Ha oversikt og forståelse for hvordan enzymer katalyserer biokjemiske reaksjoner (inkl. enzymkinetikk)

Ha oversikt og forståelse for hvordan enzymer katalyserer biokjemiske reaksjoner (inkl. enzymkinetikk) Ha oversikt og forståelse for hvordan proteiners aktivitet reguleres via fosforyleringer Aktuell litteratur: Nelson & Cox (Principles of biochemistry): 190-237 Alberts m.fl. (The Cell): 162-188 Labhefte verlapper Espen Molden (emolden@farmasi.uio.no) Rom 229/2. etg Begrepsapparat/språk Forståelse 1

er proteiner - ethvert gen koder for et unikt protein Gen m-rna m-rna Cytosol Aminosyrer Protein Ulike typer proteiner - basert på funksjon - enzymer (katalyserer kjemiske reaksjoner) - reseptorer (viderebringer signaler) - transportører (transporterer molekyler over membraner) - ionekanaler (regulerer flux av ioner over membraner) Legemidler binder seg til proteiner Plasmaproteiner/ fordelingsproteiner (metabolisme lever) [farmakodynamikk] Målprotein (reseptor, enzym etc.) Transportører (sekresjon urin/galle) /transportører (sekresjon/metabolisme tarm) 2

Viktige funksjoner av enzymer Energiproduksjon (stoffskifte) Transkripsjon/translasjon (proteinuttrykk) Signalering (biologisk kommunikasjon) Beskyttelse/fjerning av biologisk søppel (inkl. legemidler) Enzymforståelse fundamentalt for å for forstå - hvordan mange legemidler virker - grunnlaget for mange sykdommer er biologiske katalysatorer av kjemiske reaksjoner -> Endring i kjemiske struktur av substrater [spaltning eller dannelse av kovalente bindinger] H 3 C H - Endogene substrater ( laget i kroppen ) - Eksogene substrater ( laget utenfor kroppen ) H H N CH 3 N CH 3 H 3 C H kodein H H H H morfin - - Uridin P P Uridindifosfat (UDP)-glukuronid H H H CH H NH HC H N CH 3 NAVN? H norkodein H morfin-6-glukuronid 3

Navngiving (nomenklatur) og klassifisering av enzymer Som regel på bakgrunn av funksjon ( hvilken reaksjon/substrat enzymet katalyserer ) som katalyserer samme reaksjoner i samme klasse/familie (eks. hydrolaser, polymeraser, kinaser, oksidaser, transferaser etc.) Systematisering hvert enzym får sitt unike navn -> enzymkommisjon nummer -> 4 tall eks. 2.7.1.1. 2 transferase 7 fosfotransferase 1 hydroksyl som funksjonell gruppe på substrat 1 D-glukose som substrat upraktisk når samme enzym har mange ulike substrater Kan også navngi/klassifisere på bakgrunn av identitet Hensiktsmessig for enzymer med bred substratspesifisitet -> mange ulike substrater/reaksjoner -> eks. cytokrom P450 (CYP)-oksidaser (reaksjoner oftest dealkyleringer eller hydroksyleringer) -> viktig i legemiddelmetabolisme (særlig 3A4, 2D6, 2C9, 2C19 og 1A2) Legemiddel Metabolitt Endoplasmatisk retikulum Kjerne 1958 - begrepet P450 ( peak absorbans ved λ =450 nm) introduseres 1962 - begrepet cytokrom ( cellefarge ) introduseres 1967 - første CYP-enzym isoleres 1987 - nomenklatur system basert på gensekvenser introduseres: mer enn 40% slektskap, samme familie (eks. CYP3) mer enn 55% slektskap, samme underfamilie (eks. CYP3A) siste tall indikerer individuelt enzym (eks. CYP3A4) 4

