PCR-BASERT DNA-FINGERPRINTING Hensikt Hensikten med forsøket er å få en grunnleggende forståelse av PCR, se hvordan denne teknikken kan brukes til å lage genetiske fingeravtrykk (DNA-profiler) til benyttelse i rettsmedisinske undersøkelser. Bakgrunn I arvematerialet vårt (DNA) er det enkelte områder som varierer mye mellom ulike personer. Ved å undersøke mange slike variable områder (kalt DNA-polymorfismer) kan man bestemme en persons genetiske fingeravtrykk (DNA-profil). Dette brukes blant annet i rettsmedisinske undersøkelser, til slektskaps- og farskapsanalyser og i studier av genetiske forhold rundt ulike sykdommer. PCR (polymerase chain reaction) er teknikken som brukes i rettsmedisinske DNA-analyser fordi metoden er rask og krever meget små mengder DNA. Figuren til høyre viser hvordan PCR brukes til DNA-analyser i straffesaker. I dette forsøket løser elevene en kriminalsak ved å fremstille genetiske fingeravtrykk for fire mistenkte personer ved bruk av PCR. Deretter benyttes elektroforese til å sammenlikne disse med DNA-profilen til biologiske spor funnet på åstedet. Aktuelle læringsmål Biologi 2, bioteknologi. Gjør greie for fremstilling av genetiske fingeravtrykk, og hvordan de kan brukes i rettsmedisin og i studier av slektskap mellom individer og grupper av organismer. Teknologi og forskningslære 1, Teknologi, naturvitenskap og samfunn. Beskriv prinsipper og virkemåte for noen moderne instrumenter i industri, helsevesen eller forskning, og gjør rede for nytten og eventuelle skadevirkninger.
LÆRERNOTATER Utstyr Medfølgende innhold: PCR EdvoBeads, konsentrert primer mix, TE-buffer, DNA-templat (4 ulike), 200 bp DNA-standard, agarose, konsentrert elektroforesebuffer (50x TAE), 10x Gel loading solution, konsentrert FlashBlue DNA-farge (25x), 0,5 ml mikrosentrifugerør, 0,2 ml PCR-rør, vokskuler. Forsøkssettet inneholder materialer til 5 elevgrupper (totalt 25 PCR-reaksjoner). Oppbevaring: Se tabellen under for oppbevaring av de ulike reagensene. Øvrige komponeneter oppbevares ved romtemperatur. Rør Innhold Oppbevaring A Rør med PCR EdvoBeads (dntp mix, Taq DNA polymerase-buffer, Taq DNA Romtemperatur polymerase, MgCl2) B Konsentrert primer-mix - 20 C C 200 bp DNA-standard - 20 C D DNA-templat #1-20 C E DNA-templat #2-20 C F DNA-templat #3-20 C G DNA-templat #4-20 C H TE-buffer - 20 C Nødvendig tilleggsutstyr (foreslåtte varenumre i parentes): mikropipetter (014405) og pipettespisser (014431), PCR-maskin (544200), elektroforesekar (544150/544160/544165), spenningskilde (544122/544124), erlenmeyerkolbe 250 ml (007910), målesylindre (011820, 011821, 011824)/ pipettefyller og pipetter (015330, 014084),deionisert vann (890300-6), is/ kjølespann (067600). Anbefalt tilleggsutstyr (foreslåtte varenumre i parentes): Hansker (086046-49), mikrosentrifuge (067700), vannbad (066600)/termostatblokk (066670), lysplate (544420). Forberedelser Del 1: PCR-amplifikasjon Alikvotering av PCR EdvoBeads 1. Overfør en PCR EdvoBead til hvert 0,2 ml PCR-rør, fem rør til hver elevgruppe. Fortynning og alikvotering av primer-mix 1. Tin den konsentrerte primer-mixen (rør B) og TE-buffer (rør H) på is eller i kjølespann. 2. Tilsett 1 ml TE-buffer til røret med konsentrert primer-mix, sett på korken igjen, og bland godt. 3. Alikvoter 120 µl primer-mix i 0,5 ml mikrosentrifugerør merket «P», ett rør til hver elevgruppe. Alikvotering av DNA-templat Forsøkssettet inneholder fire ulike DNA-templater (rør D, E, F og G) som tilsvarer DNA fra fire mistenkte personer. Ett av de fire templatene (hvilket er valgfritt) brukes også som DNA fra åstedet. For at det forventede resultatet skal være likt gelbildet og resultatforklaringen senere i denne
