Nutrition in larvae and juveniles of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.)

Sluttrapport Strategisk instituttprogram 130195/140 1999-2003 Nutrition in larvae and juveniles of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) 8.5 8.0 7.5 7.0 Stage 9 MH (mm) 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Stage 8 Stage 7 Stage 6 Stage 5

Innhold Faglige mål Deltagere Sammendrag av oppnådde faglige resultater Vitenskapelig publisering Faktaark 0. Vitale mål hos kveitelarver 1. Ernæringsstatus og metamorfose hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton 2. Forskjell i jod- og tyroidhormon nivå i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder 3. Organstørrelse hos kveitelarver påvirkes av diett 4. Artemia anriket med jod fôret til kveitelarver 5. Stadieinndeling hos kveite fra startforing til bunnslåing, uavhengig av øyenvandring 6. Forbeining og øyenvandring hos kveitelarver påvirkes av diett 7. Vitamin A i kveitelarver og yngel (Hippoglossus hippoglossus L.) kan Artemia dekke behovet for retinoider? 8. Innhold av vitamin A i Artemia og copepoder 9. Innhold av vitamin A i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder 10. Vitamin A behov i kveiteyngel 11. Proteinfordøyelse og aminosyreutnyttelse i marine fiskelarver. 12. Radioaktiv merking av modellprotein til bruk i studier av proteinfordøyelse og utnyttelse i marine fiskelarver 13. Pre-hydrolyse bedrer absorpsjon og utnyttelse av diettprotein i kveitelarver 14. En metode for syntese av proteiner egnet til metabolismestudier av fiskelarver 15. Proteinmetabolisme i kveitelarver; effekt av proteinstørrelse 16. Vitamin C behov hos kveiteyngel Effekt av vitamin E

1 Sluttrapport Strategisk instituttprogram 130195/140. 1999-2003 Nutrition in larvae and juveniles of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) Faglige mål Å frembringe grunnleggende kunnskap om effekt av utvalgte næringsstoffer på næringsopptak, proteinomsetning, vekst og normal utvikling av kveitelarver 1. Å studere sammenhengen mellom larvens utviklingsstadium, aktivitet av fordøyelsesenzymer og opptak av næringsstoffer. 2. Å studere effekter av protein gitt i intakt og hydrolysert form på proteinomsetning og vekst 3. Å studere effekt av utvalgte næringsstoffer på tyroidhormon metabolisme og normal utvikling gjennom metamorfose 4. Å bestemme behov for mikronæringsstoffer hos kveiteyngel ved hjelp av multivariat tilnærming Deltakere Nasjonalt Institutt for Ernærings- og Sjømatforskning (NIFES) Dr. scient Kristin Hamre (Prosjektleder) Stipendiat Sigurd Tonheim Stipendiat Mari Moren Havforskningsinstituttet, Austevoll Forsker Ingegjerd Opstad Stipendiat Stine C. Hovde Universitetet i Bergen Dr. scient Karin Pittman (Intitutt for fiskeri og marinbiologi, IFM) Professor Ivar Rønnestad (Zoologisk institutt) Professor Arnt Johann Raae (Molekylærbiologisk institutt) Stipendiat Jostein Solbakken (IFM) Hovedfagsstudent Øystein Sæle (IFM) Hovedfagsstudent Børre Erstad (IFM) Hovedfagsstudent P.G.Espedal (IFM) Hovedfagsstudent E.Grotan (IFM) Programmet ble startet opp 01.01.99 og avsluttet 31.12.03 Sammendrag av oppnådde faglige resultater Programmet har to hovedretninger. Den ene går på fordøyelse, absorpsjon og omsetning av protein (Delmål 1 og 2), der målet er å oppnå en best mulig proteinutnyttelse og dermed vekst. Marine fiskelarver har et lite differensiert fordøyelsesapparat, men utvikler dette gjennom metamorfosen. Bl.a. mangler magen, som denaturerer proteinet ved hjelp av syre og skiller ut fordøyelsesenzymet pepsin. I tillegg er aktiviteten av andre proteaser lav ved startfôring, men økende utover på larvestadiet og gjennom metamorfose. Man har derfor en

2 hypotese om at marine fiskelarver før metamorfose har begrenset evne til å fordøye protein (Ark 11). I levende fôr er en stor andel av proteinet vannløselig og antagelig relativt lett fordøyelig. I formulerte fôr og protein-anrikningsfôr for levende fôrorganismer brukes for en stor del fiskemel, der en stor andel av proteinet er tungt løselig. En utfordring er valg og eventuell prosessering av protein som gjør det tilgjengelig for larvene uten at det lekker ut av det mikropartikulære fôret. Det viser seg at kontrollerte fôringsforsøk med marine fiskelarver der man ser på effekt av frie aminosyrer og hydrolysert protein, som begge er små og sterkt vannløselige molekyler, vanskeliggjøres av høy lekkasje fra de mikropartikulære fôrene. Både delmål 1 og 2 er derfor løst ved hjelp av sondefôringsteknikk, der det er mulig å tvangsfôre enkeltlarver med et radioaktivt merket protein. Fordøyelse, absorpsjon, deponering av protein og forbrenning kan registreres ved å følge og kvantifisere radioaktivteten. Det er utviklet metoder for å produsere 3 ulike radioaktivt merkede proteinpreparater. To er produsert ved hjelp av PCR-teknikk og deretter oppformert ved innsetting av gensekvensen i bakterier (Ark 14). Det tredje er isolert fra lakseserum etter at laksen var fôret med en blanding av radioktivt merkede aminosyrer (Ark 12). Preparatene er brukt til å undersøke ontogenien i larvenes evne til opptak av protein og hvordan proteinstørrelse og hydrolyse av protein til peptider påvirker proteinopptak og omsetning i larven (Ark 13 og 15). Det ble bl.a. vist at andel av proteinet som ble absorbert var lavt på larvestadiet, at opptak av protein ble mer effektivt med økende alder på larvene og at opptak av små protein og hydrolysat var mer effektivt enn opptak av hhv. store protein og intakt protein. Det er viktig at proteinet fordøyes og absorberes raskt, fordi høy tarmtømmingsrate gjør at langsomme proteiner i stor grad blir utskilt som fekalier (Ark 13). Den andre hovedretningen var å undersøke hva som kan være årsaken(e) til feilutvikling hos kveitelarver i intensiv kultur, et trekk som i hovedsak er ernæringsbetinget siden zooplanktonfôrede larver i liten grad blir feilutviklede (Delmål 3). Hypotesen var i utgangspunktet at langkjedete fettsyrer (n-3 og n-6), vitamin A og tyroidhormon er med på å styre metamorfosen og at mangel eller overskudd av disse næringsstoffene eller av næringsstoffer som er nødvendig for syntese av tyroidhormon kunne være årsaken til feilutvikling. Bakgrunnen for hypotesen var at alle tre har vist seg å påvirke pigmentering og til en viss grad øyevandring i flatfisk. I tillegg er de ligander til kjernereseptorer som styrer avlesning av gener som igjen styrer embryonalutvikling og antagelig også metamorfose. Det er dessuten interaksjoner mellom kjernereseptorer som binder vitamin A og hhv. fettsyrer og tyroidhormon. Det ble kjørt et forsøk der kveitelarver ble fôret med Artemia eller zooplankton, der larvene ble undersøkt for utviklingsfeil og der fôr og larver ble screenet for en rekke næringsstoffer (Ark 1, 2 og 9). Mer enn 90% av larvene fôret med Artemia var feilpigmentert og hadde manglende øyevandring, mens for larver fôret med zooplankton var tallene hhv. 32 og 12%. Det var stor forskjell i fettsyresammensetning mellom Artemia og zooplankton, med markert høyere DHA og EPA og lavere arachidonsyre i zooplankton enn i Artemia. Fettsyresammensetningen i fôret ble gjenspeilet i larvene. Larver fôret med zooplankton hadde noe høyere innhold av vitamin A enn larver fôret med Artemia. Jodnivået i zooplankton var dessuten 700 ganger høyere enn i Artemia. Jod er nødvendig for dannelse av tyroidhormon og tyroidhormon nivået i larver fôret med zooplankton var høyere enn i larver fôret med Artemia i det kritiske vinduet for metamorfose (14-25 dager etter startfôring). Det så ut til å være tilstrekkelig av de andre næringsstoffene som inngår i tyroidhormon syntesen i Artemia. Siden det er gjort mye forskning på fettsyrebehov hos marine fiskelarver valgte vi å gå videre med vitamin A og jod.

