NOV 2011 Temanummer Tarmhelse FISKEHELSE
Fagtidsskriftet Fiskehelse INNHOLD ISBN 978-82-8208-028-6 Utgiver: Tekna Fiskehelseforeningen Faglig gruppe i Tekna www.fiskehelseforeningen.org Adresse: Tekna Fiskehelseforeningen Postboks 2312 Solli 0212 Oslo Redaksjonen Redaktør: Kjetil Korsnes kjetil.korsnes@uin.no Redaksjonsmedarbeider: Jostein Grip jostein.grip@gmail.com Tema: Tarmhelse, Kjetil Korsnes... 4 Lipid malabsorption in Atlantic salmon the reoccurring problem of floating feces, Michael H. Penn... 6 A focus on fish gut health, Charles McGurk... 13 Tarmhelse hos laks hva gjør EWOS? Asbjørn Dyrkorn Løland...15 Probiotika en alternativ inn fallsvinkel for sykdomskontroll: Myte eller realitet? Viswanath Kiron, Kjetil Korsnes... 19 What is fish gut telling you? Makoto Inami... 23 Skriveveiledning til fagtidsskriftet Fiskehelse... 27 Layout: Anne Edholm anne.edholm@tekna.no Forside illustrasjon: Laksestudio Foto: www.suldal.kommune.no 2
Annonsering i tidsskriftet Fiskehelse Fiskehelse utgis av Fiskehelseforeningen, en faglig gruppe i Tekna. Målgruppen for tidsskriftet er fiskehelsebiologer, veterinærer, konsulenter, forskere, forvaltning, oppdrettere og andre interesserte i fagfeltet. Bladet finansieres av annonser og abonnement. Pris på annonser: Helside kr 3 000 Halvside kr 1 500 Prisene er ekskl. MVA Fiskehelse inneholder faglige artikler der forskere og andre fagfolk skriver om aktuell e problemstillinger innenfor fiskehelse og akva kultur. I tillegg er det presentasjoner av mastergrader i fiskehelse og informasjon fra Fiskehelseforeningen. Henvendelser angående annonser i tidsskriftet Fiskehelse sendes til: Kjetil Korsnes kjetil.korsnes@hibo.no Abonnere på tidsskriftet Fiskehelse Ved å abonnere på tidsskriftet Fiskehelse får du aktuell informasjon om hva som foregår innenfor fagfeltet akvakultur og fiskehelse. Bladet koster kr 100 pr. utgave. Abonnement opprettholdes inntil eventuell oppsigelse. Henvendelser angående abonnement sendes: Tekna Fiskehelseforeningen fiskehelse@tekna.no Skrive i tidsskriftet Fiskehelse? Er du interessert i å skrive en artikkel i tids skriftet Fiskehelse, kan du ta kontakt med redaktør. For skriveveiledning til fag tidsskriftet Fiskehelse, se s. 27. Studer fiskehelse! Profesjonsstudium i fiskehelse/akvamedisin Norge trenger flere fiskehelsebiologer Kan fisk få influensa og feber? Blir de like slappe som oss mennesker? Hvordan er det å være syk når man er fisk, og hvordan blir man frisk? Kan man vaksinere en fisk? Disse og mange andre spørsmål jobber fiskehelsebiologer med å besvare. Noen har vi funnet svar på, men det er mange gåter. Hvis du har interesse for dyrehelse, biologi og bioteknologi, og har en realfaglig bakgrunn fra videregående skole, har du gode forutsetninger for å studere fiskehelse/akvamedisin. Fiskehelsebiologer utdannes til å arbeide med biologiske problemstillinger i skjæringspunktet mel lom fiskehelse, miljø, produksjon og teknologi, dermed har de en nøkkelrolle i Norges viktigste fremtidsnæring, fiskeoppdrett. Se mer om fiskehelse på youtube.com/ studerfiskehelse fiskehelse@tekna.no www.fiskehelseforeningen.org 3
Tema: Tarmhelse Kjetil Korsnes, redaktør FISKEHELSE Universitetet i Nordland, 8049 Bodø kjetil.korsnes@uin.no Tarmhelse hos fisk er et stort tema, og ernæring og helse påvirker hverandre. Denne utgaven av Fiskehelse gir et innblikk i noen av temaene som er i fokus nå, og har tatt utgangspunkt i en workshop arrangert av Norwegian Centres of Expertise (NCE) Aquaculture tidligere i år. En av grunnene til at tarmhelse har fått økt fokus er problemer observert hos laks. NCE har initiert et prosjekt for å se på denne problemstillingen, samt hvordan miljøfaktorene rundt lakseoppdrettsanlegg påvirker fiskens helse og fordøyelsesfunksjon. Eksempelvis har flyte fece s ved flere anledninger blitt sett hos laks i oppdrett, noe som har vært gjenstand for nærmere undersøkelser. Michael H. Penn ved Norges veterinærhøgskole går inn i denne problemstillingen i sin artikkel. Tarmen er mye mer enn bare opptak av næringsstoffer, og i et fiskehelseperspektiv er tarm svært interessant. Fôrselskapene fokuserer derfor på tarmhelse, og Charles McGurk fra Skretting ARC og Asbjørn Dyrkorn Løland fra EWOS gir ett innblikk i hva disse selskapene jobber med innenfor dette feltet. Det er derfor ikke uventet at en er interessert i økt kunnskap rundt fysiologiske og immunologiske prosesser i tarmen. Dette er viktig informasjon om en ønsker å påvirke både ernærings- og helsestatus. Likevel mangler vi mye kunnskap, noe Makoto Inami fra Universitetet i Tromsø peker på i sin artikkel. Et tema som er velkjent er bruk av probiotika for å forbedre helsen. Mye av kunnskapen kommer fra landlevende dyr, men det har vært relativt lite brukt i fiskeoppdrett i Norge. Mange har pekt på ulike bruksområder, både som tilsetning i vannmiljø og i dietten, noe som tilsynelatende burde være svært attraktivt i fiskeoppdrett. Fokuset på probiotika har økt de siste årene. Blant annet har EWOS benyttet dette for å øke 4 tilveksten hos fisk. Det er også pekt på potensialet for å bruke probiotika for å styrke fiskens immunsystem, men det mangler fremdeles mye kunnskap rundt tarmimmunologi og hvordan en i praksis kan bruke dette i oppdrett. Kiron Viswanath og undertegnede fra Universitetet i Nordland gir et innblikk i problemstillinger rundt utvikling og bruk av probiotika for å redusere sykdomsproblemer hos fisk. Tarmhelse er uten tvil et tema som vil få økt oppmerksomhet i tiden fremover, og det pågår mye kunnskapsgenerering i private og offentlige forskningsmiljøer. Dagens sykdomsproblemer i lakse- og torskeoppdrett tilsier at en også må ta i bruk alternative innfallsvinkler for redusere problemene.
