Oppgave 1: Tynnsjikt-kromatografi (TLC)

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet, Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2017 / s. 1 av 7 Oppgave 1: Tynnsjikt-kromatografi (TLC) Sammendrag: Ved hjelp av tynnsjiktskromatografi skal ulike blandinger separeres ved å velge en mobilfasesammensetning som gir best separasjonen, samt se på ulike måter å detektere komponenter som ikke er synlig med blotte øye. Hensikten med oppgaven er å se på hvordan ulike mobilfaser, heretter kalt MF, påvirker separasjonen i praksis. Ved hjelp av teoretiske parametere (bl.a løsningsmiddelstyrke og RF-verdier) skal dere kunne velge de betingelsene som gir best separasjon av ulike komponenter i en blanding på en gitt stasjonærfase, heretter kalt SF; altså det optimale elueringssystemet for ulike komponenter, både med tanke på separasjon og deteksjon. Dere skal også kunne identifisere de ulike komponentene i en blanding ved hjelp av standarder og RF-verdier i det optimale elueringssystemet. Oppgaven består av deloppgavene a til d og gjennomføres over en labøkt. Avhenging av hvor effektivt dere jobber, kan denne økten bli noe lengre enn de oppsatte 4 timene! Vi bruker helseskadelige løsningsmidler og kjemikalier Les sikkerhetsdatabladene og gjør deg kjent med eventuell risiko og farer som gjelder for kjemikaliene Svar på minitesten på It s Learning senest dagen før dere skal på lab. Les labteksten godt i forkant. Bruk verneutstyr i henhold til databladene og lokale retningslinjer Bruk avtrekksskap og bruk de riktig! Vær nøye med løsningsmiddelavfall (med eller uten halogen) CA-nr. Ref.-liste (Stoff [CAS-nr.]) : Petroleter (80-100ºC el. 40-65ºC) [8032-32-4], etylacetat [141-78-6], diklormetan [75-09-2], aceton [67-64-1], toluen [108-88-3], benzil [134-81-6], benzyl-benzoat (benzoesyre-benzylester) [120-51-4], 1-klornaftalen [90-13-1], svovelsyre [7664-93-9], fosformolbydensyre [51429-74-4] el. løsning den i etanol), jod [7553-56-2], benzylmetylketon (=fenylaceton) [103-79-7], fenyl-2-propanol [698-87-3],

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet, Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2017 / s. 2 av 7 Innledning: TLC-eksperimentene 1 a.-1 e. er eksempler på normal-fase adsorpsjonskromatografi. Den praktiske utførelsen for disse er relativt like, derfor beskrives utførelsen generelt. Start med alle deloppgavene samtidig, unntatt 1 c., da alle oppgaver foruten 1 c. har samme fremgangsmåte. Optimeringen i 1.a - 1.e utføres på TLC-plater av typen: MERCK, "Kieselgel 60 F 254, 0,2 mm silikagel på aluminiumfolie. Separasjonsbetingelsene må optimeres for de aktuelle komponentene i blandingen. Siden platetypen, altså SF, allerede er valgt, er den viktigste gjenværende parameteren valget av MF. Mulige mobile faser i dette forsøket begrenses til følgende løsningsmidler: Petroleter 80-100º, ε 0,01 Etylacetat, ε 0,56 Diklormetan, ε 0,42 Aceton ε 0,58 Toluen, ε 0,29 De rene løsningsmidlene som nevnt ovenfor testes først, deretter testes blandinger med petroleter. Petroleter, som har ε 0,01, fungerer som en fortynner ved å bremse elueringshastigheten, altså å justere ned høye RF-verdier (f. eks. sterkt løsningsmiddel + petroleter 1+2, 1+4, 1+9). Bruk kun blandinger med ett løsningsmiddel og petroleter, der petroleter benyttes til å justere elueringsstyrken. Test gjerne ulike blandinger av løsningsmiddel og petroleter parallelt slik at man jobber mer effektivt. RF-verdier oppnådd i samme begerglass og på samme plate, er som regel mindre variable, dvs bedre reproduserbarhet, enn verdier fra forskjellige begerglass. Generell eksperimentell fremgangsmåte: Et begerglass (600ml) fores innvendig ca. ¾-rundt med filterpapir og fylles med 10-20 ml elueringsmiddel. Begerglasset tettes med et lokk av aluminiumsfolie, og rystes litt for å fukte hele papiret med mobilfase. For å bedre reproduserbarheten av RF-verdier, bør lokket være tett og karet stå i noen minutter før bruk slik at atmosfæren er mettet med mobilfase. Merk glasset med MF-innhold. Silikagel-platene lages av 20 x 20 cm plater ved å klippe til en platestørrelse på ca 10 x 4 cm. Sjiktet bør bli minst mulig bøyd og skadet under klippingen da det fører til ujevn MFvandring, skjev væskefront og lite reproduserbare RF-verdier. Berør hovedsakelig baksiden av platen og ikke det hvite silikasjiktet. Bruk hansker og/eller pinsett ved håndtering av platene.

