk evaluering. 7.A. SENSITITIVITET OG SPESIFISITET 482 serum prøver fra blodgivere og pasienter ble testet med CMVIgM ELA Test PKS medac I sammenligning med en meget spesifikk ELISA som er i rutinemessig bruk i laboratorier. Resultatene er vist i tabellen under. CMVIgMELA Test PKS Referanse test negative positive negative 314 1 positive 1 166 Sensitivitet = 99,40 % Spesifisitet = 99,68 % Positiv prediktiv verdi: 99,40 % Negativ prediktiv verdi: 99,68 % 7.B. PRESISION Prøver Intraassay variasjon Prøver Interassay variasjon (n = 11) OD SD CV (%) n OD SD CV (%) gj. sn. gj. sn. NC 0,034 0,005 15 24 NC 0,050 0,010 20 BC 0,314 0,013 4 24 BC 0,230 0,021 9 PC 2,269 0,048 2 24 PC 1,456 0,064 4 N 1 0,049 0,008 16 27 N 4 0,058 0,007 12 N 2 0,317 0,023 7 27 N 5 0,264 0,037 14 N 3 2,673 0,086 3 27 N 6 0,271 0,039 14 N 7 1,788 0,073 4 NC = negativ kontroll; BC = svak positiv kontroll (Ikke inkludert i kitet); PC = positiv kontroll 110PKSVPN/010512 9
GENERELLE RÅD For å unngå krysskontaminasjon må ikke skrukorkene på ampullene byttes om. Reagensene må forsegles umiddelbart for å forhindre fordampning og mikrobiell kontaminasjon. Etter bruk må reagensene oppbevares i henhold til bruksanvisningen for å kunne garantere holdbarheten. Etter bruk må alle komponenter i kitet oppbevares Ii sin originale forpakning for å hinder blanding av reagensene med andre tester eller lot nr. (se også 3.). HELSE OG SIKKERHETS INFORMASJON De lokale helsemyndigheters reguleringer må følges. Reagenser av human opprinnelse er testet negativt på HbsAg og på antistoff mot HIV1/2 og HCV. Men det anbefales på det sterkeste at dette materialet så vel som det som er av animalsk opprinnelse (se kit innhold) behandles som potensielt smittefarlig. KASSERING Rester av kjemikalier og reagenser er å anse som risikoavfall. Kassering skal skje i henhold til lokale eller nasjonale regler. Ta kontakt med lokal myndighet som vil gi råd om hvordan risikoavfall skal håndteres. Dato utgave: 01.05.2012 110PKSVPN/010512 10
REFERANSER Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban und Schwarzenberg, München, 930 (1990). Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995). Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der CytomegalievirusInfektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum Nachweis von spezifischen IgMAntikörpern in Serumproben von immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9), 480484 (1996). Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag, 279290 (1996). Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solidphase enzyme immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 5, 629634 (1977). Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G. and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy. Arch. Virol. 53, 177184 (1977). Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an EnzymeLabelled Antigen (ELA). J. Gen. Virol. 50, 5968 (1980). Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585589 (1991). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human Cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme immunoassays for the detection of HCMVspecific IgM antibody. Clin. Diagn. Virol. 2, 245259 (1994). 110PKSVPN/010512 11