3 Undersøkelser av vitamin A innhold i zooplankton, Artemia (Ark 8) og larver (Ark 9), av kveiteyngelens evne til å omdanne karotenoider til vitamin A og av vitamin A behovet hos kveiteyngel (Ark 10) ledet til konklusjonen at Artemia ikke inneholder vitamin A, men antagelig nok karotenoider til å forsyne kveitelarver med tilstrekkelig vitamin A (Ark 7). Når det gjelder jod, ble det kjørt et fôringsforsøk der Artemia ble anriket med jod og der man så et økt opptak av jod i Artemia og larver (Ark 4). Det var også en tendens til økt syntese av tyroidhormon, men dette var ikke signifikant. Det må gjøres mer arbeid for å undersøke hvilken effekt anrikning med jod eventuelt har på utviklingsfeil. Forsøket med fôring av Artemia og zooplankton til kveitelarver var også utgangspunkt for stadieinndeling av kveitelarver fra startfôring til metamorfose, basert på beindannelse (Ark 5). Det er utarbeidet beskrivelser og tegninger av stadium 5 (ved startfôring) til 9 (etter metamorfose), korrelert med myotomhøyde, standard lengde og antall dager etter startfôring. Det er videre vist at larver fôret med zooplankton har større beinmasse enn larver fôret med Artemia (Ark 6) og at hypofysen og tyroidea er større (Ark 3). Det siste tyder på at zooplankton stimulerer tyroidhormon produksjonen. Det er gjort en studie av effekten av vitamin E på vitamin C behov (Ark 16, Delmål 3). Behovet for vitamin C ble funnet å ligge på 30 mg kg -1. Det ble bare funnet små effekter av vitamin E på vitamin C behovet. 24.02.04 Kristin Hamre Vitenskapelige utgivelser og annen publisering Avhandlinger Tonheim S. (2004) Protein digestion and amino acid utilisation in marine fish larvae. Dr. scient thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway. Moren M. (2004) Vitamin A in juvenile and larval Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) does Artemia cover the retinoid requirement? Dr. scient thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway. Solbakken JS. (2003) Plasticity of metamorphosis in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus): responses to internal and external cues. Dr. scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway. Sæle Ø (2002) Ossification as staging criterion in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) Larvae and the effects of diet. Cand. scient. thesis in aquaculture. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway Erstad B. (in prep.) Responses of halibut larvae to startfeeding diets: the effects on thyroid hormones levels and growth of the pituitary and thyroid glands. Cand. Scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway

4 Grøtan E. (in prep.) Responses of cod larvae to first feeding diets and temperature: the effects on thyroid hormones levels and growth of the pituitary and thyroid glands. Cand scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway Espedal P.G. (in prep). Development of protocol to determine IgM in Atlantic halibut using in situ hybridization. Cand scient. thesis. Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen, Norway Artikler i internasjonale tidsskrift med referee Conceição, L. E. C., Rønnestad, I. & Tonheim, S. K. (2002) Metabolic budgets for lysine and glutamate in unfed herring (Clupea harengus) larvae. Aquaculture 206, 305-312 Hamre, K., Opstad, I., Espe, M., Solbakken, J., Hemre, G.-I. & Pittman, K. (2002) Nutrient composition and metamorphosis success of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus, L.) larvae fed natural zooplankton or Artemia. Aquaculture Nutrition, 8, 139-148. Moren, M. Opstad, I. & Hamre, K (Accepted) A comparison of retinol, retinal and retinyl ester concentrations in larvae of Atlantic halibut (Hippolglossus hippoglossus L.) fed Artemia or zooplankton. Aquaculture Nutrition. Moren, M., Næss, T. & Hamre, K. (In press) Conversion of β-carotene, canthaxanthin and astaxanthin to vitamin A in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. Fish Physiology and Biochemistry. Moren, M., Opstad, I., Berntssen, M.H.G., Zambonino Infante, J-L. & Hamre, K. (Accepted) An Optimum level of vitamin A supplements for Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) juveniles. Aquaculture. Rønnestad, I., Rojas-García, C. R., Tonheim, S. K. & Conceição, L. E. C. (2001) In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae. Aquaculture 201, 161-175. Rønnestad, I., S. K. Tonheim, H. J. Fyhn, C. R. Rojas-García, Y. Kamisaka, W. Koven, R. N. Finn, B. F. Terjesen, Y. Barr & L. E. C. Conceição (2003) The supply of amino acids during early feeding stages of marine fish larvae: a review of recent findings. Aquaculture 227, 147-164. Sæle, Ø., Solbakken, J., Watanabe, K., Hamre, K., Power, D. & Pittman, K. (submitted) Stages of Atlantic halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.) from first feeding through metamorphosis with emphasis on cranial ossification independent of eye migration. Aquaculture Sæle, Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K., & Pittman, K. (2003) The effect of diet on ossification and eye migration in Atlantic halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture 220, 683-696. Solbakken J. & Pittman K. (In press) Photoperiodic modulation of metamorphosis in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture Solbakken, J.S., Norberg, B. & Pittman, K. (Accepted). Sensitivity of metamorphosis to exogenous thyroxine during larval development in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.): consequences for eye migration and asymmetrical pigmentation post-metamorphosis. Journal of Fish Biology Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2003) Differential iodine and thyroid hormone levels between Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exogenous feeding until post metamorphosis. J. Fish. Biol., 61, 1345-1362.

5 Tonheim, S.K., Espe, M., Raae, A.J., Darias, M.J. & Rønnestad, I. (in press) In vivo incorporation of [U] 14 C-amino acids: an alternative protein labelling procedure for use in examining larval digestive physiology. Aquaculture. Bokkapitler Kjørsvik E., Pavlov, D. & Pittman, K. (2003). From fertilization to metamorphosis - functional development. In: Mokness, E., Kjørsvik, E. & Olsen, Y. (eds.) Cultivation of Coldwater Marine Fish, Blackwell Science, Oxford, UK pp 204-278 Pittman, K., (2003) Flatfish Nutrition. In: (Lall, S. et al. eds.) Encyclopedia of Farm Animal Nutrition, Prentice & Hall Stoss, J., Hamre, K. & Otterå, H. (2003) Weaning and nursary. In: Moksness, E., Kjørsvik, E. & Olsen, Y. Culture of cold-water marine fish. Blackwell Science Ltd, Oxford, UK. Foredrag Erstad, B., Brown, J. & Pittman, K. (2002) Thyroid hormone development in Atlantic halibut larvae fed rotifers and Artemia. Proceedings of the World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27, Grøtan, E., Pittman, K. & Otterlei, E. (2002) Whole body levels of thyroid hormones in early life stages of cod (Gadus morhua) with focus on metamorphosis. Proceedings of the World Aquaculture Society Meeting, Beijing China Apr 24-27, Hamre, K., Opstad, I., Solbakken, J. & Pittman, K. (2000) Artemia eller zooplankton som fôr til kveitelarver larveutvikling, nivå av tyroid hormon og ernæring. Det 11. Norske Fiskeernæringsseminar, Norheimsund, 8-10. mai. Moren, M., Næss, T.H. & Hamre, K (2000) Omdanning av karotenoider til vitamin A hos yngel av kveite. Det 11. Norske Fiskeernæringsseminar, Norheimsund, 8-10. mai. Moren, M., Opstad, I., Zambonino Infante, J.L., Berntssen, M. & Hamre, K (2002) Behov for vitamin A i larve og yngelfasen hos kveite. Programkonferansen Havbruk og villaks. Tromsø 16-18 september. Moren, M., Opstad, I., Zambonino Infante, J.L., Berntssen, M. and Hamre,K. (2002) Possible roles of vitamin A in the metamorphosis of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae. 10th International Symposium on Nutrition & Feeding in Fish, Rodos 2-7. juni 2002. Pittman, K. (2001). Farming flatfish. Marine and Coastal Management, Cape Town South Africa, 30 November Pittman, K. (2001) Halibut Production in Norway: New Biology meets New Business. Ocean Science Center, Memorial University of Newfoundland, 3. May Pittman, K. (2001) Rearing Halibut in Norway: Current Practice and Challenges, 12 April, Harbour Branch Oceanographic Inst, Fort Pierce, Florida Pittman, K. (2002) Overview of marine fish culture in Norway. Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa Pittman, K. (2002) Salmon, cod and halibut farming in Norway. Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa Pittman. K. (2002) Trends and constraints in global finfish aquaculture. Keynote speech at Southern African Aquaculture Association Conference, Sept 1-4 Stellenbosch South Africa Pittman, K. (2004) What makes a flatfish flat? Canada-Norway halibut workshop. January 19-24, National Research Council, Halifax, Canada Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish with examples from Atlantic halibut. 26th Annual Larval Fish Conference 22-26 July, Bergen, Norway