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet, Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2017 / s. 3 av 7 Figur 1.1 Prøvene appliseres på platene slik at startflekkene ikke kommer i direkte kontakt med MF (ca 1.5 cm opp fra kanten), og med god avstand (ca 1 cm) til sjiktkanten sideveis. Avmerk appliseringspunkt på platen med blyant. Forsøk å lage startflekkene så små som mulig. Unngå altfor konsentrerte flekker da det vil overbelaste SF og kan føre til uregelmessige flekkformer og høye RF-verdier. Hvis flekken er for svak til å bli detektert, påsett heller litt av gangen flere ganger, og la den tørke opp mellom hver applisering på samme flekk. Unngå å skade sjiktet med kapillæret eller blyanten. Skadene vil føre til deformerte flekker og ekstra sonespredning. Påsettingen skjer med kapillærrør; ett til hver prøveløsning. Det er mulig å bruke begge ender for å spare kapillærrør Det er plass til ca 3-4 appliseringflekker på en plate (se figur 1.1 og 1.2) Når startflekkene er tørre, settes platen forsiktig ned i begerglasset vhj av en pinsett og aluminiumslokket settes på. Når væskefronten nærmer seg den øvre enden av sjiktet, avsluttes elueringen. Platen tas ut av karet og MF-fronten avmerkes med blyant umiddelbart da den fordamper fort. La de dampe helt av før de tas ut av avtrekksskapet. Fig. 1.2 Identifisering ved ko-kromatofrafering. Figuren viser en TLC plate i et elueringskar hvor prøve som ønskes separert er helt til venstre på platen, mens flekkene fra venstre mot høyre representer hver enkelt komponent i ren form, altså en standard for hver enkelt komponent i blandingen 1.MF/eluent 2.TLC-plate 3.Påsatt prøveblanding 4.Standarder for hver enkelt komponent 5. Løsningsmiddelfronten/MF-fronten 6.Startlinje

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2016 / s. 4 av 7 Bedøm separasjonen ved hjelp av RF -verdier. Et godt elueringssystem bør ha størst mulig spredning av komponentene med RF -verdier i intervallet 0,2 og 0,6. Om det er bedre å ha lengst mulig avstand mellom flekkene eller størst mulig RF-forhold, vurderes i hvert enkelt tilfelle og valget diskuteres i rapporten. Diskuter det du mener er optimal MF med lab.leder før du går videre i oppgaven, og før du anser deg som ferdig for dagen, så slipper du kjedelige overraskelser når du skal skrive rapporten. Fig.1.3 viser hvordan man beregner RF -verdier basert på MF-fronten og stoffenes vandringslengde. En RF -verdi er karakteristisk for et spesifikt stoff såfremt elueringsbetingelsene er konstante. Dokumenter kromatogrammene inkludert de fra utprøvingen ved fotografering eller kopiering. Resultatene fra utprøvingen kan bli nyttige til å forklare uventede resultater. I rapporten skal dokumentasjon av alle resultatene fra de optimale MF-sammensetningene være med i rapportens resultatdel, og de fra utprøvingen legges ved som vedlegg. Platene må derfor være godt merket.

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2016 / s. 5 av 7 Eksperimentelt: Prøver til oppgavene får dere utdelt. Les godt på prøveglassene slik at det ikke skjer ombyttinger. Oppgave 1.a: Separasjon av fargede substanser i blanding. Finn optimal MF for separasjon av innholdet i følgende prøver 4 ulike faregepigmenter i en fargeblanding Pigmenter i gress- eller rucculaekstrakt Pigmenter i paprikaekstrakt Hint: De ulike ekstraktene har ikke nødvendigvis samme optimale MF-sammensetning, så optimer hver enkelt av de tre blandingene individuelt. Marker med en ring rundt flekkene innen rimelig tid med blyant da pigmentflekkene kan blekne ganske fort pga foto-/luftoksidasjon. I rapporten: Angi sammensetningen av den optimale MF-blandingen til hver av de ulike ekstraktene. Rapporter RF-verdiene for de ulike hovedpigmentene i hvert enkelt ekstrakt og angi fargen på hovedpigmentene (altså flekkene på platen) i tabellform. Oppgave 1.b: Separasjon og identifisering av ikke-fargete substanser i blanding. Finn optimal MF for separasjon av komponentene i en blanding som inneholder benzil, benzyl-benzoat (benzoesyre-benzylester) og 1-klornaftalen. Benzil benzyl-benzoat (benzoesyre-benzylester) 1-klornaftalen Figur 1.4 viser strukturen til komponentene i blandingen Etter optimal MF sammensetning er funnet, skal forbindelsene identifiseres ved å eluere med standarder av enkeltkomponentene, dvs ko-kromatografere de 3 ulike standarene i det optimerte systemet sammen med komponentblandingen på samme plate. Detekter flekkene i en UV-boks ved 254 nm. Gjenta kromatograferingen av blandingen med den optimale MF på en aktivert plate dvs en plate som på forhånd er tørket i varmeskap ved 110 C. Platene er forhåndstørket og ligger klare i varmeskap til bruk.