Del-prosesser i en katalytisk syklus [hele prosessen betegnes metabolisme] enzym + substrat (4) produkt + enzym (3) (1) enzym-substrat (2) enzym-produkt (1) enzym og substrat bindes (polare/ioniske interaksjoner viktig) (2) kjemisk reaksjon katalyseres (produkt bundet til substrat) (3) produkt/metabolitt frigis (4) enzym tilgjengelig for å ta i mot nytt substrat Hva mener vi med at en kjemisk reaksjon katalyseres? Fri energi, G S + E ES EP P + E ES EP P + E [Principles of Biochemistry] [The Cell] reduserer aktiveringsenergien -> reaksjonshastigheten øker (likevekt oppnås fortere) Binding (polar/ionisk) mellom enzym-substrat gjør det lettere å oppnå transition-state (overgangstilstand) påvirker ikke likevekten (avhengig av forskjell i fri energi) 5

Binding av substrat til enzym - i det katalytiske setet [NB! 3D-struktur] Faktorer av betydning - ph (pka-verdier av aminosyrer) - Temperatur - Kofaktorer (metall-ioner; Fe2+, Mg2+ m.fl.) - Koenzymer (organiske forbindelser) [Kosubstrater/ komplementærsubstrater nødvendig for mange reaksjoner] Enzymkinetikk Matematisk modeller generelt Beskrive sammenhengen mellom de observasjoner vi gjør - Hva skjer med en variabel hvis en annen endrer seg? - Hva skjer med reaksjonshastigheten når konsentrasjonen dobles? - Hva skjer med kronekursen når renta går opp 2%? Estimere parametre/konstanter - Beskriver i hvilken grad ting skjer eller hvor fort ting skjer utleder matematiske modeller/uttrykk for mikro- eller makro-systemer Kinetikk (bevegelse; hastighet på endring ) : kvantitativ beskrivelse av enzymkatalyserte reaksjoner basert på hastighetsmålinger som funksjon av konsentrasjon (eller tid) : identifisere hastighetsbestemmende enzymer i signalveier, identifisere enzymer som styrer nedbrytning av legemidler og forstå enzymfunksjon 6

Matematisk modell for sammenhengen mellom [S] og v 0 Utgangspunkt E + S ES E + P k 1 k -1 k [k -2 Neglisjeres 2 kalles også k cat ] k 2 tidlig P/tid 1. Dannelse av [ES]/tid = k 1 * [E] * [S] 2. Tap av [ES]/tid = (k -1 * [ES]) + (k 2 * [ES]) Ved likevekt ( steady-state) er 1=2; dvs. dannelse lik tap k 1 * [E] * [S] = (k -1 * [ES]) + (k 2 * [ES]) = [ES] * (k -1 + k 2 ) [E] = [E tot ] [ES] k 1 * ([E tot ] [ES]) * [S] = [ES] * (k -1 + k 2 ) :k 1 og flytte [ES] * S til høyre-siden [E tot ] * [S] = [ES] * (k -1 + k 2 ) + [ES] * [S] k 1 :(k -1 +k 2 ) + [S] k 1 [E tot ] * [S] = [ES] (k -1 +k 2 ) + [S] v0 = k2 * [ES] - de første som utledet denne sammenhengen var Michaelis og Menten v max * [S] v 0 = K m + [S] (k -1 +k 2 )/k 1 = K m [E tot ] = [ES] max -> k 2 * [ES] max = V max [E tot ] * [S] = v 0 /k 2 (k -1 +k 2 ) + [S] k 1 k 1 Michaelis-Menten beskriver ofte sammenhengen mellom [S] og v 0 v 0 = v max * [S] K m + [S] 0,6 0,4 V 0 (k -1 +k 2 )/k 1 = K m k 2 = v/c k -1 = v/c k 1 = v/c 2 Ved v o = ½ v max er [S] = K m 0,2 0 - alle enzym-reaksjoner beskrives ikke av Michaelis-Menten 0 25 50 75 100 [S] K m -verdien betraktes ofte som et uttrykk for substratets affinitet til enzymet V max -verdien er et uttrykk antallet enzymer og k 2 (k cat ) 7

