COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Bestillings- COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: 21118390 123 informasjon HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: 11 1839 0 US: 83369 Tiltenkt bruk COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, versjon 1.5 (v1.5) er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1) RNA i humant plasma ved hjelp av COBAS AMPLICORanalysatoren. Testen kan kvantitere HIV-1-RNA i området 50 750 000 kopier/ml ved å bruke en kombinasjon av de to prøveprepareringsprosedyrene Standard og UltraSensitive. Testen skal brukes sammen med kliniske funn og andre laboratoriemarkører for sykdomsprogresjon i forbindelse med klinisk oppfølging av pasienter som er smittet med HIV-1. Testen kan brukes til å vurdere pasientens prognose ved å måle baseline-hiv-1-rna-nivået eller til å monitorere effekten av antiretroviral behandling ved å måle endringer i plasma-hiv-1-rna-nivået i løpet av den antiretrovirale behandlingen. HIV-1-RNA-nivå målt med polymerasekjedereaksjon (PCR) ble brukt som en av surrogatmarkørene i den akselererte FDAgodkjenningsprosessen for følgende medikamenter: proteasehemmerne INVIRASE (sakinavirmesylat), CRIXIVAN (indinavirsulfat), NORVIR (ritonavir) og FORTOVASE (sakinavir); ikke-nukleosid revers transkriptase-hemmerne VIRAMUNE (nevirapin), SUSTIVA (efavirenz) og ZIAGEN (abakavir); og for revers transkriptase-hemmeren EPIVIR (lamivudin). COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 skal ikke brukes som en screeningtest for tilstedeværelse av HIV-1 i blod eller blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av HIV-1-infeksjon. P/N: 05001668 170 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/53
Oppsummering og forklaring av testen HIV (Human Immunodeficiency Virus) er det etiologiske agenset som forårsaker AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) 1-3. HIV-infeksjon kan overføres ved seksuell kontakt, via infisert blod eller infiserte blodprodukter eller fra en infisert mor til fosteret 4. Tre til seks uker etter HIV-eksponering utvikler den smittede personen vanligvis et kortvarig akutt syndrom som kjennetegnes av influensalignende symptomer og høye nivåer av viremi i perifert blod 5-8. For de fleste smittede personer blir dette etterfulgt av en HIV-spesifikk immunreaksjon og en reduksjon i plasmaviremi, vanligvis innen fire til seks uker fra symptomstart 9,10. Etter serokonvertering vil de fleste smittede personer gå inn i en klinisk stabil, asymptomatisk fase, som kan vare i flere år 11-13. Den asymptomatiske perioden kjennetegnes av persisterende, lavt virusnivå i plasma 14 og en gradvis reduksjon av CD4 + T-lymfocytter, som fører til alvorlig immundefekt, multiple opportunistiske infeksjoner, maligniteter og død 15. Selv om virusnivået i perifert blod er relativt lavt under den asymptomatiske fasen av infeksjonen, ser virusreplikering og clearance ut til å være dynamiske prosesser der en høy aktivitet av virusproduksjon og infeksjon av CD4 + -celler balanseres av virusclearance, celledød av infiserte celler og nyproduksjon av CD4 + -celler i like stor grad, noe som fører til relativt stabile nivåer av både virus i plasma og CD4 + -celler 16-18. Kvantitative målinger av HIV-virus i det perifere blodet har vist at høyere virusnivåer kan korrelere med økt risiko for klinisk progresjon av HIV, og at reduksjon av virusnivå i plasma kan assosieres med nedsatt risiko for klinisk progresjon 19-21. Virusnivået i perifert blod kan kvantiteres ved måling av HIV p24- antigenet i serum, ved kvantitativ dyrking av HIV fra plasma, eller ved direkte måling av virus-rna i plasma ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjons- eller signalamplifikasjonsteknologier 22-26. p24-antigenet er det primære kjerneproteinet i HIV og finnes enten fritt eller bundet til anti-p24-antistoff i serum. Fritt p24-antigen kan måles med kommersielt tilgjengelige enzymimmunanalyser (EIA-tester), selv om nytteverdien av p24- antigenet som markør for virusmengde er begrenset, da antigenet kun kan påvises hos 20 % av de symptomfrie pasientene og hos 40 50 % av pasientene med symptomer. Prosedyrer for oppsplitting av antigen-antistoff-komplekser forbedrer sensitiviteten til p24-antigentestene, men virusproteinet kan fortsatt ikke påvises hos de fleste symptomfrie pasientene 22. Infeksiøst HIV i plasma kan dyrkes ved inokulasjon i aktiverte perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra normale donorer. Kvantitering oppnås ved inokulering av PBMC med serielle fortynninger av plasmaprøven. Kvantitativ dyrkning har begrenset nytteverdi til monitorering av virusnivåer hos smittede personer, da kun en liten andel av viruspartiklene er infeksiøse in vitro. Infeksiøst virus kan ofte ikke påvises hos symptomfrie individer 22. HIV-RNA i plasma kan kvantiteres ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjon, som for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR) 27-29. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 bruker PCR-teknologi for å oppnå maksimal sensitivitet og dynamisk område for kvantitativ påvisning av HIV-1-RNA i plasma antikoagulert med EDTA eller ACD 24. 