6 Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish. World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27 Pittman, K., Sæle, Ø., Solbakken, J. & Hamre, K. (2002) Control of metamorphosis in flatfish with examples from Atlantic halibut. Larval Fish Society Conference Bergen July 24-27 Pittman, K.(2003) Kveiteoppdrett den vanskelige veien til en flatfisk middag. AquaNor Trondheim Aug 11-14 Pittman, K., J. Solbakken, & K. Hamre (2001) Control of metamorphosis in flatfish. Oral contribution and extended abstract to Larvi 2001, Ghent Belgium Sæle, Ø., Solbakken, J., Hamre, K. & Pittman, K. (2002) Early development of bony structures in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus). Proceedings of the World Aquaculture Society, Beijing China Apr 24-27, Tonheim, S. K., Darias, M. J., Espe, M. & Rønnestad, I. (2002) Merking av lakseserumprotein med 14 C for bruk i metabolske studier av marine fiskelarver. Programkonferansen Havbruk og villaks. Tromsø 16-18 september. Postere Moren, M. & Hamre, K. (2003) Retinoids in Artemia and copepods. Aquaculture Europe, Trondheim 9.-12.aug. European Aquaculture Society. Moren, M., Opstad, I., Pittman, K., & Hamre, K. (2001) A comparison of retinol, retinal and retinyl ester concentrations in larvae of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) fed Artemia or zooplankton. Larvi 01, Ghent, Belgium 3.-6. september. Rojas-García, C.R., Tonheim, S.K. & Rønnestad, I. (2002). Post-prandial changes of ph in the gut of developing Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) studied by in vivo tube feeding. Aquaculture Europe 2002, Trieste, Italy, 16.-19.okt. European Aquaculture Society. Solbakken, J.S., Hamre, K., Berntssen, M., Opstad, I, Norberg, B. & Pittman, K. (2000) Nutritional effects on whole body thyroid hormone levels, larval development and juvenile quality in Atlantic halibut. New Species in Mariculture, August, Faro, Portugal. Tonheim, S., Hamre, K., Espe, M. Aursland, K. & Rønnestad, I. (2001) A study of the protein digestion and amino acid uptake and metabolism in fish larvae. Larvi 01, 3.-6. Sept., Ghent, Belgium.

Vitale mål hos kveitelarver Sammenheng mellom alder (dager etter startfôring), standard lengde, myotom høyde og vekt hos kveitelarver fôret med copepoder i 60 dager. Dag Standard lengde Myotom høyde Tørrvekt (mm) (mm) (mg) 0 13,2±0,4 1,9 1,0 15 15,4± 0,8 2,2±0,1 2,5±0,7 25 16,7± 0,0 3,1±0,1 4,9±0,3 29 18,0± 0,3 3,5±0,3 6,5±1,2 34 19,8± 1,0 4,6±0,5 10,4±2,6 46 23,5± 0,9 5,8±0,2 22,5±1,2 55 25,9± 0,3 6,8±0,1 36,4±0,7 60 28,1± 0,3 7,4±0,1 47,7±3,0