An apple a day procontra Photo: Tom Haga An apple a day keeps the doctor away, ifølge ordtaket. Protec fungerer litt på samme måten. Helsefôret styrker immunforsvaret og tarmhelsen, stabiliserer mikrofloraen i tarmen og fyller opp fiskens lager av antioksidanter og vitaminer. Frisk som en fisk! www.skretting.no 5
Lipid malabsorption in Atlantic salmon the reoccurring problem of floating feces Michael H. Penn Aquaculture Protein Centre, a CoE, Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Norwegian School of Veterinary Science, P.O. Box 8146 Dep, NO-0033 Oslo, Norway michael.penn@nvh.com In the summer of 2002 (though some reports indicate as early as summer 2001) a new disease emerged in Atlantic salmon at farms throughout Norway. The first outward sign of the disease was large accumulations of white or yellow floating material collecting around sea cages and nets (Fig. 1). The material attracted the attention of sea Figure 1. Accumulations of white to yellow material around sea cages and net pens (Photograph: Ragnhild Hanche-Olsen). gulls as well as neighbors and local residents. The material was quickly identified as feces, unusual not only in its appearance but also because it floated. It was determined that these characteristics were due to abnormally high lipid content. The medical term for this is steatorrhea and is indicative of insufficient digestion (maldigestion) or absorption (malabsorption) of dietary fat. Epidemiological information The first widespread reports of floating feces occurred in 2002, appearing in July/August and declining and disappearing in September/October. The problem re occurred in 2003 but appeared earlier, in May/June, and lasted longer, until November. Thereafter it disappeared until summer 2010, when floating feces was again observed. The phenomenon has been reported in all regions of Norway and seems to peak during highest water temperatures. It has been reported that even within the same area neighboring farms may be differently affected. Even within the same farm, some cages may be affected while others are not. Several strains of salmon have been affected. Prior to the onset of signs, fish have been reported to have high feed intake, though afterward feed intake has varied, some fish exhibiting reduced intake while others continued to eat well. There is no clear correlation with feed type or manufacturer though there is anecdotal evidence that some of the outbreaks were related to a specific feed batch and symptoms were reduced when the batch was changed. However, due to the large amount of feeds used and simultaneous delivery of several batches, it can be difficult to positively identify specific feed batches fed to individual cages. When the malabsorption initially appeared, only larger salmon in their second year at sea were affected. More recently, however, smaller fish have been affected. One of the challenges in dealing with this problem is the often fragmentary and anecdotal nature of information available. Unfortunately, no consistent reporting scheme has been used and the epidemiological data is often incomplete (i.e. variable monitoring of feed intake, water quality parameters, feed batches, etc.) At the Norwegian Centres of Expertise Aquaculture meeting held in April 2011 in Bodø, a reporting scheme was proposed to standardize reporting. Farmer participation and reporting is vital to improve the epidemiological evidence. 6
The time course for the disease has not been well established. Floating feces is observed during high water temperatures, but it is not known if the underlying disease parallels the overt signs, or remains subclinical and becomes overt under a certain set of conditions. To date no long term monitoring has been reported, so it is not known how quickly the disease develops or how quickly fish recover, and whether or not recovery is complete or only partial. Gross examination On necropsy the pyloric caeca and intestines of affected fish are swollen and appear white (Fig. 2). The pyloric region (pyloric caeca and intestine between the pyloric sphincter and last pyloric caeca) is most often affected, while the mid intestine is variably involved. As the severity increases the white discoloration affects areas farther along the intestine. In the most severe cases even the most proximal parts of the distal intestine can be affected. The mucosa of affected tissue is thickened and pale; in markedly affected individuals the mucosa appears white (Fig. 3). Occasionally at the transition between abnormal and normal tissues the mucosa has a white blotchy appearance. When dissecting the intestine, a white viscous lipidic material is often observed oozing from cut surfaces or free within the lumen of pyloric caeca after gentle manipulation, indicating that the epithelial cells are very fragile and prone to rupture. The amount of visceral fat varies. It is not uncommon to find feed pellets within the stomach, and normal appearing intestinal contents (digesta) buffeting abnormal yellow to brownish yellow lipidic digesta. This suggests that the malabsorption may be episodic, but the reason is unclear. Very few other abnormalities are consistently found. Histological findings The most prominent histological change in affected fish is a marked hypervacuolization of intestinal epithelial cells (enterocytes; Figs. 4 & 5) in the pyloric and mid intestine regions. Occasionally epithelial sloughing is observed with a concomitant inflammatory response. However, when the epithelium is intact, inflammation is rarely present. This suggests that inflammation is secondary to cellular damage or loss of the epithelial barrier Figure 2. View of the serosal surface of the intestine in the area of the pyloric and mid intestines. The last pyloric caeca is denoted (asterisk). Abnormal tissue is evident (arrow) in the more proximal part of the intestine by its lighter color. Normal tissue (arrowhead) appears reddish-gray. At the transition between abnormal and normal tissues, the tissue has a blotchy appearance. Figure 3. Mucosa of the pyloric caeca appears thickened and rugose. The tissue appears much lighter in color than normal, in severe cases approaching white. Arrows indicate residual luminal content. When viewed in situ within the intestine, floating feces can be difficult to distinguish from starvation pellets. Figure 4. Histological appearance of the pyloric caeca mucosal folds. Long stretches of hypervacuolated epithelium are evident at low magnification. 7