veiledningen bruker du DNA-templat #2 som åsteds-dna. Alternativt kan de ulike elevgruppene få utdelt forskjellig DNA-templat som åsteds-dna slik at gjerningsmannen varierer mellom elevgruppene. 1. Tin DNA-templatene på is eller i kjølespann. 2. Alikvoter 7 µl av DNA-templatene #1, #2, #3 og #4 i 0,5 ml mikrosentrifugerør merket hhv. «DNA #1», «DNA #2», «DNA #3» og «DNA #4». Dette tilsvarer DNA-prøvene fra de fire mistenkte personene, hver elevgruppe skal ha ett rør av hver type. 3. Alikvoter 7 µl åsteds-dna (velg DNA-templat #1, #2, #3 eller #4) i 0,5 ml mikrosentrifugerør merket «DNA Å», ett rør til hver elevgruppe. Alikvotering av 10x gel loading solution Alikvoter 50 µl 10x gel loading solution i 0,5 ml mikrosentrifugerør merket 10x GLS, ett rør til hver elevgruppe. I Tabell 2 nederst på siden finner du reagensene hver elevgruppe trenger. Programmering av PCR-maskinen PCR-maskinen programmeres som beskrevet i punkt 4 i delen «PCR-amplifikasjon» i elevveiledningen. Programmet ligger allerede lagret på PCR-maskinen Edvocycler fra Edvotek under navnet 371. Skru på maskinen og velg program før PCR-reaksjonene settes i maskinen, lokket lukkes og programmet startes. Del 2: Elektroforese Støping av agarosegeler Agarosegelene kan støpes på forhånd for å korte ned forsøkstiden. Ferdigstøpte geler kan forsegles med plastfolie og oppbevares i kjøleskap i inntil 1-2 uker. Elektroforese-bufferen (TAE) og FlashBluefargeløsningen kan også fortynnes på forhånd. Alikvotering av 200 bp DNA-standard På hver gel skal 30 µl 200 bp DNA-standard appliseres i en av brønnene for at man skal kunne bestemme størrelsen til de ulike PCR-produktene. 1. Alikvoter 30 µl 200 bp DNA-standard (rør C) i 0,5 ml mikrosentrifugerør merket «S», ett rør til hver elevgruppe. Tabell 2. Oversikt over reagenser til hver elevgruppe. Rør Innhold Antall 0,2 ml PCR-rør PCR EdvoBead 5 DNA Å 7 µl DNA isolert fra åstedet 1 DNA #1 7 µl DNA fra mistenkt 1 1 DNA #2 7 µl DNA fra mistenkt 2 1 DNA #3 7 µl DNA fra mistenkt 3 1 DNA #4 7 µl DNA fra mistenkt 4 1 P 120 µl primer-mix (fortynnet) 1 10x GLS 50 µl 10x Gel loading solution 1 S 30 µl 200 bp DNA-standard 1
Klargjøring av vannbad/termostatblokk Før elektroforesen skal DNA-standarden og PCR-prøvene inkuberes ved 50 C i 2 minutter. Sett på vannbadet/termostatblokken ca. 1 time før den skal brukes. Dersom du ikke har vannbad eller termostatblokk kan du lage et program på PCR-maskinen bestående av ett trinn som holder 50 C i f. eks. 1 time. Forsøkstid PCR: oppsett ca 30 minutter, PCR-amplifikasjon ca 70-90 minutter (eller over natt) Elektroforese: ca 45 minutter Resultatanalyse fasit Se figuren under for gelbilde med forventede resultater. DNA-profilen til mistenkt #2 er identisk med profilen til DNAet fra åstedet. Dette viser at mistenkt #2 har vært på åstedet. Man kan imidlertid ikke konkludere med at hun/han er skyldig i den kriminelle handlingen utelukkende på bakgrunn av dette. Brønn (fra venstre mot høyre): 1 200 bp DNA-standard 2 Å DNA funnet på åsted 3 #1 DNA-prøve fra mistenkt 1 4 #2 DNA-prøve fra mistenkt 2 5 #3 DNA-prøve fra mistenkt 3 6 #4 DNA-prøve fra mistenkt 4 Merk! Avhengig av hvilke PCR-betingelser som er benyttet kan man i en eller flere av prøvene se et diffust bånd med lav molekylvekt ( 200 bp). Disse båndene kalles «primer-dimerer» og er et PCRartefakt som kan ses bort fra. Andre svake bånd kan også fremkomme pga uspesifikk binding av primerne andre steder i DNA-templatet enn målsekvensen, og dermed amplifisering av disse.