Ernæringsstatus og metamorfose hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton Kristin Hamre, Ingegjerd Opstad, Marit Espe og Karin Pittman Ark 1 Kveitelarver fôret med Artemia blir ofte feilpigmenterte og får ufullstendig øyevandring. Larver fôret med copepoder, som er larvenes naturlige føde, vil derimot som oftest utvikle seg normalt. Feilutvikling av kveitelarver synes derfor å være ernæringsbetinget. I dette forsøket ble kveitelarver fôret med de to typene fôrorganismer under ellers like forhold for 1) å kartlegge vekst og utvikling og 2) å kartlegge næringsinnhold i fôrorganismer og ernæringsstatus i larver, for derigjennom å identifisere næringsstoffer som kan gi opphav til feilutikling. Introduksjon Fettsyresammensetning og vitamin A er de næringsstoffene som har vist størst effekt på pigmentering hos flatfisk. Når det gjelder fettsyresammensetningen, har særlig nivå av DHA og DHA/EPA ratio fått stor oppmerksomhet. Det er vist at total mangel på n-3 fettsyrer gir feilpigmentering og at god anrikning med DHA gir bedret pigmentering, men hvilket nivå som skal til for å få normal pigmentering (behovet) er ikke kjent. I den senere tid er det også kommet publikasjoner som viser at høyt nivå av arachidonsyre (ARA), og dermed lav EPA/ARA ratio gir dramatisk økt feilpigmentering. Derimot hadde DHA/EPA-ratio liten effekt på pigmentering. Anriking av Artemia med vitamin A ga bedret pigmentering hos japansk flyndre, men dette var ledsaget av skjelettdeformiteter. Bad av larver i retinsyre, den aktive metabolitten av vitamin A, stimulerte også dannelsen av pigmentceller hos japansk flyndre. I tillegg til vitamin A og fettsyrer, er tyroid hormon vist å stimulere til normal utvikling hos flatfisk. Næringsstoffer som er nødvendige for dannelse av tyroid hormon er bl. a. jod, selen og aminosyrene fenylalanin og tyrosin. Manglende øyevandring er et mye større problem hos kveitelarver enn hos andre flatfisk, og det er ikke gjort mye arbeid på dette feltet. Det har vært foreslått at god øyevandring henger sammen med god vekst. Fôring med Artemia anriket med planteolje (mangel på langkjedete n-3 fettsyrer) ga dessuten dårlig øyevandring hos piggvarlarver. Dette faktaarket tar for seg hovednæringsstoffene, fettsyrer og aminosyrer. For vitamin A og næringsstoffer som er nødvendige for tyroid hormon syntese, se andre ark i denne rapporten. Materialer og metoder Egg fra en hunnfisk ble befruktet med sperm fra en hann og inkubert på egg- og larvestadiet i henhold til standard prosedyrer ved Austevoll Havbruksstasjon. De ble så flyttet til 4 1500 L kar, 5000 larver per kar, som ble driftet i henhold til standard prosedyrer. Larvene ble fôret i duplikat i 60 dager med Artemia (RH-type, INVE) anriket med DHA-Selco og vitaminer eller med zooplankton filtrert fra poll (Svartatjønn). Zooplanktonet bestod i hovedsak av de calanoide copepodene Eurytemora affinis og Centrophages hamatus. Analyse av næringsstoffer er utført i henhold til akkrediterte metoder ved NIFES. Resultater Det var ikke signifikante forskjeller i dødelighet mellom de to larvegruppene (Fig.1), selv om dødeligheten i det ene karet fôret med Artemia var noe høyere enn i de andre 3 karene. Dette førte til at det ble mangel på materiale i dette karet på slutten a) mg tørrvekt 65 55 45 35 25 15 5-5 0 10 20 30 40 50 60 70 b) Dager etter startfôring C umluative mortality (no. of larvae) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Dager etter startfôring Zooplankton Artemia Figur 1. Vekst a) og dødelighet b) hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager fra startfôring. Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Ark 1 Tabell 1. Pigmentering og øyevandring hos kveitelarver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager fra startfôring Artemia Zooplankton Feilpigmentert 93 32 Manglende øyevandring 90 12 Fri dorsalfinne 82 33 av forsøket, og at vi derfor bare har en parallell for vekst ved siste uttak. Veksten i de to larvegruppene var lik til og med dag 45. Deretter ser copepode fôrete larver ut til å vokse bedre enn Artemia forede larver. Det var stor forskjell i pigmentering og øyevandring i de to larvegruppene (Tabell 1). Feilpigmenterte larver i Artemia-gruppen var depigmenterte, mens de i zooplanktongruppen var pigmentert på begge sider. Næringsinnhold i fôrorganismene Artemia og zooplankton hadde noenlunde samme tørrstoff- og proteininnhold, mens nivå av fett og glykogen var høyere i Artemia enn i zooplankton (Tabell 2). Fettsyresammensetningen (Tabell 3) i zooplankton var karakterisert ved høyt nivå av DHA, EPA og totale n-3 fettsyrer. Artemia hadde lavt innhold av DHA, EPA og n-3 fettsyrer og høyere innhold av monoener, n-6 fettsyrer og ARA enn zooplankton. DHA/EPA-ratio var ikke signifikant forskjellig mellom de to. Tabell 2 Tørrvekt og innhold av hovednæringsstoffer i fôrorganismene Artemia Zooplankton Tørrvekt (mg g -1 våtvekt) 110±10 110±20 Protein (mg g -1 tørrvekt) 620±40 720±80 Fett (mg g -1 tørrvekt) 266±5a 156±31b Glykogen (mg g -1 tørrvekt) 74±6 a 5±2 b Tabell 3 Fettsyresammensetning (% fordeling) i fôrorganismene Artemia Zooplankton ARA (20:4 n-6) 2.1±0.1 a 0.7±0.2 b EPA (20:5 n-3) 4.9±0.3 a 18.6±3.2 b DHA (22:6 n-3) 6.3±0.9 a 28.5±4.8 b Σ Mettede 21.3±1.2 22.5±1.0 Σ Monoener 27.3±0.2 a 10.4±4.0 b Σ n-3 34.5±0.4 a 55.9±4.8 b Σ n-6 8.1±0.4 4.3±3.3 DHA/EPA 1.3±0.1 1.6±0.4 EPA/ARA 2.3±0.0 a 29±10 b Tabell 4. Nivå av frie og totale aminosyrer (mg g -1 protein) i fôrorganismene. Essensielle aminosyrer er merket med asterix. Frie aminosyrer Totale aminosyrer Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Asp 2.6±0.4 a 3.9±1.3 b 76±3 77±13 Glu 13±2 12±6 113±4 109±21 OH-Pro 0.2±0.0 a 0.1±0.1 b - - Ser 10±2 9±3 42±1 42±7 Gly 6.5±1.3 a 22±8 b 42±2 a 60±12 b Gln 12±2 a 6.1±2.7 b - - His* 4.1±0.7 4.1±1.6 16±1 17±5 Tau 14±2 a 9±3 b 17±1 a 12±4 b Arg* 18±3 a 25±8 b 60±3 60±13 Thr* 6.2±1.1 7.3±2.6 40±1 39±7 Ala 21±4 17±7 55±2 56±10 Pro 13±3 15±6 42±2 42±7 Tyr 8.0±1.7 7.5±3.0 37±1 37±6 Val* 8.6±1.6 10±4 44±2 42±8 Met* 4.7±0.9 a 6.3±2.3 b 17±1 19±4 Ile* 4.4±0.8 a 6.5±2.9 b 41±2 35±6 Leu* 12±2 a 15±6 b 66±3 60±11 Phe* 7.0±1.2 7.3±2.7 39±2 32±5 Trp* 1.8±0.3 2.1±0.8 - - Lys* 17±3 17±6 68±3 59±12 ΣAA 183±33 248±24 818±30 797±148 fôrorganismene, mens EPA/ARA ratio var mer enn 10 ganger høyere i Artemia enn i zooplankton. Zooplankton hadde ca 35% høyere innhold av frie aminosyrer enn Artemia (Tabell 4), med høyere innhold av følgende essensielle aminosyrer: arginin, metionin, isoleucin og leucin. Den største forskjellen lå imidlertid i glycin, som er en ikkeessensiell aminosyre. Det var bare små forskjeller i innhold av totale aminosyrer mellom de to fôroganismene (Tabell 4). Ernæringsstatus i larver Tørrstoffinnholdet i larver økte gjennom startfôringsperioden fra ca 9 til ca. 18% av våtvekt, mens proteininnhold i % av tørrstof ble redusert fra 87 til ca 70. Det var bare små forskjeller i protein og tørrstoffinnhold mellom fôringsgruppene. Fettinnhold i larvene var målt som FAME, dvs. totale fettsyrer, som gir et noe lavere tall enn om man hadde målt totalt fett. Ved 15 og 29 dager hadde larver fôret med Artemia tilsynelatende lavere fettinnhold enn larver fôret med zooplankton, men dette var ikke signifikant. Fettinnholdet i larver fôret med Artemia økte mot slutten av forsøket, mens det i zooplanktonfôrede Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Ark 1 Tabell 5. Utvikling av tørrstoff, protein, fett og glykogeninnhold i larver fôret med Artemia eller zooplankton i 60 dager Tørrstoff (mg g -1 våtvekt) Protein (mg g -1 tørrvekt) FAME*) (mg g -1 tørrvekt) Glykogen (mg g -1 tørrvekt.) Dag Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton 0 15 29 45 60 94±1 94±1 870±50 870±50 70±4 70±4 5±1 5±1 113±12 123±3 770±90 760±20 77±4 88±8 11±2 a 1±2 b 124±15 a 138±5 b 790±70 730±30 59±5 88±11 8±3 6±1 161±4 151±8 680±20 720±40 89±25 89±5 9±2 13±3 181±2 177±1 660±40 710±50 114±13 a 76±4 b 20±5 a 9±2 b larver var en liten nedgang i fettinnhold. Signifikant forskjell i fettinnhold i larver finner man bare på dag 60. Glykogeninnholdet i larvene økte utover i startfôringsperioden og var høyere i Artemia fôrede enn i zooplankton forede larver på dag 15 og 60. Når det gjelder nivå av aminosyrer i larvene, var det høyere innhold av metionin på dag 15 og lavere innhold av taurin på dag 45 i larver foret med Artemia enn i larver fôret med zooplankton (Tabell 6). Tabell 6. Totale aminosyrer i kveitelarver fôret med Artemia i 15 og 45 dager. Essensielle aminosyrer er merket med astriks. Dag 15 Dag 45 Artemia Zoopl. Artemia Zoopl. Asp 83±1 83±1 86±1 85±3 Glu 122±2 121±1 124±0 125±1 Hyp 5±0 5±0 7±0 6±0 Ser 45±0 45±1 50±3 47±0 Gly 51±1 52±0 59±3 55±1 His* 16±0 16±0 20±1 19±0 Tau 25±0 24±1 27±1 a 22±0 b Arg* 65±1 64±0 60±1 61±0 Thr* 45±1 44±0 43±0 44±1 Ala 51±1 50±0 58±1 56±1 Pro 36±0 37±0 39±0 38±0 Tyr 35±1 34±1 32±0 33±0 Val* 45±1 45±2 44±1 45±0 Met* 17±1 a 20±1 b 27±0 28±0 Ile* 38±1 38±2 39±1 39±0 Leu* 72±2 70±2 75±1 75±1 Phe* 37±1 38±3 38±0 38±0 Lys* 69±1 70±1 75±1 75±1 ΣEAA 403 403 420 424 ΣNEAA 453 451 482 468 ΣAA 857 854 902 891 Det var store forskjeller I fettsyresammensetning mellom larver fôret med de to fôrorganismene, med dramatisk høyere ARA, lavere EPA og DHA i larver fôret med Artemia i forhold til zoolpankton fôrede larver (Figur 2). AA (wt%) EPA (wt%) DHA (wt%) 15 10 5 0 45 40 35 30 25 20 15 10 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 5 0 c c b d ARA a e 0 15 30 45 60 Days after firstfeeding bc d EPA b d 0 15 30 45 60 a Days after firstfeeding ab c DHA a d 0 15 30 45 60 Days after firstfeeding a d b a e a d a e ab Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Artemia Zooplankton Figur 2. Essensielle fettsyrer i larver fôret med Artemia eller zooplankton. d d Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Ark 1 Diskusjon Vekst frem til dag 45 og dødelighet var ikke signifikant forskjellig i de to gruppene. Tidligere studier har vist noe varierende resultater med hensyn til vekst av kveitelarver, men hovedinntrykket fra dette og tidligere studier er at Artemia har lignende potensial som copepoder til å fremme vekst hos kveitelarver i tidlige stadier. Lengre ute på larvestadiet er det mulig at Artemia blir for små, da det har vært beregnet at kveitelarver trenger opp til 2500 Artemia per dag på dette stadiet for å dekke sitt energibehov. En større andel av larvene fôret med copepoder var normalt utviklet, sammenlignet med larver fôret med Artemia. Dette bekrefter tidligere resultater der det også er funnet store forskjeller i pigmentering og øyevandring mellom larver fôret med de samme fôrorganismene. Det at larver fôret med zooplankton hadde såpass høyt innslag av feilutvikling var imidlertid uventet. Pigmentering på begge sider, funnet i en stor andel av denne yngelen, kan være et resultat av manglende øyevandring. Sammensetning av hovednæringsstoffene var innenfor optimalområdet definert for yngel, i copepoder, mens fett- og glycogeninnhold var litt i overkant av antatt øvre grense (hhv. 25 og 5%) i Artemia. Økt fett- og glycogeninnhold ved slutten av forsøket i larver fôret med Artemia reflekterer fôret og stemmer overens med resultater fra kveiteyngel. Tidligere på larvestadiet hadde forskjellene i hovednæringsstoff i fôrorganismene ingen klar effekt på sammensetningen av larvene. Tendensen til lavere fettinnhold i larver fôret med Artemia var, selv om den ikke var signifikant, i motstrid til resultater fra kveiteyngel, og kan ha sammenheng med lav tilgjengelighet av fett fra anrikningsemulsjonen. Dette fettet består av triacylglycerol, mens det er vist at fosfolipid er mer tilgjengelig for marine fiskelarver. Lavere tilgang på energi i larver fôret med Artemia i den perioden som er antatt å være kritisk for utvikling, kan muligens forklare forskjellen i øyevandring. Forskjellen i frie aminosyrer mellom Artemia og copepoder ser ikke ut til å ha hatt innvirkning på proteinsyntesen, siden verken vekst eller proteininnhold i larvene var forskjellig. Det er vist at Artemia har høyt innhold av vannløselig protein, som antagelig er godt tilgjengelig for larvene, selv om disse ikke har et fullt utviklet fordøyelsessystem. Totalinnholdet av aminosyrer var ganske likt de to fôrorganismene, bortsett fra at glycin var høyere i zooplankton enn i Artemia. Glycin er en ikke essensiell aminosyre og Artemia ser derfor ut til å være en like god proteinkilde for kveitelarver som copepoder, i alle fall med hensyn til aminosyresammensetning. Aminosyresammensetningen i protein fra larver er genetisk bestemt og den frie aminosyre poolen er liten i forhold til totale aminosyrer. Det er derfor vanskelig å forklare at metionin er lavere i larver fôret med Artemia enn i zooplankton-fôrede larver. Dersom det hadde vært mangel på metionin ville proteinsynteseraten blitt lavere, noe som ville ha medført redusert vekst eller proteindeponering i larvene. Forskjellen i metionin i larver er liten og antagelig forårsaket av feil i analysene. Den største forskjellen i næringsinnhold mellom Artemia og copepoder fant man ikke uventet i fettsyresammensetningen. Lav DHA, høy ARA og lav EPA/ARA ratio i Artemia kan ha vært årsaken til feilpigmentering. Det var ikke forskjell i DHA/EPA forholdet i fôrorganismene. Hvilke mekanismer som styrer fettsyrenes effekt på pigmentering er ikke kjent, men EPA og ARA danner utgangspunkt for syntese av eicosanoider. Disse signalstoffene påvirker svært mange funksjoner i organismen. EPA og ARA konkurrerer om enzymene cyclo-oxigenase og lip-oxigenase som styrer dannelsen av eicosanoider, mens DHA binder seg til enzymene og blokkerer syntesen. N-3 og n-6 fettsyrer gir eicosanoider med forskjellig funksjon. Det er derfor viktig å ha riktig balanse mellom disse fettsyrene. Selv om man i den vitenskapelige litteraturen finner generelt lave nivå av DHA i Artemia (5-10%), er det mange kommersielle anlegg som oppnår langt høyere nivå. Det bør være mulig å anrike Artemia med opp til 20% DHA og få relativt høye nivå av EPA. ARA finner man imidlertid i selve Artemia og det kan være vanskelig å få redusert nivået. Siden det er balanse det dreier seg om, kan det vise seg å være tilstrekkelig å øke DHA og EPA i Artemia for å oppnå normal pigmentering hos kveitelarver. Balansert fettsyresammensetning kan også ha betydning for øyevandring. Konklusjoner Artemia kan gi en stor andel feilpigmentering og manglende øyevandring hos kveitelarver, i motsetning til copepoder. Utviklingsfeilene er ernæringsbetinget. Ubalansert fettsyresammensetning er en av flere mulige årsaker til feilpigmentering Mangel på energi og ubalansert fettsyresammensetning er to av flere mulige årsaker til manglende øyevandring. Artemia har antagelig omtrent samme potensialet som copepoder til å stimulere vekst hos tidlige stadier av kveitelarver. Artemia er antagelig en god protein- og aminosyrekilde for marine larver. Anriket Artemia inneholder litt for mye fett og glycogen i forhold til optimalområdet for kveiteyngel. Referanse: Hamre et al. (2002), Aquaculture Nutrition, 8, 139-148.