Figure 5. Histological appearance of pyloric caeca epithelium. Normal (left panel) enterocytes exhibit uniformly to finely vacuolated eosinophilic staining cytoplasm (asterisk). Abnormal (right panel) enterocytes exhibit marked hypervacuolization causing cells to be taller than normal. Condensed (pyknotic) nuclei are also evident (arrow). No inflammation is present. The bracket denotes the margins of a single mucosal fold. lu intestinal lumen, bb epithelial brush border, lp lamina propria Figure 6. A schematic diagram of the basic processes involved in lipid digestion. Ingested fat (as lipid droplets) are emulsified by bile salts and phospholipid secreted by the liver and released by the gall bladder. Pancreatic lipase then hydrolyzes the triglycerides into free fatty acids and monoglycerides. Short chain fatty acids are absorped directly after hydrolysis of triglycerides. Medium and long chain fatty acids, monoglycerides, cholesterol and fat soluble vitamins combine with bile salts and phospholipids to form mixed micelles. The micelles approach the brush border of absorptive epithelial cells (enterocytes) and the lipid soluble components diffuse through the membrane. Within the enterocyte, fatty acids are shuttled to the endoplasmic reticulum where triglycerides are re-synthesized and packaged into lipoproteins (chylomicrons) along with cholesterol, phospholipids and apolipoproteins. After additional modifications in the golgi apparatus chylomicrons are exocytosed into the systemic circulation. 8
and not a primary cause of the enterocyte hypervacuolization. Pancreatic tissue often appears normal, though in some samples exocrine pancreatic acinar cells appear to have reduced secretory granules (containing enzymes related to protein and lipid metabolism, e.g. trypsin and lipase), but no significant degeneration/necrosis or inflammation have been observed. Focal inflammatory lesions have been observed in the heart of some individuals, but what, if any, relationship with the lipid malabsorption is not known. Composition of feces Proximate analysis of fecal samples indicates that samples have a high dry matter content, low protein content and very high lipid content (some higher than 70%). Analysis of the viscous white material taken from the pyloric caeca is similar to the feces, but contains a higher amount of protein, suggesting that the material originates from ruptured enterocytes. Fatty acid profiles of feed, the viscous white lipidic material from pyloric caeca (extruded cellular contents), and floating feces are quite similar, suggesting that there is no significant differential uptake of specific individual or classes of fatty acids. There was a minor difference in the n 4 polyunsaturated fatty acids, floating feces samples having approximately half the level compared to feed. However, these data are based on very few samples and some lipid is likely lost by dispersion from samples collected from water, particularly if the lipid is in oil form. Causes of steatorrhea In mammals, the causes of malabsorption can be classified according to the physiologic process affected: intraluminal digestion, terminal digestion or transepithelial transport (Fig. 6). Failures of intraluminal digestion (e.g. liver disease, pancreatitis) result in improper breakdown of dietary components, preventing absorption. Insufficient terminal digestion (e.g. lactose intolerance) prevents final breakdown and absorption, particularly of carbohydrates and peptides. Insufficient transepithelial transport (e.g. inflammatory bowel diseases, abetalipoproteinemia) prevents transport of nutrients across the epithelium and into the systemic circulation. Lipid malabsorption is most often caused by insufficient intraluminal digestion or transepithelial transport (terminal digestion is not required for lipid absorption). Diseases that affect the liver or pancreas can affect production or secretion of components (bile salts and lipase, respectively) necessary for emulsification and hydrolysis of lipids, and formation of micelles that are necessary for absorption of fatty acids, cholesterol and lipid soluble vitamins. Bile salt levels, and lipase and trypsin (proteinase of pancreatic origin) activities in digesta have been examined in fish exhibiting signs of lipid malabsorption. Although the sample size was small (8 individuals) the results suggest that bile salt (Fig. 7) and lipase levels were not the primary cause of the malabsorption. These findings, coupled with the histological observations (i.e. accumulation of lipid within enterocytes) suggest that the malabsorption is more likely due to a deficiency in transepithelial transport, resulting in accumulation of lipid within the intestinal epithelium. Enterocyte hypervacuolization has been reported previously in a number of fish species, including Arctic char (Olsen et al., 1999, 2000), Rainbow trout (Olsen et al., 2003; Dapra et al., 2011) and common carp (Fontagne et al., 1998). The vacuoles are thought to be temporary storage forms of lipid, implying that lipid absorption into the enterocyte exceeds export. This may be due to insufficient phospholipid, leading to impaired lipoprotein (chylomicron) production. Many species of larval and juvenile fish have limited capacity to synthesize phospholipids (Tocher, 2008), and enterocyte lipid accumulation can be ameliorated by supplementing diets with phospholipids (Fontagne et al., 1998; Dapra et al., 2011). It is currently believed that older fish are capable of synthesizing sufficient quantities of phospholipids and do not have a requirement for exogenous phospholipid per se. However, there is scant evidence in the literature either supporting or refuting this claim, as virtually no studies have been performed on adult fish. Several factors can influence phospholipid synthesis. Dietary lipid source, and consequently fatty acid profile, can alter the type of fatty acids found in tissue phospholipids (Olsen et al., 2003; Oxley et al., 2005a). Temperature adaptation alters the type of fatty acids incorporated into phospholipids with a shift toward saturated fatty acids (C16:0 and C18:0) at higher temperatures and mono- and poly-unsaturated fatty acids at lower temperatures (Farkas et al., 2001). Consequently, interactions between dietary fatty acid profiles and temperature can affect phospholipid profiles (Jobling & Bendiksen, 2003). Temperature also affects the enzymes involved in phospholipid synthesis, for example diacylglycerol cholinephosphotransferase (CPT), a key enzyme in phospholipid synthesis (Holub et al., 1975). CPT also requires Mg2+ and is inhibited by Ca2+ (Oxley et al., 2005b) and must compete for substrate (1,2-diacylglycerol) with the triglyceride synthesis pathway. Other factors, such as the degree of lipid hydrolysis (incomplete, yielding free fatty acids and monoacylglycerol, or complete, yielding free fatty acids and glycerol) in the intestinal lumen during digestion can also affect phospholipid synthesis. 2-monoacylglycerol is the preferred substrate for phospholipid synthesis via the monoacylglycerol pathway (Oxley et al., 2007); otherwise, the glycerol- 3-phosphate pathway is used, but is slower and more energy demanding (Bogevik et al., 2008). It is possible that under certain conditions fish cannot maintain sufficient quantities of phospholipids within enterocytes to effectively export absorbed lipid, particularly during times of high feed intake. This hypothesis merits investigation. 9