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2016 / s. 6 av 7 I rapporten: Angi sammensetningen av den optimale MF, samt deteksjonsmetode og RF-verdier, inkludert RF-verdier for aktivert plate, til komponentene i blandingen og tilhørende standarder i tabellform i rapportens resultatdel. Diskuter observert elueringsrekkefølge av analyttene med tanke på analyttenes kjemiske egenskaper og evt. effekt av aktivert plate i rapportens diskusjonsdel. Oppgave 1.c: Ulike fremkalling-/visualiseringsteknikker av komponenter etter eluering vhj av TLC Eluer fire identiske plater av komponentblandingen fra oppgave 1.b. Tips til gjennomføringen: Eluer en plate med fire identiske flekker. Lag flekkene ekstra konsentrerte (altså appliser flere ganger på samme flekk) for bedre resultat. Klipp platen i fire like deler etter endt eluering, slik at du nå har fire identiske plater med en flekk på hver plate. Pass på at løsningsmiddelet er dampet av før platene fjernes fra avtrekksskapet. Fremkall/visualiser flekkene på hver enkelt plate med hver sin unike metode; altså en plate til hver av de fire metodene listet opp under: 1) å se i UV-lys ved hhv. 254 nm OG 365 nm (bølgelengde endres med en knapp på toppen av boksen) 2) dypping i 10 % svovelsyreløsning i metanol og oppvarming i varmeskap i min. 15 min ved 125 C 3) spraying eller dypping i en 5 % løsning av fosformolybdensyre i etanol, og oppvarming som over. 4) Min.10-15 minutters fremkalling i jod-kammer Merk av de synlige komponentene fra alle metodene over og dokumenter platene. I rapporten: Dokumenter resultatene (f.eks med bilde) fra de ulike metodene i resultatdelen. Regn RFverdier og gi et anslag på hvilke komponenter dere evt har identifisert ved sammenlikning av RF-verdiene i 1 b) Diskuter de testede metodene. Hvilke(n) metode(r) fungerer best for de tre ulike komponentene? Hva funger (ikke)? Diskuter hvorfor/hvorfor ikke. Husk at ingen resultat er også et resultat. Oppgave 1.d: Separasjon av blandingen benzyl-metylketon og 1-fenyl-2-propanol Finn optimal MF for separasjonen av benzyl-metylketon (benzosyre-benzylester, utgangsstoff) og 1-fenyl-2-propanol (produkt, og evt. biprodukter).

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2016 / s. 7 av 7 Reduksjon Benzylmetylketon Fenyl-2-propanol Fig 1.5 viser struktur til komponentene i blandingen Etter optimal MF sammensetning er funnet, skal forbindelsene identifiseres ved å eluere med standarder av enkeltkomponentene, dvs ko-kromatografere de 2 ulike standarene i den optimerte MF-sammensetningen sammen med komponentblandingen. Detekter flekkene i en UV-boks ved 254 nm. I rapporten: Angi sammensetningen av den optimale MF, samt deteksjonsmetode og RF-verdier til komponentene i blandingen og tilhørende standarder i tabellform i rapportens resultatdel Rapportering: Skriv rapporten mest mulig helhetlig. Det er ikke nødvendig å dele rapporten inn i hver enkelt deloppgavene da mange av resultatene som rapporteres er felles for alle oppgavene. Samle resultater og RF-verdier i færrest mulig tabeller. Husk å merke tabellene og bruk tabelltekst. Ved identifisering, utform tabellen slik at RF-verdier i blanding og RF-verdier til tilhørende standard kommer ved siden av hverandre. Eks på tabell under: Dette er ingen absolutt mal for hvordan tabellen skal se ut, bare et tips i riktig retning, spesielt med tanke på at RF-verdier fra blanding og standarder bør være sidestilt for mest mulig oversiktlighet. RF-verdier Komponent Blanding Standard Aktivert plate Benzil 0,17 0,16 0,15 Benzylbenzoat 0,28 0,27 0,26 1-klornaftalen 0,47 0,45 0,45 Husk å svare på alle spørsmål skrevet i kursiv under hver deloppgave. Pass på hva som hører hjemme i resultatdel og hva som hører hjemme i diskusjonsdelen. Kun resultater fra plater med optimert MF skal være med i resultatdelen. Platene fra utprøvingen, skal legges ved som vedlegg. Ingen originale plater i rapporten, kun kopier eller bilder. Henvis til utprøvingen om nødvendig for å forklare valg dere har tatt, uforutsette resultater o.l. Merk derfor platene og vedleggene godt

Norges teknisk naturvitenskapelige universitet Institutt for kjemi KJ 2053 / TLC / 2016 / s. 8 av 7