Ark 2 Forskjell i jod- og tyroid hormon nivå i kveitelarver fôret med Artemia eller copepoder Hamre, K., Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B. & Pittman, K. Tyroid hormon er en viktig faktor i styring av metamorfosen hos en rekke dyr, inkludert fisk. Aminosyrene fenylalanin og tyrosin, samt selen og jod er nødvendig for dannelse av tyroid hormon. Vi fant at jod-nivå i Artemia var ca 700 ganger lavere enn i copepoder og at det var forskjeller (2-3 ganger) også i larvene. Tyriod hormon var høyere på dag 15 og 25 etter startfôring i larver fôret med copepoder, noe som falt sammen med initiering av øyevandring i denne gruppen. Man kan stille spørsmål om Artemia som fôres til kveitelarverbør anrikes med jod. Introduksjon Tyroid hormon styrer metamorfosen i en rekke dyr, inkludert marine fiskelarver. Feilpigmentering og manglende øyevandring hos kveitelarver fôret med Artemia er i hovedsak ernæringsbetinget. Vi ville derfor undersøke om næringstoffer som er sentrale i syntesen av tyroid hormon var tilstede i forskjellig nivå i copepoder og Artemia og i larver fôret med de to organismene. I tillegg ville vi måle tyroid hormon i larvene for å se om dette var avhengig av fôrorganisme. Tyroid hormon dannes med utgangspunkt i aminosyren tyrosin som kan dannes fra aminosyren fenylalanin. I den videre prosessen bindes 4 jod til tyrosin (T 4 ). Den aktive formen av hormonet dannes ved å spalte av ett jod til T 3. Enzymet dejodinase som står for denne siste omdanningen er avhengig av selen for å fungere. Vi har derfor fokusert på næringsstoffene fenylalanin, tyrosin, jod og selen i larver fôret med Artemia eller copepoder fra startfôring og gjennom metamorfose. Materialer og metoder Egg fra en hunnfisk ble befruktet med sperm fra en hann og inkubert på egg- og larvestadiet i henhold til standard prosedyrer ved Austevoll Havbruksstasjon. De ble så flyttet til 4 1500 L kar, 5000 larver per kar, som ble driftet i henhold til standard prosedyrer. Larvene ble fôret i duplikat i 60 dager med Artemia (RH-type, INVE) anriket med DHA-Selco og vitaminer eller med zooplankton filtrert fra poll (Svartatjønn). Zooplanktonet bestod i hovedsak av de calanoide copepodene Eurytemora affinis og Centrophages hamatus.. Analyse av næringsstoffer er utført i henhold til akkrediterte metoder ved NIFES og analyse av øyevandring og T 4 er gjennomført ved Austevoll Havbruksstasjon. Resultater Det var ingen forskjell i nivå av selen, tyrosin eller fenylalanin mellom Artemia og copepoder. Jod var Jod (ug/g tørrvekt.) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Jod i larver 0 15 29 45 60 Dager etter startfôring Artemia Zooplankton Tabell 1. Innhold av selen, jod, tyrosin og fenylalanin i fôrorganismene (n=5). (µg g -1 tørrvekt) Artemia Zooplankton 2,8 2,4 Selen i larver Selen 2,2±0,2 2,0±0,4 Jod 0,51±0.05 a 350±40 b Aminosyrer (mg g -1 protein) Tyrosin 37±1 37±6 Selen (ug g-1 tørrvekt) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 Fenylalanin 39±2 32±5 0,0 0 15 29 45 60 Dager etter startfôring Artemia Zooplankton Figur 1. Jod og selen i larver fôret med zooplankton eller Artemia

