UNIVERSITETET I BERGEN UNIVERSITY OF BERGEN FYSIOLOGISK INSTITUTT Årstadveien 19 59 BERGEN Tlf.: 55 2 6 Fax:552641 DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY Årstadveien 19 N-59 BERGEN, NORWAY Phone: 47 55 26 Fax: 47552641 Rapport: Deteksjon av intravaskulære gassbobler med uttralyd i våkne rotter etter ekskursjoner fra metningsdykk. av Linda Elin Birkhaug Stuhr Klient!Oppdragsgiver: J-de1prosj ekt- TRYKKENDRINGER (Norsk Hydro, Statoil, Saga, OD) Sainmendrag: Vi har undersøkt om boble-mengden i våkne rotter kan kvantifiseres under et simulert metningsdykk med tre innlagte ekskursjoner. i mm store ultralyd-krystaller implantert i vena cava inferior ble benyttet for å detektere gass-bobler i veneblod. Det simulerte metningsdykket fulgte følgende profil: Etter 15 min kontroll-måling ved i bar ble rotten komprimert til 1 bar (.4 bar 2,.8 bar N2, 8.8 bar He) i løpet av 15 min. Etter en 2 timers metningperiode på 1 bar ble i alt 3 identiske ekskursjoner til 12 bar (a 3 min) foretatt. Tiden mellom ekskursjonene var 4 min. Etter siste ekskursjon ble kontinuerlige målinger foretatt i 6 min. Samtlige rotter (n = 9) viste en betydelig intravaskulær boblemengde etter alle ekskursjonene. Antallet bobler var betydelig større etter ekskursjon II og III enn etter ekskursjon I. Det ble også funnet et betydelig antall bobler under ekskursjonene II og III Videre var det store individuelle variasjoner i bobleantall. Auditiv deteksjon underestimerte antall intravaskulære bobler med 35% i forhold til elektronisk deteksjon. Auditiv deteksjon av bobler var også i liten grad følsom for variasjoner i antall elektronisk detekterte bobler over tid. På bakgrunn av dette arbeidet kan man konidudere med at dyre-modellen fungerer i sin helhet. Videre er ultralyd-metoden godt egnet til å detektere bobler i våkne rotter etter ekskursjoner fra metning, selvom metoden ikke er kalibrert for bestemmelse av boblestørrelse eller eksakt bobleantall. Emneord - Norsk: Intravaskulære gassbobler Ekskursjoner Metning Ultralyd-krystaller Emneord - Engelsk: Intravascular gas bubbles Excursions Saturation Ultrasound-crystals 31.7.1994
2 INNIIOLDSFORTEGNELSE 1. INNLEDNING 3 1.1 Bakgrunn 3 1.2 Målsetning 3 side 2. METODE 4 2.lRotter 4 2.2 Ultralyd-krystaller 4 2.3 Trykkprofiler 5 2.4 Statistikk 6 3. RESULTATER 6 4. DISKUSJON 1 4.1 Metoden 1 4.2 Hørbare versus elektroniske boblesignal 1 4.3 Bobler detektert etter ekskursjoner fra metning 11 4.4 Bobler detektert under ekskursjoner fra metning 11 5. KONKLUSJONER 11 6. REFERANSER 12 7. SAMARBEIDSPARTNERE 13
3 1. INNLEDNiNG: 1.1 Bakgrunn Det er velkjent at venøse gassbobler kan påvises i dykkere under og etter dekompresjon. Vår forståelse av boble-dannelse og -transport, og boblenes biologiske effekt er ufullstendig. Dette fører til at dekompresjons-prosedyrer bedømmes ut fra kliniske kriterier på dekompresjonssykdom, noe som er en grov evaluering av et sluttresultat. Bobler kan indusere en rekke akutte symptomer avhengig av hvor boblene sitter i organismen. I enkelte vev/situasjoner eksisterer boblene uten at akutte symptomer