Fosfolipaser, identifikasjon av intracellulære signaliseringsdomener og integrering av multiple signal! Introduksjon! Intra/inter-cellulære lipid sek. budbringere! Fosfolipase A2! Fosfolipase C og D! Sfingomyelinase! Cellulære responser regulert av lipid sek. budbringere! Integrering av multiple signal! Intracellulære signaliseringsdomener
Introduksjon! Membran fosfolipider viktig lager for lipid sekundære budbringere i ustimulerte celler! Membran fosfolipider omfatter fosfolipider (PI, PE, PC) og sfingomyelin! Produksjon av lipid sekundære budbringere reguleres av fosfolipase A2, C og D; og sfingomyelinase! Prinsipielt to typer sek. budbringere: -lipid-derivater -forskjellige fosforyleringsformer av PI utført av lipid kinaser (f.ex. PI-3K, PI-4K)
Intra/inter-cellulære lipid sek. budbringere! Intercellulære lipid budbringere: -plateaktiverende faktor (PAF) -lysofosfatidic acid (LPA) -eicosanoider (parakrin mekanisme)! Intracellulære lipid budbringere -fosfatidylinositol fosfat (PIPs) -diacylglycerol (DAG) -ceramid -eicosanoider (autokrin mekanisme)! Enzymer involvert: -PLA2, PI-PLC, PLD, SMase, PI-kinaser
Fosfolipase A2! frigjør umettede fettsyrer fra sn-2-posisjon i membran fosfolipider, regulerer produksjon av lyso-fosfolipid og umettede fettsyrer! umettede fettsyrer omsettes momentant til eicosanoider via bl.a. cyclooksygenaser og lipoksygenaser! 11 forskjellige typer PLA2 enzymer, kan deles inn i tre grupper: -sekretoriske PLA2 -cytosoliske, calsiumavhengige PLA2 -cytosoliske, calsiumuavhengige PLA2! 3 PLA2-enzymer involvert i cellulær signalisering: gruppe IIA, IV og V
! Funksjon: -de/re-acylering av membr. fosfolipider -eicosanoid, lpc-produksjon: prostaglandiner, leukotriener, lysofosfatid-syre (LPA)! Regulering av signaliserings PLA2 enzymer: -sekretoriske: sekresjon, substrattilgang -cytosoliske: økning i intracellulær Ca2+, fosforylering (ser 505, 727), PIP2 (Huwiler et al, 2000)! Cellulære responser: -inflammasjon -proliferasjon -genregulering (NF-κB)
Fosfolipase C og D! fosfatidyl-spesifikk fosfolipase C, PI-PLC spalter PI i diacylglycerol (DAG) og inositol 3-fosfat (IP3)! PI-PLC, hovedsaklig 3 former, men flere versjoner av hver form: -PLC-β β (4) -PLC-δ δ (4) -PLC-γ γ (2)! regulert via heterotrimere G-protein (β) eller reseptor tyr kinaser (γ)! fosfolipase D, PLD, substrat er fosfatidylcholin PC! to mammalske PLD klonet, PLD1 og PLD2! regulering: PLC eller PKC, heterotrimere/monomere G- prot (rho)
Sfingomyelinase! substrat sfingomyelin (SM), primært i ytre del av plasmamembranen, indre distinkte forekomster spesielt i lysosom, endosom! SM! ceramid! sfingosin! sfingosin 1 fosfat! SMase-typer: 3 -membranassosiert, Mg 2+ -avhengig, nøytral -sur SMase lysosom/endosom -cytosolisk, Mg 2+ -uavhengig, nøytral! SM stimuleres av: TNF, IL1β, γ-ifn, NGF, DAG (PLC)! cer stimulerer: CAPK, raf! MEK, MAPK, cpla2 (Huwiler et al., FASEB J, 2000)
Cellulære responser regulert av lipid sek. budbringere! Arachidonyl-deriverte eicosanoider, LTB 4, PGE 2, HETEs etc. samt LPA og PAF virker via distinkte trimere G- protein-koblede reseptorer! aktivering av disse reseptorer initierer intracellulære kinase-kaskader som omfatter PKC, MAPK,... etc.! PI sentralt reguleringspunkt i intracellulære signalresponser ved at forskjellige fosforyleringsformer utført av PI-kinaser regulerer kons av membranens innhold av PIP, PIP 2, PIP 3! PIP2 viktig som substrat for PI-PLC, PI-3K og som regulator av cpla2 membranassosiasjon! biologiske responser regulert av lipid sek. budbringere og PIPs, se fig.
Integrering av multiple signal! reseptorer kan vekselvirke med flere forskjellige effektormolekyler i celler, eks. EGFR kan indusere Ras/MAPK pathway og parallelt aktivere PIP 2 via PLC-γ! forskjellige reseptorproteiner kan vekselvirke med forskjellige G-proteiner i forskjellige celler, noe som fører til ulike responser, eks: Gα og Gβγ (PI-3K) påvirker hver sine intracellulære signalveier! TNF/IL1-b indusert aktivering av transkripsjonsfaktor NF-kB er avhengig av PLA2-mediert signalisering
Intracellulære signaliseringsdomener! overføring av ekstracellulære signal til intracellelære responser er basert på reseptor-indusert rekruttering og samvirking av proteiner i signaliseringskomplekser på innsida av plasmamembranen! protein/protein og protein/lipid vekselvirkninger er viktig i denne prosessen! identifisering av lipidkomponenter som vekselvirker med proteiner er mulig ved hjelp av fluorescensproteiner (GFP)! GFP-merking av intracellulære proteinbindende domener har indentifisert 3 domener: -PH domener; plekstrin homology domain, gjenkj. IPs -FYVE dom.; cys-rike moduler sikrer interaksjon med PI-3P -START dom., lipid-bindende domener involvert i cholesterol og PC transport