Ark 2 Eye migration index T4 (ng g -1 ) 3 2 1 0 50 40 30 20 10 *** *** *** *** ** *** 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Days post hatching ** *** 0 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Days post hatching Figur 2. Øyevandring (a) og tyroid hormon nivå (T4, b) i larver fôret med Artemia (åpne symboler) eller copepoder (lukkede symboler) fra startfôring (43 dager etter klekking) til etter metamorfose. ca 700 ganger høyere i copepoder enn i Artemia (Tabell 1). I larvene var det 2-3 ganger høyere nivå av jod hos dem som hadde fått copepoder, sammenlignet med dem som hadde fått Artemia (Figur 1a). Selen nivå i larver fôret med Artemia var høyere enn i larver fôret med copepoder (Figur 1b). Det var ingen forskjeller i fenylalanin- of tyrosin nivå i larvene. Det var stor forskjell i øyevandring mellom gruppene. Øyet begynte å vandre hos larver fôret med copepoder rundt 58 dager etter klekking som tilsvarer 15 dager etter startfôring (Figur 2a). Det var høyere nivå av tyroid hormon i larver fôret med copepoder i perioden rundt initiering av øyevandring (Figur 2b). Det var ca 700 ganger mer jod i copepoder enn i Artemia, men bare 2-3 ganger så mye i larver fôret med copepoder, sammenlignet med Artemia-fôrede larver. Sjøvann er en viktig jod-kilde, og man antar at det er tilstrekkelig til å dekke jodbehov hos støøre fisk. Hos voksen fisk taes jod opp over gjellene. Larver på et tidlig stadium har ikke gjeller og hvordan jod eventuelt taes opp fra vannet på dette stadiet er ikke kjent. Man kan også spørre seg om fiskelarver er tilvendt til og avhengig av et fôr som inneholder mye jod. Larver fôret med copepoder hadde også høyere nivå av tyroid hormon i perioden der øyevandring ble initiert, noe som kan ha sammenheng med økt jod tilgang. Denne perioden sammenfaller med copepodevinduet der man ved å fôre copepoder i fra dag 18-25 etter startfôring, fikk en markant positiv effekt på pigmentering og øyevandring (Næss og Lie 1998). Det er imidlertid et åpent spørsmål om larver har behov for jod via fôret i de mengdene som man finner i copepoder. Konklusjoner Av de næringsstoffene som er nødvendig for syntese av tyroid hormon, var bare jod lavere i Artemia enn i copepoder og i Artemia- sammenlignet med copepodefôrede larver. Lavt jod kan ha vært årsaken til lavere nivå av tyroid hormon og svakere øyevandring i larver fôret med Artemia. Om jodanrikning av Artemia er nødvendig for å få normal utvikling av kveitelarver må undersøkes nærmere. Referanse Solbakken, J.S., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2003) Differential iodine and thyroid hormone levels between Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exogenous feeding until post metamorphosis. J. Fish. Biol., 61, 1345-1362. Diskusjon Det at selen, fenylalanin og tyrosis ikke var lavere i Artemia enn i copepoder og heller ikke i larver fôret med Artemia enn i dem som hadde fått copepoder, kan sees som en indikasjon på at det er nok av disse næringsstoffene i Artemia. Det høye nivået av selen i Artemia-fôrede larver kan være et resultat av god tilgjengelighet av selen fra dette byttedyret. Selen foreligger i forskjellige former med forskjellig tilgjengelighet.

Organstørrelse hos kveitelarver påvirkes av diett Espedal, P.G., Sæle, Ø., Erstad, B., Watanabe, K., Hamre, K. & Pittman, K. Ark 3 Dersom kveitelarvens diett påvirker skjelettdannelse og yngelens utseende, er det flere mekanismer som kan ligge bak. En fiskelarve har en hjernedel, hypofysen, som styrer hormonutskillelse, og en kjertel, tyroiden, som mottar signalene og skiller ut hormoner som styrer celle-endringer i resten av kroppen. Vi ville se om dietten påvirket så basale organer tidlig i kveitelarvens utvikling. Vi undersøkte organdannelse hos en utviklingsserie av 76 kveitelarver, fôret enten på anriket Artemia eller naturlig dyreplankton. Disse var seriesnittet medialt, farget og analysert stereologisk for volum av hypofyse, tyroidens epitel og colloid, og tarmepitel. Analyse av det siste er ikke ferdig. Resultatene viser at fôring med dyreplankton gir en signifikant større hypofysevolum fra startfôring og gjennom hele utvikling, og tyroidfolliklene er ikke-signifikant større gjennom hele utvikling enn de er hos larver fôret med Artemia. Det er en endring i trendene i alle data rundt 3-4 mm myotomhøyde, som er tilsvarende Stadiet 7. Da hypofyse og tyroid også påvirker tarmutvikling, kan det være en feedback loop der riktig mat bygger opp hjernen og tyroid som hjelper til å forbedre fordøyelse som fører til normal utvikling osv. Effekten av diett på hjerneoppbygging og dermed larvens evne til å styre egen utvikling er målbart kort etter startfôring. Introduksjon Utviklingsproblemer er ofte relatert til diett, men mekanismene bak er uklare. Etter plommesekkabsorpsjon, er det dietten som gir byggesteinene for all organdannelse, inkludert hjernen. Hos fisk er det en hjernedel, hypofysen, som utvikles under hoveddelen av hjernen. Hypofysen hos voksne beinfisk skiller ut bl.a. prolactin, veksthormon, melanoforstimulerende hormon (for pigmentering), ACTH (styrer cortisol) og tyroidstimulerende hormon. Det er altså hypofysen som styrer hormonutskillelse fra tre andre organer: interrenalen, gonadene og tyroiden. Av disse er det mest interessante på larvestadiet tyroiden. Tyroiden bygges opp rundt starforing og skiller ut tyroidhormoner som er nødvendig for å styre metamorfose, på lik linje som hos frosker. En effekt er på tarmen, der tyroidhormon øker volumet av epitel og absorbativt vev (egne data). Vi ville derfor undersøke kveitelarvens oppbygging av hypofyse, tyroid og tarm for å se når og hvor forskjeller oppstår som respons til diett. Dette var en del av en flerfaglig undersøkelse. Materialer og metoder (Se faktaark om Jod og tyroid for forsøksoppsettet.) En utviklingserie på tilsammen 76 kveitelarver, foret på enten zooplankton eller anriket Artemia ble samlet inn på regelmessig fra dag 5 til 46 etter startfôring. Disse ble bedøvd, målt for standard lengde, myotomhøyde, og øyenvandring, og fiksert før innstøping, snitting i 5 µ tykke snitt og farget. Programvaren CAST 2 (Olympus Danmark) ble brukt for stereologisk måling av areal som sammen med snitt-tykkelse ga volumet til hvert organ på hver larve. Tyroidfollikkelen ble delt opp i epitel og colloid. Resultater Volumet av hypofysen øker med økende myotomhøyde hos larvene i begge grupper (Fig. 1). Larver fôret med dyreplankton har samlet sett signifikant større hypofyse fra kort tid etter startfôring (covariansanalyse) og forskjellen øker med økende størrelse. Trenden ser ut til å endres rundt myotomhøyde 3-4 som tilsvarer Stadiet 7. Til tross for store individforskjeller er det signfikant større hypofyse hos kveitelarver som får dyreplankton. Hypofysevolum (mm 3 ) 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 * * 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Myotomhøyde (mm) Fig. 1 Volumet av hypofyse hos kveitelarver fôret med dyreplankton (røde firkanter) eller Artemia (blå sirkler). N=76. Regresjonslinjene er signfikant forskjellig (covariansanalyser). Stolpene indikerer området der Solbakken et al. (2003) målte økt tyroidnivå hos larver fra samme forsøk. Tyroidfollikkelvolum hos kveitelarvene gjenspeilet samme trend (figur 2). Hos begge gruppene økte tyroidfollikkelvolum med økende larvestørrelse, og igjen var det større tyroid hos de som fikk dyreplankton, selv om forskjellen ikke var signifikant. Igjen var det en endring da myotomhøyde var mellom 3-4 mm, og dette svarte til størrelsesområdet der Solbakken et al. (2003)