Figure 7. Bile salts concentrations in digesta throughout the entire intestinal tract in fish showing signs of lipid malabsorption. Eight fish were sampled from a single site in Hordaland in November 2010. Bile salt levels follow a typical trend of decreasing levels as digesta moves along the tract. Large variation between individuals is typical for the proximal parts of the intestine. The shaded area denotes the range of values from control (fishmeal based diet fed) fish from several dietary trials at the Aquaculture Protein Centre (CoE). Levels appear to be sufficient for proper emulsification of dietary lipid. Conclusion There is no clear singular cause yet identified for the recurring episodic lipid malabsorption observed in farmed Atlantic salmon. The current prevailing belief is that the disease is multifactorial, or is at least influenced by multiple factors. The most consistent histological finding is enterocyte hypervacuolization, resulting from lipid accumulation likely due to deficient transepithelial lipid transport. It has not been conclusively determined if this change signifies the primary disease process, or is secondary to another disease process. Taking into account information from the field, a number of potential causes or contributing factors must be considered, including phospholipid deficiency, changes in intestinal microbiota, infectious agents, toxins, water quality and feeding regime. Additional analyses are necessary to rule out other potential causes. Improved recordkeeping and reporting will serve to improve epidemiological data. References Bogevik, A.S., Olsen, R.E., Tocher, D.R., 2008. Utilization and metabolism of palmityl and oleoyl fatty acids and alcohols in caecal enterocytes of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture Nutrition 14, 270-280. Dapra, F., Geurden, I., Corraze, G., Bazin, D., Zambonino-Infante, J.L., Fontagne-Dicharry, S., 2011. Physiological and molecular responses to dietary phospholipids vary between fry and early juvenile stages of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 319, 377-384. Farkas, T., Fodor, E., Kitajka, K., Halver, J.E., 2001. Response of fish membranes to environmental temperature. Aquaculture Research 32, 645-655. Fontagne, S., Geurden, I., Escaffre, A.M., Bergot, P., 1998. Histological changes induced by dietary phospholipids in intestine and liver of common carp (Cyprinus carpio L.) larvae. Aquaculture 161, 213-223. Holub, B.J., Nilsson, K., Piekarski, J., Slinger, S.J., 1975. Biosynthesis of Lecithin by Cdp-Choline Pathway in Liver-Microsomes of Rainbow-Trout, Salmo-Gairdneri. Journal of the Fisheries Research Board of Canada 32, 1633-1637. 10
Jobling, M., Bendiksen, E.A., 2003. Dietary lipids and temperature interact to influence tissue fatty acid compositions of Atlantic salmon, Salmo salar L., parr. Aquaculture Research 34, 1423-1441. Olsen, R.E., Myklebust, R., Kaino, T., Ringo, E., 1999. Lipid digestibility and ultrastructural changes in the enterocytes of Arctic char (Salvelinus alpinus L.) fed linseed oil and soybean lecithin. Fish Physiology and Biochemistry 21, 35-44. Olsen, R.E., Myklebust, R., Ringo, E., Mayhew, T.M., 2000. The influences of dietary linseed oil and saturated fatty acids on caecal enterocytes in Arctic char (Salvelinus alpinus L.): a quantitative ultrastructural study. Fish Physiology and Biochemistry 22, 207-216. Olsen, R.E., Dragnes, B.T., Myklebust, R., Ringo, E., 2003. Effect of soybean oil and soybean lecithin on intestinal lipid composition and lipid droplet accumulation of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss Walbaum. Fish Physiology and Biochemistry 29, 181-192. Oxley, A., Tocher, D.R., Torstensen, B.E., Olsen, R.E., 2005a. Fatty acid utilisation and metabolism in caecal enterocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed dietary fish or copepod oil. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids 1737, 119-129. Oxley, A., Torstensen, B.E., Rustan, A.C., Olsen, R.E., 2005b. Enzyme activities of intestinal triacylglycerol and phosphatidylcholine biosynthesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 141, 77-87. Oxley, A., Jutfelt, F., Sundell, K., Olsen, R.E., 2007. Sn-2-monoacylglycerol, not glycerol, is preferentially utilised for triacylglycerol and phosphatidylcholine biosynthesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) intestine. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 146, 115-123. Tocher, D.R., Bendiksen, E.A., Campbell, P.J., Bell, J.G., 2008. The role of phospholipids in nutrition and metabolism of teleost fish. Aquaculture 280, 21-34. Vårens kurs i regi av Akvaveterinærenes forening og Tekna Fiskehelseforeningen Stress og fiskevelferd, hvordan kan vi forbedre dette i produksjonen? 24.-25. april, Quality Airport Hotell Gardermoen Kursinnhold Kurset gir en innføring i hva som mener med velferd, stress og adferd generelt og hvordan stress påvirker fiskevelferden i produksjonen. Det blir lagt vekt på velferd på viktige områder som avlusing, vaksinering, transport, slakting og fôring. Samt hvordan slaktekvaliteten påvirkes av stress. Det legges opp til en paneldebatt på slutten av kurset, der viktige offentlige aktører, samt private skal diskutere problemstillinger rundt stress og velferd i dagens produksjon. Målsetting Sette fokus på hvordan stress og velferd, påvirker hele produksjonen. Målgruppe Fiskehelseveterinærer, fiskehelsebiologer og andre som jobber med fiskehelse, samt forvaltningen og oppdrettsaktører som jobber med velferd i produksjonen. www.tekna.no/fiskehelse www.vetnet.vo 11
12