oppstår. Slike stille bobler kan teoretisk indusere små skader i vevet som over tid kan gi funkjonsforandringer hos dykkere (Polkinghorne et al 1988, Todnem 199, Thorsen et al 199). Per i dag vet man lite om hvor mange og hvor lenge bobler frigis i vev og sirkulerer i kroppens blodårer. Det er sannsynlig at opptreden og levetiden av bobler blir endret etter flere ekskursjoner fra et metningsdyp, men dette er fortsatt ukjent. Gassbobler refiekterer ultralyd meget kraftig, og dette kan benyttes til å identifisere gassfaser i kroppen. Ekstern deteksjon av bobler med ultralyd har derfor vært den vanligste metoden for å måle bobler som passerer et karavsnitt hos dykkere og større forsøksdyr. En metode for måling av intravaskulære bobler med Doppler-probe i vene er innarbeidet på anesteserte rotter (Hope & Sundland 1992). Denne ultralyd-metoden er nå videre-utviklet ved vårt laboratorium til bruk i våkne rotter under hyperbare forhold (Hope et al 1992, Hope & Tyssebotn 1993). Små ultralyd krystaller ble implantert i nedre vena cava for uker, og kunne detektere passerende bobler etter ett eller repeterte dykk og ved ulike dekompresjons hastigheter. Både tidsforløp av bobler, antall og levetid kunne beskrives. 1.2 Målsetning - ved - Videre hjelp av ultralyd-teknikk, å måle hvor lenge etter en ekskursjon fra metning gassbobler kan detekteres i blodbanen. var det ønskelig å registrere om gjentatte ekskursjoner påvirket bobledannelsen og i hvilke tidsrom boblene eksisterer i blodbanen.
4 2. METODE: 2.1 Rotter Det ble benyttet våkne Wistar han-rotter som over en 4 ukers periode ble trent for forsøkssituasjonen med hensyn til støy og bevegelses-begrensning (Fig 1). En slik tilpasning er helt essensiell for gjennomføringen av forsøks-serien, fordi rotten da vil være ustresset og rolig under selve forsøket. Denne rotte-modellen, som er utvildet ved Fysiologisk institutt har i en årrekke gitt verdifull informasjon om det kardiovaskulære system både ved hyper og hypo-bare forhold. TRYKK-KAMMER Respira,jonsm ler (iitralyjkrystall Fig. 1. Skjematisk tegning av det eksprimentelle oppsettet med en våken rolle plassert i en plasttube i trykk-kammeret. 2.2 Ultralyd-krystaller For å måle tilstedeværelse av bobler intravaskulært, ble det benyttet ultralyd-krystaller (DBF 12A-XS, 2Hz, Chrystal Biotech, USA). Disse krystallene ble i adaptasjons-perioden (etter I uker) og under anestesi (Hypnorm-Dormikum, i mg/kg) implantert i rottens vena cava inferior (like under nyre-nivå). Ultralyd-krystallen er kun i mm i diameter og opptar derfor mindre enn 5 % av vena cavas totale overflate-areal. Man kan dermed detektere intravaskulære bobler uten å forstyrre generell sirkulasjon. Krystallens til/fraførende ledninger plasseres under huden og taes ut bak på nakken av rollen. Denne plasseringen er valgt fordi rotten da normalt ikke vil kunne bite over ledningene og derved ødelegge forsøket underveis. Selve registreringsoppsettet er bygget rundt et multifrekvent pulserende Doppler ultralydinstrument ( Alfred, Vingmed A/S, Horten, Norge eller 545C-3 Directional pulsed Doppler flowmeter, University of Iowa, Iowa, USA). I denne studien ble frekvensene 1 eller 2 MHz benyttet. Prinsippet ved ultralyd deteksjon er at når ultralyd sendes mot et bevegelig mål, så vil lydsignalene refiekteres med en annen frekvens. Frekvensforskjellen