2/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Testprinsipper COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 er basert på fem hovedprosesser: prøvepreparering, revers transkripsjon av mål-rna for å generere komplementært DNA (cdna) 30 ; PCR-amplifikasjon 30 av mål-cdna ved hjelp av HIV-1-spesifikke komplementære primere, hybridisering av de amplifiserte produktene til oligonukleotidprober som er målspesifikke, samt deteksjon av probebundete amplifiserte produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 muliggjør samtidig revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon av HIV-1 og HIV-1-kvantiteringsstandard- RNA. Master Mix-reagenset inneholder et primerpar som er spesifikt for både HIV-1-RNA og HIV-1-kvantiteringsstandard-RNA, og det er utviklet for å sikre en likeverdig kvantitering av gruppe M-subtypene av HIV-1. Testens ytelseskarakteristika for gruppe O-prøver er ikke bestemt. Kvantiteringen av HIV-1-RNA-virus utføres ved hjelp av HIV-1-kvantiteringsstandarden. HIV-1-kvantiteringsstandarden er et ikke-infeksiøst RNA-transkript som inneholder identiske primerbindingsregioner som mål-hiv-1-rna, og en unik probebindingsregion som gjør det mulig å skille kvantiteringsstandardamplicon fra HIV-1-amplicon. Et kjent kopiantall av HCV-kvantiteringsstandarden tilsettes i hver individuelle prøve og blir ført gjennom trinnene med prøvepreparering, revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon, hybridisering og deteksjon sammen med mål- HIV-1 og amplifiseres sammen med mål-hiv-1. COBAS AMPLICORanalysatoren beregner HIV-1-RNA-nivåene i testprøvene ved å sammenligne HIV-1-signalene med kvantiteringsstandardsignalene for hver prøve. Kvantiteringsstandarden kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer amplifikasjonsprosessen slik at kvantiteringen av HIV-1-RNA blir korrekt i hver prøve. Prøvepreparering COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 kan utføres med to alternative prøveprepareringsprosedyrer, Standard- eller UltraSensitive-prosedyren. I Standardprøveprepareringsprosedyren isoleres HIV-1-RNA direkte fra serum eller plasma ved lysering av viruspartikler med et kaotropisk stoff etterfulgt av presipitering av RNA med alkohol. I UltraSensitive-prøveprepareringsprosedyren oppkonsentreres først HIV-1-viruspartiklene i plasma ved hjelp av høyhastighetssentrifugering etterfulgt av lysering av viruspartiklene med et kaotropisk stoff og presipitering av HIV-1-RNA med alkohol. Et kjent antall kvantiteringsstandard-rna-molekyler tilsettes hver prøve sammen med lyseringsreagenset. HIV-1-kvantiteringsstandarden medføres gjennom preparering av prøver, revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon, og den brukes for kvantitering av HIV-1-RNA i testprøven. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/53
Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon Valg av mål Valg av mål-rna-sekvens for HIV-1 avhenger av identifikasjon av regioner i HIV-1-genomet som viser maksimal sekvenskonservering. Derfor er riktig valg av primere og probe avgjørende for testens evne til å påvise HIV-1-genotypen. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 bruker primerne SK145 og SKCC1B til å definere en sekvens på 155 nukleotider innen den høykonserverte regionen i HIV-1 gag-genet 31. Gag-regionen koder for de gruppespesifikke antigenene eller kjernestrukturproteiner i virionet. HIV-1-gaggenene har vanligvis en lengde på 1500 nukleotider og er plassert omtrentlig ved posisjonene 789 2290 i HIV-genomet. Nukleotidsekvensen av primerne er optimert for å gi en likeverdig amplifikasjon av gruppe M-subtyper av HIV-1. Revers transkripsjon Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjonsreaksjoner utføres med det termostabile rekombinantenzymet Thermus thermophilus DNA-polymerase (rtth pol). I nærvær av mangan og under passende bufferforhold har rtth pol både revers transkriptase- og DNA-polymeraseaktivitet 30. Dermed kan både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon forekomme i samme reaksjonsblanding. Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (A-rør) der både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon skjer. Nedstrøms- eller antisenseprimeren (SKCC1B) og oppstrøms- eller sense-primeren (SK145) er biotinylert ved 5'-endene. Reaksjonsblandingen varmes opp for å gjøre det mulig for nedstrømsprimeren å hybridisere spesifikt til mål-hiv-1-rna og til HIV-1- kvantiteringsstandard-rna. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleosidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin-, deoksyuridin- og deoksytymidin-trifosfater, forlenger rtth pol den hybridiserte primeren og danner en DNA-tråd (cdna) som er komplementær til mål-rna. Målamplifikasjon Etter omvendt transkripsjon av HIV-1-mål-RNA og HIV-1-kvantiteringsstandard- RNA varmes reaksjonsblandingen opp for å denaturere RNA:cDNA-hybriden og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres oppstrøms-primeren (SK145) spesifikt til cdna-tråden, rtth pol forlenger primeren, og en ny DNA-tråd syntetiseres. Dette avslutter den første PCRsyklusen og gir en dobbelttrådet DNA-kopi av HIV-1-RNAs og HIV-1- kvantiteringsstandard-rnas målregion. Reaksjonsblandingen varmes opp på nytt for å separere dette dobbelttrådete DNA-et og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, vil primerne SK145 og SKCC1B hybridiseres til mål- DNA. I nærvær av Mn 2+ og dntp i overskudd, forlenger rtth pol de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl med 155 basepar som kalles et amplicon. COBAS AMPLICOR-analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. Amplifikasjonen skjer kun i HIV-1-genomets region mellom primerne. Hele HIV-1-genomet amplifiseres ikke. 4/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra den kliniske prøven oppnås i COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 ved hjelp av AmpErase (uracil-nglykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjonen av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 32, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna-et. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkningen i det første varmetrinnet ved alkalisk ph i Master Mixen, brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. Etter amplifikasjon denatureres eventuelle rester av enzymet ved å tilsette denatureringsløsning og dermed hindres nedbryting av målamplicon. AmpEraseenzym i COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 har vist seg å kunne inaktivere minst 10 3 kopier av deoksyuridin-inneholdende HIV-1-amplicon per PCR. Hybridiseringsreaksjon Etter PCR-amplifikasjonen tilsetter COBAS AMPLICOR-analysatoren automatisk denatureringsløsning i A-rørene for kjemisk denaturering av HIV-1- amplicon og HIV-1-kvantiteringsstandardamplicon for å danne enkelttrådet DNA. For å oppnå kvantitative resultater over et stort dynamisk område utfører COBAS AMPLICOR-analysatoren serielle fortynninger av denaturert amplicon i deteksjonskoppene (D-kopper). En suspensjon av magnetiske partikler som er belagt med en oligonukleotidprobe som er spesifikk for HIV-1-amplicon (SK102) eller HIV-1-kvantiteringsstandardamplicon (CP35), tilsettes henholdsvis hver av fire fortynninger av HIV-1-amplicon eller hver av to fortynninger av HIV-1- kvantiteringsstandardamplicon. Det biotinmerkede ampliconet hybridiseres til de målspesifikke oligonukleotidprobene som er bundet til magnetpartiklene. Hver kvantitative bestemmelse krever fire uavhengige absorbansmålinger av reagenset med HIV-1-probesuspensjon og to absorbansmålinger av probesuspensjonen for HIV-1-kvantiteringsstandard. Deteksjonsreaksjon Etter hybridiseringsreaksjonen vasker COBAS AMPLICOR-analysatoren de magnetiske partiklene i D-koppen for å fjerne ubundet materiale og deretter tilsettes avidin-hrp-konjugat (Avidin-Horseradish Peroxidase Conjugate). Avidin-HRP binder seg til det biotinmerkede ampliconet som er hybridisert til de målspesifikke oligonukleotidprobene bundet til de magnetiske partiklene. COBAS AMPLICOR-analysatoren fjerner ubundet konjugat ved å vaske de magnetiske partiklene og tilsetter deretter en substratløsning som inneholder hydrogenperoksid og 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) i hver D-kopp. I nærvær av hydrogenperoksid katalyserer det partikkelbundne HRP oksidering av TMB, som danner et farget kompleks, og absorbansen av dette måles av COBAS AMPLICOR-analysator ved en bølgelengde på 660 nm. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/53
HIV-1-RNA-kvantitering Total HIV-1 A Total QS A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen, v1.5 kvantiterer HIV-1-viralt RNA ved å benytte en annen målsekvens (HIV-1-kvantiteringsstandard) som tilsettes prøven i kjent konsentrasjon. HIV-1-kvantiteringsstandarden er et ikkeinfeksiøst 233-nukleotid in vitro-transkribert RNA-molekyl med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-hiv-1-sekvensen. HIV-1-kvantiteringsstandarden inneholder SK145- og SKCC1B-primerbindingsregioner og genererer et amplifikasjonsprodukt med samme lengde (155 baser) og basesammensetning som mål-hiv-1-rna. HIV-1-kvantiteringsstandardampliconets probebindingsregion er modifisert for å kunne skille HIV-1- kvantiteringsstandardamplicon fra mål-hiv-1-amplicon. Innenfor analysens lineære område er absorbansen ved 660 nm (A 660 ) i hver D-kopp proporsjonal til mengden HIV-1-amplicon eller HIV-1-kvantiteringsstandardamplicon i D-koppen. COBAS AMPLICOR-analysatoren beregner total HIV-1-absorbans og HIV-1-kvantiteringsstandardabsorbans ved å multiplisere absorbansen for hver D-kopp med fortynningsfaktoren for ampliconet i den aktuelle D-koppen, og velger deretter D-koppen med maksimal total absorbans. Beregnet total absorbans er proporsjonal med mengden HIV-1-RNA eller HIV-1- kvantiteringsstandard-rna som finnes i hver revers transkripsjon-/pcramplifikasjonreaksjon. Mengden HIV-1-RNA i hver prøve beregnes ut fra forholdet mellom total HIV-1-absorbans og total HIV-1-kvantiteringsstandardabsorbans samt input-antallet av HIV-1-kvantiteringsstandard-RNA-molekyler ved hjelp av følgende ligning: [ ] AF x Input HIV-1 QS-kopier/PCR x prøvevolumfaktor = HIV-1-RNA-kopier/ml der: Total HIV-1 A = beregnet total absorbans for HIV-1-ampliconet Total QS A = beregnet total absorbans for kvantiteringsstandard amplicon Input HIV-1 QS-kopier/PCR = antall kopier av kvantiteringsstandarden i hver reaksjon. Dette antallet er lotspesifikt Prøvevolumfaktor = faktor for å omregne kopier/pcr til kopier/ml AF = justeringsfaktor for å standardisere COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5-testresultat til AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5-testresultat (justeringsfaktor = 1,11). Prøvevolumfaktor = 40 (for Standard-prøveprepareringsprosedyren) Prøvevolumfaktor = 4 (for UltraSensitive-prøveprepareringsprosedyren) 6/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Reagenser COBAS AMPLICOR HIM 48 tester P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Prøveprepareringsreagenser HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR lyseringsreagens) Tris-HCl-buffer 68 % guanidintiocyanat 3 % ditiotreitol < 1 % glykogen + Xn 68 % (v/v) guanidintiocyanat 4 x 9,0 ml Helseskadelig HIV-1 QS, v1.5 4 x 0,1 ml (HIV-1 MONITOR kvantiteringsstandard, versjon 1.5) < 0,001 % ikke-infeksiøst in vitro-transkribert RNA (mikrobielt) som inneholder HIV-1-primerbindingsekvenser og en unik probebindingsregion < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR fortynningsløsning) Tris-HCl-buffer < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 4 x 4,8 ml Kontrollreagenser HIM CTL NHP 4 x 1,6 ml [Negativt plasma (humant)] Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA er ikke detekterbart med PCR i poolede enheter fra donorer. Det ble ikke påvist HBV-core-antistoff med en FDA-lisensiert test. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontroll] < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 4 x 0,05 ml 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/53
HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR lav (+) kontroll] < 0,001 % ikke-infeksiøst in vitro-transkribert RNA (mikrobielt) som inneholder HIV-1-sekvenser < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR høy (+) kontroll] < 0,001 % ikke-infeksiøst in vitro-transkribert RNA (mikrobielt) som inneholder HIV-1-sekvenser < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 4 x 0,05 ml 4 x 0,05 ml Amplifikasjonsreagenser HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 4 x 0,7 ml (HIV-1 MONITOR Master Mix, versjon 1.5) Bicine-buffer Glyserol < 0,01 % rtth DNA-polymerase (rtth pol, mikrobiell) Kaliumacetat < 0,07 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001 % SKCC1B- og SK145-primere, biotinylerte < 0,01 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobielt) 0,05 % natriumazid HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganløsning, versjon 1.5) < 2 % mangan Eddiksyre Amarantfarge 0,05 % natriumazid 4 x 0,1 ml Spesifikke deteksjonsreagenser HIM DK AD3 (Ampliconfortynningsreagens) EDTA 0,8 % natriumhydroksid + Xi 0,8 % (v/v) natriumhydroksid 2 x 75 tester Irriterende IM PS1, v1.5 (HIV-1 MONITOR probesuspensjon 1, versjon 1.5) MES-buffer < 0,01 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med HIV-1-spesifikk oligonukleotid-bindingsprobe SK102 0,09 % natriumazid 2 x 100 tester 8/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR IM4, v1.5 (HIV-1 MONITOR probesuspensjon 2, versjon 1.5) Natriumfosfatbuffer < 0,2 % detergent 24,9 % natriumtiocyanat 2 x 100 tester IQ PS1, v1.5 1 x 100 tester (HIV-1 MONITOR kvantiteringsstandard probesuspensjon 1, versjon 1.5) MES-buffer < 0,01 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med HIV-1-kvantiteringsstandardspesifikk oligonukleotid-bindingsprobe CP35 0,09 % natriumazid IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantiteringsstandard probesuspensjon 2, versjon 1.5) Natriumfosfatbuffer < 0,2 % detergent 24,9 % natriumtiocyanat 1 x 100 tester Generiske deteksjonsreagenser DK DN4 (Denatureringsløsning) 1,6 % natriumhydroksid EDTA Tymolblått + Xi 1,6 % (v/v) natriumhydroksid 1 x 100 tester Irriterende CN4 (Avidin-HRP-konjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001 % Avidin-HRP-konjugat Bovint serumalbumin (pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1% ProClin 150 konserveringsvæske SB3 (Substrat A) Sitratløsning 0,01 % hydrogenperoksid 0,1% ProClin 150 konserveringsvæske 3 x 100 tester 5 x 75 tester 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/53
SB (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) T 40 % (v/v) dimetylformamid (DMF) 5 x 5 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan gi fosterskader. Farlig ved innånding og hudkontakt. Irriterer øynene. S: 53-45 Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig. COBAS AMPLICOR WB 500 tester P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-vaskekonsentrat) < 2 % fosfatbuffer < 9 % natriumklorid EDTA < 2 % detergent 0,5 % ProClin 300 konserveringsvæske 2 x 250 tester Advarsler og forholdsregler Til bruk i in vitro-diagnostikk. Denne testen skal kun brukes for humane plasmaprøver med EDTA eller ACD som antikoagulans. Heparin har vist seg å hemme PCR og må ikke brukes i denne prosedyren. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespisser anbefales. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. 10/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan sendes på forespørsel fra ditt lokale Roche-kontor. Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal, og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/ deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter må starte med reagenstillaging og fortsette med prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert til hver preamplifikasjonsaktivitet og ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøvepreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet til enhver tid. Prøver må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse rutinene er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 og CLSI-dokumentet M29-A3 34. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. ADVARSEL: Dette kitet inneholder en komponent (NHP) som stammer fra humant blod. Kildematerialet er testet med US FDA-godkjente tester og har vist seg å være ikke-reaktivt for antistoffer mot HCV, antistoffer mot HIV-1/2, HIV p24 antigen og hepatitt B-overflateantigen (HBsAg). Poolede enheter fra donorer ble også testet. HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ble ikke påvist i PCR, og det ble ikke påvist HBV-core-antistoff med en FDA-lisensiert test. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. NHP må håndteres som infeksiøst, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 og i CLSIdokumentet M29-A3 34. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 og IQ PS1, v1.5 inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker når du håndterer HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB og aktivt substrat (blandet SB3- og SB-reagens). Unngå kontakt med hud, øyner eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra disse reagensene. Unngå at SB eller det aktive substratet kommer i kontakt med hud og slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. SB og aktivt substrat inneholder dimetylformamid som er rapportert å være giftig i høye orale doser og som kan gi fosterskader. Unngå hudkontakt, innånding av damp og svelging. Ved hudkontakt må du vaske grundig med såpe og vann og oppsøke lege umiddelbart. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 11/53