A focus on fish gut health Charles McGurk BVMS, MSc, PhD, MRCVS Skretting ARC, Sjøhagen 15, Postboks 319 Sentrum, 4002 Stavanger charles.mcgurk@skretting.com Charles McGurk is a research veterinarian based at Skrettin g ARC, Stavanger, Norway. He has a strong re search focus on gut health, functional feeds and coordinates the global Skretting Fish Health Network. After graduating from Glasgow University Veterinary School in 1994, Charles worked in mixed species veterinary practice for 6 years before undertaking an MSc at Stirling University on Aquatic Veterinary Studies. There after, he continued at the Institute of Aquaculture on PhD and post-doc projects in addition to acting as MSc module director for pathology. Charles joined the Fish Health Depart ment of ARC in 2007. As the primary interface between food and fish, the gastrointestinal tract is naturally of immense relevance to a global aquaculture nutrition company such as Skretting. Many measurement criteria to assess gut functionality have been developed and optimised over the years by Skretting ARC in Norway, where the company s research and development activities are coordinated. Recently, novel cutting edge methodologies have been developed in-house at ARC to complement the already extensive list of analyses. Approaches such as quantitative histology and microbiota analysis also have the potential to give valuable insights into other fish defence systems such the gills and skin. It is clear that severe damage to the guts of fish would lead to immediate clinical signs that would be easily recognised on farm. Such syndromes (often of infectious origin) are common place in other production animal sectors (such as pigs & poultry) but are refresh- Figure 1: Charles McGurk conducts quantitative histological appraisal of fish guts using the image analysis system at Skretting ARC. ingly some what rare r in cultured fish species, although there are some still key diseases such as rainbow trout gastro enteritis and enteric red mouth to contend with. However, there is no room for complacency, as the gut is just as much a crucial and sensitive organ in fish as land animals. Skretting ARC dedicates many resources in optimising gut health and functionality assessments to ensure optimal utilisation of feed. But beyon d wellestablished methods, there has been demand for additional approaches to not only ensure that the gut is not compromised in any way but to gauge positive gut health indicators. As well as being the focus of digestive and absorptive processes, the intestine also represents a massive surface area for potential infection to take hold. Such pathogens whether virus, bacterial or parasitic could also pass through the gut wall and find their way to other target organs. Therefore, the immune mechanisms in the intestine (alongside the skin and gills) should be considered as a first line defence. It has been shown that non-specific or innate immunity is fundamental in protecting fish, and these mechanisms are particularly suited to modification by in-feed immunomodulators. Skretting ARC has focused on developing the understanding and quantification of the dynamic relationship between feed and the digestive tract. For several years, Skretting ARC has been focusing on increasing the power of gut assessment approaches. The examination of specially stained thin slices of tissue using microscopes has been a key approach for a wide range health assessments, spanning multiple organ systems. Of course, such histological methods are essential for diagnosis of disease by specialist pathologists, but can also be used to pick out subtle changes in tissue structure which might well be beneficial to the host. As it is notoriously demanding and potentially inconsistent for human operators to make subjective histological scoring, 13
various semi-quantitative morphometric scales have previously been documented. However, the highly laborious nature of this approach has often limited its application to relatively small-scale specialist research studies. Over the last years, Skretting ARC has through collaborations with academic institutes such as the University of Stirling - been developing methods of refining and increasing the capacity of quantitative gut app raisal. Research projects at Stirling involving funding of two doctorate students have focused on the development and subsequent application of quantitative histology methods in appraising not only gut samples but also gills. It is now possible to take measurements of important characteristics of the tissue structure that can be used to make some conclusions on the functionality. At the recent conference of the European Association of Fish Pathologists, PhD student Polyana da Silva presented a validation study that was conducted at ARC s Lerang research station in Norway. In this trial, the novel method successfully measured experimentally elicited inflammatory changes in salmon intestines. Previously, this type of assessment involved labour intensive examinations to be carried out by highly trained personnel. Not only can the new approach increase the throughput of analysis but it can mitigate some of the variation that can be seen between different pathologists because of its previously subjective nature. Skretting ARC has also invested in state-of-the-art histology equipment at its headquarters in Stavanger. A high resolution histology slide scanner allows digitisation of micro scope slides. This is a great advance on the more traditional method of using a camera-on-microscope combination and allows generation of masses of data with relatively little user input. This approach is now regularly used in human medical facilities to allow highly specialised pathologists to examine pathological samples from patients anywhere in the world. ARC is pioneering the use of the technology in fish health and nutrition research. In addition, customised image analysis software is used to extract quantitative data from tissue sections. This refinement of the Stirling approach has allowed previously undetectable differences in gut structures to be found. A newly deve loped diet has been shown to reduce subclinical changes in gut morphology in fish reared in water temperatures in excess of the optimal range. Of course, the potential of this approach is not limited to intestines and ARC is focusing on other key organ systems for the future. It is clear from the plethora of probiotic products marketed for human consumption that the microbes resident within the intestinal tract should be considered in any discussion of gut health. To this end, ARC has been co operating with research organisations that have developed advanced methods for assessing the range and quantity of microbiota (especially bacteria) in the guts of fish. Nume rous trials have been conducted with a measured focus on assessing the potential impact of highly sustainable diets on the gut micro environment. Comprehensive assessments of Microbalance diets have shown that replacement of dieta ry fish protein sources with vegetable proteins has no demonstrable impact on the delicate balance between lactic acid bacteria and other microbes