vil være proposjonal med hastigheten av boblen, og intensiteten (amplituden) på det refiekterte signalet vil muligens kunne si noe om størrelsen på boblen (se oversikt av Brubakk et al 1982). Under forsøkene, ble signalene fra krystallen kontinuerlig overført til en båndspiller (innebygget i Alfred, Vingmed A/S, Horten, Norge eller Tandberg Instrumentation recorder series 115, Oslo, Norge). Signaler ble så skrevet ut på en Gould skriver (TA 2, Japan), for at resultatene senere skulle kunne analyseres nøyaktig. Boblesignalene kunne da detekteres som spikes. Kriteriet for boblekvantifisering var at spikes -amplituden var større enn i kontroll-situasjonen. De refiekterte signalene ble skrevet ut kontinuerlig. Dyrene ble kontinuerlig video-overvåket under forsøkene, for å registrere eventuell innflytelse av kropps-bevegelser på målingene. I tillegg ble det registrert bobler auditivt under hele forsøket, og antall auditive signaler ble senere korrelert med de elektronisk detekterte boblesignalene. 5 Fig.2. Bildet viser den 1 mm store ultralyd-krystallen, med størrelsessammenligning. 2.3 Trykkprofil ET 27 liters trykkammer ved Fysiologisk institutt ble benyttet. Rotten ble eksponert til 1 bar (.4 bar - 2.8 bar N2-8.8 bar He) i løpet av 15 min. Etter en 2 timers metningsperiode, startet den første ekskursjonen (El) fra 1 til 12 bar i løpet av i min, og rotten oppholdt seg ved 12 bar i 3 min. Dekompresjonen til 1 bar ble utført i løpet av gjennomsnittlig 4 sekund. Gassbobler ble så detektert i 4 min ved 1 bar (D1-D2), før man lot dyret gjøre en identisk ekskursjon (E2) med en identisk måleperiode. Etter en tredje ekskursjon (E3) ble boblene detektert i 1 time (D3). Oksygentensionen ble holdt konstant på o.4 bar gjennom hele forsøket. Den totale dykketid var 6.5-7 timer. Trykkprofilen for forsøkene er vist i fig. 3. De aktuelle tidene (E og D) ble valgt for å sikre en profil som ville gi ett visst minimum av bobler.
- 6 12 1 ( i.q 8 E1 E2 E3 D1 fl D2 fl D3 6 N 4 2 I I I 1 15 2 25 3 35 tid (min) Fig. 3. Bildet viser trykkprofilen som ble benyttet i denne studien. 2.4 Statistikk Sammenligning av bobleantall detektert etter ekskursjonene D2, D3) ble utført med paret Student t-test. En p-verdi lavere enn.5 ble ansett som statistisk sigmfikant. Alle gjennomsnittsverdier er angitt med standard error of the mean (SEM). (Dl, 3. RESULTATER: Det ble i alt utført 11 forsøk, hvorav 2 måtte utelukkes av varierende grunner. To timers metning på 1 bar etterfulgt av en 3 min ekskursjon til 12 bar med påfølgende hurtig dekompresjon (4 sek) tilbake til 1 bar, resulterte i en betydelig mengde intravaskulære gassbobler i alle rotteforsøkene. Fig. 4 viser eksempler på intravaskulære bobler detektert i vena cava inferior. Fig.4. Registrering av sirkulatoriske bobler målt i vena cava inferior. Papirhastighet: 5 mm/sek.