Ark 3 hadde målt økt tyroidnivå hos larver fra samme forsøk. Tyroidfollikkelvolum (mm 3 ) Fig. 2 Volumet av tyroidfolliklene hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). Stolpen er det intervallet myotomhøyde der økt tyroidnivå er blitt målt hos larver fra samme forsøk. Når man delte opp tyroid i epitelcellelaget (som opptar bl.a. tyrosin og jod og tillater hormonutslipp), og colloidlaget (som binder molekylene sammen for å lage tyroidhormonene) blir bildet av det som skjer i fisken mer nyansert (Fig. 3). Samlet sett er epitelcellelaget signifikant større hos dyreplankton-fôret larver etter ca 4 mm myotomhøyde, men det er stor individvariasjon. Trenden er også at epitelcellelaget er større hos mindre larver som har fått dyreplankton, men ikke signifikant. Epitelvolum (mm³) 0,024 0,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 Myotomhøyde (mm) * 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Myotomhøyde (mm) Fig. 3 Volumet av epitelcellelaget (ytre del av tyroidfollikkelen) hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). * er signifikant større (covariansanalyse). Stolpen er det intervallet myotomhøyde der økt tyroidnivå er blitt målt hos larver fra samme forsøk. Colloiden i tyroidfollikklene har en litt annen trend i utviklingen, og viser signifikant større volum tidlig i utviklingen, men ikke senere (Fig. 4). Igjen er det en økning hos begge gruppene i myotomhøydeintervall 3-4 mm. Det er stor individvariasjon hos større fisk. Colloidvolum (mm 3 ) 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 * 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Myotomhøyde (mm) Figur 4. Volumet av colloid (indre del av tyroidfollikklene) hos kveitelarver fôret med dyreplankton (rød firkant) eller anriket Artemia (blå sirkel). * er signifikant større (covariansanalyse). Diskusjon Diett ga signifikante forskjeller i størrelse på hypofyse og tyroid fra kort tid etter startfôring. Volumet av colloiden, som lager hormonene, var signifikant større hos dyreplanktonfôret kveitelarver i perioden før det ble målt høyere tyroidnivå hos samme gruppen (Solbakken et al. 2003). Dette støtter hypotesen om at diett har en tidlig, direkte påvirkning på organsystemer som fisken bruker for å styre egen utvikling. Volumendringene følger samme mønsteret men forholdet mellom volum og funksjon av et organ er ikke kartlagt. Størrelsesforskjeller peker på muligheten til utvidet funskjonalitet, noe som må testes med andre metoder. Foreløpig støtter våre data hypotesen om at diett bygger hjernen og hjernens oppbygging er grunnlaget for resten av utviklingen hos kveite. Vi skal snart sette disse data sammen med målinger fra tarmsystemet. Kan diett bygge hjernen som i sin tur påvirker tarmen og hvordan blir dietten utnyttet? Konklusjoner Fra kort etter startfôring er det signifikant større hypofyse og tyroid hos kveitelarver som får dyreplankton. Oppbygging av colloid, som lager hormon, er signifikant større i størrelsesintervallet før det er målt økt tyroidnivå hos kveitelarver fra samme forsøk.

Ark 4 Artemia anriket med jod fôret til kveitelarver M. Moren, I. Opstad, K, Pittman og K. Hamre Jod er nødvendig for dannelse av tyroidhormoner som igjen nødvendige for å initiere metamorfosen. Innholdet av jod i copepoder (zooplankton) er inntil 700 ganger høyere enn i Artemia. Larver som har blitt fôret med copepoder har høyere innhold av jod enn de som er fôret med Artemia. Vi anriket Artemia med jod slik at nivået var på høyde med copepoder. Videre ble dette fôret til kveitelarver i 53 dager. Resultatet ble en økning av jod i larvene og en indikasjon på økt innhold av tyroidhormon. Introduksjon Dersom man fôrer Artemia til kveitelarver, får man feilutvikling i høyere grad enn om man gir larvene copepoder. Tyroidhormon initierer metamorfosen og kan derfor spille en rolle for hvor vellykket den blir. Mikronæringsstoffet jod er nødvendig for å danne disse hormonene. Solbakken et al (2002) fant et jodnivå i copepoder som var 700 ganger høyere enn i Artemia. Videre hadde larver fôret med copepoder høyere innhold av jod og en tendens til høyere tyroidhormon-nivå enn de som var fôret med Artemia. Målet med dette studiet var å undersøke om det var mulig å øke innholdet av jod i larver ved å anrike Artemia til et nivå tilsvarende copepoder. Effekter på innhold av jod og tyroidhormoner ble målt. Innholdet av jod ble også målt i copepoder samlet gjennom en lengre periode av året for å få et sesonggjennomsnitt og for å se variasjonen. Materialer og metoder Copepoder ble samlet fra mai til november i Svartatjønn (van der Meeren, 2001) og fôringsforsøket inklusive anrikningen av Artemia med jod ble utført ved Austevoll Havbruksstasjon. Larver fra dag 8 etter startforing ble fordelt på 12 kar (1000 larver pr 1500 L tank). Artemia ble enten anriket med DC-DHA-Selco (kontroll-artemia) eller med DC-DHA-Selco tilsatt jod (jodanriket Artemia). De to variantene av anriket Artemia ble fôret til larver i 6 kar i en periode på 53 dager. Prøver ble tatt av fôrorganismene hver 10. dag, mens larver ble tatt ut til analyse ved start og slutt av fôringsforsøket. Prøvene ble frosset ned på tørris og lagret på 80 C for analyse av tyroidhormon og på 20 C for jodanalysene. Jod ble gitt som en olje men den aktive formen er på sin side ikke fettløselig. Derfor spaltet vi larveprøvene i en fettfraksjon og en fraksjon uten fett og analyserte innholdet av jod i disse som en kontroll på hvorvidt larvene hadde nyttegjort seg jodet i oljen. Innholdet av jod ble analysert ved NIFES. Tyroidhormoner ble analysert ved Institutt for Fiskeri- og Marinbiologi, UiB. Resultater Jodinnholdet i copepodene varierte fra 8.4 35.1 µg g -1 (våtvekt.) gjennom sesongen. Innholdet i jodanriket Artemia lå innenfor dette spekteret selv om det er signifikant lavere enn gjennomsnittet for copepoder (tabell 1). Kontroll-Artemia hadde klart lavere innhold av jod enn de to øvrige fôrgruppene. Tabell 1. Jodinnhold i Artemia anriket med DC- DHA-Selco (kontroll-artemia) eller med jod i tillegg (jodanriket Artemia) og copepoder. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD, p<0,05) Fôrtype Jodanriket Artemia (n=12) Kontroll-Artemia (n=12) Copepoder (n=14) Jodinnhold (µg I g -1 våtvekt) 9.4 ± 2.7 a 0.194 ± 0.084 b 18.1 ± 7.3 c Resultatene i tabell 2 viser at jodet har blitt igjen i larven. Andelen som var i fettfraksjonen var relativt stor, men det resterende, altså det som må anses som tilgjengelig for larver var signifikant høyere enn jod i larver fôret med kontrollartemia (figur 1). Tabell 2. Konsentrasjoner i larver fôret jodanirket eller kontrollartemia i 53 dager.. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD, p<0,05). Larvegruppe Larver fôret med Jodanriket Artemia Larver fôret med Kontroll- Artemia Jodinnhold (µg I g -1 våtvekt) 21.63 ± 9.3 a 1.49 ± 1.2 b