mskrivning av Michaelis-Menten til lineær sammenheng v 0 = v max * [S] K m + [S] 1/v 0 5 K m + [S] 1/v 0 = = v max * [S] K m v max * [S] + [S] v max * [S] 1/v max 4 3 2 1/v 0 = (K m /v max * 1/[S]) + 1/v max 1/y = a * 1/x + b - de første som utledet denne sammenhengen var Linweaver og Burk -1/K m 1-0,4-0,3-0,2-0,1 0,1 0,2 0,3 0,4 1/[S] Pharmacophore ( legemiddelpore ) enzym-modeller Særlig aktuelt for legemiddelmetaboliserende enzymer Benytter enzymkinetiske parametre for ulike substrater (først og fremst K m - verdier) og aminosyresekvens av pore (katalytisk sete) Finner ut hva som er viktig for bindingsgrad til et enzym -> eks. avstand mellom basisk N og H -> kjemi møter biologi! Kan designe substanser man ikke vil skal metaboliseres i særlig grad via et bestemt enzym Katalytisk sete til CYP2D6 ( docking av fluoksetin/fontex ) de Groot et al. J Med Chem 1999 [in silico-modellering] 8

Hemming av regulatoriske enzymer attraktivt angrepspunkt for legemidler -> Enzymet bør ha høy spesifisitet -> Hemmingen bør bære spesifikk/selektiv Enzymspesifisitet: eks. angiotensin I-konverterende enzym (ACE) Hemmingsspesifisitet: eks. cyklooxygenase (CX) Angiotensin I ACE Bradykinin PLA 2 AA Angiotensin II Cellemembranen AT 1 CX-1 CX-2 Second messenger (-> økt blodtrykk og vekststilumering) TxA 2 PGE 2 Ulike biokjemiske/fysiologiske effekter PLA 2 = fosfolipase A 2; AA = arakidonsyre; CX-1 = isoform 1; CX-2 = isoform 2; NSAID = ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler Selektivitet av NSAIDS: hemming CX-1 i forhold til CX-2 Hemming av legemiddelmetaboliserende enzymer årsak til mange interaksjoner -> Mekanismer - metabolitt-kompleksering (hemmer er substrat) - kompetitivt (hemmer er substrat) - non-kompetitivt (hemmer ikke substrat) Zocor 33 tabletter Erytromycin Zocor Zocor Zocor Zocor CYP3A4 1½ tablett Clin Pharmacol Ther 1998;64:177 Enzyminduksjon også viktig interaksjonsmekanisme -> oppregulering av enzymantallet 9

HMG-CoA redukstase hemmere (statiner) -> hemmer hastighetsbestemmende trinn i kolesterolsyntesen Forenklet(!) skisse over kolesterolsyntesen Kolesterol 3 x Acetyl-CoA 7-Dehydrokolesterol Hydroksymetylglutaryl CoA Statiner Mevalonat Lanosterol Squalen H H CH 3 CH 2 C - C CH 2 C H SCoA Hydroksymetylglutaryl CoA H H C - H Farnesyldifosfat Ubiquinon (coenzym Q 10 ) Dolichol Simvastatin lakton (inaktiv) Simvastatin syre (aktiv) Hvorfor redusert i serum? Effekt på sykelighet/dødelighet Kolesterol -R -R -R Antall tilfeller 600 500 400 300 200 Simvastatin Placebo 149 35 % [5 år] Må behandle 2222 pasienter i 5 år for å hindre 74 dødsfall [ca 3/100 per 5 års behandling] 74 100 0 Hjerteinfarkt Dødsfall Simvastatin Placebo 4444 pasienter - etablert koronarsykdom - gjennomsnittlig 4.9 mmol/l Lancet 1994;344:1384 10

Protein kinaser Regulerer aktivitet av andre proteiner ved fosforylering (binding av fosfat) høyt oppe i hierarkiet En fosfat-gruppe fra eller kan å store konsekvenser for konformasjon NH 3 + - P NH + - 3. eller direkte innvirke på binding av substrates ligand ATP er fosfatkilden (ATP -> ADP + P i ) Fosforylering kan gi økt eller redusert aktivitet Fosfataser de-fosforylerer (spalter av fosfat) Aminosyrer med H-grupper danner fosforyleres CH H 2 N CH C H CH 2 H H 2 N H CH C H C H H 2 N C H CH 2 Serin CH 3 Threonin H Tyrosin Kalles ofte tyrosinkinase o.s.v. Mange ulike, ca. 500 kinase-gener på humant genom Sekvens på 250 aminosyrer felles Enkelte avhengige av koenzymer (cyklin eller calmodulin) 11