I I I I 7 Under forsøkene ble både hørbare og elektroniske bobler detektert. Av fig. 5 ser vi at dersom man kun benytter auditiv deteksjon, underestimerer man trolig det reelle antall intravaskulære bobler. I gjennomsnitt utgjorde de hørbare boblesignalene kun 35 % av de elektronisk detekterbare signalene. G) -Q G) G) G) C/] 1 5 E2 D: E: etter dekornpresjon ekskursjoner E3 D3 : G) - G) LO cl 1 o io 1 CO UD If) ( 1 Ol 2 LO IlD IC 2 cl LO 1 CD IlD Il) 2 1 I ) 1 cl UD LO If) 2 CO LO Tidsintervall (min) Fig.5. Figuren angir hørbare bobler i prosent av elektronisk detekterbare bobler under og etter ekskursjoner i metning, eksemplifisert ved visse tidsrom under forsøket. I tillegg til at de auditivt detekterte boblene trolig underestimerer det reelle antall bobler intravaskulært, ser vi av fig.6 at auditiv deteksjon av bobler bare i noen grad følger de variasjoner som over tid detekteres elektronisk. Det kan dermed synes som om auditiv deteksjon av bobler i liten grad er følsom for reelle variasjoner i antall intravaskulære bobler tid. iver
8 i elektroniske bobler hörbare bobler 9 E1 E2 D2 E3 D3 Q) 8 7 6 5 4 3 2 1 I,J/ \J I LI \LJ 135 166 26.67 237.67 278.5 39.5 37 tid (min) Fig. 6. Gjennomsnittlig antall elektroniske og hørbare boble-signaler under og etter ekskursjoner i metning. Hvert punkt representerer 5 min perioder. Arbeidet har vist et bemerkelsesverdig og uventet høyt antall boble-signaler ekskursjonene E2 og E3 (15-4 bobler/5 min, fig. 6). Der ble eksempelvis registrert flere boble-signal i de første 1 min av E2 og E3 enn i løpet av de siste 15 min av henholdsvis og D2 (fig. 6). Dl under Arbeidet har også vist at etter ekskursjoner fra metning D2, D3)) ble det detektert et stort antall intravaskulære bobler i alle måleperiodene på 4-6 min (fig. 7). (Dl,
v 5 etter ekskursjon III (Da) 6 etter ekskursjon 11(D 1) Å etter ekskursjon I (D1) error of the mean som er angitt i figurene. forskjellige måleperiodene hos rottene. Dette ser man tydelig av de relativt store Standard dekompresjon (D3), men etter denne siste ekskursjonen ble det også funnet et ekstra maksimum ( 6 bobler/5 min) senere i forløpet (mellom 3 og 4 min). Et tilsvarende maksimum ( 45 bobler/5 min) ble funnet umiddelbart etter tredje etter dekompresjonen (mellom og 15 minutter). periode mellom 2 og 3 minutter ( 3 bobler/5 min). min etter ekskursjon I (Dl)( 1-2 boblerl5 min). de første 2 minuttene etter ekskursjon II og III (D2, D3) sammenlignet med de første 2 (D1,D2,D3). Fig. 7. Gjennomsnittlig antall elektronisk detekterte boble-signal etter dekompresjonene 9 Antallet intravaskulære boble-signaler var betydelig større ( 2-5 bobler/5 min, p <.1) Etter ekskursjon I (Dl) viste registreringene at antall boble-signal nådde et maksimum i en Etter ekskursjon II (D2) ble det oppnådd et maksimum ( 45 bobler/5 min) umiddelbart Det viste seg også å være relativt store individuelle variasjoner i bobleantall under de Tid (min) 1 2 3 4 5 6 1 bo.. 4
1 4. DISKUSJON: 4.1 Metoden Sirkulatoriske bobler i vena cava inferior hos rotte ble detelctert ved hjelp av ultralyd krystaller etter og under ekskursjoner fra metning. Fordi disse krystallene er svært små (se metode), vil ikke implantasjon av disse i vena cava påvirke generell sirkulasjon. Den tekniske delen og utstyret har funksjonert tilfredsstillende. Doppler ultralyd metoden har generelt vist seg å gi meget sterke elektroniske signal fra sirkulerende bobler i vena cava. I noen få tilfeller har imidlertid kvaliteten på Doppler signalene vært noe redusert