Ikke la HIV-1 LYS, som inneholder guanidintiocyanat, eller IM4, v1.5 og IQ4, v1.5, som inneholder natriumtiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontaminering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. Krav til oppbevaring og håndtering Ikke frys reagenser. Oppbevar HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 og HIV-1 DIL ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. Det dannes et bunnfall i HIV-1 LYS under oppbevaring ved 2 8 C. Varm opp HIV-1 LYS til 25 37 C før bruk for å løse opp bunnfallet. Varm opp HIV-1 LYS i maks. 30 minutter og bland godt til krystallene er løst opp. Før bruk må hver flaske med HIV-1 LYS undersøkes mot en hvit bakgrunn. Se etter tegn på en gulaktig farge eller lekkasje. Ikke bruk flasken til analysering hvis det er tegn på gulaktig farge eller lekkasje. Ta kontakt med det lokale Roche-kontoret for erstatning. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. Det aktive lyseringsreagenset (tillaget ved tilsetning av HIV-1 QS, v1.5 i HIV-1 LYS) må oppbevares ved romtemperatur og brukes innen 4 timer etter tillaging. Oppbevar HIV-1 MMX, v1.5 og HIV-1 Mn 2+, v1.5 ved 2 8 ºC. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. Working Master Mix (preparert ved tilsetning av HIV-1 Mn 2+, v1.5 i HIV-1 MMX, v1.5) må oppbevares ved 2 8 ºC og er stabil i 4 timer ved 2 8 ºC. Oppbevar NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C ved 2 8 ºC. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. Oppbevar AD3 ved 2 25 ºC. Så snart AD3 er satt inn i COBAS AMPLICORanalysatoren, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. AD3 kan brukes i maks. 4 instrumentsykluser (24 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar IM PS1, v1.5 og IM4, v1.5 ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Så snart IM PS1, v1.5 og IM4, v1.5 er blandet, er det aktive reagenset stabilt i 14 dager ved 2 8 C. Det aktive reagenset kan brukes i maks. 2 instrumentsykluser (24 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar IQ PS1, v1.5 og IQ4, v1.5 ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Så snart IQ PS1, v1.5 og IQ4, v1.5 er blandet, er det aktive reagenset stabilt i 30 dager ved 2 8 C. Det aktive reagenset kan brukes i maks. 4 instrumentsykluser (24 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar DN4 ved 2 25 C. DN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart DN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. DN4 kan brukes i maks. 4 instrumentsykluser (24 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. 12/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Oppbevar CN4 ved 2 8 C. CN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart CN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. CN4 kan brukes i maks. 4 instrumentsykluser (24 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar SB3 og SB ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Det aktive substratet må tillages hver dag ved å blande SB3 og SB. Det aktive substratet er stabilt i 16 timer i COBAS AMPLICORanalysatoren. SB3, SB eller det aktive substratet må ikke utsettes for metaller, oksideringsmidler eller direkte lys. Oppbevar WB ved 2 30 C. WB er stabil til angitt utløpsdato. Undersøk WB før fortynning og, om nødvendig, varm opp til 30 37 C for å løse opp ev. bunnfall. Den aktive vaskebufferen (1X), som tillages ved å fortynne WB 1:10 med destillert eller deionisert vann, må oppbevares ved 2 25 C i COBAS AMPLICORs vaskebufferbeholder og er stabil i 2 uker fra tillagingsdato. Oppbevar delvis brukte deteksjonsreagenser ved 2 8 C mellom analyseseriene. Kontroller utløpsdatoen til åpnede reagenser eller aktive reagenser før de settes i COBAS AMPLICOR-analysatoren. Materiell som medfølger COBAS AMPLICOR HIM P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Prøveprepareringsreagenser HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR lyseringsreagens) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantiteringsstandard, versjon 1.5) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR fortynningsløsning) Kontrollreagenser HIM CTL NHP [Negativt plasma (humant)] HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontroll] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR lav (+) kontroll] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR høy (+) kontroll] 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 13/53
Amplifikasjonsreagenser HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR Master Mix, versjon 1.5) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganløsning, versjon 1.5) Spesifikke deteksjonsreagenser HIM DK AD3 (Ampliconfortynningsreagens) IM PS1, v1.5 (HIV-1 probesuspensjon 1, versjon 1.5) IM4, v1.5 (HIV-1 probesuspensjon 2, versjon 1.5) IQ PS1, v1.5 (HIV-1-kvantiteringsstandardprobesuspensjon 1, versjon 1.5) IQ4, v1.5 (HIV-1-kvantiteringsstandardprobesuspensjon 2, versjon 1.5) Generiske deteksjonsreagenser DK DN4 (Denatureringsløsning) CN4 (Avidin-HRP-konjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-vaskekonsentrat) Materiell som kreves, men som ikke medfølger Preamplifikasjon reagensklargjøringsområde COBAS AMPLICOR A-ring utstyrt med 12 A-rør COBAS AMPLICOR A-ringholder Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Eppendorf Combitip -reservoar (steril, enkeltpakket) Pipetter (kapasitet 50 μl og 100 μl)* med aerosolbarriere eller positive displacement RNase-frie spisser Engangshansker, uten pudder 14/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområde 2,0 ml rør med skrulokk, sterile (Sarstedt 72.694.006 eller tilsvarende)** 1,5 ml rør med skrulokk, sterile (Sarstedt 72.692.105 eller tilsvarende)** Rørstativ (for eksempel Sarstedt 93.1428) 95 % etanol, for molekylærbiologi eller histologi (nyfortynnet til 70 % med destillert eller deionisert vann) Isopropylalkohol, reagenskvalitet Sterile overføringspipetter med fin spiss, RNase-frie Sterile serologiske engangspipetter av polystyren (5 ml, 10 ml og 25 ml) Pipetter (kapasitet 12,5 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 400 μl, 500 μl og 600 μl, 800 μl og 1000 μl)* med aerosolbarriere eller positive displacement RNase-frie spisser Mikrosentrifuge (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende Nedkjølt ultrasentrifuge med