ELEVVEILEDNING PCR-BASERT DNA-FINGERPRINTING Utførelse PCR-amplifikasjon 1. Merk PCR-rørene med tallene 1-5 og sett dem på is. Tilsett de ulike reagensene som oppgitt i tabellen under. Bland godt og se til at PCR EdvoBead er løst fullstendig opp. Sett hvert rør tilbake på is mens resten av reaksjonene settes opp. Husk å bytte pipettespiss for hver reagens som tilsettes. Tabell 1. Oppsett for PCR-reaksjoner. Reagens Rør 1 Rør 2 Rør 3 Rør 4 Rør 5 PCR EdvoBead (inneholder dntp mix, Taq DNA polymerase, reaksjonsbuffer og 1 1 1 1 1 MgCl2) Primermix (Forward og reverse primere) 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl DNA #1 (DNA fra mistenkt 1) 5 µl - - - - DNA #2 (DNA fra mistenkt 2) - 5 µl - - - DNA #3 (DNA fra mistenkt 3) - - 5 µl - - DNA #4 (DNA fra mistenkt 4) - - - 5 µl - DNA Å (DNA fra åstedet) - - - - 5 µl
2. Sentrifuger kort for å samle hele reaksjonsblandingen i bunnen av rørene. 3. Kun dersom PCR-maskinen ikke har oppvarmet lokk eller PCR-vannbad benyttes: legg en vokskule over reaksjonsblandingen for å hindre fordamping. Se videre beskrivelse i den engelske veiledningen. 4. Overfør rørene til PCR-maskinen og amplifiser DNA-sekvensen ved følgende program: Innledende denaturering ved 94 C i 3 min 30 sykler av følgende tre trinn: Denaturering: 94 C i 30 sekunder Annealing: 55 C i 65 sekunder Ekstensjon: 72 C i 30 sekunder Avsluttende ekstensjon ved 72 C i 4 min 5. Tilsett 5 µl 10x gel loading solution til hvert rør og bland godt. VALGFRITT STOPP-PUNKT: PCR-prøvene kan lagres ved -20 C etter amplifikasjon (eller i PCR-maskinen til neste dag dersom den er programmert til å holde 4 C etter endt program) og elektroforese kan utføres senere. Støping av 1,0 % agarosegeler 1. Sett et gelkar i støpekammeret eller forsegl karet med endestykker/tape og sett i en kam med 6 tenner (se punkt 1 i flytskjemaet). Vei inn 0,5 g agarose og overfør til en 250 ml erlenmeyerkolbe. Tilsett 1,0 ml 50x konsentrert TAE-buffer og 49,0 ml destillert (deionisert/demineralisert) vann (eller 50 ml 1x TAE-buffer). Dette er nok til 1 stk 1,0 % agarosegel. 2. Kok opp i mikrobølgeovn (høy effekt i ca 1 min). Kok opp gjentatte ganger (høy effekt i ca 25 s) til agarosen er fullstendig oppløst og løsningen er klar som vann. Roter kolben innimellom for å få en jevn agaroseløsning. Følg nøye med for å unngå at det koker over. Sjekk at det ikke er uløst agarose eller klumper i løsningen. 3. Avkjøl agaroseløsningen under rennende vann mens du roterer kolben til temperaturen er ca 60 C (når du kan holde kolben i hånden uten å brenne deg). Sett gelkaret på et horisontalt underlag og hell i agaroseløsningen. La stå til gelen har stivnet (20-30 min). Klargjøring av DNA-standarden og PCR-prøvene for elektroforese 1. Inkuber 200 bp DNA-standarden og PCR-prøvene ved 50 C i 2 minutter. 2. Avkjøl prøvene i romtemperatur. Applisering av prøvene på gelen 1. Fjern endestykkene/tapen på gelkaret og legg gelen i elektroforesekaret slik at brønnene er nærmest den negative (svarte) elektroden. Hell 1x TAE-buffer i karet til buffernivået er omtrent 5 mm over gelen. Ta kammen forsiktig ut av gelen. Se til at det er buffer i alle brønnene.