på grunn av støy. Det har vanskeliggjort evalueringen av om det er bobler til stede eller ikke. Det vil derfor være av vesentlig betydning for fremtidige forsøk å unngå støy/redusere støykildene fra omgivelsene. Det vil også være en videreutvikling av metoden å få overført Doppler signalene direkte til en computer for automatisk skåring. Det arbeides nå med å utvide metoden ved bruk av frittgående rotter med hodeplugg (jfr. o-programmets prosjekt trykkendringer, høsten -94). Å kvantifisere det eksakte antall bobler intravaskulært har vært vanskelig å gjøre, fordi vi ikke vet hvorvidt amplituden på et boblesignal indikerer en stor boble eller flere små. Det vil likevel være mulig å estimere et minimums -antall bobler, og dermed kunne si om det foreligger bobler etter en dekompresjon eller ikke. Videre er det benyttet våkne rotter, for å unngå side-effekter av anestesi på forsøksresultatene. Oksygentesjonen ble holdt konstant (o.4 bar), temperaturen i kammeret ble regulert til termonøytalt området for He, rotten arbeidet ikke (sto i ro), og hadde god væske og mat tilgang. Dette ble gjort for å unngå å variere relevante faktorer som kunne påvirke perifer sirkulasjon og inertgass-utskillelse og derfor også bobledannelse i disse forsøkene. Det er dermed trykkendringene som i seg selv har vært bestemmende for antall bobler som ble dannet etter dekompresjon. 4.2 Hørbare versus elektroniske boblesignal Forsøkene viste en betydelig underestimering av hørbare boblesignaler sammenlignet med elektroniske. Det kan skyldes at ikke alle boblesignalene oppfattes av det menneskelige øret eller at de minste boblene rett og slett ikke gir noe hørbar boblesignal. Hjelle et al (1992) konkluderer også med at de ikke er sikre på om de klarer å høre alle bobler som passerer under Doppler-målinger ved operasjonelle dykkeoperasjoner. Det vil derfor trolig være riktigere å basere seg på elektronisk bobledeteksjon i dyrestudier for å få et mer reelit bilde av antall bobler som sirkulerer i blodet etter ulike dekompresjonsprosedyrer.
4.3 Bobler detektert etter ekskursjoner fra metning: Forsøkene resulterte i bobler hos alle rottene etter dekompresjon fra metnings-ekskursjoner. Det går videre frem av resultatene at det var betydelige individuelle forskjeller når det gjaldt responsen på dekompresjon. Dette kan tyde på at enkelte individer er mer følsomme for dekompresjon og dermed for bobledannelse enn andre. Lignende observasjoner er gjort hos dykkere. I alle rotte-forsøkene fortsatte gassbobler å sirkulere 4-6 min etter dekompresjon. Det var likevel en tendens til fall i bobleantall på slutten av hver måleperiode (Dl, D2, D3, fig. 7). Det er ikke mulig på bakgrunn av disse forsøkene å si noe om hvor lenge bobler ville fortsatt å sirkulere i blodet etter en tilsvarende dekompresjon. Dette vil det derimot være ønskelig å evaluere ved fremtidige forsøk. Under metnings-dekompresjon, hvor alle kroppens vev i utgangspunktet har et partialtrykk av inertgass som er likt inspirasjonsgassen, vil vev hvor inertgass eliminasjon er langsom oppnå størst overmetning. Det er muligens nettopp disse vevenes gass-eliminasjon som gjenspeiler seg som en topp i antall boble-signal 3-4 min etter siste dekompresjon (D3, fig.7). Denne toppen i bobleantall er forsinket i tid i forhold til etter første dekompresjon (Dl, mellom 2-3 min), noe som kan tyde på at det tar lengre tid å eliminere gass fra de langsomste vevene under dekompresjon etter repeterte ekskursjoner. 