rotor med fast vinkel (45 grader, kapasitet på minst 24 1,5 ml rør) med en RCF på 23 600 x g (Heraeus 17RS med HFA 22.1-rotor, Biofuge 28RS eller tilsvarende) Vortexmikser Engangshansker, uten pudder Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområde COBAS AMPLICOR-analysator og skriver Operatørmanual for COBAS AMPLICOR-analysator Valgfritt: AMPLILINK-programvare inkludert: Datastasjon for AMPLILINK-programvare, med skriver Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software versjon 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan - analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR-analysator (for bruk sammen med AMPLILINK Software, v3.2 Series) eller applikasjonsmanual for AMPLILINK Software versjon 3.3 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR-analysator og cobas p 630-instrument (for bruk sammen med AMPLILINK Software, v3.3 Series) Stativ med D-kopper Destillert eller deionisert vann 5 ml serologiske pipetter Vortexmikser Engangshansker, uten pudder * Pipettene må ha 3 % nøyaktighet for angitt volum. Aerosolbarriere eller positive displacement RNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering mellom prøver og amplicon. ** Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontamintering av prøver og kontroller. Ikke bruk rør med snapplokk. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 15/53
Taking, transport og oppbevaring av prøver Merk: Alle prøver må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Taking av prøver COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 skal kun brukes for plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA eller ACD som antikoagulant. Prøver som er antikoagulert med heparin, kan ikke brukes for denne testen. Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 6 timer. Bruk av ACDantikoagulerte prøver vil gi testresultater som er cirka 15 % lavere enn testresultater fra EDTA-antikoagulerte prøver, på grunn av fortynningseffekten av 1,5 ml ACD-antikoagulant i blodprøverøret. Figur 1 viser hvilken effekt ACD- og EDTA-antikoagulanter har på HIV-1-RNA-resultater fra plasmaprøver. Figur 1 Sammenligning av ACD- og EDTA-antikoagulanter* ACD-prøver Gjennomsnittlig AMPLICOR HIV-1 MONITOR-resultat (HIV-RNA-kopier / ml plasma, n = 2) AMLICOR HIV-1 MONITOR Resultater fra EDTA- og ACD-prøver 5 10 y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097 10 4 3 10 EDTA = ACD 3 10 4 10 5 10 EDTA-prøver Gjennomsnittlig AMPLICOR HIV-1 MONITOR-resultat (HIV-RNA-kopier / ml plasma, n = 2) * Dataene vist i figur 1 ble oppnådd med AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen med Standard-prøveprepareringsprosedyren. Separer plasma fra fullblod innen 6 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved 800 1600 x g i 20 minutter i romtemperatur. Overfør plasma til et sterilt polypropylenrør. Transport av prøver Oppbevaring av prøver Transport av fullblod eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 35. Fullblod må transporteres ved 2 25 C og behandles innen 6 timer etter prøvetaking. Plasma kan transporteres ved 2 8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. Plasmaprøver kan oppbevares i romtemperatur i opptil 1 dag, ved 2 8 C i opptil 5 dager eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. Det anbefales at prøvene oppbevares i porsjoner á 600 700 μl i sterile 2,0 ml polypropylenrør med skrulokk (f.eks. Sarstedt 72.694.006). Plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil tre ganger. Figur 2 viser data fra disse fryse/tine-undersøkelsene. 16/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Figur 2 Gjennomsnittlig HIV-1-resultat fra tre pools av HIV-1-positivt plasma Etter 2, 3 og 4 fryse/tine-sykluser* 2,0 HIV-1-RNA-kopier/ml Normalisert til 1. opptining 1,5 1,0 0,5 0,0 1 2 3 4 Antall opptininger Bruksanvisning * Dataene vist i figur 2 ble oppnådd med AMPLICOR HIV-1 MONITOR-testen med Standard-prøveprepareringsprosedyren. Merk: Merk: Merk: Merk: Merk: Teststørrelse Hvis du ønsker detaljert informasjon, utskrift av resultater og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, kan du se i (1) operatørmanualen for COBAS AMPLICOR-analysator, og (2) ved bruk av AMPLILINK Software v3.2, kan du se i applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software versjon 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR-analysator, eller ved bruk av AMPLILINK Software v3.3, kan du se i applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software versjon 3.3 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48- analysator, COBAS AMPLICOR-analysator og cobas p 630-instrument. Alle reagenser må ha romtemperatur før bruk. Kontroller visuelt at alle reagensene inneholder tilstrekkelig reagensvolum før testprosedyren startes. Plasmaprøver må ha romtemperatur før bruk. Bruk pipetter med aerosolbarriere eller positive displacement -spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig for å sikre selektiv amplifikasjon. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontamintering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 må kun kjøres i modusen Basic. Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for fire analyseserier à 12 tester. Disse kan utføres separat eller som to serier à 24 tester. Maks. antall prøver per analyseserie er 24 (21 prøver + 3 kontroller). Minst ett replikat hver av AMPLICOR HIV-1 ( ) kontroll, AMPLICOR HIV-1 MONITOR lav (+) kontroll og AMPLICOR HIV-1 MONITOR høy (+) kontroll må inngå i hver analyseserie (se Kvalitetskontroll ). Forpakningen av prøvepreparerings- og amplifikasjonsreagensene består av flasker á 12 tester for engangsbruk. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 12. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 17/53