2. Sentrifuger prøvene kort eller dunk dem lett mot bordplaten for å samle hele volumet nederst i røret. Appliser DNA-standarden og PCR-prøvene i brønnene på gelen som vist i tabellen under. Pass på at du ikke stikker pipettespissen for langt ned slik at det blir hull i brønnen. Tips: dersom brønnene er vanskelige å se kan det hjelpe å legge et svart/mørkt papirark e. l. under elektroforesekaret. Tabell 2. Oversikt over prøvene på gelen. Brønn Prøve Volum 1 200 bp DNA-standard 30 µl 2 #5 (prøven fra åstedet) 30 µl 3 #1 (mistenkt 1) 30 µl 4 #2 (mistenkt 2) 30 µl 5 #3 (mistenkt 3) 30 µl 6 #4 (mistenkt 4) 30 µl Elektroforese 1. Sett lokket på elektroforesekaret og koble til spenningskilden. Kjør gelen på 70-125 V i 30-60 min. Tiden det tar å separere DNA-molekylene avhenger av spenningen og størrelsen på elektroforeseapparatet. Se Tabell 3 under for anbefalte innstillinger av elektroforeseapparatene fra Edvotek. Ikke sett spenningen høyere enn anbefalt da for høy spenning kan resultere i at gelen smelter. Når elektroforesen er i gang dannes små, synlige bobler på elektrodene, og de negativt ladete DNA-molekylene vandrer mot den positive elektroden. La fargestoffene migrere 3-4 cm vekk fra brønnene. 2. Når elektroforesen er ferdig, skrus strømmen av før lokket fjernes. Tabell 3. Anbefalte innstillinger for Edvoteks elektroforeseapparater. Tids- og spenningsangivelsene kan også brukes som retningslinjer for elektroforeseapparater av de fleste andre merker. Tid og spenning Volt M6Plus M12 og M36 Minimum/maksimum Minimum/maksimum 150 15/20 min 25/35 min 125 20/30 min 35/45 min 70 35/45 min 60/90 min 50 50/80 min 95/130 min Farging av gelen og visualisering av DNA 1. Fortynn 10 ml av 10x FlashBlue fargeløsning med 90 ml destillert vann og bland godt. Hell 75 ml av fargeløsningen (1x) over i et stort veieskip (eller annet egnet plastkar). 2. Overfør gelen forsiktig til fargekaret. Tilsett mer fargeløsning dersom gelen ikke er fullstendig dekket. La gelen ligge i fargeløsningen i 5 min. 3. Hell av fargeløsningen og tilsett 250-300 ml destillert vann. Sett avfargingskaret på et vippebrett eller vipp på karet med noen minutters mellomrom. La gelen ligge til avfarging i 20 min. Skift vannet hyppig for raskere avfarging. De mørkeblå DNA-båndene vil etter hvert bli synlige mot den lyseblå bakgrunnen.
4. Fjern gelen forsiktig fra avfargingsløsningen og legg den i en gjennomsiktig plastpose (f. eks. en ziplock-pose eller brødpose). Legg gelen på en lyskilde med hvitt lys for tydelig visualisering av DNA-båndene. Resultatet kan dokumenteres ved å ta bilde av gelen med et digitalkamera. Gelen kan oppbevares i kjøleskap i flere uker hvis den ligger i en forseglet plastpose med litt elektroforesebuffer. Laboratoriesikkerhet Bruk hansker og vask hendene godt med såpe og vann etter å ha jobbet i laboratoriet. Avfallshåndtering Geler og plastavfall kan kastes i restavfallet. Elektroforesebufferen (1x TAE-buffer) kan helles ut i vasken. Skyll godt med vann etterpå. Resultatanalyse Sammenlign DNA-profilene til de fire mistenkte (brønn 3-6) med profilen til DNAet fra åstedet (brønn 2). Kan du identifisere gjerningsmannen for den kriminelle handlingen på bakgrunn av dette?