11 4.4 Bobler detektert under ekskursjoner fra metning: At gassbobler dannes etter trykkfall er kjent. Derimot er det lite publisert når det gjelder tilstedeværelse av bobler under repeterte ekskursjoner fra metning. I dette arbeidet gikk det klart frem at bobler også er tilstede i betydelig grad under påfølgende ekskursjoner fra metning (E2, E3). Dette kan være et resultat av etterslep av bobler fra den foranliggende dekompresjonsperioden, jfr den relativ korte tiden på 4 min mellom ekskursjonene. 5. KONKLUSJONER: I dette arbeidet, ble det detektert gassbobler i rotter etter ekskursjoner fra metning ved hjelp av Dopplerlyd-registrering. Det viste seg å være stor diskrepans mellom antall hørbare og elektronisk detekterte bobler. A basere boblemåling kun på hørbar deteksjon av intravaskulære bobler vil trolig gi en betydelig underestimering av det reelle antall bobler i sirkulasjonen. I tillegg vil ikke hørbar deteksjon av bobler alene kunne fange opp de reelle forandringer i bobleantall som forekommer under og etter ekskursjoner fra metning. Det ble dannet et stort antall sirkulerende bobler hos rotte etter dekompresjon fra 12 til 1 bar, men også under selve ekskursjonene på 12 bar. Intravaskulære bobler ble detektert i alle måleperiodene, både under ekskursjonene (3 min) og etter ekskursjonene (4-6 min). Det var likevel store individuelle forskjeller i antall boble-signal mellom rottene. På bakgrunn av dette arbeidet kan man konidudere med at dyre-modellen fungerer i sin helhet. Videre er ultralyd-metoden godt egnet til å detektere bobler i våkne rotter etter ekskursjoner fra metning, selvom metoden ikke er kalibrert for bestemmelse av boblestørrelse eller eksakt bobleantall.
12 6. REFERANSER: Brubakk, AG., Grip, A., Holaud, B., Dawson, R., Tonjum, S. Ultrasound Doppler measurements of circulatory changes and circulating bubbies during Deep Ex II. Nutec rapport 11-82, 1982. Hjelle, J., Padbury, E.H., Thorsen, E., Kambestad, B.K. Dopplermonitorering ved en operasjonell dykkeoperasjon. Nutec rapport 51-91, 1992. Hope, A., Sundlaud, HA. Dekompresjon - Lokal sirkulasjon og gassbobler. I. Etablering av metoder for måling av intravaskulære gassbobler hos rotte. Nutec rapport 5-91, 1992. Hope, A., Bergø, G.W., Tyssebotn, I. Trykkfallsyke og gassbobler i vmcne rotter. Nutec - FUDT seminar innen dykketeknologi og dykkemedisin/fysiologi, 41-43, 1992. Hope, A., Tyssebotn, I. Intravascular gas bubbie detection by doppler ultrasound in conscious rats. XIXth Annual meeting ofeubs on diving and hyperbaric medicine, p.273, 1993. Polkinghorne, P.J., Sehmi, K., Cross, M.R., Minassian, D., Bird, A.C. Ocular fundus lesions in divers. Lancet, 1381-1383, 1988. Thorsen, E., Hjelle, J., Segadal, K., Gulsvik, A. Exercise tolerance and pulmonary gas exhange after deep saturation dives. J Appi Physiol 68, 189-1814, 199. Todnem, K. Neurological disturbances in saturation diving. Acute effects from deep diving on central and peripheral nervous system. Neurological long term health effects from occupational saturation diving. Doktorgrads avhandling, Universitetet i Bergen, 199.
13 7. SAMARBEU)SPARTNERE: Jeg vil rette en stor takk til mine samarbeidspartnere. Uten deres hjelp hadde ikke dette prosjektet latt seg gjennomføre. Forsker dr. philos. Guri W. Bergø, Universitetet i Bergen. Professor dr. med. Ingvald Tyssebotn, Universitetet i Bergen. Tekniker Birgitte Hageseter, Universitetet i Bergen. Ingeniør Finn Strand, Universitetet i Bergen. Forsker dr. philos. Arvid Hope, NUTEC. Ingeniør Harald A. Sundland, NUTEC.