Merk: Arbeidsflyt Tillaging av reagenser COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 må kun kjøres i modusen Basic. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 kan fullføres i løpet av én dag, eller over to dager. Følg instruksjonene som er beskrevet under Tillaging av reagenser, prøve- og kontrollpreparering samt revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon i tur og orden hvis analyseringen skal fullføres i løpet av én arbeidsdag. Analyseringen kan fullføres over 2 dager ved å starte med prøve- og kontrollpreparering på dag 1, etterfulgt av tillaging av reagenser og revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon på dag 2. Hvis prøve- og kontrollpreparering skal utføres på dag 1 og revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon på dag 2, utføres enten Standard prøve- og kontrollprepareringen (trinn A.1 til A.14) eller UltraSensitive prøve- og kontrollprepareringen (trinn B.1 til B.19), og de preparerte prøvene oppbevares som angitt i trinn A.14 eller B.19. Dag 2 starter med tillaging av reagenser, og deretter tines de preparerte prøvene og kontrollene ved romtemperatur. Fortsett med Standard prøve- og kontrollprepareringsprosedyren, trinn A.15, eller UltraSensitive prøve- og kontrollprepareringsprosedyren, trinn B.20, til revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon. Utført i: Preamplifikasjon reagensklargjøringsområde 1. Bestem antall A-ringer som er nødvendig for analysering av pasientprøver og kontroller. Plasser A-ringen(e) i A-ringholderen(e). 2. Klargjør Working Master Mix ved å tilsette 100 μl HIV-1 Mn 2+, v1.5 i en flaske med HIV-1 MMX, v1.5. Det er ikke nødvendig å måle Master Mixvolumet. Tilsett 100 μl HIV-1 Mn 2+, v1.5 i hele flasken med HIV-1 MMX, v1.5. Sett på plass korken og bland godt ved å vende røret opp ned 10 15 ganger. Ikke vortex Working Master Mix. Det rosa fargestoffet i HIV-1 Mn 2+, v1.5 brukes til visuell bekreftelse på at HIV-1 Mn 2+, v1.5 er tilsatt Master Mix. Kast resterende HIV-1 Mn 2+, v1.5. Working Master Mix må oppbevares ved 2 8 C og brukes innen 4 timer etter tillaging. 3. Tilsett 50 μl Working Master Mix i hvert A-rør ved hjelp av en dispenserpipette eller en pipette med aerosolbarriere eller positive displacement -spiss. Ikke lukk igjen lokkene til A-rørene i dette trinnet. Kast ubrukt Working Master Mix. 4. Plasser A-ringen(e) som inneholder Working Master Mix i en forseglbar plastpose, og lukk posen godt. Flytt A-ringen(e) til preamplifikasjon prøveprepareringsområdet. Oppbevar A-ringen(e) som inneholder Working Master Mix, ved 2 8 C i preamplifikasjon prøveprepareringsområdet til prøve- og kontrollprepareringen er fullført. Working Master Mix er stabil i 4 timer ved 2 8 C når A-rørene er forseglet i plastposen. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Merk: Utført i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområde For å amplifisere tidligere behandlede prøver og kontroller, utfør først trinnene under Tillaging av reagenser. Tin preparerte prøver og kontroller i romtemperatur og fortsett med Standard prøve- og kontrollpreparering, trinn A.15, eller UltraSensitive prøve- og kontrollpreparering, trinn B.20. Det dannes bunnfall i HIV-1 LYS ved oppbevaring ved 2 8 C. Varm opp ved 25 37 C før bruk og bland godt for å løse opp bunnfallet. 18/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR Merk: Før bruk må hver flaske med HIV-1 LYS undersøkes mot en hvit bakgrunn. Se etter tegn på en gulaktig farge eller lekkasje. Ikke bruk flasken til analysering hvis det er tegn på gulaktig farge eller lekkasje. Ta kontakt med det lokale Roche-kontoret for erstatning. Standard prøve- og kontrollpreparering A.1. A.2. A.3. Klargjør 70 % etanol. Til 12 tester blandes 11,0 ml 95 % etanol og 4,0 ml deionisert eller destillert vann. Merk ett 2,0 ml rør med skrukork til hver pasientprøve, og merk tre ekstra rør med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C. Klargjør Standard aktivt lyseringsreagens. Vortex HIV-1 QS, v1.5 i minst 10 sekunder før bruk. For hver analyseserie med opptil 12 prøver og kontroller tilsettes 100 μl HIV-1 QS, v1.5 til en flaske med HIV-1 LYS. Bland godt. Det er ikke nødvendig å måle volumet av HIV-1 LYS. Det rosa fargestoffet i HIV-1 QS, v1.5 brukes til visuell bekreftelse på at HIV-1 QS, v1.5 er tilsatt HIV-1 LYS. Kast gjenværende HIV-1 QS, v1.5. Standard aktivt lyseringsreagens er stabilt i 4 timer i romtemperatur. Merk: Ved bruk av nedfrossede prøver tines prøvene i romtemperatur og vortexes i 3 5 sekunder. Sentrifuger prøverøret kort, slik at prøven samles i bunnen av røret. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøvene behandles. A.4. Tilsett 600 μl Standard aktivt lyseringsreagens i hvert av de korresponderende rørene. Kork rørene. Kontroller at aktivt lyseringsreagens er rosa for å bekrefte at HIV-1 QS, v1.5 ble tilsatt HIV-1 LYS. A.5. Preparer Standard-kontroller på følgende måte: Vortex NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C i 3 5 sekunder. Tilsett 200 μl NHP i hvert av de tre kontrollrørene. Kork rørene og vortex i 3 5 sekunder. Tilsett 50 μl HIV-1 ( ) C i røret som er merket HIV-1 ( ) C og som inneholder Standard aktivt lyseringsreagens og NHP. Kork røret og vortex i 3 5 sekunder. Tilsett 50 μl HIV-1 L(+)C i røret som er merket HIV-1 L(+)C og som inneholder Standard aktivt lyseringsreagens og NHP. Kork røret og vortex i 3 5 sekunder. Tilsett 50 μl HIV-1 H(+)C i røret som er merket HIV-1 H(+)C og som inneholder Standard aktivt lyseringsreagens og NHP. Kork røret og vortex i 3 5 sekunder. A.6. A.7. Tilsett 200 μl av hver pasientprøve i de korresponderende rørene med Standard aktivt lyseringsreagens. Kork rørene og vortex i 3 5 sekunder. Inkuber prøve- og kontrollrørene i 10 minutter i romtemperatur. A.8. For én prøve og kontroll av gangen fjernes korken, 800 μl 100 % isopropylalkohol (romtemperert) tilsettes, røret korkes på nytt og vortexes kraftig i 3 5 sekunder. Kun ett rør skal stå åpent om gangen. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 19/53