in the gut. These studies benefitted from collaboration with other Nutreco and external research organisations in the Netherlands using cutting-edge DNA pyrosequencing techniques. Being part of Nutreco (a global agricultural feed company), allows researchers in Skretting ARC to share expertise and resources with colleagues based in various parts of the world. A Nutreco Gut Health Platform has been established with members bringing proficiency and knowledge from different animal feed sectors including aquaculture, pigs, poultry and ruminants. This approach has already proved to be very fruitful in widening the scope and potential of re search collaborations within the company while retaining a strong focus on the performance on farms. Over the years, Skretting ARC has actively contributed to the understanding and assessment of intestinal health in farmed fish. University collaborative projects have led to the development and refinement of novel quantitative appraisal methods that remove the human factor from measuring gut structural characteristics. Interaction with other Nutreco research centres has allowed ARC to attain ground-breaking insights into the stability of gut microbes of fish fed on highly sustainable low fish protein diets. The future looks bright for fish gut health as the formation of competence groups will ensure that premium research technologies that are implemented in other animal sectors will be incorporated into aquaculture research. Figure 2: (a) A histological image of the distal intestine of salmon. (b) Image analysis discriminates between specific structures, labelling them by colour classification. 14
Tarmhelse hos laks hva gjør EWOS? Asbjørn Dyrkorn Løland, produktkoordinator fiskehelse EWOS AS, Tollbodallmenningen 1B, Postboks 4 Sentrum, 5803 Bergen asbjorn.dyrkorn.loland@ewos.com mobil: 970 86 259 Tilvekst og helse er to viktige temaer hvor EWOS har et sterkt fokus og for fisken vil de to påvirke hverandre. Et godt produksjonsresultat er en direkte funksjon av fisken s helsestatus fra klekking til slakt. En feilernært fisk vil være mer utsatt for sykdom på samme måte som syk fisk vil kunne ha et annet ernæringsbehov i forhold til en frisk fisk. EWOS har et høyt fokus på tarmhelse og har i løpet av det siste tiåret drevet et intensivt forskningsprog ram samtidig med utvikling av og deltakelse i et internasjonalt FoU-nettverk. Resultatet av dette er blant annet omfattende kunnskap om hvilke bakterier som finnes i tarmflora hos laks og hvordan forholdet mellom disse påvirker appetitt, fordøyelse og næringsopptak, samt helsestatus hos fisken. I tillegg er det utviklet en rekke teknikker for å analysere tarmfloraen som for eksempel qpcr basert på 16S rrna, in vitro simulatorer og metoder basert på ex vivo undersøkelser av tarm og tarmflora. Det foregår et komplekst samspill mellom laksens tarmflora, tarmepitel og tarmens immunforsvar hvor ubalanse kan medføre redusert appetitt, redusert fordøyelse eller i verste fall sykdom og død. Gjennom forskning avdekker vi faktorer som kan påvirke eller endre tarmflora og fiskens helsestatus. Dette arbeidet har ført til utvikling av funksjonelle komponenter som positivt påvirker både tarmflora, tarmepitel og tarmens immunforsvar. Laksens tarmflora Både varmblodige og vekselvarme dyr har gjennom evolusjon utviklet et symbiotisk forhold til de bakterier som koloniserer overflaten i fordøyelseskanalen. Tarmfloraen tar seg av funksjoner som nedbryting av næringsstoffer, produksjon av vitaminer og avgiftning av mat. Viktigheten av en funksjonell tarmflora må ikke undervurderes. Studier på havabbor har vist hvordan tarmfloraen er involvert i produksjon av glykoproteiner, samt regulering, metabolisme og transport av cholesterol (Bates et al., 2006). Forsøk med sebrafisk (Danio rerio) har vist entydig hvor viktig tarmfloraen er for at alle funksjoner i tarm skal fungere optimalt (Rawls et al., 2004). I et studium ble sebrafisk med og uten steril tarm gitt samme fôr samtidig som en rekke gener ble overvåket ved hjelp av DNA micro-array teknikk. Blant annet ble gen som koder for følgende funksjoner kun aktivert hos fisk som hadde normal tarmflora; stimulering av epitelial celleproliferasjon økt nedbryting og absorpsjon av næringsstoff utvikling av immunkomponenter i tarmens slimlag stimulering av medfødt immunforsvar og stimulering av angiogenese En stabil og optimal tarmflora er vist å utøve en positiv effekt på tarmsystemet og vertens ytelse. Tarmfloraen kan legge til rette for fordøyelse og utnytting av næringsstoff samt forbedre fysiologi og immunitet (figur 1). Blant annet bidrar tarmfloraen med produksjon av essensielle aminosyrer som metionin og lysin i tillegg til kortkjedete og flyktige fettsyrer som acetat, laktat, proprionat og butyrat. Slike næringsstoffer har en høy energiverdi (20kJ/g 48kJ/g) og kan i tillegg absorberes direkte av verten. Tarmfloraen bidrar også indirekte med å redusere ph i mage som gir positiv effekt på fordøyelsesenzymer og samtidig negativ effekt på patogene bakterier som passerer gjennom tarmen (McKellep et al., 2007). Endring av denne optimale tarmfloraen kan ha en rekke effekter både i fisk og andre dyr, for eksempel tap av den normale barrierefunksjonen i tarm. Dette øker sjansen for at bakterier og endotoksiner fra tarmlumen kan trenge gjennom og infisere nærliggende vev. I tillegg kan immuntoleransen mot de kommensale bakteriene endres, og en kan også få redusert kontroll over pato 15
Figur 1. Effektene av en stabil, optimal tarmflora (modifisert fra Ewing and Cole, 1994) gene bakterier. Normalt vil en naturlig tarmflora kunne kontrollere patogene og ikke-kommensale bakterier ved hjelp av en rekke metoder, for eksempel konkurranse om bindingsseter og næringsstoff (Ewing & Cole, 1994, Ringø et al., 2003). Som fôrleverandør er det viktig for EWOS å ha god kunnskap om råvarene vi benytter i fôret. I forsøk er det observert at råvareendringer kan føre til endringer i sammensetningen av tarmfloraen. Disse endringene kan være av både positiv og negativ karakter for fisken. I denne sammenheng har EWOS lagt ned mye arbeid i utvikling av funksjonelle komponenter og studier av hvordan vi positivt kan påvirke tarmfloraen gjennom tilsetting av blant annet prebiotika i fôret, eller ved å balansere spesielt utvalgte råvarer. Her følger en kort presentasjon av noen av EWOS funksjonelle komponenter med effekt på tarmflora, hvordan disse fungerer og eksempler på hvilke effekter de har. Tarmepitel og nukleotider EWOS boost ble lansert på slutten av 90-tallet og er et av de best dokumenterte funksjonelle fiskefôr på verdensbasis. Dette er et funksjonelt fôr som inneholder blant annet rensede og balanserte nukleotider som tas opp i tarm og transporteres gjennom blodet til de av fiskens vev og organer hvor det er behov for tilskudd. Den positive effek ten av nukleotider er beskrevet hos en rekk e Figur 2. Histologisk forskjell mellom (A) fisk fôret med kontrollfôr og (B) fisk fôret med EWOS nukleotider (farget med Haematox ylin og Eosin). 16