Ark 4 Larver har som kjent ikke gjeller og det er ikke sikkert at et lavt nivå av jod i fôr kan kompenseres med økt opptak fra vann. Det er uansett vist her at økt innhold av jod i fôr gir økt innhold i larvene og dermed kan ikke opptaket av jod fra fôr anses som en uvesentlig kilde. De høye nivåene i copepoder, det naturlige fôret for kveitelarver, gjør kanskje nettopp fôret til den beste jodkilden ute i naturen. Før vi kan si om jod i fôret er den viktigste kilden gjenstår det å undersøke effekten av jodopptak fra vann og den eventuelle påvirkingen økt jod i fôret har på pigmentering og øyevandring. Figur 1. Innold av jod i fettfri fraksjon fra larver fôret med (0) kontroll-artemia eller jodanriket Artemia. (1) i 53 dager. Konklusjon Det er mulig å heve innholdet av jod i larver ved å fôre dem med Artemia som er anriket med jod i form av en jodetert olje. Effekten av dette på metamorfosen gjenstår ennå å se. Referanser Hunn, J.B.F., P.O. (1966) In vivo uptake of radioiodide by rainbow trout. J. Wat.Pollut. Control. Fed., 38, 1981-1985. Figur 2. Innhold av tyroidhormonet triiodotyronin (T 3 ) i larver fôret med med (0) kontroll-artemia eller (1) jodanriket Artemia i 53 dager og (2) fra 1. dag i fôringsforsøket. Det var ikke signifikant forskjell i innhold av triiodotyronin (T 3, den aktive formen av tyroidhormonene), men figur 2 viser en indikasjon på at jodanriket Artemia har gitt en økning av dette hormonet i larvene. Diskusjon Meeren, v.d. (2001) Biochemical compostition of Copepods: seasonal varation in lagoon-reared zooplankton In Larvi '01 - Fish and shellfish larviculture symposium (Hendry, C.I., Van Stappen, G., Wille, M. Sorgeloos, P. ed., Vol. Special publication no. 30, pp. 614-615. European Aquaculture Society, Ghent, Belgium. Solbakken, J.B., Berntssen, M.H.G., Norberg, B., Pittman, K. & Hamre, K. (2002) Different iodine and thyroid hormone levels between Atlantic hailbut larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exougenous feeding until post metamorphosis. Journal of Fish biology, 60, 1345-1362. Den store forskjellen i jodinnhold mellom Artemia og copepoder påvirker innholdet av jod i larven (Solbakken et al., 2002) og det kan være mulig at fôret er en viktig jodkilde for kveitelarver. Men jod finnes også tilgjengelig for fisk i sjøvannet. Det er vist at jod kan tas opp som jodid (I - ) over gjeller (Hunn, 1966).

Ark 5 Stadieinndeling hos kveite fra startforing til bunnslåing, uavhengig av øyenvandring Sæle, Ø., Solbakken, J.S., Watanabe, K., Hamre, K., Power, D. & Pittman, K., Sammenligning av forsøk og resultater på kveitelarver er vanskelig på grunn av mangel på standardiserte målestokk. Inngående studier av kveitelarvens generell utvikling og forebeining av hodeskallet muliggjorde korrelasjoner med mål som bl.a. myotomehøyde og dannet grunnlaget for robuste definisjoner på stadier 5 til 10, fra startforet larve til bunnslått yngel. Uavhengig av øyenvandring, var korrelasjonen mellom stadie og myotomhøyde R 2 0.086. Stadieinndelingen var videre validert på to grupper kommersielt produsert kveitelarver. Hvordan yngelen skal se ut etter bunnslåing ser ut til å være fastsatt innen Stadie 8. Siden metamorfose tar lang tid hos kveite, kan denne stadieinndelingen og særlig bruken av myotomhøyde hjelpe til å standardisere prøvetaking og analyse mellom forsøk og mellom produsenter. Introduksjon Sammenligning av forsøk og resultater på kveitelarver er vanskelig på grunn av mangel på standardiserte målestokk. Vår tidligere arbeid også viste at hverken antall dager fra f.eks. klekking, døgngrader, standard lengde, pigmentering eller øyenvandring ga en god nok indikasjon på hvor langt i utviklingen larvene var kommet. Derfor ble det prøvetatt en tidsserie med larver fra en eggbatch, fóret med zooplankton eller Artemia. Disse ble grundig undersøkt for forbeining på hode og generell utvikling. Utviklingsdivisjonene ble teste på to grupper kommersielt produsert kveitelarver. Studiet var en del av et større forsøk som så på diett, jod, tyroid, og skjelettutvikling hos kveite. Materialer og metoder (Se faktaark om jod og tyroid for detaljer om forsøksoppsett.) Fem larver fra hvert kar ble tatt på dag 0, 5, 10, 14, 21, 25, 28, 35, 40 og 46 etter startforing, tilsammen 180 larver. Disse ble anestisert, målt levende for standard lengde og myotomhøyde, og så fiksert i 10% bufret formalin. Larvene ble klarnet og farget for calsifisert vev og oppbevarte i 87% glycerol. Vi brukte hodet til en 28 dager gammel larve for å identifisere de enkelte bein, da de fleste var tilstede men ikke fusjonert på dette tidspunkt. Tabuleringen av hodebeinutvikling dannet grunnlaget for en mulig stadieinndeling. Etter å ha bestemt basale utviklingstrinn, ble larvene sortert i stadier og individets stadie sammenlignet med standard lengde, myotomehøyde og alder. Samme prosedyre ble utført på 23 larver produsert på det kommersielle kveiteoppdrettsanlegg på Island, Fiskey, og resultatene sammenlignet. For å sammenligne morfometriske endringer mellom satdiene, ble ytterlige 101 kveite fra Fiskey anestisert og fotografert digitalt. Resultater Utvikling ble best korrelert med myotomhøyde (0.86) men det var også relativt godt korrelert med standardlengde (Fig. 1). Alder var minst korrelert med individets utvikling. DPSF 50 40 30 20 10 0 MH (mm) 8 7 6 5 4 3 2 1 5 6 7 8 9 Stage Figur 1. Korrelasjoner mellom stadie, dager etter startfôring, standard lengde og myotomhøyde hos 178 kveitelarver med forbeining. Det ble laget stadieinndelinger 5 (startforing, premetamorfose) til 10 (bunnslått yngel, postklimaks metamorfose) for å forstette arbeid fra Pittman et al. (1990). Øyenvandring er følgt av beinet som heter Frontale, som forbeines før den har fått sin ferdige form (Fig. 2). 30 28 26 24 22 20 18 16 14 SL (mm)