Mulig framtidig behandling med hemmere av Cd-protein kinaser Cancer (mange aktuelle kinaser) CNS forstyrrelser (eks. Alzheimers sykdom) Virus infeksjoner (eks. HIV) Kardiovaskulære sykdommer (eks. hjertesvikt) men det er mye som skal klaffe! Individuelle variasjoner i enzymaktiviteter Sykdom Legemiddeleffekt (ulik eksponering eller enzym-sensitivitet/følsomhet Genetisk- eller miljøbetinget Gen m-rna Protein Ulike typer av stabile mutasjoner - singel nukleotid polymorfismer (SNPer), delesjon eller insersjon -> endret transkripsjon (avlesning) -> endret splicing av primært transkript til mrna -> endring av aminosyrer [ evt. stille mutasjoner] Måling av mutasjoner -> genotyping 12

CYP2D6-genetikk: betydning for eksponering av metoprolol Mutasjon Funksjon Mutasjonsfrekvenser (%) Afrikansk Kaukasisk 2549A>delesjon Defekt - 1.6 1846G>A Defekt 3.1 19.4 Gen delesjon Defekt 2.8 4.1 1707T>delesjon Defekt - 1.0 Totaleksponering 2 fungerende alleler (55%) 1 defekt allel (38%) Samme dose metoprolol 2 defekte alleler (7%) Hyppighet av bivirkninger ca. 5 ganger høyere Pharmacogenetics 2002; 12: 465 Clin Pharmacol Ther 2002; 72: 429 Laboratorie-eksperiment: enzymkinetikk Hensikt - estimere enzymkinetiske parametre for omsetning av p-nitrofenylfosfat (PNPP) katalysert via enzymet alkalisk fosfatase N N + H 2 0 + HP 4 - [skift i absorbans; 405 nm] P - - PNPP H p-nitrofenol - og teste uorganisk fosfat som kompetitiv inhibitor (d.v.s. tilsette et av produktene i overskudd) 13

ppsett på mikrotiterplate (96 brønner) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 mm A 1.33 1.33 1.33 1.33 1.33 1.33 B 1/2 1/2 1/2 1/32 1/32 1/32 C 1/4 1/4 1/4 1/16 1/16 1/16 D 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1.33 mm PNPP i alle E 1/16 1/16 1/16 1/4 1/4 1/4 F 1/32 1/32 1/32 1/2 1/2 1/2 G 0 0 0 2 2 2 mm 1-3: + PNPP 4-9: ingenting 10-12: + inhibitor [KH 2 P 4 ] Benk/lag A Praktiske ting: - parti 1 -> 0830-12 og parti 2 -> 1215-16 Benk/lag B Benk/lag C - demonstrasjon av pipetteringsteknikk på lab - gjennomgang av prosedyre på lab (NB! dere får en ny med RIKTIGE konsentrasjoner) - hver benk får sin mikrotiterplate Benk/lag D Benk/lag E Benk/lag F - hver benk deler på å pipettere ut i brønnene - alle utgangsløsninger er ferdige, men dere må lage fortynningene selv - Mona Gaarder tilsetter enzym - signal/uv-absorbans avleses rutinemessig i løpet av 40 minutters inkubasjon (automatisk i plateleser) 14

Databehandling (bruk av Excel) - hvert lag får sin egen Excel-datafil med sine resultater - beregne gjennomsnittsverdier for de enkelte betingelsene - plotte data på 3 forskjellige måter (1) v [1.33 mm] tid v 1/2 tid o.s.v. -1/K m 1/v max (2) 1/v 0 1/[S] -> i tidslineært område v 0 (3) [I] -> i tidslineært område Innlevering av rapport - Dere får rapportskjema på lab - Et skjema per lag/benk - Innleveringsfrist 1 uke etter øvelsen - Lag 1-6 (før lunsj) leverer til Espen Molden - Lag 7-12 (etter lunsj) leverer til Gro Mathisen 15