skalldyr og mange forskjellige fiskearter i tillegg til patte dyr. I utviklingen av dette produktet så vi en svært positiv effekt på morfologisk status av tarm, og virkningen på tarmepitel er målbar positiv. Tarmmorfologien endrer seg ved variasjoner i ernæring, stress, alder og/ eller sykdom. Høyde og form på lamellene i tarmveggen anses som en direkte indikasjon på tarmens tilstand/ helse. Ved å tilsette de rensede og balanserte nukleotidene EWOS benytter i EWOS boost ser vi en signifikant positiv endring i høyden på lamellene i hele tarmen (18 24 %), noe som betyr økt tarmoverflate og dermed økt næringsopptak. Tarmflora og prebiotika I utvikling av fiskefôr er det et stadig ønske å oppnå raskere og mer effektiv tilvekst. For å oppnå dette må tarmfloraen inneholde både en viss mengde, men også en viss kvalitativ sammensetning av bakterier for å effektivisere og sikre opptak av næringsstoffer. EWOS har over lang tid brukt ressurser på å kartlegge denne balansen, og vi ser at råvareendringer også fører til endring av tarmfloraens sammensetning. For å etablere og stabilisere en optimal tarmflora har vi valgt å benytte prebiotika i flere av våre fôr på markedet. Et innledende screeningprosjekt med kartlegging av tilgjengelige prebiotiske produkters totale innhold av prebiotika, og ikke minst hvor stor andel som var aktiv og tilgjengelig for fisken, ledet frem til at EWOS prebiosal ble tatt inn i EWOS portefølje av funksjonelle komponenter. Med EWOS prebiosal har vi dokumentert i gjennomsnitt ca 10 % økt tilvekst fra 500 gram til slakt sammenlignet med standard fôr uten pre biotika. Denne effekten ser vi i over 10 individuelle forsøk utført av EWOS Innovation inkludert in vitro, karforsøk og merdforsøk. I tillegg ser vi også effekten i kundeforsøk. Prebiotika er kort beskrevet næring for bakteriene i tarm. Prebiotika kan ikke fordøyes av fisken og er derfor tilgjengelig for bakterier gjennom hele fiskens tarm. Det finnes en rekke forskjellige prebiotika med noe forskjellig virkemåte; noen fungerer direkte som substrat for de gunstige bakteriene som finnes i tarm, mens andre fungerer både som substrat i tillegg til å ha antigenbindende egenskaper. Prebiotika har således en direkte påvirkning på tarmflora, og indirekte påvirkning på tarmepitel og immunologiske komponenter i tarm. Immunforsvar og immunstimulanter Tarmen er en del av fiskens overflate mot omgivel sene, og fungerer derfor som et av fiskens førstelinjeforsvar mot uønskede mikroorganismer. Omkring 70% av fisken s immunceller er lokalisert rundt fordøyelseskanalen. Under utviklingen og uttestingen av nukleotidene ble det dokumentert positiv effekt på overlevelse i forbindelse med sykdom og/eller stress. I tillegg til normal celle deling benyttes nukleotidene også av celler både i det medfødte og det spesifikke immunforsvar, men også i en rekke signalmolekyl og andre fysiologiske funksjoner. Kombinasjonen av en immunstimulant som i første omgang stimulerer cellene i det medfødte immunforsvar og nukleotidene som bidrar til raskere celledeling gav oss et nytt produkt, EWOS robust, som ble lansert våren 2011. Ved å ha et oppregulert immunforsvar i tarm vil fisken kunne bekjempe uønskede agens mer effektivt enn om patogenet selv skal aktivere forsvaret. Dette gir raskere bekjempelse, og mindre risiko for å utvikle sykdom. Et av våre seneste forsøk viser oppregulerte nivåer av spesifikke cytokiner etter fôring med EWOS robust. Dette er signalmolekyl som er viktig i forbindelse med aktivering av blant annet det medfødte immunforsvar. I tillegg har vi sett svært gode effekter mot både lus og bakterier. Tarmens helse og funksjonalitet er et viktig utgangspunkt for å få maksimal utnyttelse av laksen sitt vekstpotensial, og ved å kombinere et solid vekstfôr sammen med de nevnte funksjonelle komponenter legger vi til rette for å oppnå optimal helse, ytelse og vekst. Knowledge makes the difference Kunnskap om laksens ernæringsbehov, biologi, tarmhelse og fiskehelse generelt er grunnlaget for at EWOS skal fortsette å tilby verdens beste fôr til oppdrettsbransjen. EWOS vil opprettholde sitt høye fokus på tarmhelse slik at vi kan bistå næringen og fortsatt være det tryggeste valget for høy ytelse i oppdrett. 17
Les mer om tarmhelse her Ewing W., Cole D. (1994). The gastrointestinal tract. In: The living gut. 10-28. Nottingham University Press. Peng Li, Delbert M. Gatlin III (2006). Nucleotide nutrition in fish: Current knowledge and future applications. Aquaculture, vol 251, 141-152 Rawls J.F., Samuel B.S, Gordon J.I. (2004). Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionary conserved responses to the gut microbiota. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 4596 4601 Ringø, E., Olsen, R.E., Mayhew, T.M., Myklebust, R. (2003). Electron microscopy of the intestinal microflora of fish. Aquaculture, 227, 395-415 Sukanta K. Nayak (2010). Review article; Role of gastrointestinal microbiota in fish. Aquaculture Research, 1-21 Tekna Havbruk noe for deg? Tekna Havbruk er en faggruppe i Tekna som engasjerer seg i samfunnsspørsmål innenfor havbruk og oppdrettsnæringen. De jobber for økt rekruttering til bransjen og for å fremme forskning og utvikling for å sikre bærekraft. Tekna Havbruk ønsker å skape en tverrfaglig møteplass for nettverksbygging og for å være en arena for faglig utvikling gjennom arrangementer. Medlemskap i gruppen er åpent for alle Tekna-medlemmer som er interessert eller jobber innenfor havbruk eller oppdrett. Medlemskapet er gratis. SMS-innmelding: Send en SMS til 2007 med kodeord havbruk www.tekna.no/havbruk 18