A.9. Sett et retningsmerke på hvert rør, og plasser rørene i mikrosentrifugen med retningsmerkene pekende utover, slik at pelletene vil bli dannet i flukt med retningsmerkene. Sentrifuger prøver og kontroller ved maksimal hastighet (12 500 16 000 x g) i 15 minutter ved romtemperatur. A.10. Bruk en ny engangs overføringspipette med fin spiss for hvert rør, og fjern supernatanten forsiktig fra hvert rør og kast den. Vær forsiktig, slik at du ikke ødelegger pelleten (som kanskje ikke er synlig). Fjern så mye væske som mulig uten å røre pelleten. Sug opp supernatanten langsomt, og la væsken renne helt av fra sidene av røret. Ikke bruk vakuumsug. A.11. Tilsett 1,0 ml 70 % etanol (ved romtemperatur) i hvert rør, sett på korkene og vortex i 3 5 sekunder. A.12. Plasser rørene i en mikrosentrifuge med retningsmerkene vendt utover. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved maksimal hastighet (12 500 16 000 x g) i romtemperatur. A.13. Bruk en ny engangs overføringspipette med fin spiss for hvert rør, og fjern supernatanten forsiktig uten å røre pelleten. Pelleten skal være klart synlig i dette trinnet. Ta bort så mye av supernatanten som mulig. Etanolrester kan hemme amplifikasjonen. A.14. Tilsett 400 μl HIV-1 DIL i hvert rør. Kork rørene. Vortex kraftig i 10 sekunder for å resuspendere det ekstraherte RNA-et. Noe uoppløst materiale kan være igjen. Amplifiser de preparerte prøvene og kontrollene innen 2 timer etter preparering. Hvis amplifikasjonen ikke kan startes innen 2 timer etter preparering, kan prøvene oppbevares nedfryst ved -20 C eller kaldere i opptil en uke, med kun én fryse/tine-syklus. Mer enn én fryse/tinesyklus kan føre til tap av antall kopier. Merk: Hvis preparerte prøver og kontroller har vært oppbevart i frossen tilstand før amplifikasjonen, må de tines i romtemperatur og vortexes i 5 sekunder før du fortsetter med trinn A.15. A.15. Tilsett 50 μl av hver preparerte prøve og kontroll til et korresponderende A-rør som inneholder Working Master Mix, ved hjelp av en pipette med aerosolbarriere eller positive displacement -spiss. Bruk en ny spiss for hver prøve og kontroll. Vær nøye med å ikke overføre eventuelt presipitert materiale som ikke er gått tilbake i løsning. Kork A-rørene. A.16. Noter ned posisjonene for kontrollene og prøvene i A-ringen(e). Amplifikasjonen må startes innen 45 minutter fra det tidspunktet da de behandlede prøvene og kontrollene ble tilsatt A-rørene med Working Master Mix. Flytt de preparerte prøvene og kontrollene i A-ringene til amplifikasjons-/deteksjonsområdet. Gjenværende materiale fra de preparerte prøvene kan fryses ved -20 C eller kaldere i opptil en uke med maks. én fryse/tine-syklus. Mer enn én fryse/tine-syklus kan føre til tap av antall kopier. 20/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2011, Revision 9.0
HIV-1 MONITOR UltraSensitive prøve- og kontrollpreparering B.1. B.2. B.3. B.4. Kjøl ned ultrasentrifugen med rotor til 2 8 C, slik det er beskrevet i ultrasentrifugens operatørmanual. Klargjør 70 % etanol. Til 12 tester blandes 11,0 ml 95 % etanol og 4,0 ml deionisert eller destillert vann. Merk ett 1,5 ml rør med skrukork til hver pasientprøve, og merk tre ekstra rør med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C. Klargjør UltraSensitive lyseringsreagens. Vortex HIV-1 QS, v1.5 i minst 10 sekunder før bruk. For hver analyseserie med opptil 12 prøver og kontroller tilsettes 25 μl HIV-1 QS, v1.5 i en flaske med HIV-1 LYS. Bland godt. Det er ikke nødvendig å måle volumet av HIV-1 LYS. Det rosa fargestoffet i HIV-1 QS, v1.5 brukes til visuell bekreftelse på at HIV-1 QS, v1.5 er tilsatt HIV-1 LYS. Kast gjenværende HIV-1 QS, v1.5. UltraSensitive aktivt lyseringsreagens er stabilt i 4 timer i romtemperatur. Merk: Ved bruk av nedfrossede prøver tines prøvene i romtemperatur og vortexes i 3 5 sekunder. Sentrifuger prøverøret kort, slik at prøven samles i bunnen av røret. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøvene behandles. B.5. B.6. B.7. B.8. Tilsett 500 μl av hver pasientprøve i korresponderende merkede rør. Tilsett 500 μl NHP i hvert av de merkede kontrollrørene. Sett et retningsmerke på hvert rør, og plasser rørene i ultrasentrifugen med retningsmerkene pekende utover, slik at pelletene vil bli dannet i flukt med retningsmerkene. Sentrifuger prøver og kontroller ved 23 600 x g i 60 minutter ved 2 8 C. Bruk en ny engangs overføringspipette med fin spiss for hvert rør, fjern forsiktig supernatanten fra hvert rør, og kast denne. Vær forsiktig, slik at du ikke ødelegger pelleten (som kanskje ikke synes). Fjern så mye væske som mulig uten å røre pelleten. Sug opp supernatanten langsomt, og la væsken renne helt av fra sidene av røret. Ikke bruk vakuumsug. Merk: Viruspelleter fra trinn B.8 i prøveprepareringsprosedyren UltraSensitive er stabile i opptil 6 timer i romtemperatur og i minst 14 dager ved -20 C eller kaldere. B.9. Tilsett 600 μl aktivt lyseringsreagens i hvert av de merkede rørene. Kork rørene. Kontroller at aktivt lyseringsreagens er rosa for å bekrefte at HIV-1 QS, v1.5 ble tilsatt HIV-1 LYS. Vortex røret i 3 5 sekunder for å resuspendere pelleten. B.10. Preparer UltraSensitive-kontroller på følgende måte: Vortex HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C i 3 5 sekunder. Tilsett 12,5 μl HIV-1 ( ) C i røret som er merket HIV-1 ( ) C og som inneholder UltraSensitive aktivt lyseringsreagens. Kork røret og vortex i 3 5 sekunder. Tilsett 12,5 μl HIV-1 L(+)C i røret som er merket HIV-1 L(+)C og som inneholder UltraSensitive aktivt lyseringsreagens. Kork røret og vortex i 3 5 sekunder. 6/2011, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 21/53