Probiotika en alternativ innfalls vinkel for sykdomskontroll: Myte eller realitet? Viswanath Kiron* og Kjetil Korsnes Fakultet for Biovitenskap og Akvakultur, Universitetet i Nordland, Postboks 1490, 8049 Bodø *kvi@uin.no Begrepet probiotika kommer fra det greske språk, og betyr pro-liv siden probiotiske mikroorganismer betraktes å gi liv i form av bedre helse. I human ernæring er derfor probiotka knyttet til bruk av levende mikroorganismer gitt gjennom dietten, i den hensikt å oppnå en helsegevinst. Med tanke på sykdomsproblemene i fiskeoppdrett, er det naturlig å vurdere anvendelse av probiotika også her. Men hvor langt er vi egentlig kommet? Erfaringer fra human ernæring I human ernæring er probiotisk mat også betraktet som funksjonell mat (functional food) dersom det kan gi en positiv effekt utover den rent ernæringsmessige. Mikroorganismer tilsatt dietten kan være fordelaktige ved å bedre helsestatusen og dermed redusere risiko for sykdom. Dette kan oppnås ved at immunsystemet vårt stimuleres gjennom slimhinnene i tarmen, der probiotiske mikroorganismer kan påvirke både sammensetningen og balansen av probionter. Det finnes derfor en rekke ulike produkter på markedet i dag som bruker ulike bakterier for å oppnå dette. Slike kommersielt tilgjengelige produkter benytter derfor et tilstrekkelig antall av spesifikke levende mikroorgansimer for å påvirke tarm floraen på fordelaktig måte. Våre matvaner og livsstil har endret seg mye de siste femti år, noe som har medført økende helseproblemer knyttet til tarm- og immunsystemet. I dag er det vanlig med matallergier, autoimmune- og inflammatoriske sykdommer. I tillegg har bedre hygiene, vaksinering og antibakterielle behandlinger ført til en dramatisk lavere sannsynlighet for naturlig stimulering fra mikrober. Vi vet at immunsystemet blir stimulert når det blir eksponert mot mikroorganismer. De nyttige mikroorganismene som er en del av en sunn tarmflora eller som betraktes som probiotiske, tyder på at tarmens forsvarsmekanismer omfatter immun ekskludering, eliminering og regulering. Logikken bak dette er at mikroorganismer produserer antibakterielle substanser, endrer tarmens mikro bielle økologi, gjør tarmens slimhinner mer robust og styrker immun homeostasen. Sykdomsfremkallende mikroorganismer blir eliminert når det uspesifikke immunsystemet responderer på tilstedeværelsen av probiotiske bakterier. Probiotika er effektiv i behandlingen av sykdommer som diaré, lindring av tarmbetennelse og for å unngå hypersensitivitet (allergi) i tarmen. Dette gjør at behandlingspotensialet er anerkjent i dag. Det er derfor logisk at dette også kan gjelde når verten ikke er et menneske, men en fisk. Bekjempelse av sykdom i akvakultur alternative metoder Det å finne alternativer til medikamentell behandling for fisk er et prioritert område innenfor akvakulturforskningen. I den sammenheng er bruk av probiotika betraktet som en ny innfallsvinkel for å redusere sykdomsproblemer hos oppdrettsfisk. Hovedsakelig har fokuset vært på bruk av probiotiske bakterier tilsatt vannmiljøet for å hindre fremvekst av sykdomsfremkallende mikroorganismer, eksempelvis i klekkerier. Når dette brukes på anleggene, vil en kunne øke nedbryting av organisk materiale, redusere mengden nitrogen og fosfor og kontrollere ammoniakk og nitritt. Brukt i fiskens diett, vil en kunne oppnå både ernærings- og immunologiske effekter. Siden probiotika her har dobbel anvendelse (miljø og tarm), er flere arter av mikroorganismer i betraktning her sammenlignet med bruk på landlevende dyr. Probiotiske bakterier tiltenkt anvendelse i akvakultur er vanligvis klassifisert i følgende grupper: Bacilli, Actinobacteria og tre klasser av Proteobacteria (alfa-, beta- og gamma-). I 19
denne artikkelen er fokuset på fiskehelse hvordan påvirker probiotiske organismer fiskens fysiologi og gjør den bedre i stand til å unngå sykdom? Dominerende probiotiske arter Probiotika for mennesker og landlevende dyr er vanligvis Gram-positive obligate fakultative anaerobe, og for det meste melkesyrebakterier. Til bruk for mennesker dominerer flere kjente probiotiske arter av Lactobacillus og Bifidobacterium. I motsetning i landlevende dyr, er fiskens tarmflora i stor grad påvirket av det ytre miljøet (vann-). Fisken er i tillegg vekselvarm og sammensetningen av tarmfloraen svært ulik den en finner hos landlevende dyr. Gram-negative fakultativ anaerobe bakte rier er den gruppen som mest er assosiert med tarmfloraen til fisk. En skal også merke seg at effektive probiotika for akvatiske dyr kan være ulik de for landlevende dyr. Likevel, flere stammer av Lactobacillus arter er funnet å være effektive for å oppnå beskyttelse i fisk. Andre nyttige organismer som er testet på fisk omfatter bakterie arter som Bacillus, Vibrio, Pseudomonas, Carnobacterium og Aeromonas. De fleste forsøk er gjort i ferskvann med doser fra 10 6 til 10 8 CFU/g (kolonidannende enheter pr gram), med fôring fra to til fire uker. Flere fiskearter er funnet å få økt beskyttelse mot sykdom ved bruk av probiotika, blant annet mot sykdommer som furunkulose, edwardisellose, streptococcose, infeksjon fra iridovirus og parasitt infeksjon med ichthyophthiriasis (encellet parasitt). Figur 1 oppsummerer bruk av ulike probionter til terapeutisk behandling mot vanlige bakterielle sykdommer hos fisk. I tillegg til å distribuere probiotika gjennom dietten, kan en også gi fiskelarver dette bioinnkapslet gjennom levendefôret. Slik bruk har gitt økt overlevelse på fisken i oppdrettsanlegg. En skal merke seg at beskyttende effekt er ofte oppnådd gjennom immunstimulering og konkurranse inhibering, men bevis for dette er bare vist i noen få rapporter. Det er kjent at mage- og tarmkanalen er en viktig infeksjonsrute hos fisk. Derfor er den viktigste rollen for probiotiske organismer å beskytte tarmens slimhinnebarriere mot sykdomsfremkallende organismer. Likevel, det er nødvendig å utføre flere omfattende studier for å bekrefte effekten av probiotika. Figur 1. Probiotisk behandling mot vanlige bakterielle sykdommer hos fisk. Informasjonen er satt sammen fra flere internasjonale studier. Er de virkelig probiotiske? Som tidligere understreket, flere av de probiotiske bakteriene som er blitt testet på fisk har sitt opphav fra bruk på mennesker og landlevende dyr. Dette er den enkleste innfallsmåten, siden det finnes en rekke rimelige probiotiske produkter kommersielt tilgjengelig. Bruken av disse i akvakultur er kanskje ikke ideelt, siden det er sannsynlig at disse mikroorganismene ikke er egnet i et akvatisk miljø. Derfor kreves det grunnleggende forskning og feltutprøving for å utvikle egnede probiotika for akvatiske dyr. Videre må probiotiske produkter ha strenge kvalitetskrav, slik at de påståtte egenskapene kan reproduseres. En systematisk vei må følges når en utvikler probiotika, noe som er skissert i Figur 2. Viktige trinn er: Isolering, identifisering, karakterisering og testing ved kontrollerte forsøk. Den beste måten vil være å isolere en potensiell probiont fra verten selv (f. eks. fiskearten en ønsker å beskytte). Det vil redusere risikoen for at den isolerte probionten kan være uegnet på et senere tidspunkt. Dersom probiotiske bakterier er isolert fra fiskens tarm, så er de sannsynlig at de også har ph og galle toleranse og vil overleve i tarmen. I identifiseringstrinnet er det viktig at konvensjonelle mikrobiologiske verktøy også støttes av mer sensitive molekylære metoder. Identifisering basert på fenotype, vekst, fermenteringsprofil 20